BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
C. Validasi Metode
Parameter validitas metode untuk penetapan kadar asam traneksamat secara spektrofotometri UV yang diamati dalam penelitian ini adalah spesifisitas, linieritas, LOD, LOQ, akurasi dan presisi.
1. Spesifisitas
Spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel (Harmita, 2004). Pada
y = 0,02717x + 0,0243 r = 0,9998 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 0 20 40 60 Ab so rba n si *
Kadar Asam Traneksamat (µg/mL)
penelitian ini, spesifisitas metode dibuktikan dengan cara membandingkan panjang gelombang maksimum dari larutan OPA dengan panjang gelombang maksimun dari produk derivatisasi antara asam traneksamat dengan OPA serta tingkatoverlappingyang terjadi. Jika panjang gelombang maksimum (selective UV-wavelength) dari pola spektra berbeda, maka dapat dikatakan bahwa metode tersebut spesifik (Ermer and Miller, 2005), karena pada panjang gelombang tersebut tidak ada absorbansi dari senyawa lain, hanya senyawa analit saja yang terukur.
Berdasarkan data yang diperoleh, panjang gelombang maksimum larutan OPA yaitu 260,5 nm yang ditunjukkan pada gambar 9, sedangkan panjang gelombang maksimum hasil derivatisasi asam traneksamat dengan OPA yaitu 334 nm yang ditunjukkan pada gambar 14. Setelah kedua gambar tersebut dibandingkan, maka dapat diketahui bahwa OPA tidak memberikan absorbansi pada panjang gelombang 334 nm, sehingga metode ini dikatakan spesifik.
Gambar 14. Spektra hasil derivatisasi asam traneksamat dengan OPA setelah 4 menit reaksi
Metode ini juga dapat membedakan absorbansi produk derivat dengan hasil degradasi produk derivat. Hal ini dibuktikan dari spektra hasil degradasi
produk derivat yang memiliki panjang gelombang maksimum berbeda dengan panjang gelombang maksimum produk derivat seperti yang tertera pada gambar 15. Hasil degradasi produk derivat memiliki panjang gelombang maksimum sebesar 246-280 nm.
Gambar 15. Spektra hasil degradasi produk derivatisasi asam traneksamat (30 µg/mL) dengan OPA setelah 35 menit reaksi
Gambar 16. Reaksi degradasi produk derivatisasi asam traneksamat dengan OPA (Coppex, 2000)
Berdasarkan lampiran 7 dan 8, dapat diketahui bahwa senyawa hasil degradasi produk derivat memiliki absorbansi yang meningkat setelah 35 menit reaksi karena data yang didapat menunjukkan bahwa pada konsentrasi asam traneksamat yang sama, setelah 4 menit reaksi, senyawa pada panjang
gelombang 246 nm memiliki absorbansi sebesar 0,259, sedangkan setelah 35 menit reaksi, senyawa pada panjang gelombang 246 nm memiliki absorbansi sebesar 0,482. Hal ini berbanding terbalik dengan absorbansi produk derivat. Pada konsentrasi asam traneksamat yang sama, setelah 4 menit reaksi, produk derivat dengan panjang gelombang 334 nm memiliki absorbansi sebesar 0,799, sedangkan setelah 35 menit reaksi, produk derivat dengan panjang gelombang 334 nm memiliki absorbansi sebesar 0,108. Hal ini menunjukkan bahwa seiring berjalannya waktu, produk derivatisasi yang terbentuk juga semakin kecil karena telah terdegradasi.
Gambar 17. Spektra hasil derivatisasi asam traneksamat dengan OPA setelah 4 menit reaksi dan tingkatoverlappingyang terjadi
Keterangan:
Gambar 17 menunjukkan bahwa tingkat overlapping yang terjadi antara produk derivat dengan hasil degradasi produk derivat sangat kecil sehingga dapat dikatakan bahwa adanya hasil degradasi produk derivat tidak
mengganggu pengukuran absorbansi produk derivatisasi asam traneksamat dengan OPA.
Berdasarkan spektra larutan asam traneksamat dalam sampel kapsul, tidak ada absorbansi pada panjang gelombang 344 nm seperti yang ditunjukkan pada gambar 18, selain itu, setelah larutan sampel yang mengandung asam traneksamat diderivatisasi dengan OPA juga tidak ada absorbansi yang mengganggu pengukuran hasil derivat pada panjang gelombang 334 nm seperti yang ditunjukkan oleh gambar 19.
