Ubi kayu berasal dari Brazil. Tanaman ini menyebar ke Asia pada awal abad ketujuh belas dibawa oleh pedagang Spanyol dari Meksiko ke Fhilipina. Kemudian
ubi kayu menyebar ke Asia Tenggara, termasuk Indonesia (Ekanayake et al. 1997).
Sebagai komoditi perdagangan, ubi kayu dapat dibuat menjadi berbagai olahan antara lain gaplek, pakan ternak, etanol, gula cair, sorbitol, tepung aromatik dan beberapa produk (Lampiran 1).
Akar ubi kayu berfungsi menjadi tempat penyimpanan makanan atau lebih dikenal dengan umbi. Pati dan serat diakumulasi di akarnya. Umbinya merupakan sumber karbohidrat yang mengandung air sekitar 60%, pati, protein,
mineral, serat, selulosa, hemiselulosa dan lignin (Tabel 1) (Pandanou et al. 2005;
Wargiono et al. 2006; Arnata 2009).
Tabel 1. Komposisi kimia ubi kayu segar dan tepung ubi kayu Jumlah (%)
Komponen
Ubi kayua Tepung ubi kayub
Air 62-65 11,5 Abu 0,3-1,3 0,7 Karbohidrat 32-35 83,8 Protein 0,7-2,6 1,0 Lemak 0,2-0,5 0,9 Serat kasar 0,8-1,3 2,1 Selulosa - 0,36c Hemiselulosa - 1,88c Lignin - 0,02c
Sumber : a. Kay (1973), b. Depperin (1989), c. Arnata (2009)
Selama ini untuk membuat bioetanol para produsen hanya memanfaatkan patinya saja, sedangkan seratnya tidak diperhitungkan. Rendemen yang dihasilkan dengan mengolah pati dan seratnya lebih tinggi jika dibandingkan dengan mengolah patinya saja (Susmiati 2009; Nurdyastuti 2005). Sebagai bahan baku bioetanol, ubi kayu memiliki dua keuntungan. Pertama, ubi kayu dapat tumbuh dengan baik pada lahan-lahan marginal, sedangkan tanaman lain seperti jagung dan beras tidak dapat
6
tumbuh dengan baik. Kedua, ubi kayu bukan makanan pokok penduduk Indonesia,
sehingga dapat digunakan sebagai bahan baku bioetanol (Dai et al. 2006). Ubi kayu
yang tidak layak digunakan sebagai bahan pangan seperti ubi kayu yang mengandung HCN tinggi (50-80 mg/kg) (Ciptadi dan Nasution, 1974), serat tinggi, ukurannya kecil dan tidak segar (Syarief 1974) dapat digunakan sebagai bahan baku etanol. Penggunaan ubi kayu tidak layak konsumsi menjadi bahan baku etanol dapat mengurangi limbah pertanian dan dapat memberikan nilai tambah bagi petani.
Ubi kayu jika ditinjau dari segi teknis, finansial dan industri layak dikembangkan sebagai bahan baku bioetanol (Anonim 2007). Kelayakan teknis dapat dilihat dari peningkatan produktivitas ubi kayu dengan laju produksi 1,3 sampai 37% pertahun, tersedianya varietas unggul untuk industri bioetanol, dan masih banyak terdapat lahan tidur serta lahan sawah tadah hujan yang sebagian besar hanya ditanami padi satu kali setahun. Kelayakan finansial ditandai oleh rasio B/C 1,49 dan 1,98 pada tingkat hasil 15 ton dan 20 ton/hektar dengan harga ubi segar di tingkat petani Rp 250/kg (Anonim 2007).
2.2 Polisakarida Dalam Ubi Kayu
Polisakarida merupakan molekul-molekul monosakarida yang dapat berantai lurus atau bercabang serta dapat dihidrolisis dengan enzim-enzim yang kerjanya spesifik. Sebagian polisakarida akan dihidrolisis menjadi oligosakarida. Susunan oligosakarida dapat digunakan utuk menentukan struktur molekul polisakarida. Polisakarida dalam bahan makanan berfungsi sebagai penguat tekstur (selulosa, hemiselulosa, pektin dan lignin) dan sebagai sumber energi (pati, dekstrin, glikogen, dan fruktan) (Winarno 1997).
