• Tidak ada hasil yang ditemukan

Kloning Dan Ekspresi Gen Β-1,4-Glukanase Dari Burkholderia Cepacia Ke Dalam Sistem Escherichia Coli Serta Optimasi Dan Karakterisasinya.

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2017

Membagikan "Kloning Dan Ekspresi Gen Β-1,4-Glukanase Dari Burkholderia Cepacia Ke Dalam Sistem Escherichia Coli Serta Optimasi Dan Karakterisasinya."

Copied!
50
0
0

Teks penuh

(1)

KLONING DAN EKSPRESI GEN β

-1,4-GLUKANASE DARI

Burkholderia cepacia

KE DALAM SISTEM

Escherichia coli

SERTA OPTIMASI DAN KARAKTERISASINYA

FITRIANI WINANGSIH

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(2)
(3)

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Kloning dan Ekspresi Gen β-1,4-glukanase dari Burkholderia cepacia ke dalam Sistem Escherichia coli serta optimasi dan karakterisasinya adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Tesis ini merupakan bagian dari proyek penelitian Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB Biogen). Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Januari 2015

(4)

RINGKASAN

FITRIANI WINANGSIH. Kloning dan Ekspresi Gen β-1,4-glukanase dari Burkholderia cepacia ke dalam Sistem Escherichia coli serta optimasi dan karakterisasinya. Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan TRI PUJI PRIYATNO.

Glukanase merupakan salah satu enzim yang dapat menghidrolisis dinding sel kapang patogen yang menginfeksi tanaman padi. Glukanase dihasilkan dari bakteri endofitik yaitu Burkholderia cepacia. Tujuan penelitian ini adalah menganalisis hasil kloning dan ekspresi gen penyandi enzim β-1,4-glukanase dari Burkholderia cepacia ke dalam sistem Escherichia coli serta mengkarakterisasi enzim rekombinannya. Gen glukanase diisolasi dari bakteri B. cepacia yang berasal dari tanaman padi dengan teknik PCR menggunakan primer Glu 1320 yang dirancang berdasarkan sekuen glukanase melalui akses internet menghasilkan fragmen DNA berukuran 1300 bp. Hasil analisis BlastN dan BlastX dari sekuen klon rekombinan menunjukkan bahwa gen berukuran 1300 bp yang telah diklon dengan vektor pGEM-T Easy dan sekuensing urutan DNA yang diperoleh menunjukkan bahwa fragmen DNA memiliki kemiripan dengan gen Endo-1,4-D-glucanase pada Burkholderia mallei dan Burkholderia pseudomallei. Hal tersebut ditunjukkan dengan nilai kemiripan (Identity) 99% dan E-value 0.0.

Analisis proteomik hasil sekuen asam amino menggunakan Server Expasy Proteomic menunjukkan gen rekombinan glukanase memiliki jumlah asam amino 451, bobot molekul 48.363 kDa dan memiliki titik isoelektrik (pI) sekitar 5.87. Hasil signal peptide memiliki nilai cleavage site berada pada posisi 23 dan 24 yang terletak pada asam amino AAA-AE. Protein klon rekombinan diperoleh dari database Protein Data Bank (PDB) dengan kode 4q2b.2.A. Protein ini terdiri atas 349 residu yang membentuk struktur sekunder berupa 7 pasang beta-hairpin, 20 turn, 3 helix-3/10, dan 17 alpha-helix. Protein hasil purifikasi memiliki bobot molekul protein fusi sekitar 65 kDa. Aktivitas spesifik enzim glukanase menunjukkan 1207.976 U mg-1 dengan yield 27.0% dan tingkat kemurnian 3.9-fold. pH dan suhu optimum dalam menghidrolisis β-glukan adalah pH 6.0 dan suhu 40 oC dengan aktivitas enzim 293.71 U mL-1.

(5)

SUMMARY

FITRIANI WINANGSIH. Cloning and expression gene β-1,4-glucanase from Burkholderia cepacia into Escherichia coli system, optimize and characterize the recombinant enzyme. Supervised by MARIA BINTANG and TRI PUJI PRIYATNO.

Glucanase is the one of enzyme that hydrolyze cell wall of fungal pathogen that was infection of rice plant. Glucanase enzyme was produced by endophytic bacteria Burkholderia cepacia. The object of this research was to analyze cloning and expression result of gene encoding β-1,4-glucanase from B. cepacia into Escherichia coli system and characterize the recombinant enzyme. The clone of glucanase gene was isolated by PCR technique using DNA fragment of B. cepacia from rice plants. The Glu 1320 primer pairs were designed based on the glucanase sequence online database, with the length of the amplicon DNA of 1300 bp. Result from BlastN and BlastX analysis showed that the DNA fragment which was cloned into pGEM-T Easy vector had similarity with Endo-1,4-D-glucanase gene of Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei. The identity of the cloned DNA fragment that was 99% and E-value 0.0.

(6)

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB

(7)

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains

pada

Program Studi Biokimia

KLONING DAN EKSPRESI GEN β

-1,4-GLUKANASE DARI

Burkholderia cepacia

KE DALAM SISTEM

Escherichia coli

SERTA OPTIMASI DAN KARAKTERISASINYA

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2015

(8)
(9)

Judul Tesis : Kloning dan Ekspresi Gen β-1,4-glukanase dari Burkholderia cepacia ke dalam Sistem Escherichia coli serta optimasi dan karakterisasinya

Nama : Fitriani Winangsih NIM : G851120031

Disetujui oleh Komisi Pembimbing

Prof Dr drh Maria Bintang, MS Ketua

Ir Tri Puji Priyatno, MSc PhD Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi Biokimia

Prof Dr drh Maria Bintang, MS

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

(10)

PRAKATA

Puji dan syukur penulis haturkan kehadirat Allah subhanahu wa ta’ala atas segala rahmat, hidayah dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan tesis. Tesis ini disusun sebagai keseluruhan rangkaian penelitian yang telah dilaksanakan guna memenuhi syarat dalam menyelesaikan pendidikan di Program Magister Biokimia Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor, Departemen Biokimia. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan pada bulan September 2013 sampai Agustus 2014 ialah kloning dan ekpresi gen, dengan judul Kloning dan Ekspresi Gen β-1,4-glukanase dari Burkholderia cepacia ke dalam Sistem Escherichia coli serta optimasi dan karakterisasinya.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof. Dr. drh. Maria Bintang, MS dan Ir. Tri Puji Priyatno, MSc.,PhD selaku pembimbing yang dengan ikhlas dan sabar membimbing penulis dari awal penulisan hingga saat ini. Ucapan terima kasih kepada Pimpinan dan Staf Peneliti terutama Bapak Ir. Tri Puji Priyatno, MSc.,PhD pada Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB Biogen). Tak lupa penulis sampaikan terima kasih kepada PEMDA Kabupaten Manokwari atas beasiswa yang diberikan selama studi.

Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, suami serta seluruh keluarga atas segala doa, dukungan dan kasih sayangnya. Semoga hasil penelitian dan rangkaian tesis ini dapat bermanfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi.

(11)

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL vi

DAFTAR GAMBAR vi

DAFTAR LAMPIRAN vi

1 PENDAHULUAN 1

Latar Belakang 1

Tujuan Penelitian 2

Manfaat Penelitian 2

Hipotesis 2

2 METODE 3

Alat dan Bahan 3

Waktu dan Tempat 3

Prosedur Penelitian 3

3 HASIL DAN PEMBAHASAN 9

Kloning Gen β-1,4-glukanase 9

Sekuensing dan Analisis Sekuen DNA 11

Analisis Proteomik 13

Domain dan Motif 16

Subkloning dan Ekspresi Rekombinan Glukanase 17

Karakterisasi Protein Rekombinan Glukanase 19

Aktivitas Glukanase 21

Suhu dan pH Optimum 22

4 SIMPULAN DAN SARAN 24

Simpulan 24

Saran 24

DAFTAR PUSTAKA 25

LAMPIRAN 28

(12)

DAFTAR TABEL

1 Hasil BlastN Gen β-1,4-glukanase 12

2 Hasil BlastX Gen β-1,4-glukanase 13

3 Hasil prediksi beberapa parameter gen β-1,4-glukanase menggunakan

Server Expasy Proteomic 14

4 Hasil pemurnian enzim β-1,4-glukanase 21

DAFTAR GAMBAR

1 Elektroforegram amplikon gen β-1,4-glukanase B. cepacia 10 2 Elektroforegram amplikon koloni terpilih menggunakan primer

Glu1320-F dan Glu1320-R 11

3 Pohon filogenetik Gen β-1,4-glukanase 12

4 Struktur protein 4q2b.2.A (Endo-1,4-beta-D-glukanase) 15 5 Struktur sekunder 4q2b.2.A (Endo-1,4-beta-D-glucanase) 16 6 PCR koloni klon glukanase (pGEM-GluBH) yang ditransformasi dalam

inang E. coli DH5 17

7 Pemotongan plasmid pGEM-GluBH dengan enzim BamH1-HindIII 18 8 Hasil PCR koloni klon glukanase dari transformasi dalam sel inang E.

coli BL21(D3)-pLyss 18

9 Pemotongan plasmid pET-Glu dengan enzim BamHI-HindIII 19 10 Hasil SDS-PAGE sampel protein dari supernatan 20

11 Hasil SDS-PAGE sampel protein dari pelet 20

12 Hasil pemurnian glukanase 21

13 Optimasi suhu terhadap aktivitas glukanase (A) dan aktivitas relatif

enzim (B) 22

14 Optimasi pH terhadap aktivitas glukanase (A) dan aktivitas relatif

enzim (B) 23

DAFTAR LAMPIRAN

1 Diagram alir penelitian 29

2 Hasil sekuensing gen penyandi β-1,4-glukanase 31 3 Hasil prediksi beberapa parameter gen β-1,4-glukanase menggunakan

Server Expasy Proteomic 32

4 Hasil penjajaran sekuen gen glukanase klon rekombinan dengan gen endo-1,4-D-glucanase pada B. mallei dan B. pseudomallei 34 5 Hasil prediksi Signal Peptide glukanase menggunakan server SignalIP