Gambar 18. Spektra larutan asam traneksamat (30 µg/mL) dalam sampel kapsul tanpa derivatisasi menggunakan OPA
Gambar 19. Spektra larutan asam traneksamat 30 µg/mL (dari sampel kapsul) dengan OPA setelah 4 menit reaksi
Pengukuran absorbansi senyawa hasil derivatisasi asam traneksamat dengan OPA dilakukan pada panjang gelombang 334 nm karena pada panjang
gelombang tersebut tidak terdapat gangguan senyawa lain baik dari eksipien, pereaksi, pelarut maupun hasil degradasinya, sehingga metode ini spesifik untuk penetapan kadar asam traneksamat.
2. Linieritas
Linieritas suatu metode dapat dilihat dari nilai koefisien korelasi (r) yang didapat dari persamaan kurva baku asam traneksamat setelah diderivatisasi dengan OPA. Suatu metode dikatakan memiliki linearitas yang baik jika nilai r ≥ 0,999 (Snyder et al., 1997). Nilai r menunjukan hubungan antara kadar analit dengan absorbansi yang dihasilkan. Jika nilai r semakin mendekati 1, maka hubungan antara kadar analit dengan absorbansinya semakin linier. Pada penelitian ini didapatkan nilai r untuk tiga replikasi kurva baku yaitu sebesar 0,9998; 0,9996 dan 0,9996 (Tabel IV). Ketiga replikasi kurva baku tersebut memiliki nilai r ≥ 0,999 sehingga dapat dikatakan bahwa metode ini memenuhi syarat linieritas yang baik.
3. Batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ)
Untuk penetapan kadar zat aktif dalam suatu sediaan obat yang termasuk kategori I, sebenarnya tidak memerlukan parameter validasi batas deteksi dan batas kuantitasi. Namun pada penelitian ini dilakukan penetapan batas deteksi dan batas kuantitasi untuk memberikan informasi mengenai sensitivitas metode dalam pengukuran absorbansi hasil derivatisasi asam
traneksamat dengan OPA. Informasi LOD dan LOQ ini dapat berfungsi untuk menentukan kadar seri baku yang digunakan.
Menurut ICH, LOD merupakan konsentrasi terkecil dari suatu analit dalam sampel yang masih dapat terdeteksi, tetapi tidak perlu terkuantifikasi pada nilai sebenarnya (Ermerand Miller, 2005). Penentuan batas deteksi dapat didasarkan pada perhitungan tiga kali nilai standar deviasi blangko dibagi dengan nilaislopekurva baku yang dibuat pada rentang kadar mendekati LOQ (Anonim, 2005c).
* = absorbansi senyawa hasil derivatisasi asam traneksamat dengan OPA Gambar 20. Kurva baku untuk menghitung LOD dan LOQ replikasi I
Untuk penentuan LOD dan LOQ secara teoritis dibutuhkan persamaan kurva baku baru yang berada pada kadar rendah mendekati LOQ. Rentang konsentrasi yang digunakan pada kurva baku untuk perhitungan LOD dan LOQ tidak boleh melebihi 10-20 kalinya LOD. Hal ini bertujuan agar konsentrasi LOD dan LOQ yang didapat mendekati nilai sebenarnya dan tidak terjadi penyimpangan kadar yang terlalu jauh, karena pada rentang konsentrasi
y = 0,0267x + 0,0011 r = 0,99997 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 0 10 20 30 40 Ab so rba n si *
Kadar Asam Traneksamat (µg/mL)
tersebut, peningkatan variasi biasanya dapat diasumsikan memiliki pengaruh yang kecil terhadap parameter dispersi dari regresi linier (Ermer and Miller, 2005). Kurva baku untuk menghitung LOD dan LOQ direplikasi 3 kali, kemudian dipilih satu kurva baku yang memiliki nilai koefisien korelasi paling besar yaitu pada replikasi I (Gambar 20) dan digunakan untuk menghitung nilai LOD dan LOQ teoritis. Berdasarkan kurva baku replikasi I diketahui nilai
slope sebesar 0,0267 (Lampiran 13). Selanjutnya dilakukan pengukuran absorbansi blangko sebanyak 15 kali untuk mengetahui nilai standard deviation (SD)-nya. Blangko yang digunakan adalah larutan OPA dalam dapar borat pH 8. Data absorbansi blangko yang diperoleh dapat dilihat pada lampiran 14.