Komposisi utama polisakarida ubi kayu adalah pati, selulosa, dan hemiselulosa. Pati disimpan sebagai cadangan makanan di akar. Pati merupakan salah satu sumber karbohidrat dari tumbuhan. Semua pati yang berasal dari tumbuhan
berbentuk granula dengan ukuran dan karakteristik fisik yang spesifik (Prasad et al.
2007). Di negara-negara tropis seperti Indonesia, Thailand, Vietnam, dan Brazil, kebanyakan pati diproduksi dari ubi kayu. Pati ubi kayu memiliki beberapa
7
keunggulan jika dibandingkan dengan pati jagung atau kentang. Keunggulan tersebut antara lain kandungan pati lebih tinggi (± 90 % basis kering), kandungan protein dan mineral lebih rendah, temperatur gelatinisasi lebih rendah, dan kelarutan amilosa lebih tinggi. Sifat-sifat tersebut sangat penting untuk hidrolisis pati secara enzimatis (Widiasa 2005).
Pati pada dasarnya terdiri dari dua polimer yang terkait di berbagai proporsi
menurut sumbernya yaitu amilosa (16%-30%) dan amilopektin (65%-85%) (Prasad et
al. 2007). Amilosa mempunyai struktur lurus dengan ikatan α-(1,4)-D-glikosidik,
sedangkan amilopektin mempunyai struktur bercabang dengan ikatan α-(1,6)-D-glikosidik sebanyak 4%-6% dari bobot total.
Selulosa merupakan komponen terbesar (33-51%) dalam lignoselulosa yang berfungsi sebagai struktur dasar dinding sel tanaman (Holtzapple 1993). Komponen
ini terdiri dari unit monomer D-glukosa yang terikat melaui ikatan β-1,
4-D-glukopiranosa. Struktur kimia selulosa berupa polisakarida linear yang tersusun dari
pengulangan unit β-1, 4-D-glukopiranosa dan berasosiasi dengan hemiselulosa (Hayn
et al. 1993.). Rumus molekul polisakarida adalah (C6H10O5)n dan n menyatakan
jumlah unit glukosa pembentuk rantai polimer atau derajat polimerisasi.
Selulosa dapat larut dalam asam pekat seperti H2SO4 72%. Asam tersebut
akan menghidrolisis selulosa menjadi glukosa. Peningkatan temperatur dan tekanan akan meningkatkan laju hidrolisis. Hidrolisis selulosa dapat dihambat oleh lignin dan hemiselulosa (Sjostrom 1994).
Hemiselulosa adalah polimer dari lignoselulosa. Di dalam lignocelulosa terdapat 19%-34% hemiselulosa (Ingram 1975). Polimer ini termasuk dalam kelompok polisakarida heterogen yang terbentuk melalui biosintetis yang berbeda dari selulosa. Komponen ini mudah terhidrolisis dengan asam menjadi komponen-komponen monomernya yang terdiri dari glukosa, manosa, galaktosa, xilosa, L-arabinosa, dan sejumlah kecil L-ramnosa disamping menjadi asam
D-glukuronat, asam 4-0-metil-glukuronat dan asam D-galakturonat (Saha et al. 2005).
Lignin merupakan polimer alkohol aromatik yang terdapat di dalam lignoselulosa (20%-30%). Dalam beberapa penelitian lignin tidak memberikan
8
kontribusi dalam proses fermentasi, bahkan lebih berpotensi menjadi penghambat
dalam proses tersebut (Antonius et al. 2006; Ingram 1975).
Pektin adalah komponen terkecil di dalam lignoselulosa (2%-20%). Pektin
tersusun atas α-(1,6)-D-glikosidik yang terhubung pada asam galakturonat. Asam
galakturonat sendiri bisa teresterifikasi dengan senyawa metil dan kelompok asetil. Pektin mengandung polisakarida bercabang seperti rhamnogalakturonan I,
rhamnogalakturonan II dan xylogalakturonan (Antonius et al. 2006; Ingram 1975).