4.1 35

6 Struktur domain hasil analisis Conserved Domain Database

(CDD)-NCBI 36

7 Motif sekuen protein gen penyandi glukanase B. cepacia 36 8 Daerah sisi aktif gen penyandi glukanase B. cepacia 37 9 Konstruk plasmid pET-32b dengan posisi His-Trx pada ujung 5' dan

(13)

1

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Peningkatan produksi tanaman padi sering mengalami beberapa kendala. Salah satu diantaranya disebabkan oleh adanya infeksi patogen. Infeksi patogen pada tanaman dapat terjadi karena bakteri, virus atau kapang. Penyakit blas yang disebabkan oleh kapang Pyricularia grisea merupakan penyakit utama padi. Salah satu upaya pengendalian kapang patogen dapat dilakukan dengan memanfaatkan bakteri endofitik antagonistik yang menghasilkan enzim penghancur dinding sel kapang. Salah satu enzim yang dimanfaatkan untuk menghambat pertumbuhan

kapang patogen yaitu enzim β-glukanase karena komponen utama dinding sel kapang adalah glukan. Enzim β-glukanase merupakan enzim golongan hidrolitik yang dapat mencegah infeksi kapang dengan menghidrolisis senyawa glukan sebagai substratnya, sehingga integritas dinding sel kapang menurun dan tidak dapat menginfeksi sel inang (Shetty et al. 2009).

Secara alami enzim ini merupakan salah satu upaya pertahanan tanaman terhadap kapang patogen, namun keberadaannya belum efektif menghambat perkembangan kapang patogen (Shaikh 2005). Salah satu bakteri endofitik yang diisolasi dari tanaman padi dan memiliki aktivitas enzim glukanase, adalah Burkholderia cepacia (No. Aksesi Biogen-CCE76). Bakteri ini dapat ditemukan pada jaringan tanaman dan juga ditemukan pada ruang antarsel tanaman tebu (Omarjee dan Balandreau 2005). Menurut Bacon & Hinton (2006), bakteri endofitik bersimbiosis secara mutualistik dengan tumbuhan inangnya. Hasil penelitian yang dilakukan oleh Fathin (2012) menunjukkan bahwa B. cepacia

menghasilkan enzim β-1,3-1,4-glukanase.

Enzim β-glukanase bekerja pada ikatan β-glikosidik dalam struktur β-glukan. Penggolongan enzim ini pun cukup beragam tergantung pada ikatan glikosidik

yang dihidrolisisnya. Enzim β-glukanase yang menghidrolisis ikatan β-1,3 dikenal sebagai laminarinase (EC 3.2.1.39) (Doxey et al. 2007), sedangkan yang

menghidrolisis ikatan β-1,4 lebih dikenal sebagai selulase (EC 3.2.1.4) (Nishiyama et al. 2001). Menurut Celestino et al. (2006) tingkat spesifikasi aktivitas dari β-glukanase tergantung pada perbedaan struktur geometri molekul

glukan. β-glukanase yang dihasilkan oleh Rhizopus microporus var. microporus hanya spesifik terhadap glukan dari oat (β-1,3-1,4-glukan), tetapi tidak terhadap laminarinase (β-1,3-glukan) maupun karboksimetil selulosa (β-1,4-glukan).

Berbagai tumbuhan menghasilkan enzim ini untuk mempertahankan diri dari serangan kapang patogen, sehingga enzim ini digolongkan dalam phatogenesis-related protein (protein PR). Saccharomyces cerevisiae merupakan jenis khamir yang menghasilkan β-glukanase yang berperan dalam proses reproduksi aseksual dan pertumbuhannya. Enzim ini dihasilkan juga untuk

remodeling β-glukan dinding sel (Adams 2004). Menurut Shaikh (2005) kapang jenis Trichoderma spp. menggunakan β-glukanase sebagai agen infeksi pada dinding sel tumbuhan inang.

(14)

2

genetik. Salah satu metode yang diterapkan untuk meningkatkan produksi β -glukanase dengan menggunakan protein rekombinan yang dihasilkan. Penelitian untuk mengembangkan upaya alternatif sebagai sumber gen ketahanan terhadap infeksi kapang patogen pada bidang pertanian diharapkan dapat mengurangi ketergantungan terhadap bahan kimia yang memiliki efek negatif terhadap lingkungan sekitarnya. Pemanfaatan enzim pendegradasi dinding sel (cell wall degrading) untuk pengembangan tanaman rekayasa genetik tahan kapang patogen sudah banyak dilaporkan. Ekspresi tertinggi enzim tersebut pada tanaman terbukti efektif mencegah infeksi patogen. Budiani et al. (2004) melaporkan bahwa

peningkatan ekspresi gen enzim β-1.3-glukanase dan kitinase pada tanaman kopi arabika (Coffea arabica L.) menunjukkan tanaman lebih tahan terhadap karat daun. Permasalahannya tidak semua tanaman potensial memiliki aktivitas enzim pendegradasi dinding sel sehingga perlu diintroduksi dari luar organisme itu sendiri.

Enzim β-glukanase dapat diproduksi dengan menggunakan teknologi protein rekombinan menggunakan bakteri Escherichia coli. Produksi protein rekombinan secara maksimal dapat dilakukan melalui pemilihan vektor dan inang ekspresi yang ideal. Penggunaan vektor ekspresi pET-32b dalam membawa gen glukanase hingga akhirnya ditransformasi dan diekspresikan ke dalam sel inang E. coli BL21 sebagai dasar pembuatan protein rekombinan glukanase belum diketahui. Oleh karena itu, perlu dilakukan kloning yang dapat mengekspresikan gen β-glukanase B. cepacia untuk memproduksi protein rekombinan enzim β -glukanase, optimasi dan karakterisasinya, serta dipelajari potensinya sebagai sumber gen ketahanan terhadap kapang patogen.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk melakukan kloning gen penyandi enzim β -1,4-glukanase dari Burkholderia cepacia, optimasi dan karakterisasi rekombinan enzim β-1,4-glukanase pada Escherichia coli serta pemurnian enzim rekombinannya.

Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini adalah diperolehnya isolat rekombinan yang potensial memproduksi β-1,4-glukanase yang nantinya digunakan dalam bidang pertanian sebagai gen ketahanan tanaman terhadap kapang patogen.

Hipotesis

(15)

3

2

METODE

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan diantaranya adalah inkubator, shaker inkubator (Kuhner), vortex mixer, spektrofotometer UV-Vis, mini spin (Eppendorf), thermal cycler PCR (Eppendorf), termomixer (Eppendorf), perangkat elektroforesis (Mupid), autoklaf, pH meter, Cold sentrifuse (Sorvale Fresco), dan alat-alat gelas yang biasa digunakan di laboratorium.

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri endofitik B. cepacia yang digunakan dalam penelitian ini adalah strain Biogen CCE76 yang diisolasi dari tanaman padi. Primer yang digunakan adalah primer Glu 1320-F dan Glu 1320-R. Medium kultur terdiri atas Luria-Bertani (LB)dengan komposisi 10 g L-1 tripton, 10 g L-1 NaCl, dan 5 g L-1 ekstrak khamir. DNA Extraction Kit (1st Base), Miniprep Kit (1st Base), Gel DNA Fragments Extraction Kit (1st base), PCR Extraction Kit (1st Base). Antibiotik yang digunakan terdiri atas ampisilin, kanamisin, dan streptomisin. Vektor kloning yang digunakan adalah pGEM-T Easy dan sel inang untuk kloningnya digunakan E. Coli DH5α.

Waktu dan Tempat

Penelitian dilaksanakan pada bulan September 2013 sampai Agustus 2014 di Laboratorium Biokimia, BB Biogen, Bogor-Jawa Barat.

Prosedur Penelitian

Peremajaan isolat bakteri B. cepacia

Bakteri dipelihara dan disubkultur setiap 3 minggu sekali pada media agar miring Luria-Bertani (LB) dalam tabung reaksi. Komposisi medium terdiri atas 10 g L-1 tripton, 10 g L-1 NaCl, dan 5 g L-1 ekstrak khamir. Biakan diinkubasi pada suhu ruangan. Diagram alir tergambar pada Lampiran 1(A).

Perancangan primer β-1,4-glukanase

Primer spesifik dirancang untuk amplifikasi daerah konservatif gen β -1,4-glukanase melalui tahapan inventarisasi sekuen -1,4-glukanase. Koleksi sekuen terpilih dijajarkan (aligment) untuk mendapatkan daerah yang tinggi homologi sekuennya (conserved region) menggunakan program Bioedit ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Daerah dengan homologi tinggi ini digunakan sebagai acuan perancangan primer menggunakan program Primer3 (http://www.biotools.umassmed.edu/) dengan mempertimbangkan persyaratan primer yang ideal. Pasangan primer yang dirancang yaitu Glu1320-F (ATGGCGAGCTTCTCGTGATGG) dan Glu1320-R (TCAACGCGCGGGCGT CAGCAC). Diagram alir tergambar pada Lampiran 1(A).

Ekstraksi DNA genomik B. cepacia

(16)

4

dengan kecepatan 75 rpm. Biakan dipanen menggunakan sentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4 oC selama 10 menit agar sel dapat mengendap. Endapan sel bakteri diresuspensi dengan buffer, lalu DNA diekstraksi menggunakan DNA Extraction Kit (1st Base). DNA hasil ektraksi disimpan pada suhu _20 oC (Modifikasi Sambrook dan Russell 2001).

