HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Transformasi Gen Kitinase pada T. harzianum Triparental Mating
Triparental mating telah dilakukan dengan mengkulturkan secara bersama E. coli yang mengandung plasmid PK2trp-chi, E. coli helper PRK dan A. tumefaciens AGL0 pada media LA tanpa antibiotik. Setelah inkubasi selama 8 jam, hasil triparental mating diseleksi pada media LA yang mengandung higromisin 25 ug/mL dan rifampisin 25 ug/mL. Tahap seleksi ini menghasilkan beberapa koloni. Koloni yang tumbuh dengan baik pada media LA yang mengandung higromisin dan rifampisin masing-masing dengan
konsentrasi 25 ug/ml dan suhu 28oC adalah Agrobacterium yang membawa konstruk
pPK2Trp1-chi. Sedangkan Agrobacterium yang tidak tertransformasi akan mati pada media yang mengandung higromisin. E. coli tidak tumbuh pada media yang mengandung rifampisin dan suhu 28oC. Koloni yang diperoleh diperiksa kembali dengan teknik PCR untuk mengetahui kestabilan transformannya. Pelaksanaan PCR menggunakan primer spesifik penyandi resistensi kanamisin (npt II) untuk mengamplifikasi fragmen KanR yang terdapat pada bagian plasmid pPK2 yang telah dimasukkan ke dalam A. tumefaciens.
Konstruksi gen kitinase asal T. harzianum di bawah promoter glyseraldehid 3 phospat (gpd) dari Aspergillus nidulans (TrpC-chi) disisipkan pada situs KpnI dan NotI pada vektor biner pPK2. Rekombinasi ini menghasilkan plasmid yang mempunyai ukuran 13,39 kb. Secara umum promoter dari gen gliseraldehid-3-phospat (gpd) telah banyak digunakan untuk melakukan transformasi pada cendawan, baik yang termasuk ascomycetes seperti Magnaporthe grisea (Leung et al. 1990), Rhisoctonia secalis (Rohe et al. 1996) maupun pada basidiomycetes seperti transformasi gen Mn(II) peroksidase pada Phanerochaete chrysosporium (Mayfield et al. 1994), gen β-1,4-endoglukanase pada Trichoderma longibrachiatum (Migheli et al. 1998).
Hasil amplifikasi PCR disajikan pada Gambar 4. Terlihat bahwa sebagian besar koloni teramplifikasi dengan ukuran fragmen sekitar 700 bp. Fragmen 700 bp merupakan bagian dari gen penyandi resistensi kanamisin (KanR) pada konstruk pPK2-Trp-Chi yang ditransformasi ke dalam A. tumefaciens. Hasil pengujian dengan PCR membuktikan
22 bahwa gen chi ditransformasi dengan baik pada E. coli maupun Agrobacterium yang dibuktikan dengan munculnya pita pada ke dua klon yang mengandung konstruk pPK2-Trp-Chi. Sebaliknya pada isolat yang sama tetapi tidak mengandung konstruk pPK2-Trp-Chi tidak muncul pita pada gel. Teknik yang sama juga telah berhasil dilakukan untuk transformasi gen chi yang berasal dari padi ke dalam A. tumefaciens LBA 4404 (Chaidamsari 1998). Hal ini menunjukkan bahwa percobaan dengan menggunakan A. tumefaciens yang positif membawa konstruk gen chi pada penelitian ini dapat digunakan untuk transformasi pada T. harzianum.
Gambar 4. PCR pada koloni dengan primer nptII.(K) kontrol pPK2-Trp-Chi; (1-14) koloni hasil mating A. tumefaciens; (M) marker 1 kb Ladder
Uji Konsentrasi Antibiotik untuk Seleksi Transformasi
Kegiatan pengujian dimulai dengan penyediaan media PDA tanpa antibiotik dan yang mengandung higromisin 100, 200, 300 dan 400 ppm. Pada percobaan awal T. harzianum secara langsung dikultur pada media PDA yang mengandung antibiotik, namun tidak satupun kultur yang mampu tumbuh pada media yang mengandung antibiotik. Hal ini kemungkinan disebabkan cendawan belum mampu beradaptasi langsung. Pada percobaan selanjutnya T. harzianum terlebih dahulu dikulturkan pada media yang tidak mengandung antibiotik selama 2 hari. Setelah tumbuh miselium, media yang mengandung antibiotik kemudian dituangkan di bagian atasnya. Hal ini akan memberi kesempatan miselium muda untuk berinteraksi dan beradaptasi dengan antibiotik yang ditambahkan.
K 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M 13 14
23 Hasil uji resistensi higromisin menunjukkan bahwa T. harzianum wildtype masih mampu tumbuh dengan menembus ke bagian atas media yang mengandung 100 µg/mL namun tidak tumbuh pada konsentrasi ≥ 200 µg/mL (Tabel 1). Oleh karena itu untuk seleksi hasil transformasi T. harzianum DT38 digunakan media yang mengandung higromisin 300 µg/mL. Konsentrasi tersebut diambil dari nilai tengah antara 200 dan 400 µg/mL dan diharapkan mencukupi untuk menyeleksi transforman. Konsentrasi antibiotik yang tepat akan mampu menyeleksi transforman dan diharapkan tidak mengganggu pertumbuhannya.