2.3 Etanol
Etanol merupakan senyawa yang sering digunakan dalam industri kimia antara lain sebagai pelarut (40%), untuk membuat asetaldehid (36%), eter, glikol eter,
etilasetat dan membuat kloral (CL3CCHO) (9%) (Lily et al. 2008). Etanol adalah
cairan yang bening, tidak berwarna dan memiliki bau yang khas. Etanol mengeluarkan bau yang agak manis ada pengenceran menjadi cairan encer, tetapi
mengeluarkan bau terbakar saat konsentrasinya ditambahkan. Etanol (CH3CH2OH)
termasuk dalam kelompok alkohol dengan gugus hidroxil (–OH ) yang berikatan dengan atom karbon dengan karakteristik tertentu (Tabel 3).
Tabel 2. Sifat fisika dan etanol
Besaran Nilai
Titik beku, oC -114,1
Titik didih normal, oC +78,32
Temperatur kritis, oC 243,1
Tekanan kritis, kPa 6383,48
Volume kritis, L/mol 0,167
Faktor kompresibilitas kritis, z 0,248
Densitas, pada 20 oC , g/ml 0,7893
Viskositas, pada 20 oC, mPa.s (=cP) 1,17
Kelarutan dalam air, pada 20 oC Larut
Panas penguapan, pada t.d normal, J/g 839,31
Panas pembakaran, pada 25 oC, J/g 29676,69
Panas pembentukan 104,6
Panas spesifik, pada 20oC, J/g.C.s
Berat molekul
2,42 0,79 Sumber : Othmer (1969).
Etanol untuk minuman telah dibuat sejak zaman dahulu menggunakan fermentasi gula dan terus berlanjut sampai sekarang. Fermentasi menghasilkan
9
maksimal sekitar 14% etanol. Etanol dengan kadar lebih tinggi dapat dihasilkan dengan distilasi larutan. Komposisi larutan distilasi adalah 96% etanol dan 4% air. Etanol komersial mengandung 95% etanol dan 5% air. Etanol murni tidak dapat diperoleh dengan penyulingan, tetapi diperoleh dengan penambahan agen dehidrasi untuk menghilangkan sisa air. Etanol dapat bercampur dengan sebagian besar pelarut organik. Hal ini berguna sebagai dalam pembuatan parfum, cat, pernis, dan bahan peledak (Anshory 2004).
Bioetanol dapat dijadikan bahan bakar pengganti bensin, namun sampai saat ini penggunaannya di Indonesia masih sangat terbatas. Di Indonesia penggunaan bioetanol sebagai bahan bakarkendaraan bermotor masih dicampur dengan bensin. Pencampuran bioetanol absolut sebanyak 10 % dengan bensin (90%), sering disebut Gasohol E-10. Gasohol singkatan dari gasoline (bensin) dan alkohol (bioetanol). Etanol absolut memiliki angka oktan (ON) 117, sedangkan Premium hanya 87-88. Gasohol E-10 secara proporsional memiliki ON 92 atau setara Pertamax. Pada
komposisi ini bioetanol dikenal sebagai octan enhancer (aditif) yang paling ramah
lingkungan dan di negara- negara maju telah menggeser penggunaan Tetra Ethyl
Lead (TEL) maupun Methyl Tertiary Buthyl Ether (MTBE) (BPPT, 2005). Produksi
bioetanol dari tanaman dan penggunaannya pada mesin mobil akan menciptakan keseimbangan siklus karbondioksida, yang berarti akan mengurangi laju pemanasan global.
2.4 Proses Pembuatan Bioetanol
Produksi bioetanol dengan bahan baku pati atau karbohidrat, dilakukan
melalui proses konversi karbohidrat menjadi gula (glukosa) larut air (Lily et al.