Amplifikasi gen β-1,4-glukanase

Gen β-1,4-glukanase diamplifikasi dari B. cepacia menggunakan primer Glu1320-F (ATGGCGAGCTTCTCGTGATGG) dan Glu1320-R (TCAACGCGC GGGCGTCAGCAC). Komposisi reaksi PCR terdiri atas 1 μL DNA B. cepacia

dengan konsentrasi 200 μg, 1 μL primer forward 20 ρmol, 1 μL primer reverse 20

ρmol, 0.5 unit (U) Taq Polymerase, 10 μmol MgSO4, 0.5 μL dNTP (10 mM), 2

μL 10× PCR buffer, dan mili-Q water ditambahkan hingga total volume reaksi

PCR 20 μL. Reaksi PCR dijalankan dengan program sebagai berikut satu siklus inisiasi (94 oC, 4 menit) dilanjutkan dengan 35 siklus yang terdiri dari: denaturasi pada suhu 94 oC selama 1 menit; annealing (penempelan) primer pada suhu 58 oC, selama 1 menit; pemanjangan pada suhu 72 oC selama 3 menit; serta 5 menit ekstensi pada suhu 72 oC (Modifikasi Sambrook dan Russell 2001). Hasil PCR diverifikasi dengan elektroforesis pada gel agarosa 1%.

Elektroforesis gel agarosa

Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan media gel agarosa (Sambrook dan Russell 2001). Gel agarosa (1%) dibuat dengan cara mencairkan agarosa 0.3 gr dalam 30 mL buffer TAE (40mM Tris-ate, 1 mM EDTA pH 8) dengan pemanasan. Gel agarosa kemudian ditambahkan dengan Gel Red sambil di goyang hingga homogen dan dituang ke dalam cetakan. Sampel DNA ditambahkan dengan loading dye (0.25% brom phenol blue dan 40% sukrosa). Campuran ini dihomogenisasi menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa. Elektroforesis dilakukan dengan menghubungkan arus listrik positif dan negatif pada tegangan 100 volt selama 25 – 30 menit. Setelah elektroforesis, visualisasi pita DNA yang terbentuk dapat dilakukan dengan penyinaran sinar UV dan pita DNA yang tampak didokumentasikan untuk dianalisis bobot molekulnya.

Ekstraksi DNA dari gel agarosa

(17)

5 microtube ukuran 1.5 mL, kemudian ditambahkan 20 – 50 µL buffer elusi atau buffer TE dan didiamkan selama 2 menit lalu disentrifugasi 16.000 × g selama 2 menit. Hasil ekstraksi DNA digunakan untuk mengklon gen.

Ligasi produk PCR pada vektor pGEM-T Easy

Ligasi dilakukan dengan menggunakan vektor pGEM-T Easy berdasarkan

panduan ligasi Promega. Sebanyak 3 μL hasil PCR (gen β-1,4-glukanase), 1 μL vektor pGEM-T Easy, 5 μL buffer ligase 2×, dan 1 μL T4 DNA ligase dicampur dalam microtube dan diinkubasi pada suhu 4 oC semalaman. Hasil ligasi ini akan mendapatkan vektor rekombinan pGEM-Gln. Diagram alir kloning gen seperti yang tergambar pada Lampiran 1(B).

Pembuatan sel kompeten E. coli DH5α

Pembuatan sel kompeten dilakukan sebelum proses transformasi hasil ligasi. Pembuatan sel kompeten menggunakan bakteri E. coli strain DH5α dan dilakukan berdasarkan metode Inoue (Sambrook dan Russel 2001). Kultur E. coli DH5α dari stok di gores pada media LB agar dan diinkubasi pada suhu 37 oC, selama ± 16 jam. Sebanyak 1 ose koloni dari cawan Petri biakan diinokulasi ke dalam 50 mL medium SOB (Super Optimal Broth) cair, kemudian diinkubasi pada inkubator shaker pada suhu 30 oC dengan kecepatan 150 rpm sampai nilai OD600 sebesar

0.4 – 0.8. Setelah nilai OD600 mencapai angka 0.4 – 0.8, kultur bakteri diinkubasi

di dalam es dan kemudian di sentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm pada suhu 4

o

C, selama 10 menit. Supernatan dibuang secara aseptis dan pelet disuspensi dengan menambahkan 16.75 mL TB buffer dingin, diinkubasi di dalam es selama 10 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm pada suhu 4 oC, selama 10 menit. Supernatan dibuang secara aseptis dan pelet disuspensi kembali dengan menambahkan 4 mL TB buffer dingin, diinkubasi di dalam es selama 10 menit. Dimetil Sulfoxida (DMSO) sebanyak 0.3 mL ditambahkan ke dalam suspensi lalu diinkubasi dalam es selama 10 menit. Suspensi dipindahkan ke dalam beberapa tabung mikro tubes masing-masing sebanyak 0.2 mL dan disimpan dalam tabung nitrogen cair.

Transformasi

Proses transformasi DNA rekombinan pada sel inang dilakukan dengan metode heat shock (kejut panas) (Sambrook dan Russel 2001). Sel kompeten

dicampurkan dengan 10 μL hasil ligasi dan diinkubasi di dalam es selama 30

menit. Campuran kemudian diinkubasi di dalam thermomixer pada suhu 42 oC selama 1 menit, kemudian diinkubasi kembali dalam es selama 2 menit. Campuran kemudian ditambahkan dengan medium SOC (SOB with Catabolite

repression) cair sebanyak 800 μL dan diinkubasi dalam inkubator shaker pada suhu 37 oC dengan kecepatan 150 rpm selama 1 jam. Campuran disentrifugasi dengan kecepatan 6000 × g selama 5 menit. Supernatan sebanyak 800 μL di

buang dan 200 μL sisa supernatan yang terbentuk digunakan untuk

mensuspensikan pellet. Hasil suspensi disebar merata ke dalam medium LB agar,

yang mengandung antibiotik ampisilin dengan konsentrasi 100 μg mL-1, Isopropyl

(18)

6

putih pada media LB agar, yang mengandung ampisilin. Selanjutnya, klon positif ditumbuhkan pada media LB cair-ampisilin untuk isolasi plasmid rekombinan.

Isolasi plasmid rekombinan

Isolasi plasmid dilakukan menggunakan Miniprep Kit (1st Base). Isolasi DNA plasmid dilakukan terhadap kultur E. coli rekombinan terpilih. Ekstraksi dilakukan sesuai dengan protokol yang diberikan dalam Kit. Kultur bakteri sebanyak 1.5 mL dimasukkan ke dalam microtube dan sentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 3 menit. Pelet yang diperoleh diresuspensi dengan

200 μL PD1 buffer (larutan resuspensi yang mengandung RNase). Sebanyak 200

μL PD2 buffer (larutan lisis) ditambahkan ke dalam tabung dan dibolak-balik selama 10 menit, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit. Sebanyak

300 μL PD3 buffer (larutan netralisasi) ditambahkan ke dalam tabung, dibolak-balik selama 10 menit dan sentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 3 menit. PD kolom ditempatkan pada collection tube dan supernatan dipindahkan ke dalam PD kolom, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 30 detik. Cairan yang tertampung di dalam collection tube dibuang. PD kolom ditempatkan pada collection tube, kemudian buffer pencuci (W1) dimasukkan sebanyak 400 μL ke dalam PD kolom, diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 30 detik. Cairan di dalam collection tube dibuang. PD kolom ditempatkan pada collection tube yang baru dan dimasukkan 600 μL buffer pencuci yang mengandung etanol, kemudian disentrifugasi dengan kondisi yang sama. Setelah itu, PD kolom ditempatkan pada collection tube yang baru dan disentrifugasi selama 3 menit. PD kolom ditempatkan pada microtube yang baru dan ditambahkan 50 μL buffer elusi, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit. Setelah diinkubasi, tabung disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 2 menit. Larutan tersebut kemudian diverifikasi dengan elektroforesis gel agarosa 1%.

Sekuensing dan analisis sekuen DNA

Plasmid rekombinan pGEM-Gln disekuensing untuk memastikan bahwa fragmen yang telah diklon adalah gen β-1,4-glukanase. Sekuensing dilakukan di Laboratorium 1st Base PT. Genetika Science, Singapura dengan mengirimkan sampel plasmid DNA rekombinan. Sekuensing dilakukan dua arah menggunakan primer T7 dan SP6. Hasil sekuensing yang berupa grafik elektroforegram dan data urutan nukleotida akan dianalisis dengan menggunakan perangkat lunak Bioedit versi 7.0.9. Elektroforegram dan urutan nukleotida dibuka dengan program Bioedit dicari sekuen forward dan reverse gen β-1,4-glukanase. Urutan nukleotida yang diperoleh kemudian dianalisis menggunakan program bioinformatika Basic local Alignment search tool (BlastN dan BlastX) pada situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast (Altschul et al. 1990).

Analisis proteomik

(19)

7 protein dilakukan menggunakan situs http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan dan penelusuran daerah sisi aktif enzim diakses pada situs http://prosite.expasy.org.

Subkloning gen β-1,4-glukanase dalam vektor ekspresi

Proses subkloning gen β-1,4-glukanase ke dalam vektor ekspresi pET-32b dilakukan dengan mengamplifikasi gen glukanase dari plasmid pGEM-Glu dengan primer Glu-B dan Glu-H yang masing-masing mengandung adaptor site untuk enzim restriksi BamHI dan HindIII, yaitu GluB-F (GATGGGATCCGG GCGAGCTTCTCG) dan GluH-R (TCAAGCTTCGGGCGTCAGCAC). Fragmen hasil PCR diligasikan ke dalam pGEM-T Easy untuk mendapatkan rekombinan pGEM-GluBH yang kemudian ditransformasikan ke dalam E. coli DH5α. Selanjutnya plasmid pGEM-GluBH di potong dengan enzim BamHI dan HindIII, lalu fragmen gen glukanase diligasikan ke dalam vektor pET-32b yang juga sudah dipotong dengan enzim yang sama. Konstruk pET32-Glu ditransformasikan ke dalam E. coli DH5α. E. coli positif membawa plasmid rekombinan dibiakan pada media LB cair yang mengandung ampisilin dan kanamisin untuk diekstraksi plasmidnya. Plasmid rekombinan ditransformasi ke dalam E. coli BL21(DE3)-pLyss dan diseleksi pada media LB agar yang telah ditambahkan antibiotik ampisilin, kanamisin, dan streptomisin. Diagram alir tergambar pada Lampiran 1(C).