Secara teoritis, nilai LOD dapat dihitung sesuai rumus. Hasil dari perhitungan LOD secara teoritis yaitu:
LOD = = ,
, = 0,227 µg/mL (Lampiran 14).
LOQ merupakan konsentrasi terkecil dari analit di dalam sampel yang masih dapat terkuantifikasi dengan memenuhi standar presisi dan akurasi yang baik (Ermer and Miller, 2005). Batas kuantitasi dapat dihitung berdasarkan perhitungan sepuluh kali nilai standar deviasi blangko dibagi dengan nilaislope
kurva baku (Anonim, 2005c).
Slope yang digunakan untuk menghitung LOQ secara teoritis juga berasal dari slope kurva baku replikasi I yaitu sebesar 0,0267. Begitu juga dengan SD blangko untuk menghitung LOQ berasal dari pengukuran absorbansi blangko OPA dalam dapar borat sebanyak 15 kali (Lampiran 14).
Perhitungan LOQ secara teoritis dapat dilihat pada lampiran 14. Hasil perhitungan LOQ secara teoritis yaitu
LOQ = = ,
, = 0,758 µg/mL (Lampiran 14).
LOQ pada penetapan kadar zat aktif dalam suatu sediaan tidak dapat digunakan sebagai kadar terkecil dari kurva baku, namun dapat digunakan sebagai kadar dalam rentang konsentrasi yang masih dapat dikuantifikasi secara reliabel dan reprodusibel dengan presisi dan akurasi melalui penggunaan hubungan konsentrasi-respon pada metode bioanalisis (Chanet al., 2004).
Setelah diketahui nilai LOD dan LOQ teoritis, kemudian dibuktikan dengan melakukan pengukuran absorbansi pada kadar LOD dan LOQ tersebut untuk mengetahui nilai absorbansi pada kadar LOD dan LOQ teoritis. Data penelitian yang didapat menunjukkan bahwa metode yang digunakan masih dapat mendeteksi analit pada kadar 0,227 µg/mL dengan nilai absorbansi rata-rata sebesar 0,0822. Namun pada kadar analit 0,758 µg/mL, metode yang digunakan sudah dapat menghasilkan nilai absorbansi rata-rata sebesar 0,0968 yang dapat digunakan untuk perhitungan kadar analit dalam metode bioanalisis, karena pada kadar tersebut telah dicapai reprodusibilitas yang baik yang dapat dilihat dari nilai CV = 0,864. Syarat reprodusibilitas yang baik menurut AOAC yaitu nilai CV ≤ 1,3 (AOAC cit., Gonzales and Herrador, 2007).
4. Akurasi
Ketepatan (accuracy) adalah ukuran yang menunjukkan kedekatan hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya. Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan (Snyder et al., 1997). Syarat % recovery yang baik menurut AOAC cit., Gonzales and
Herrador yaitu 98-102%. Dalam penelitian ini penentuan ketepatan dilakukan menggunakan cara yang ketiga yaitu dengan menggunakan standar adisi analit karena cara yang pertama dan kedua tidak mungkin dilakukan kecuali jika peneliti mendapatkan blank matriks dari sampel obat yang digunakan. Oleh karena itu, maka diperlukan penetapan kadar sampel terlebih dahulu untuk mengetahui kadar analit dalam sampel kapsul sehingga memudahkan peneliti dalam perhitungan.