2008). Teknologi proses produksi bioetanol tersebut dapat dibagi dalam tiga tahap, yaitu hidrolisis, fermentasi, dan distilasi. Proses hidrolisis bergantung pada bahan baku yang digunakan, misalnya dari bahan bergula, bahan berpati atau bahan berserat. Sebelum dihidrolisis bahan baku harus dipersiapkan terlebih dahulu mulai dari pengupasan, pencucian sampai pengecilan ukuran. Adapun tujuan setiap
teknologi persiapan atau pretreatment adalah untuk mengubah atau menghapus faktor
10
dinding sel polisakarida untuk menjadi monomer gula(Mosier et al. 2005). Hidrolisis
asam digunakan untuk menghidrolisis hemiselulosa menjadi pentosa (xilosa dan arabinosa) dan heksosa (galaktosa, mannosa dan glukosa). Hidrolisis selulosa dan hemiselulosa (terutama xylan) menjadi gula dapat dikatalis oleh bermacam-macam asam termasuk asam sulfat, asam hidroksida, sam hidrokloroda, dan nitrat.
Tahap fermentasi merupakan tahap kedua dalam proses produksi bioetanol. Pada tahap ini, monomer gula seperti glukosa dan xilosa diubah menjadi etanol dengan bantuan mikroorganisme. Proses fermentasi menggunakan dua jenis khamir
yang berbeda untuk mengubah secara bersamaan xilosa dan glukosa disebut
co-fermentation antara lain dengan menggunakan S. cerevisiae dan Pichia stipitis
(Merida dan Figueroa 2009). 2.5 Hidrolisis Asam
Hidrolisis menggunakan asam telah dikembangkan di Jerman sejak awal abad 19. Asam yang paling banyak digunakan adalah jenis asam sulfat encer. Bahan ini digunakan karena murah. Selain asam sulfat sering juga digunakan asam oksalat dan asam asetat. Perlakuan asam sulfat encer dapat digunakan dengan baik untuk bahan-bahan hasil pertanian, seperti tongkol jagung dan jerami padi atau gandum. Asam dapat memecah hemiselulosa yang merupakan bahan yang bersifat rekalsitran (sulit
terurai) dalam hidrolisis. Hidrolisat asam dapat digunakan sebagai substrat utama
produksi bioetanol. Hal ini disebabkan karena hidrolisat asam mengandung glukosa. Glukosa dapat digunakan sebagai sumber energi dan sumber karbon untuk membentuk material penyusun sel baru (Voet dan Voet 2004). Hidrolisis asam dapat menggunakan berbagai macam katalis asam pada berbagai macam konsentrasinya.
Umumnya asam yang digunakan adalah H2SO4 atau HCl (Mussatto dan Roberto,
2004) dengan konsentrasi berkisar antara 2-5% (Iranmahboob et al. 2002; Sun dan
Cheng 2002) dan suhu reaksi ± 160oC. Asam sulfat encer (1% atau pH 1,5) dan suhu
180-190oC digunakan untuk menghidrolisis tongkol jagung skala pilot. Waktu
11
xylosa dihidrolisis menjadi monomernya, 15% xilan menjadi furfural dan 15%
sisanya hilang selama hidrolisis (Zhu et al. 2004).
Gambar 1. Komposisi serat dalam batang barley dan senyawa inhibitor turunannya
Sumber: Almeida et al.(2007)
Hidrolisis asam digunakan pada bahan-bahan yang berlignoselulosa karena lebih dapat memecah hemiselulosa dan selulosa menjadi bahan bergula. Metode ini memiliki kelemahan yaitu membentuk furfural dan senyawa inhibitor lainnya yang dapat menghambat porses fermentasi (Taherzadeh dan Karimi 2007). Komponen toksik yang teridentifikasi berjumlah lebih dari tiga puluh lima senyawa. Komponen ini terbagi atas tiga kelompok utama (Gambar 1) yaitu kelompok asam-asam organik (asam asetat, format dan levulinat), turunan furan (furfural dan
5-hidroksimetilfurfural), dan komponen-komponen fenolik (Luo et al. 2002).