Ekstraksi β-Glukan

Substrat glukan dipreparasi dari oatmeal mengikuti metode Wood dan Weisz (1984). Sebanyak 20 g oatmeal dilarutkan dalam 200 mL akuades yang pH-nya diatur dengan Na2CO3 20% (b/v) hingga mencapai pH 10 sambil diaduk

dengan magnetic stirrer dan dipanaskan sampai suhu 45 oC selama 30 menit. Kemudian, larutan oatmeal disentrifugasi dengan kecepatan 4000 × g selama 15 menit pada suhu 4 oC. Supernatan dipindahkan ke gelas piala dan diatur pH-nya menjadi pH 4.5 menggunakan HCl 1 M, lalu disentrifugasi lagi dengan kecepatan 17000 × g selama 20 menit pada suhu 4 oC. Endapan dibuang, sedangkan supernatannya ditambahkan dengan 80 mL etanol 96% secara perlahan sambil diaduk. Setelah diinkubasi selama 16 – 18 jam pada suhu 4 oC, campuran disentrifugasi dengan kecepatan 17000 × g selama 10 menit untuk mendapatkan pelet glukan yang selanjutnya diresuspensi dengan 5 – 10 mL PBS (phosphat buffer saline).

Seleksi klon rekombinan glukanase secara kualitatif

(20)

8

Optimasi ekspresi E. coli rekombinan glukanase

Ekspresi gen β-1,4-glukanase dalam rekombinan E. coli BL21(DE3)-pLyss

diinduksi dengan menggunakan IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside). Konsentrasi IPTG dan suhu inkubasi sangat mempengaruhi tingkat ekspresi. Oleh karena, untuk mengetahui tingkat ekspresi yang optimal dari gen β-1.4 glukanase dalam rekombinan E. coli akan diuji pengaruh konsentrasi IPTG (0, 2.5, 5 dan 10 mM) dan suhu biakan (25 oC, 30 oC, dan 35 oC). E. coli rekombinan dibiakan dalam 10 mL media LB cair yang mengandung ampisilin, kanamisin, dan streptomisin pada suhu inkubasi yang berbeda sambil digoyang dengan orbital shaker 75 rpm. Setelah konsentrasi sel dalam biakan mencapai OD600 sekitar 0.5,

biakan ditambahkan IPTG dengan konsentrasi yang berbeda untuk menginduksi ekspresi glukanase, lalu diinkubasikan lagi hingga 16 jam. Sel bakteri kemudian dipanen dan protein rekombinan yang terekspresi diekstraksi dengan menggunakan buffer lysis bugbuster (Invitrogen) yang mengandung lysogenase. Profil ekspresi divisualisasikan pada SDS-PAGE (12%). Diagram alir tergambar pada Lampiran 1(D).

SDS-PAGE

Sampel protein yang akan dimasukkan ke dalam gel sebelumnya dicampurkan dengan buffer sampel yang mengandung mercaptoetanol dan SDS, kemudian didihkan selama 5 menit untuk mereduksi protein sampel hingga bermuatan negatif dan sampel didinginkan pada suhu ruang. Proses pemisahan dilakukan dengan cara cetakan gel ditempatkan ke dalam kotak gel, kemudian

reservoir atas dan bawah diisi dengan buffer pemisah. Sebanyak 10 μL sampel

dimasukkan ke dalam sumur (well) tempat sampel, dan pada sumur pertama dimasukkan protein standar, setelah itu dihubungkan dengan arus listrik dengan tegangan 200 V. Arus listrik dihentikan setelah pewarna protein standar (biru bromofenol) mencapai batas akhir sekitar 1 cm dari ujung gel, kemudian gel dimasukkan dalam wadah pewarnaan.

Pewarnaan dilakukan dengan cara merendam gel dalam larutan pewarna Commassie Blue selama 6 jam sambil digoyang dengan gerakan 50 – 100 rpm. Gel yang dihasilkan dalam pewarnaan dicuci dengan aquades dan direndam dalam larutan pencuciwarna (larutan destaining) dengan komposisi metanol, asam asetat dan aquades hingga dihasilkan gel yang jernih.

Pemurnian glukanase rekombinan

Protein rekombinan dimurnikan dengan teknik Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) menggunakan kolom Histag (Amersham). Elusi protein dari kolom Histag dilakukan dengan menggunakan larutan imidazol 300 mM. Selanjutnya, suspensi protein dihilangkan kandungan imidazol (desalting) menggunakan 50 mM buffer fosfat pH 6.0 dan kolom membran Centricon (Millipore, cut-off 12 kDa) melalui sentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm, pada suhu 4 oC. Protein hasil pemurnian diukur konsentrasinya, divisualisasi pada SDS-PAGE, dan diuji aktivitasnya menggunakan substrat glukan dari oatmeal.

Pengukuran aktivitas glukanase

(21)

9 fosfat pH 4.8 hingga volume akhir campuran 500 μL. Campuran ditutup dengan aluminium foil kemudian dikocok dengan vorteks. Selanjutnya campuran diinkubasi pada suhu 48 oC selama 60 menit dan dipanaskan l00 oC selama 10 menit untuk menghentikan reaksinya. Campuran ditambahkan reagen DNS sebanyak 1.5 mL lalu dipanaskan pada suhu 100 oC selama 15 menit. Campuran didinginkan selama 20 menit dan serapannya dibaca pada panjang gelombang 575 nm. Pengukuran dilakukan secara triplo. Media LB digunakan sebagai blanko untuk ekstrak enzim kasar dari supernatan, sedangkan blanko untuk ekstrak enzim kasar dari pelet menggunakan buffer lisis. Nilai konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan dikonversi dari nilai absorban yang terbaca melalui kurva standar, dengan glukosa sebagai larutan standar. Satu unit aktivitas enzim glukanase sebanding dengan satu μmol glukosa yang dihasilkan per menit, dengan perhitungan:

Aktivitas spesifik enzim dihitung dengan rumus :

Penentuan suhu dan pH optimum aktivitas glukanase

Penentuan pengaruh suhu terhadap aktivitas glukanase ditentukan pada kisaran suhu 40 – 70 oC. Prosedur pengujian aktivitas glukanase pada berbagai suhu dilakukan dengan prosedur yang sama dengan pengukuran aktivitas glukanase. Suhu yang menghasilkan aktivitas tertinggi ditetapkan sebagai suhu optimum.

Pengaruh pH terhadap aktivitas glukanase ditentukan pada kisaran pH 3.0 – 9.0 dengan berbagai variasi buffer yang sesuai dengan konsentrasi 50 mM pada suhu optimum. Buffer yang digunakan adalah Sodium asetat (pH 3.0 – 6.0), Sodium fosfat (pH 7.0), dan Tris-HCl (pH 8.0 – 9.0). Prosedur pengujian aktivitas glukanase pada berbagai pH dilakukan dengan prosedur yang sama dengan pengukuran aktivitas glukanase. Nilai pH yang menghasilkan aktivitas tertinggi ditetapkan sebagai pH optimum.

3

HASIL DAN PEMBAHASAN

Kloning gen β-1,4-glukanase

Kloning gen β-1,4-glukanase dilakukan dengan mengamplifikasi gen β -1,4-glukanase dari DNA genom B. cepacia menggunakan primer spesifik. Proses amplifikasi menggunakan teknik PCR merupakan metode enzimatis yang dilakukan untuk melipatgandakan (amplifikasi) molekul DNA dan mRNA serta kuantitasi molekul mRNA dalam waktu singkat secara in vitro (Bintang 2010). Amplifikasi gen β-1,4-glukanase B. cepacia menggunakan pasangan primer Glu1320-F dan Glu1320-R menghasilkan ukuran fragmen DNA 1300 bp seperti yang ditargetkan (Gambar 1).

... (1)

(22)

10

Gambar 1 Elektroforegram amplikon gen β-1,4-glukanase B. cepacia (M = Marker 100 bp; 1 = produk PCR)

Hasil pada Gambar 1 menunjukkan produk PCR yang dianalisis pada gel elektroforesis dengan ukuran fragmen DNA 1300 bp seperti yang ditargetkan. Keberhasilan amplifikasi tergantung pada kemurnian DNA yang digunakan dalam reaksi PCR, selain itu juga dipengaruhi oleh tingkat spesifisitas dan suhu penempelan primer. Primer yang ideal dirancang memenuhi beberapa ketentuan umum, diantaranya panjang primer antara 18 hingga 28 nukleotida, komposisi G+C sekitar 50 – 60%, dan sepasang primer mempunyai titik leleh (Tm) yang

seimbang, yakni tidak melebihi 70 oC (Innis & Gelfand 1990; Yuwono 2006). Fragmen DNA dengan ukuran 1300 bp yang merupakan produk PCR dimurnikan untuk membersihkan garam-garam dalam reaksi PCR yang kemungkinan masih terdapat sisa genom sehingga mempengaruhi proses selanjutnya. Hasil pemurnian digunakan sebagai insert (sisipan) dalam proses transformasi. Fragmen DNA hasil pemurnian dengan ukuran 1300 bp diligasikan ke dalam vektor kloning pGEM-T Easy dan ditransformasikan dalam sel kompeten E. coli DH5α. E. coli DH5α merupakan sel inang yang baik untuk proses pengklonan DNA karena memiliki efisiensi transformasi yang tinggi. Selain itu, bakteri ini memiliki beberapa kelebihan lainnya seperti memiliki kemudahan untuk dikultur dan dimanipulasi, tingkat pertumbuhannya cepat, dapat menerima gen asing dengan berbagai teknik, serta informasi sifat biokimianya telah dipahami dengan baik (Campbell et al. 2009).