Tabel 1. Pertumbuhan Trichoderma harzianum wildtype pada media PDA yang mengandung higromisin Konsentrasi higromisin (µg/mL) Umur kultur (hari) 0 100 200 300 400 2 +++ + - - - 3 +++ ++ - - - 5 +++ ++ - - -
Keterangan : - hifa tidak tumbuh, + hifa tumbuh sedikit, ++ hifa tumbuh sedang, +++ hifa tumbuh banyak
Salah satu tahapan penting sebelum melakukan transformasi adalah mengetahui efektivitas media penyeleksi yang akan digunakan. Pada penelitian ini digunakan antibiotika sebagai penyeleksi transforman. Konsentrasi higromisin sebagai antibiotik seleksi yang tepat dan efektif dapat menghambat T. harzianum wildtype atau yang tidak tertransformasi konstruk gen kitinase, tetapi tidak mematikan transforman yang dimaksud. Pengujian ini penting untuk lebih meyakinkan bahwa T. harzianum yang tumbuh pada media seleksi adalah hasil dari transformasi.
Antibiotika higromisin digunakan sebagai ‘selectable marker’ untuk menyeleksi hasil transformasi T. harzianum DT38. Banyak marker seleksi yang dapat digunakan untuk transformasi pada cendawan antara lain media yang mengandung akrilamid, media seleksi higromisin pada transformasi gen ß-1,4-Endoglukanase egl1 (Migheli et al. 1998), media yang mengandung karbon dan nitrogen tinggi pada transformasi gen manganese peroksidase mnp1 (Mayfield et al. 1994). Sistim transformasi pada tanaman yang
24 menggunakan higromisin sebagai antibotik seleksi sudah banyak digunakan, salah satu yang telah rutin dikerjakan yaitu transformasi gen kitinase yang berasal dari padi ke dalam tanaman kopi (Siswanto 2002).
Transformasi T. harzianum melalui A. tumefaciens
Spora T. harzianum DT38 ditransformasi dengan kultur A. tumefaciens pembawa pPK2trp-chi. Kokultivasi dilakukan selama 2 hari pada kertas saring steril yang diletakkan di atas media PDA tanpa antibiotik. Kegiatan ini dimaksudkan untuk memberi waktu spora tumbuh menjadi miselia sebelum diseleksi dengan media yang mengandung higromisin. Hasil seleksi mulai terlihat setelah 7 hari ditumbuhkan pada media seleksi (Gambar 5a), dan selanjutnya transforman disubkultur ke media baru tanpa antibiotik. Transforman yang disubkultur pada media yang mengandung higromisin masih mampu menembus/tumbuh di bagian atas media (Gambar 5b), meskipun pertumbuhannya terhambat. T. harzianum transforman pada media tanpa antibiotik terlihat tidak berbeda dengan non transforman (Gambar 6). Menurut Migheli et al (1998), kestabilan meiotik dan mitotik dari DNA terintroduksi dalam suatu modifikasi genetik pada agen biokontrol merupakan syarat dasar awal sebelum individu transforman tersebut dilepas ke lingkungannya.
Kegiatan transformasi ini dilakukan sebanyak 3 kali dengan media induksi yang mengandung asetosiringone. Asetosiringone digunakan pada media kultur bakteri dan media PDA. Asetosiringone ini memiliki kemampuan menginduksi virulensi A. tumefaciens sehingga diharapkan transformasi berlangsung lebih baik, meskipun belum secara pasti diketahui persamaan mekanisme transformasi yang diinduksi asetosiringone pada tanaman dan cendawan (de Groot et al. 1998). Hasil penelitian sebelumnya (Purwantara 2003) menunjukkan tidak ada perbedaan jumlah transforman pada media tanpa asetosiringone dan yang mengandung asetosiringone.
Beberapa fungi juga telah ditransformasi menggunakan A. tumefaciens (Covert et al. 2001, de Groot et al. 1998, Purwantara 2003) dimana bakteri ini mampu mentransformasi protoplas, hifa, spora dan jaringan miselia (Rho et al. 2001). Bakteri ini diketahui telah banyak digunakan untuk mentransfer gen antar kingdom dan juga
25 pada berbagai jenis tanaman, seperti kegiatan transformasi tembakau, kopi dan kakao yang rutin dikerjakan di laboratorium kultur jaringan BPBPI.
Kegiatan transformasi pada tanaman sering menghasilkan transforman yang abnormal, namun secara umum kegiatan transformasi pada cendawan berhasil dengan baik dengan transforman bisa hidup normal. Kegiatan transformasi pada Trichoderma telah banyak dilakukan dan tidak menyebabkan perubahan secara morfologis pada transformannya (de Groot et al. 1998, Migheli et al.1998, Purwantara 2003).
A B
Gambar 5. (A) Hasil seleksi transformasi pada media PDA + higromisin 300 µg/mL setelah 7 hari, (B) subkultur transforman pada media PDA+ higromisin 300 ug/mL berumur 2 hari
A B
Gambar 6. Morfologi koloni Trichoderma harzianum DT38 pada media PDA tanpa antibiotik (A) wild-type; (B) transforman
26
2. Analisis Transforman