2.6 Fermentasi
Proses fermentasi adalah proses pembebasan energi tanpa adanya oksigen, nama
lainnya adalah respirasi anaerob. Dari hasil akhirnya, fermentasi dibedakan menjadi
fermentasi asam laktatdan fermentasi alkohol. Pada beberapa mikroba pembebasan
energi dapat terjadi karena asam piruvat diubah menjadi asam asetat dan CO2
mannosa abu (0-2%) selulosa (33-51%) hemiselulosa (19-341%) lignin (21-32%) zat extraktif lain (1-5%) glukosa HMF asam levulinat asam format
furan asam lemah
galaktosa rhamnosa
xilosa arabinosa furfural
asam asetat fenol
12
selanjutanya asam asetat diubah menjadi alkohol. Dalam fermentasi alkohol, 1 molekul glukosa hanya dapat menghasilkan 2 molekul ATP. Jumlah ATP yang dihasilkan lebih kecil dari respirasi aerob. Pada respirasi aerob 1 molekul glukosa mampu menghasilkan 38 molekul ATP. Reaksi biokimia fermentasi bervariasi tergantung jenis gula yang digunakan dan produk yang dihasilkan. Tahap akhir dari
fermentasi adalah konversi piruvat ke produk fermentasi akhir. Tahap ini tidak
menghasilkan energi tetapi sangat penting bagi sel anaerobik karena tahap ini
meregenerasi nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+), yang diperlukan untuk
glikolisis.
Reaksinya :
1. Gula (C6H12O6) ————> asam piruvat (glikolisis) + ATP
2. Dekarboksilasi asam piruvat.
Asam piruvat————————————————————>asetaldehid + CO2.
piruvat dekarboksilase (CH3CHO)
3. Asetaldehid oleh alkohol dihidrogenase diubah menjadi etanol.
2 CH3CHO + 2 NADH2————————> 2 C2H5OH + 2 NAD.
alcohol dehidrogenase enzim
Secara singkat, glukosa (C6H12O6) yang merupakan gula paling sederhana,
melalui fermentasi akan menghasilkan etanol (2C2H5OH). Reaksi fermentasi ini
dilakukan oleh khamir seperti S. cerevisiae, yang bersifat fakultatif anaerobik. Pada
kondisi aerobik oksigen digunakan sebagai akseptor elektron terakhir pada jalur reaksi bioenergetik. Pemanfaatan oksigen pada keadaan ini menghasilkan penambahan biomassa sel dengan persamaan reaksi sebagai berikut:
Biomassa sel + C6H12O6 Æ CO2 + H2O + biomassa sel
Pada kondisi anaerobik di jalur reaksi bioenergetik, S cerevisiae menggunakan
senyawa organik sebagai akseptor elektron terakhir. Glukosa digunakan sebagai
substrat dengan hasil akhir berupa alkohol, CO2, aldehid dan asam organik. Reaksi
yang berlangsung dalam keadaan anaerobik tersebut adalah sebagai berikut:
13
Proses pertumbuhan mikroba sangat dinamik dan kinetikanya dapat digunakan untuk meramal produksi biomassa dalam suatu proses fermentasi. Faktor utama yang mempengaruhi pertumbuhan dan perilaku mikroba dapat digolongan dalam faktor intraseluler dan faktor ekstraselular. Faktor intraselular meliputi struktur, mekanisme, metabolisme, dan genetika. Sedangkan faktor ekstraselular meliputi kondisi
lingkungan seperti pH, suhu, tekanan (Hidayat et al .2006).
Proses pertumbuhan mikroba merupakan proses yang memiliki batas tertentu. Pada saat tertentu, setelah melewati tahap minimum, mikroba akan mengalami fase kematian. Faktor-faktor yang dapat menyebabkan berhentinya pertumbuhan mikroba antara lain:
1. Penyusutan konsentrasi nutrisi yang dibutuhkan dalam pertumbuhan
mikroba karena habis terkonsumsi.