Vektor kloning (vektor DNA) memiliki karakter substansial diantaranya mempunyai situs multiple cloninguntuk memasukkan DNA asing ke dalamnya, melakukan propagasi di dalam sel inang, dan mempunyai gen marker sebagai gen yang memungkinkan untuk seleksi bakteri rekombinan yang mengandung plasmid dengan DNA asing (Helianti 2010). Penggunaan vektor pGEM-T Easy memiliki keunggulan, diantaranya memiliki dua buah origin of replication dan gen ketahanan terhadap ampisilin (Amp). Plasmid ini mengandung Multiple Cloning Site (MCS) dan memiliki kelebihan timin yang menggantung di ujung terbuka plasmid (T overhang). Plasmid ini sering digunakan sebagai vektor untuk produk PCR yang selalu memiliki kelebihan adenin pada ujungnya tanpa memerlukan tahapan pemotongan terlebih dahulu. Plasmid pGEM-T Easy juga termasuk plasmid high copy number yang cocok untuk menyimpan gen insert dalam suatu inang.

(23)

11 ligasi gen glukanase pada vektor pGEM-T Easy membentuk plasmid rekombinan dan juga keberhasilan transformasi ke inang kloning E. coli DH5α. Metode PCR koloni merupakan metode yang mudah dan sederhana untuk skrining klon bakteri (Azhahianambi et al. 2008). Transformasi plasmid rekombinan pGEM-Glu ke inang E. coli DH5α menghasilkan puluhan koloni biru-putih. Sebanyak lima koloni terseleksi positif mengandung fragmen DNA berukuran 1300 bp (Gambar 2) yang merupakan hasil PCR koloni putih yang tumbuh pada media LB agar mengandung ampisilin, IPTG, dan X-Gal.

Gambar 2 Elektroforegram amplikon koloni terpilih dengan menggunakan primer Glu1320-F dan Glu1320-R (M= Marker 100 bp; 1, 2, 3, 4 dan 5= koloni positif)

Berdasarkan Gambar 2 sebanyak lima koloni positif hasil transformasi diambil untuk kemudian dilakukan isolasi plasmid untuk memastikan bahwa koloni positif hasil transformasi membawa insert gen glukanase. Pada isolasi plasmid, pemisahan DNA plasmid dari DNA kromosom bakteri yang terdapat dalam sel didasarkan pada perbedaan konformasi antara DNA plasmid dan DNA bakteri. Bentuk plasmid tidak hanya sirkular, tetapi dapat berbentuk supercoilled (berlilitan) sedangkan DNA kromosom bakteri berbentuk sirkular dan pada saat terjadi preparasi, ekstrak sel akan pecah menjadi fragmen-fragmen linear (Brown 2010).

Sekuensing dan analisis sekuen DNA

Hasil sekuensing diperoleh dua sekuen dari arah forward dan reverse yang masing-masing dengan panjang 793 bp dan 821 bp. Sekuen kontaminasi vektor pGEM-T Easy dihilangkan, sehingga sekuen reverse dikonversi menjadi reverse komplement pada analisis overlapping dengan sekuen forward. Hasil analisis ini memperoleh sekuen β-1,4-glukanase dengan panjang 1314 bp. Gen β -1,4-glukanase memiliki kodon start ATG dan kodon stop TGA. Sekuen hasil sekuensing gen penyandi β-1,4-glukanase dalam bentuk elektroforegram diubah ke dalam bentuk FASTA Format menggunakan software Bioedit (Lampiran 2).

Analisis Blast dilakukan untuk mengetahui dan memastikan identitas

(24)

12

Tabel 1 Hasil BlastN gen β-1,4-glukanase

Nomor Accession Deskripsi Spesies E-value Identitas (%)

CP000547.1 Burkholderia mallei NCTC 10247

chromosome II, complete sequence

0.0 99

CP000545.1 Burkholderia mallei NCTC 10229 chromosome II, complete sequence

0.0 99

CP000011.2 Burkholderia mallei ATCC 23344

chromosome 2, complete sequence

0.0 99

CP003782.1 Burkholderia pseudomallei BPC006

chromosome II, complete sequence

0.0 99

CP000573.1 Burkholderia pseudomallei 1106a

chromosome II, complete sequence

0.0 99

LK936443.1 Burkholderia pseudomallei genome

assembly BP_3921g , chromosome : 2

0.0 99

CP000125.1 Burkholderia pseudomallei 1710b

chromosome II, complete sequence

0.0 99

BX571966.1 Burkholderia pseudomallei strain

K96243, chromosome 2, complete sequence

MSHR146 chromosome 2, complete sequence

0.0 99

Data hasil Blast kemudian disajikan dalam bentuk pohon filogenetik (Gambar 3) untuk menunjukkan hubungan evolusi antara spesies yang satu dengan lainnya. Pohon filogenetik dibuat untuk memvisualisasikan hubungan evolusi diantara berbagai spesies atau benda-benda lain. Pohon filogenetik berupa diagram bercabang-cabang dapat dikonstruksi berdasarkan kesamaan atau perbedaan sifat fisik atau genetik seperti sekuen DNA, sekuen asam amino (protein), pola pemotongan enzim restriksi, dan ukuran alel pada analisa

microsatellite. Pohon filogenetik dibuat dengan menggunakan software Mega 5.05 (Tamura et al. 2011).

(25)

13

Diagram pohon filogeni menunjukkan bahwa gen penyandi β-1,4-glukanase

B. cepacia memiliki tingkat kekerabatan yang dekat dengan gen glukanase pada B. mallei-NCTC.

Selain melakukan analisis BlastN, juga dilakukan analisis BlastX untuk melihat homologi di tingkat proteinnya. Hasil analisis BlastX sekuen DNA gen penyandi β-1,4-glukanase menunjukkan bahwa fragmen DNA mempunyai tingkat homologi yang tinggi dengan endo-1,4-D-glukanase pada B. mallei (99%) dan B. pseudomallei(98%) (Tabel 2).

Tabel 2 Hasil BlastX gen β-1,4-glukanase

Nomor Accession Deskripsi Spesies E-value Identitas (%) WP 011857778.1 endo-1,4-D-glucanase Burkholderia mallei 0.0 99 WP 011832151.1 endo-1,4-D-glucanase Burkholderia mallei 0.0 99 WP 011204605.1 endo-1,4-D-glucanase Burkholderia mallei 0.0 99 WP 004557798.1 endo-1,4-D-glucanase Burkholderia

pseudomallei

0.0 98

WP 024428480.1 1,4-D-glucanase Burkholderia pseudomallei 0.0 98 WP 011857712.1 endo-1,4-D-glucanase Burkholderia

pseudomallei

0.0 98

Secara teoritis hasil analisis Blast dengan nilai E-value ≥ e-04

mengindikasikan tingkat kemiripan yang tinggi (Claverie & Notredame 2007). Dengan demikian dapat dipastikan bahwa fragmen DNA 1300 bp yang diklon dari

B. cepacia adalah gen glukanase.

Analisis Proteomik

Sekuen basa nukleotida kemudian diubah menjadi sekuen asam amino menggunakan ServerExpasy Proteomic. Hasil sekuen asam amino yang diperoleh adalah:

Tanda bintang yang terdapat pada akhir urutan asam amino merupakan asam amino yang disandikan oleh kodon stop. Urutan asam amino tersebut tidak terdapat kodon stop di tengah urutan sehingga diduga dapat diekspresikan menjadi asam amino yang dalam hal ini adalah glukanase.

(26)

14

Tabel 3 Hasil Prediksi Beberapa Parameter Gen β-1,4-glukanase menggunakan Server Expasy Proteomic

Hasil prediksi beberapa parameter pada Tabel 3 menunjukkan adanya perbedaan parameter yang disebabkan karena perbedaan sekuen asam amino pada gen rekombinan glukanase dengan yang terdapat pada database Genebank. Perbedaan sekuen asam amino dapat diketahui dengan melakukan alignment menggunakan software ClustalW (Larkin et al. 2007). Data hasil alignment (Lampiran 4) sekuen gen glukanase pada klon rekombinan dengan gen endo-1,4-D-glucanase pada B. mallei dan B. pseudomallei menunjukkan bahwa pada sekuen tertentu terdapat persamaan dan perbedaan. Persamaan kode asam amino antara gen klon rekombinan dengan gen endo-1,4-D-glucanase pada B. mallei (No. Accession WP011204605.1, WP011857778.1, WP011832151.1) terdapat pada asam amino Metionin (M) sekuen ke-227 dan Valin (V) sekuen ke-302, selain itu Fenilalanin (F) pada sekuen ke-268 sama dengan sekuen pada B. mallei (No. Accession WP011857778.1 dan WP011832151.1). Sedangkan perbedaan terletak pada asam amino Asam Aspartat (D) sekuen ke-32, Leusin (L) sekuen ke-44, Serin (S) sekuen ke-142, Metionin (M) sekuen ke-205, dan Threonin (T) sekuen ke-306 .

Hasil signal peptide (Lampiran 5) dari gen klon rekombinan menunjukkan nilai cleavage site berada pada posisi 23 dan 24 yang terletak pada asam amino AAA-AE. Hal tersebut berarti enzim rekombinan ini mature protein pada posisi 24. Hasil signal peptide diperoleh dengan menggunakan server SignalIP 4.1 secara on-line (Petersen et al. 2011). Keberadaan signal peptide dan kaitannya dengan sekresi protein secara ekstraselular terbukti dengan adanya zona lisis pertumbuhan B. cepacia pada media glukan.