Berdasarkan lima kali replikasi penetapan kadar asam traneksamat dalam serbuk kapsul batch 1 didapatkan kadar asam traneksamat rata-rata sebesar 85,05% (b/b) untuk batch 1 dan 82,15% (b/b) untuk batch 2, untuk perhitungannya secara rinci dapat dilihat pada lampiran 19 dan 21. Kemudian setelah diketahui kadar asam traneksamat dalam sampel serbuk kapsul, peneliti dapat memperkirakan melalui perhitungan kadar terukur yang akan digunakan agar setelah diadisi menggunakan larutan baku asam traneksamat dengan tiga level kadar, absorbansi yang dihasilkan masih berada dalam rentang kurva baku yang dipergunakan untuk perhitungan kadar yang telah terbukti linier. Ekstrapolasi tidak dikehendaki karena diluar rentang kurva baku yang digunakan tidak ada jaminan linieritas antara kadar analit dengan absorbansi
yang dihasilkan. Adisi larutan baku asam traneksamat dilakukan pada tiga level konsentrasi yaitu kadar rendah, sedang dan tinggi. Hal ini bertujuan untuk membuktikan bahwa penggunaan metode pada kadar rendah, sedang dan tinggi tersebut memberikan hasil yang tepat. Berdasarkan hasil pengukuran absorbansi larutan serbuk kapsul batch 1 setelah diadisi menggunakan tiga level kadar larutan baku, didapatkan data bahwa pada level rendah, recovery
yang didapatkan sebesar 99,87 – 101,63%; pada level sedang, recovery yang didapatkan sebesar 98,73 – 98,96% dan pada level tinggi, recovery yang didapatkan sebesar 99,96 - 101,43%. Perhitungan secara lengkap tercantum pada lampiran 20.Recoveryyang didapatkan padabatch1 level rendah, sedang dan tinggi tersebut memenuhi syarat yang ditetapkan AOAC untukrecovery98 –102%.
Berdasarkan hasil pengukuran absorbansi larutan serbuk kapsul batch
2 setelah diadisi menggunakan tiga level kadar larutan baku, didapatkan data bahwa pada level rendah, recovery yang didapatkan sebesar 99,32– 101,00%; pada level sedang, recovery yang didapatkan sebesar 99,10 – 100,73% dan pada level tinggi, recovery yang didapatkan sebesar 98,44 - 100,96%. Perhitungan secara lengkap tercantum pada lampiran 22. Recovery yang didapatkan pada batch 2 level rendah, sedang dan tinggi tersebut memenuhi syarat yang ditetapkan AOAC untukrecovery98–102%.
5. Presisi
Ketelitian adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual yang diperoleh dari pengambilan sampel berulang yang telah dihomogenkan dengan suatu metode analisis (Snyder et al., 1997). MenurutUnited Stated Pharmacopeia Convention(2005), presisi suatu metode ditentukan berdasarkan koefisien variasi (CV) yang diperoleh dari pengulangan pengukuran suatu sampel homogen. Kriteria presisi yang diterima untuk kadar zat analit 100% adalah CV≤1,3% (AOACcit., GonzalesandHerrador, 2007).
Menurut dokumen ICH Q2(R1), cara untuk menentukan repeatability
dapat dilakukan dengan menggunakan 9 kali penetapan dengan 3 level konsentrasi dan 3 kali replikasi untuk masing-masing konsentrasi. Setelah dilakukan tiga kali replikasi pada level kadar rendah, sedang dan tinggi didapatkan data koefisien variasi sebagai berikut: pada sampel kapsul batch 1 CV level rendah sebesar 0,899%; CV level sedang sebesar 0,190% dan CV level tinggi sebesar 0,660%. Sedangkan pada sampel kapsul batch2 CV level rendah sebesar 0,841%; CV level sedang sebesar 0,799% dan CV level tinggi sebesar 1,261%. CV yang didapatkan pada batch1 danbatch2 baik pada level rendah, sedang dan tinggi memenuhi syarat yang ditetapkan AOAC untuk syarat CV≤ 1,3%.
Presisi dan akurasi yang dilakukan menggunakan standar adisi ini bertujuan untuk mengetahui apakah selama proses preparasi sampel ada analit yang hilang. Untuk mengetahui baik atau tidaknya metode yang digunakan ini maka dapat dilihat dari parameter akurasi presisi. Pada lampiran 25 dan 26 dapat
diketahui nilai standar deviasi dari slope dan intersep kurva LOQ; kurva adisi sampelbatch1 dan kurva adisi sampel batch2. Setelah dilakukan analisis statistik menggunakan independent t-test dengan taraf kepercayaan 95% maka dapat diketahui bahwa slope yang didapat dari kurva LOQ jika dibandingkan dengan
slopeyang didapat dari kurva adisi pada batch1 danbatch2 secara statistik tidak berbeda signifikan (Lampiran 27). Intersep yang didapat dari kurva LOQ jika dibandingkan dengan intersep yang didapat dari kurva adisi pada batch 1 dan
batch 2 secara statistik juga tidak berbeda signifikan (Lampiran 28) sehingga dapat disimpulkan bahwa preparasi sampel yang dilakukan tidak mempengaruhi kadar asam traneksamat yang didapat secara signifikan.