2. Produk akhir metabolisme yang menghambat pertumbuhan mikroba karena terjadinya inhibisi dan represi.
Pertumbuhan kultur mikroba umumnya dapat digambarkan dalam suatu kurva pertumbuhan. Pertumbuhan mikroba dapat terbagi dalam beberapa tahap yaitu:
1. Fase adaptasi atau fase lag. Pada fase ini mikroba menyesuaikan diri dengan lingkungan dan medium baru. Mikroba berusaha merombak materi-materi dalam medium agar dapat digunakan sebagai nutrisi untuk pertumbuhannya. Bila dalam medium ada komponen yang tidak dikenal, mikroba akan memproduksi enzim ekstraselular untuk merombak komponen tersebut. Pada fase ini juga berlangsung seleksi. Hanya mikroba yang dapat mencerna nutrisi yang dapat bertahan hidup. Fase lag bisa berlangsung lebih lama pada media yang mengandung inhibitor.
2. Fase log atau pertumbuhan dipercepat adalah fase pertumbuh dan
perkembangbiakkan mikroba dimana jumlahnya meningkat dengan cepat. Pada fase ini mikroba sudah dapat menggunakan nutrisi dalam medium fermentasinya. 3. Fase stationer adalah fase dimana laju pertumbuhan tetap yaitu pada laju
pertumbuhan maksimum (µmaks), Namun jumlah mikroba yang mati juga bertambah. Kematian ini diakibatkan oleh berkurangnya nutrien dan akumulasi senyawa toksik.
14
4. Fase kematian atau fase menurun adalah fase terhentinya pertumbuhan disertai meningkat jumlah mikroba yang. Pada proses fermentasi secara komersil etanol
dipanen sebelum memasuki fase ini. (Crueger dan Crueger 1984; Hidayat et al.
2006).
Gambar 2. Kurva pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae
2.7 Saccharomyces cerevisiae
S. cerevisiae (Saccharomycetes) adalah salah satu jenis khamir yang termasuk
dalam kingdom fungi dengan karakteristik dinding sel banyak mengandung kitin dan manan (Moore 2001). Khamir bereproduksi dengan membentuk sel baru secara serial. Pertumbuhannya disetarakan dengan pertumbuhan tunas yang mencapai ukuran sel dewasa pada saat memisahkan diri dari sel induk. Siklus selnya biasanya terdiri dari tahapan berikut G1, S, G2 dan M yang merupakan tahap mitosis (Moore 2001). Waktu generasinya pendek yaitu 1,5-2 jam dan dapat dengan mudah dikulturkan. Khamir hidup di alam dalam keadaan terbatas pada habitat yang dapat ditempatinya (Moore 2001). Hidup optimum pada pH 4,0-4,5, pada suhu 30°C dan akan mati jika
terkena radiasi ultraviolet sebesar 3 sampai 4 mW detik x 103 (Hidayat et al. 2006).
S. cerevisiae merupakan khamir yang paling banyak digunakan dalam
fermentasi, dan merupakan mikroorganisme yang sangat dikenal oleh masyarakat
luas sebagai khamir roti (baker’s yeast). Khamir roti ini digunakan dalam pembuatan
15
makanan, minuman dan juga dalam industri etanol (Russel et al. 1991). Khamir ini
digunakan dalam proses fermentasi alkohol karena mampu memproduksi etanol dalam jumlah yang besar, toleran terhadap etanol yang cukup tinggi 12-18% (v/v), toleran terhadap kadar gula tinggi dan tetap aktif melakukan fermentasi pada suhu
4-23oC (Harrisson dan Graham 1970).
Bahan baku dan perlakuan yang berbeda akan mengakibatkan perbedaan produksi etanol yang dihasilkan. Fermentasi Jerusalem artichoke menggunakan kultur
tunggal S. cerevisiae menghasilkan etanol sebanyak 0,45 g/g, rendemen sebesar 88,1
g/l, hasil dan produktivitas etanol sebanyak 1,84 g/l (Pakhvirun et al. 2007).
Semua galur S. cerevisiae dapat tumbuh aerobik pada glukosa, maltosa, dan
trehalosa namun tidak dapat tumbuh pada laktosa dan selobiosa. Pertumbuhannya pada gula lain dapat berubah-ubah. Dua jenis gula yang paling baik untuk difermentasikan adalah glukosa dan fruktosa (Martini dan Martini 2001).