(27)

15 kemiripan hasil dengan model yang dimiliki Endo-1,4-beta-D-glukanase seperti pada Gambar 4. Enzim endo-1,4-beta-D-glukanase merupakan salah satu bagian dari enzim selulase. Selulase merupakan enzim ekstraseluler yang pada dasarnya memiliki mekanisme pemotongan rantai ikatan yang sangat kompleks karena melibatkan sinergitas kerja 3 komponen besar yaitu endo-1,4-β-D-glukanase yang berfungsi memutuskan ikatan selulosa (ikatan glikosidik β-1,4) secara random dengan memulai serangan acak pada sisi internal amorf dari serat selulosa sehingga sisi yang terbuka dapat diserang oleh ekso-β-1,4-glukanase. Ekso-β -1,4-glukanase memotong ujung-ujung rantai individu selulosa, yaitu menyerang bagian luar non-reducing dari selulosa sehingga dihasilkan selobiosa sebagai struktur utamanya. Selanjutnya β-glukosidase yang berfungsi memotong selobiosa menjadi molekul-molekul glukosa.

Gambar 4 Struktur protein 4q2b.2.A (Endo-1,4-beta-D-glucanase)

(28)

16

Gambar 5 Struktur sekunder 4q2b.2.A (Endo-1,4-beta-D-glucanase)

Domain dan motif

Domain merupakan unit dari suatu fungsi, yang dibentuk oleh bermacam kombinasi elemen struktur sekunder dan motif, mencirikan suatu kelompok gen tertentu dan memiliki karakteristik khas secara struktural. Domain biasanya berukuran lebih panjang dari motif. Sebuah domain terdiri lebih dari 40 residu hingga mencapai 700 residu, dengan rata-rata panjang 100 residu. Sebuah domain dapat memiliki bagian motif didalamnya dan dapat pula tidak mengandung motif (Xiong 2006). Hasil analisis karakter domain fungsional dari sekuen gen pengkode glukanase B. cepacia menunjukkan pada sekuen gen ditemukan conserved domain, yaitu endo-1,4-D-glucanase (PRK11097) yang menunjukkan karakter khas gen penyandi enzim glukanase pada bakteri (Geer et al. 2013) (Lampiran 6). Domain Glyco Hydro 8 superfamily merupakan daerah yang menunjukkan karakteristik daerah fungsional kelompok enzim penyandi enzim-enzim hidrolase family 8, termasuk didalamnya selulase.

(29)

17 dan motif Glyco_Hydro_8 (Lampiran 7). Motif CK2_PHOSPHO_SITE menunjukkan daerah terjadinya fosforilasi kasein kinase II, motif MYRISTYL menunjukkan situs tempat terjadinya proses miristilasi, yaitu penambahan gugus myristyl pada protein diakhir proses translasi. Motif PKC_PHOSPHO_SITE menunjukkan terjadinya fosforilasi protein kinase C.

Penelusuran daerah sisi aktif diperoleh dengan menggunakan web http://prosite.expasy.org. Daerah sisi aktif dapat diketahui dengan adanya keberadaan residu asam amino tertentu. Sisi aktif merupakan situs yang memiliki kaitan dengan aktifitas enzim, yang pada umumnya terkait dengan pengikatan enzim terhadap substrat. Pada penelusuran daerah sisi aktif diketahui terdapat di daerah ALA_RICH yang diidentifikasi sebagai pengikat enzim (Lampiran 8). Hasil secara In Silico dari sekuen protein gen penyandi glukanase pada bakteri B. cepacia menunjukkan bahwa sekuen protein tersebut memiliki aktivitas fungsional yang dapat diketahui adanya peluang terekspresinya enzim glukanase dari isolat bakteri tersebut bila dilakukan proses ekspresi gen.

Subkloning dan ekspresi rekombinan glukanase

Klon gen pGEM-Glu diamplifikasi dengan primer yang mengandung adaptor site BamHI dan HindIII, diligasikan ke dalam vektor pGEM-T Easy dan ditransformasikan dalam E. coli DH5α yang mengandung antibiotik ampisilin, sehingga menghasilkan klon pGEM-GluBH. Gambar 6 menunjukkan plasmid pGEM-GluBH yang mengandung adaptor site BamHI dan HindIII dengan hasil PCR koloni berupa lima koloni terseleksi positif (sumur 1, 2, 4, 5, dan 6) yang mengandung fragmen dengan ukuran 1300 bp.

Gambar 6 PCR koloni klon glukanase (pGEM-GluBH) yang ditransformasi dalam inang E. coli DH5 (1, 2, 4, 5, dan 6 = koloni pET-GluBH;

M = Marker 1 kb)

Konfirmasi keberadaan adaptor tersebut dibuktikan dengan analisis pemotongan enzim BamHI dan HindIII. Enzim tersebut hanya memiliki situs pemotongan pada klon glukanase dan tidak dimiliki oleh vektor pGEM-T Easy. Hal tersebut terlihat pada ukuran fragmen DNA dan vektor kloning yang terbentuk dari hasil pemotongan enzim (Gambar 7), masing-masing memiliki ukuran 3015 bp untuk ukuran pGEM-T Easy dan sekitar 1300 bp untuk ukuran

(30)

18

Enzim restriksi dapat mengenali dan memotong rangkaian DNA untai ganda spesifik dengan panjang rangkaian 4 – 7 pb (pasangan basa). Potongan-potongan DNA yang terbentuk menghasilkan ujung tumpul (blunt ends) atau ujung lengket (sticky ends) yang tergantung pada mekanisme pemotongan yang dilakukan oleh enzim (Murray et al. 2009).

Gambar 7 Hasil visualisasi elektroforesis gel agarosa (1%) Restriksi plasmid pGEM-GluBH yang membawa insert gen glukanase (1= restriksi dengan BamH1, 2= tanpa restriksi, 3= restriksi dengan BamH1-HindIII, 4= restriksi dengan HindIII; M= Marker 100 bp)

Gen glukanase B. cepacia diekspresikan dalam sistem pET-32b dengan inang E. coli BL21(DE3)-pLyss. Vektor ekspresi pET mengandung beberapa elemen yang penting seperti gen lacI yang mengkode protein lac repressor, promoter T7 yang hanya spesifik dengan T7 RNA Polimerase. Vektor pET-32b merupakan sistem yang dilengkapi dengan multiple situs restriksi dan terdapat fusi sekuen thioredoxin (Trx.Tag), histidin (His-Tag), S-Tag, serta situs pemotongan thrombin dan enterokinase (Novagen 2006).

Gen dikonstruk dalam plasmid pET-32b dengan posisi antara His-Trx pada

ujung 5’ dan His pada ujung 3’ (Lampiran 9). Subkloning gen glukanase dari pGEM ke vektor pET-32b dilakukan dengan adaptor site BamHI dan HindIII. Fragmen DNA glukanase hasil pemotongan enzim BamHI dan HindIII dimurnikan, diligasikan ke dalam pET-32b yang juga dipotong dengan kedua enzim tersebut menghasilkan rekombinan pET-Glu.

(31)

19 Verifikasi rekombinan pET-Glu pada PCR koloni berupa tujuh koloni positif yang menunjukkan adanya fragmen berukuran 1300 bp (Gambar 8). Adanya fragmen yang muncul pada hasil visualisasi menunjukkan bahwa proses transformasi berhasil dilakukan. Proses transformasi dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya konsentrasi DNA yang akan ditransformasi, sel yang digunakan, media kultur, suhu dan waktu penyimpanan sel kompeten sebelum digunakan dalam transformasi (Zhiming Tu et al. 2005).

Keberhasilan konstruk gen glukanase ke dalam pET-32b menunjukkan adanya dua pita berukuran 5800 bp sebagai vektor pET-32b dan 1300 bp sebagai glukanase pada pemotongan rekombinan pET-Glu dengan enzim BamHI dan HindIII (Gambar 9).

Gambar 9 Pemotongan pET-Glu yang membawa gen glukanase dengan enzim BamH1-HindIII (1 – 3 = gen pET-Glu; M = Marker 1 kb)

Verifikasi dengan pemotongan hasil rekombinan menggunakan enzim restriksi memiliki sifat spesifik yang dapat mengenali sekuen nukleotida pendek dalam molekul DNA dan memotong pada titik tertentu dalam sekuen nukleotida tersebut (Campbell et al. 2009). Produk PCR yang digunakan memiliki bentuk linear sehingga jika di potong dengan enzim restriksi maka akan terbentuk dua pita.

Karakterisasi protein rekombinan glukanase

(32)

20

Gambar 10 Hasil SDS-PAGE sampel protein dari supernatan (M= Marker; 1 = rekombinan 1 diinduksi IPTG; 2 = rekombinan 1 tanpa induksi; 3 = rekombinan 2 diinduksi; 4 = rekombinan 2 tanpa induksi; 5 = DE3 membawa pET diinduksi; 6 = DE3 membawa pET tanpa induksi; 7 = DE3 diinduksi; 8 = DE3 tanpa induksi)

Gambar 11 Hasil SDS-PAGE sampel protein dari pelet (M= Marker; 1 = rekombinan 1 diinduksi IPTG; 2 = rekombinan 1 tanpa induksi; 3 = rekombinan 2 diinduksi; 4 = rekombinan 2 tanpa induksi; 5 = DE3 membawa pET diinduksi; 6 = DE3 membawa pET tanpa induksi; 7 = DE3 diinduksi; 8 = DE3 tanpa induksi)

(33)

21 protein terlarut hanya terdapat dalam jumlah sedikit dalam ektrak protein, sehingga telah mengalami elusi.