Fermentasi substrat terhambat apabila di dalam substrat tersebut terdapat inhibitor berupa furfural, 5-hidroksimetil furfural (HMF) dan asam asetat (Nevoight
2008). Jika dibandingkan dengan mikroorganisme yang lain seperti Zymomonas,
Pichia stipitis dan Escherichia coli, species ini lebih toleran terhadap inhibitor (asam
asetat, furfural dan HMF) (Olsson dan Hahn-hagerdal 1996).
Laju fermentasi pada hidrolisat asam oleh S. cerevisiae lebih lambat daripada
laju fermentasi pada hidrolisat enzim. Hal tersebut mungkin disebabkan oleh adanya senyawa inhibitor. Sanches dan Baustista (1988) menyatakan bahwa waktu atau fase lag bisa berlangsung lebih lama dengan adanya konsentrasi HMF sebesar 2 g/L. Selain HMF, furfural dengan konsentrasi 4 g/l dapat menurunkan laju pembentukan
CO2 sekitar 35% pada. HMF dan furfural dapat menghambat laju pertumbuhan
spesifik dan laju produksi etanol baik pada kondisi aerob maupun anerob pada sistem
kultivasi dan fermentasi S. cerevisiae secara curah (Taherzadeh et al. 1999).
Beberapa penelitian mencoba mengatasi hal tersebut antara lain dengan cara seleksi dan adaptasi galur yang tahan terhadap senyawa inhibitor.
2.8Pengaruh Furfural dan HMF Terhadap S. cerevisiae
Furfural dan HMF dalam konsentrasi tinggi dapat menghambat pertumbuhan
16
dapat menghambat aktivitas enzim glikolitik seperti piruvat dehidrogenase (PDH), fosfat dehidrogenase, alkohol dehidrogenase (ADH), dan aldehid dehidrogenase
(AlDH) (Modig et al. 2002). Pada keadaan anaerobik S. cerevisiae dapat mereduksi
furan menjadi kelompok alkohol fungsional seperti mereduksi furfural menjadi furfuril alkohol dan HMF menjadi HMF alkohol (Gambar 3).
Gambar 3. Perubahan HMF menjadi HMF alkohol
Gambar 4. Skema jalur metabolisme S. cerevisiae dan kemungkinannya berinteraksi
dengan furfural (Modig et al.2002)
S. cerevisiae menggunakan nicotinamida adenin dinukleotida
(NADH)-dependent sebagai kofaktor dalam mereduksi furfural dan nikotinamida adenin denukleoitida fosfat (NADPH) sebagai kofaktor dalam mereduksi HMF (Diaz de
Villegas et al. 1992; Palmqvist et al. 1999; Wahlbom dan Hann-Hageral 2002). ADH
memiliki fungsi ganda yaitu mereduksi furfural dan mereduksi asetaldehide menjadi etanol. Begitu juga dengan AlDH, enzim ini dapat mereduksi furfural menjadi asam
17
furoat namun juga berfungsi mereduksi asetaldehid menjadi asam asetat. Adanya fungsi ganda ADH dan AlDH menyebabkan kompetisi penggunaan enzim antara dua
substrat (Gambar 4) (Modig et al. 2002).