Gambar 12 Hasil pemurnian glukanase menggunakan kolom histag centicon (M= Marker; 1= sampel 1 protein terjerap; 2= sampel 2 protein tidak terjerap; 3= sampel 1 protein terjerap ; 4= sampel 2 protein terjerap) Ukuran bobot molekul protein glukanase sekitar 48 kDa, namun diperoleh secara fusi dengan adanya thioredoxin dan 6x histidin (fusi Trx-(His)6-tag) yang

berukuran sekitar 17 kDa, sehingga terjadi penambahan ukuran protein menjadi sekitar 65 kDa. Fusi Trx-(His)6-tag juga terdapat pada penelitian ekspresi rabbit

neutrofil peptide-1 ke dalam vektor pET-32b(+) pada sel inang E. coli DE3 pLyss yang menghasilkan protein terlarut (soluble) setelah dilakukan ekstraksi dengan sonikasi (Yu-Ling et al. 2011). Banyak protein yang secara normal diproduksi dalam bentuk tidak terlarut (insoluble) pada E. coli dan menjadi bentuk terlarut (soluble) jika difusikan dengan sekuen N-terminal thioredoxin (La Valline et al. 1993). Bobot molekul β-1.4-glukanase pada B. cepacia tidak berbeda dengan enzim β-glukanase pada organisme lain, seperti pada Fibrobacter succinogenes yang memiliki bobot molekul enzim sebesar 65 kDa (Zeng et al. 2009).

Aktivitas Glukanase

Aktivitas suatu enzim dinyatakan dengan unit. Pengujian dan pengukuran aktivitas enzim β-glukanase didasarkan pada perhitungan gula pereduksi dari hasil

hidrolisis substrat glukan yang mengandung β-glukan. Yield (%) diperoleh dari perhitungan aktivitas total pada tahap pemurnian dibagi dengan aktivitas total ekstrak kasar kali 100% (Tabel 4). Tingkat kemurnian enzim diperoleh dari perhitungan aktivitas spesifik tahap pemurnian dibagi dengan aktivitas spesifik ekstrak kasar. Aktivitas total menunjukkan jumlah total unit enzim yang terdapat dalam suatu fraksi (Nelson dan Cox 2004).

(34)

22

Aktivitas spesifik enzim glukanase pada hasil pemurnian mencapai 1207.98 U mg-1 dengan yield 27.0% dan tingkat kemurnian 3.9-fold lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak kasar (crude) yang mencapai 303.03 U mg-1. Hasil yang diperoleh berbeda dengan hasil purifikasi enzim 1,3-1,4-β-glukanase dari R. microsporus var. microspores oleh Celestino et al. 2006 yang menghasilkan aktivitas spesifik enzim 12.596 U mg-1, dengan tingkat kemurnian 55.529-fold dan yield sekitar 114.912%, hasil tersebut menunjukkan bahwa β-glukanase yang dihasilkan oleh R. microsporus var. microspores memiliki kespesifikan terhadap glukan dari oat (β-1,3-1,4-glukan) dan tidak spesifik terhadap laminarin (β -1,3-glukan) maupun karboksi metilselulosa (β-1,4-glukan) karena adanya perbedaan geometri molekul pada setiap β-glukan (Celestino et al. 2006).

Enzim β-glukanase dapat menghidrolisis substrat berupa β-glukan pada ikatan β-glikosidik dalam struktur β-glukan. Enzim tersebut dapat menghidrolisis ikatan β-1,3 yang disebut sebagai laminarinase (EC 3.2.1.39) (Doxey et al. 2007) dan menghidrolisis ikatan β-1,4 sebagai selulase (EC 3.2.1.4) (Nishiyama et al. 2001).

Suhu dan pH optimum

Aktivitas suatu enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya suhu dan derajat keasaman (pH). Suhu merupakan salah satu faktor yang penting terhadap aktivitas enzim. Perubahan suhu dapat menyebabkan terjadinya pelipatan protein atau enzim sehingga sisi aktif enzim berada pada posisi yang tepat untuk mengkatalisis substratnya. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim glukanase dapat dilihat pada Gambar 13.

(A) (B)

Gambar 13 Optimasi Suhu terhadap aktivitas glukanase (A) dan aktivitas relatif enzim (B)

Aktivitas glukanase mengalami perubahan seiring dengan adanya peningkatan suhu. Pada suhu 10 oC aktivitas enzim 61.54 U mL-1 kemudian meningkat menjadi 73.90 U mL-1 pada suhu 20 oC, selanjutnya suhu 30 oC meningkat 161.29 U mL-1 dan meningkat lagi menjadi 293.71 U mL-1 pada suhu 40 oC. Peningkatan suhu setelah 40 oC, terjadi penurunan aktivitas enzim menjadi 109.69 U mL-1 pada suhu 50 oC dan 62.24 U mL-1 pada suhu 60 oC. Hasil analisis menunjukkan bahwa aktivitas enzim glukanase tertinggi terjadi pada suhu optimum 40 oC.

(35)

23 glukanase pada B. cepacia sebanding dengan hasil aktivitas glukanase pada Pseudomonas aeruginosa C 32a yang memiliki aktivitas enzim sebesar 0.029 U mL-1 pada suhu 40 oC (Suryadi et al. 2014). Hasil penelitian ini juga menunjukkan bahwa aktivitas glukanase memiliki karakteristik yang berbeda pada jenis bakteri yang berbeda, seperti dilaporkan oleh Natsir (2014) bahwa aktivitas enzim glukanase B. licheniformis HSA3-1a mencapai aktivitas tertinggi 0.91 U mL-1 pada suhu 50 oC dan pada Streptococcus salivarius subsp. thermophilus aktivitas glukanase tertinggi pada suhu 70 °C (Asan dan Ozcan 2007). Aktivitas enzim akan meningkat berbanding lurus dengan meningkatnya suhu hingga mencapai suhu optimumnya, kemudian aktivitas enzim akan menurun setelah melewati suhu optimumnya.

Aktivitas relatif enzim glukanase dalam titik maksimal terjadi pada suhu 10

o

C hingga 40 oC, dengan aktivitas sekitar 94% (40 oC) hingga 100% (30 oC), namun pada suhu lebih dari 40 oC terjadi penurunan aktivitas enzim. Suhu optimum aktivitas enzim glukanase memiliki kesamaan dengan hasil pada aktivitas relatif enzim glukanase, sehingga dapat dikatakan tetap stabil karena dalam reaksinya masih mengandung glukan sebagai substrat. Pada suhu optimum, tumbukan antara enzim dengan substrat sangat efektif sehingga kompleks enzim-substrat semakin mudah terbentuk dan produk yang dihasilkan juga meningkat. Untuk mempertahankan aktivitas enzim yang tinggi dan tetap stabil, maka suatu enzim harus mempertahankan konformasinya terhadap pengaruh suhu dan pH.

Aktivitas enzim terhadap suhu dipengaruhi oleh energi kinetik enzim dan substrat untuk saling bertumbukan. Peningkatan suhu menyebabkan energi kinetik meningkat. Pada suhu rendah sebelum suhu optimum aktivitas enzim glukanase lebih rendah daripada aktivitas enzim glukanase pada suhu optimum. Hal tersebut terjadi karena tumbukan antara enzim dengan substrat intensitasnya masih rendah, sehingga produk yang dihasilkan sedikit. Peningkatan suhu hingga suhu optimum meningkatkan tumbukan yang terjadi antara enzim dengan substrat, sehingga aktivitas enzim juga meningkat.

Secara umum, faktor yang turut mempengaruhi peningkatan aktivitas enzim adalah tingkat derajat keasaman (pH). Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim glukanase menunjukkan aktivitas enzim glukanase meningkat hingga mencapai pH 6 (Gambar 14).

(A) (B)

(36)

24

Hasil analisis menunjukkan bahwa pH 6 merupakan pH optimum aktivitas enzim glukanase B. cepacia. Suryadi et al. (2014) melaporkan bahwa pH 6 juga merupakan pH optimum untuk aktivitas maksimal enzim glukanase pada bakteri Pseudomonas aeruginosa C 32a. Hasil yang sama juga dilaporkan bahwa pH 6 adalah pH optimal aktivitas glukanase pada Pseudomonas sp. CL3 (Cheng dan Chang 2011). Aktivitas relatif enzim glukanase dalam titik maksimal terjadi pada pH 5 – 7, dengan aktivitas sekitar 87% (pH 5 dan 7) hingga 100 % (pH 6), namun pada pH lebih dari 7 terjadi penurunan aktivitas enzim. pH optimum aktivitas enzim glukanase memiliki kesamaan dengan hasil pada aktivitas relatif enzim glukanase, sehingga dapat dikatakan tetap stabil karena dalam reaksinya masih mengandung glukan sebagai substrat.

Pada kondisi pH optimum terjadi proses ionisasi asam-asam amino yang berada pada sisi aktif enzim sehingga akan terbentuk interaksi antara substrat dengan enzim membentuk kompleks substrat-enzim dan menghasilkan produk secara maksimal. Setelah pH mencapai optimum (pH 6), peningkatan pH menyebabkan terjadinya penurunan aktivitas glukanase. Aktivitas glukanase di luar pH optimum menurun karena enzim mengalami denaturasi. Pada pH rendah, enzim terprotonasi dan kehilangan muatan negatif, sedangkan pada pH tinggi menyebabkan substrat terionisasi sehingga kehilangan muatan positif.

4

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Kloning gen penyandi β-1,4-glukanase dari isolat B. cepacia strain Biogen CCE76 telah berhasil dilakukan ke dalam vektor pGEM-T Easy dan ditransformasikan ke dalam sel inang E. coli DH5α dan diperoleh plasmid rekombinan dengan ukuran gen insert 1300 bp. Sekuen yang dihasilkan berdasarkan hasil BlastN dan BlastX menunjukkan bahwa gen tersebut memiliki tingkat homologi tinggi dengan gen endo-1,4-D-glucanase pada Burkholderia mallei (99%) dan Burkholderia pseudomallei (98%) dan terbukti mengandung conserved domain enzim Glyco Hydro superfamily 8 sebagai ciri khas kelompok enzim glikohidrolase dan endoglukanase. Pada analisis proteomik signal peptide

menunjukkan nilai cleavage site posisi 23 dan 24 pada asam amino AAA-AE.