Kompetisi tidak hanya pada penggunaan enzim saja tetapi juga penggunaan
kofaktor (Palmqvist et al. 1999). Konsekuensi dari kompetisi tersebut adalah kofaktor
NADH dan NADPH bebas harus tersedia untuk mendetoksifikasi inhibitor tersebut. Oleh karena itu, keteraturan jalur oksidasi dan reduksi menjadi sangat penting untuk
toleransi furfural (Gorsich et al. 2006). Reaksi-reaksi tersebut dapat dijelaskan dalam
persamaan berikut :
asetaldehid + NADH +H+ ⎯⎯ →ADH⎯
etanol + NAD+ (1)
furfural + NADH +H+ ⎯⎯ →ADH⎯
furfuril alkohol + NAD+ (2)
asetaldehid + NAD+ ⎯⎯ →AlDH⎯
asam asetat + NADH + H+ (3)
furfural + NAD+ ⎯⎯ →AlDH⎯
asam furoat + NADH +H+ (4)
2.9SeleksiGalurS. cerevisiae
Inhibitor menyebabkan berkurangnya produktivitas S. cerevisiae. Seleksi
galur adalah cara yang dapat dilakukan untuk mengatasi masalah tersebut, selain detoksifikasi terhadap hidrolisat asam (Martin dan Jonsson 2003). Seleksi galur berdasarkan perbedaan toleransi tiap galur terhadap inhibitor sehingga berpotensi menghasilkan konsentrasi etanol yang tinggi. Seleksi ini sangat penting untuk
optimalisasi proses produksi (Brandberg et al. 2004).
Beberapa galur S. cerevisiae dianggap memiliki kemampuan toleransi
terhadap inhibitor sehingga Martin dan Johnsson (2003) menyeleksi sepuluh galur S.
cerevisiae yang salah satunya adalah ragi roti dan dua strain Zygosaccharomyces.
Fermentasi dilakukan pada medium sintetik dengan menambahkan campuran inhibitor yang mengandung 3,5g/l asam format, 4,5g/l asam asetat 2,9g/l furfural, 3,8g/l HMF, 0,15 g/l asam sinamat dan 0,18 g/l koniferyl aldehid. Pada fermentasi didapat bahwa ragi roti pada keadaan tanpa inhibitor sampai level inhibitor 50% menghasilkan etanol yang paling tinggi baik setelah 12 jam dan 24 jam fermentasi. Etanol yang dihasilkan sebesar 0,42 g/g dan 0,106 g/g. Artinya bahwa kemampuan ragi roti dalam menghasilkan etanol dapat diandalkan bila dibandingkan dengan galur
18
dengan menyeleksi sembilan galur S. cerevisiae. Seleksi dilakukan melalui proses
fermentasi hidrolisat asam potongan kayu yang mengandung senyawa inhibitor berupa furfural sebanyak 0,61 g/l, HMF sebanyak 2,3 g/l, dan asetat 2,8 g/l. Proses fermentasi lakukan secara curah dan semi curah. Dari penelitian tersebut didapat satu
strain yang paling tolerant yaitu S. cerevisiae ATCC 96581.
2.10AdaptasiS. cerevisiae
Metode adaptasi merupakan metode yang paling murah dan mudah untuk
meningkatkan kinerja S. cerevisiae pada saat fermentasi dibandingkan metode fisika,
kimia dan biologis yang lain (Silva dan Roberto, 2001). Peningkatan toleransi
dikaitkan dengan peningkatan kemampuan NADH- dan NADPH menkonversi
furfural dan HMF ke masing-masing bentuk alkoholnya. Studi-studi terdahulu telah
meningkatan potensi detoksifikasi in situ dan menunjukkan bahwa aktivitas reduktase
tinggi dapat menjadi dasar bagi toleransi (Tabel 3).
Tabel 3. Perbandingan hasil dan produktivitas dari galur S. cerevisiae yang terdaptasi
terhadap galur tidak teradatasi
No Parameter Non adaptasi Teradaptasi
1 Hasil (g/g) 0,18 0,38
2 Produktivitas (g/g.h-1) 1,15 2,55
Sumber : Martin et al. 2007
Galur yang adaptif biasanya mengkonsumsi glukosa sebanyak 2,0 g per gram biomassa pada 8 jam pertama. Etanol yang terbentuk adalah 0,1 g/g per jam selama
periode fermentasi (Brandberg et al. 2004). Martin et al. (2007) mengadaptasi S.
cerevisiae yang telah direkayasa dengan penambahan gen dari Pichia stipitis pada
media yang mengandung inhibitor konsentrasi tinggi secara bertahap selama 353 jam menggunakan bahan baku bagas. Hasilnya menunjukkan 74% furfural dan 40% HMF dapat dikonversi menjadi furfuril alkohol dan HMF alkohol oleh galur yang