Gen penyandi β-1,4-glukanase dari isolat B. cepacia strain Biogen CCE76 mampu diekspresikan oleh E. coli BL21(DE3)-pLyss dengan ukuran protein fusi glukanase sekitar 65 kDa. Aktivitas spesifik enzim glukanase hasil pemurnian mencapai 1207.98 U mg-1. Aktivitas optimum terjadi pada suhu 40 oC dan pH 6, serta aktif pada suhu 10 – 40 oC dan pH 5 – 7.

Saran

(37)

25

DAFTAR PUSTAKA

Adams DJ. 2004. Fungal cell wall chitinase and glucanase. Microbiology. 150:2029-2035.

Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. 1990. Basic Local Alignment Search Tool. J Mol Biol. 215:403-410.

Arnold K, Bordoli L, Kopp J, Schwede T. 2006. The SWISS-MODEL workspace: a web-based environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics. 22:195-201.

Asan M dan Ozcan N. 2007. Expression of (β-1,3-1,4) glucanase gene in Streptococcus salivarius subsp. thermophillus. Turk J. Vet. Anim. Sci. 31:319-324.

Azhahianambi P, Ghosh S, Kumar A, Suryanaraya VVS. 2008. Cost effectiveness of colony lysis and colony PCR methods for screening of recombinant Escherichia coli colonies—a comparative study. Indian J. Exp. Biol. 46(10):731-735.

Bacon CW, Hinton DM. 2006. Growth-inhibiting effects of concentrations of fusaric acid on the growth of Bacillus mojavensis and other biocontrol Bacillus species. Journal Applied microbiology. 100: 185-194.

Bintang M. 2010. Biokimia: Teknik Penelitian. Jakarta: Erlangga.

Budiani A, Susanti I, Mawardi S, Santoso DA, Siswanto. 2004. Ekspresi β -1,3 glukanase dan kitinase pada tanaman kopi arabika (Coffea arabica L.) tahan dan rentan karatdaun. Menara Perkebunan. 72(2):57-71.

Brown TA. 2010. Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction 6thEd. Wiley-Blackwell. ISBN 978-1-4051-8173-0.

Campbell NA, Reece JB, Mitchell LG. 2009. Biology, Eighth Edition. Pearson Benjamin Cummings. San Fransisco: USA.

Celestino KRS, Cunha RB, Felix CR . 2006. Characterization of a β-glucanase produced by Rhizopus microsporus var. microsporus and its potential for application in the brewing industry. BMC Biochemistry. 7: 23-31.

Cheng CL dan Chang JS. 2011. Hydrolysis of lignocellulosic feedstock by novel celluloses originating from Pseudomonas sp. CL3 for fermentative hydrogen production. Bioresour Technol. 102(18):8628-8634.

Claverie JM, Notredame C. 2007. Bioinformatics for Dummies 2ndEd. New York: Wiley Publishing, Inc.

Doxey AC, Yaish MW, Moffatt BA, Griffith M, McConkey BJ. 2007. Functional divergence in the Arabidopsis β-1,3-glucanase gene family inferred by phylogenetic reconstruction of expression state. Mol Biol Evol. 24:1045-1055. Fathin MF. 2012. Pemurnian enzim β-1,3-1,4 glukanase dari Bakteri Burkholderia

cepacia Endofitik Padi [Skripsi]. Bogor: Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Geer RC, Gonzales NR, Gwadz M, Hurwitz DI, Lanczycki CJ, Lu F, Lu S, Marchler GH, Song JS, Thanki N, Yamashita RA, Zhang D, Bryant SH. 2013. CDD: conserved domains and protein three-dimensional structure. Nucleic Acids Res. 41:348-352.

(38)

26

Helianti I. 2010. Materi Workshop biologi molekuler kloning dan transformasi pada Bacillus. Tanggerang: Laptiab BPPT.

Innis MA, Gelfand DH. 1990. Optimization of PCRs in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. San Diego: Academic Press.

Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG. 2007. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics. 23:2947-2948.

La Vallie ER, DiBlasio EA, Kovacic S, Grant KL, Schendel PF, McCoy JM. 1993. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Nature Biotechnology. 11(2):187-193. Murray RK, Granner, DK, Mayes, PA, Rodwell, VW. 2009. Biokimia Harper.

Brahm U. Pendit, penerjemah; Nanda W et al., editor. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC. Terjemahan dari: Harper’s illustrated biochemistry, 27thed. Ed ke-27.

Natsir H. 2014. Optimasi Produksi dan Karakterisasi Sifat Biokimiawi Enzim Glukanase dari B. licheniformis HSA3-1a Asal Sumber Air Panas, Sulawesi Selatan. Seminar Nasional Uin Syarif Hidayatullah Jakarta 2014-05-30 [Internet]. [diunduh 2014 Sept 19]; [belum terbit]. Tersedia pada http://repository.unhas.ac.id/handle/123456789/9943.

Nelson DL, Cox MM. 2008. Lehninger Principles of Biochemistry. New York: W.H. Freeman and Company.

Nishiyama Y, Kuga S, Sato S. 2001. Role of the putative membrane-bound putative endo-β-D-1,4-glucanase KORRIGAN in cell elongation and cellulose synthesis in Arabidopsis. Plant Cell Physiology. 42:251-263.

Novagen. 2006. pET System Manual. EMD Biosciences, Inc., an affiliate of Merck KGaA, Darmstadt: Jerman, 80 hlm.

Omarjee J, Balandreau J. 2005. The Application of Flourecent Single-Strand Conformation Polymorphism (F-SSCP)To Assess The Diversity of Burkholderia Species in Sugarcane Rhizosphere. Proceedings of The 79th Annual Congress of South Africa Sugar Technologist Association; Mount Edgecombe, 19-22 Juli 2005. Mount Edgecombe: South Africa Sugar Technologist Association. hlm 239-241.

Petersen TN, Brunak S, Von Heijne G, Nielsen H. 2011. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nat Methods. 8:785-786.

Sambrook J, Russell DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rdEd. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Shaikh ZJ. 2005. Cloning and characterization of endoglucanase genes from Trichoderma spp. [tesis]. Dharwad: Department of Biotechnology, University of Agricultural Sciences, Darward.

Shetty NP, Jens DJ, Anne K, Christine F, Naomi G, Andreas B, David BC, Hans JLJ. 2009. Effect of β-1,3-glucan from Setoria tritici on structural defence responses in wheat. Journal of Experimental Botany. 60:4287-4300.

(39)

27 Tamura K, Petersen D, Stecher G, Nei M, Kumar S. 2011. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol. 28:2731-2739. Wood PJ, Weisz J. 1984. Use of calcoflour in analysis of oat beta-D-glukan.

Cereal Chem. 61: 73-75.

Xiong J. 2006. Essential Bioinformatics. New York: Cambridge University Press. Yu-Ling S, Yi-Juain L, Chih-Sheng L. 2011. Soluble expression and production of rabbit neutrophil peptide-1 in Escherichia coli. Romanian Biotechnological Letters. 16(5):6618-6629.

Yuwono T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Yogyakarta: Penerbit Andi.

Zeng YF et al. 2009. Simultaneous refolding, purification, and immobilization of recombinant Fibrobacter succinogenes 1,3-1,4-β-glucanase on artificial oil bodies. J Chem Technol Botechnol. 84:1480-1485.

(40)

28

(41)

29 Lampiran 1 Diagram alir penelitian

(A) Tahap awal

(42)

30

(C) Subkloning gen β-1,4-glukanase ke dalam vektor ekspresi

(43)

Gambar

Gambar 3 Pohon filogenetik  gen penyandi  β-1,4-glukanase
Tabel  3  Hasil  Prediksi  Beberapa  Parameter  Gen  β-1,4-glukanase  menggunakan
Gambar 5  Struktur sekunder 4q2b.2.A (Endo-1,4-beta-D-glucanase)
Gambar 10   Hasil SDS-PAGE sampel protein dari supernatan (M= Marker;  1 =  rekombinan 1 diinduksi IPTG; 2 = rekombinan 1 tanpa induksi; 3 =  rekombinan 2 diinduksi;  4 = rekombinan 2 tanpa induksi; 5 =  DE3  membawa pET diinduksi; 6 = DE3 membawa pET tanp
+3

Referensi

Dokumen terkait

Lama Kota Langsa, Aceh pada tahun 2017 meng- hasilkan model akhir yaitu umur, riwayat keluar- ga, pola makan dan indeks massa tubuh dengan faktor dominan yang menjadi penyebab DM tipe

Pada pemeriksaan ultrasonografi (USG) dapat dilihat adanya cairan dalam rongga peritoneum yang bebas atau terfiksasi (dalam bentuk kantong-kantong) menurut Rama

data pada data warehouse sesuai kebutuhan atau tujuan instansi/ perusahan. Selanjutnya dengan aplikasi data mining dapat diadapat data sesuai dengan

Abstract: Dampak globalisasi di Kawasan Danau Toba telah menyebabkan hilangnya identitas kawasan yang telah mengakibatkan penurunan nilai dan image kawasan. Tujuan penelitian ini

• Setelah semua pertanyaan selesai dibahas, guru meminta siswa mendata aturan- aturan apa saja yang harus dilakukan untuk menjaga kebersihan di lingkungan rumah

Melihat uraian tersebut, maka dapat dikatakan bahwa kualitas pelayanan yang dilakukan pemerintah sangatlah penting, yang dalam hal ini Dinas Perhubungan, Komunikasi

Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan, didapat data sebagai berikut: (1) perencanaan program kelompok bina usaha (KBU) handycraft dilihat dari kebutuhan,