61
PENINGKATAN APOPTOSIS SEL GERMINAL SETELAH PENYUNTIKAN
ANDROGEN/PROGESTIN DAN HUBUNGANNYA DENGAN PENURUNAN
KONSENTRASI SPERMATOZOA
Syafruddin Ilyas dan Nursal
Staf Pengajar FMIPA USU
Abstrak
Telah dilakukan penelitian pemberian hormon androgen/progestin pada tikus Sprague Dawley untuk melihat adanya penurunan konsentrasi spermatozoa melalui peristiwa apoptosis pada sel germinal. Metode eksperimen dan rancangan acak lengkap dengan 3 perlakuan dan 5 ulangan. Perlakuan terdiri dari praperlakuan (minggu -4 sampai 0), penekanan (minggu ke 0 sampai 24) dan pemeliharaan (minggu ke 24 sampai 36). Dosis pemberian androgen 2,5 mg (interval 6 minggu) dan progestin 1,25 mg (interval 12 minggu) selama 36 minggu.Pemberian androgen/progestin ternyata dapat meningkatkan apoptosis sel germinal secara signifikan (P<0,05) sehingga menurunkan konsentrasi spermatozoa sampai azoospermia. Hubungan apoptosis vs konsentrasi spermatozoa adalah sangat signifikan (P<0,01) dengan persamaan garis regresi linear Y=125jt-1,6jt.X dan r= -0,75 dengan kuat hubungan (korelasi) r= -0,60 (P<0,01). Lokalisasi apoptosis sel germinal akibat pemberian androgen/progestin menyebar pada spermatogonia, spermatosit dan pada tahap pemeliharaan banyak terdapat pada spermatid.
Kata kunci:Apoptosis, androgen/progestin, spermatozoa
PENDAHULUAN
Spermatogenesis merupakan proses dinamik yang sangat membutuhkan adanya sinkronisasi yang melibatkan tahap-tahap pembelahan dan diferensiasi dengan kecepatan pemulihan untuk mengontrol efisiensinya. Hilangnya sel yang telah dijelaskan dari terdahulu, ternyata tidak terlepas dari konsep apoptosis atau programmed cell death (Allan at al.,
1992). Di antara sel germinal, spermatogonia, dan spermatosit adalah target penting dari apoptosis baik pada kondisi fisiologinya atau ekstrafisiologinya (radiasi, kemoterapi, hipertermia, dan pengurangan hormonal). Ekspterimen pertama telah mencoba mengkombinasi hipofsektomi atau antagonis GnRH dengan suplementasi hormonal terhadap efek demonstrasi dan promosi dari FSH dan testosteron pada pertahanan hidup sel germinal (Henriksen et al., 1996). Aksi testosteron pada apoptosis sel germinal, bergantung pada kondisi eksperimental dan tahap spermatogenetic telah pernah dilaporkan (Troiano et al., 1994). Caspase 3 akhir-akhir ini telah dilaporkan juga terlibat pada apoptosis ketika testosteron dikurangi (Kim et al., 2001). Eksperimen kriptorkhidisme telah dilaporkan mengubah apoptosis sel germinal pada beberapa tahap spesifik pada tikus (tahap XII–XIV) dan melibatkan faktor-faktor lokal (Shikone, 1994). Sehubungan dengan itu, tujuan penelitian ini adalah melihat bagaimana
hubungan hormon, khususnya hormon androgen/ progestin yang telah terbukti efektif pada percobaan klinis di Indonesia terhadap gambaran apoptosis sel germinal pada tikus.
BAHAN DAN METODE PENELITIAN
Penelitian dilakukan dengan metoda eksperimen dan rancangan acak lengkap dengan delapan puluh ekor tikus jenis Sprague Dawley (dari Balai POM Depkes Jakarta) dibagi dalam kelompok perlakuan dan kontrol. Kelompok perlakuan dibagi 3 kelompok. Pertama, kelompok praperlakuan (minggu ke-4 sampai 0); kedua, kelompok penekanan (minggu ke-0 sampai 24) dan ketiga, kelompok pemeliharaan (minggu ke-24 sampai 36). Penyuntikan androgen (TU) 2,5 mg dengan interval 6 minggu dan progestin (DMPA) 1,25 mg serta dilakukan selama 36 minggu. Penghitungan spermatozoa kauda epididimis dilakukan dengan mengambil dan diencerkan dengan menambahkan 250 μL NaCl 0,95%. Kemudian dilarutkan 1:20 dengan larutkan George dan diambil 1 tetes untuk dihitung pada kamar hitung Neubaeur. Hasil hitungan (dari 10 kotak kecil kamar hitung) dijumlahkan dan dikali dengan faktor pengalinya, yakni 2,5 x 20 x 10.000 x 4.
Syafruddin Ilyas dan Nursal JURNAL PENELITIAN REKAYASA
Volume 1, Nomor 1 Juni 2008
62
Testis yang diambil dari tikus difiksasi dengan Bouin dan kemudian didehidrasi dengan alkohol bertingkat dan dijernihkan dengan benzil benzoat kemudian dimasukkan dalam benzol sebelum diembedding dalam parafin. Potongan jaringan 6 μm ditempelkan pada frosted slide yang telah di coated dengan poly-l-lysine (Sigma) untuk pengecatan TUNEL (apoptosis) yang menggunakan
In Situ Death Detection Kit, POD (Cat No. 11 684 817 001 – Roche). Jaringan testis di counterstain
dengan haematoxylin mayer’s. Untuk visualisasi digunakan diaminobenzidin (DAB) dan sel germinal yang apoptosis akan berwarna coklat. Penghitungan apoptosis sel germinal dilakukan pada ±400 tubulus seminiferus dan dibagi menjadi 3 kategori, yakni (1) tubulus tanpa apoptosis sel germinal, (2) tubulus dengan apoptosis sel germinal 1-3 dan (3) tubulus seminiferus dengan apoptosis >3. Data dikalkulasi sebagai persentase dari jumlah total dan dihitung rata-rata±SEM nya.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan, didapatkan hasil sebagai berikut:
- Apoptosis sel germinal
Pada Gambar diperlihatkan adanya peningkatan apoptosis sel germinal mulai dari minggu ke 12 sampai minggu ke 36 (A) dan (B) jika data dikelompokkan menjadi 3 kelompok yakni praperlakuan, penekanan, dan pemeliharaan.
- Konsentrasi spermatozoa
Konsentrasi spermatozoa setelah perlakuan dapat dilihat pada Gambar 2 di bawah ini. Gambar 2 (A) merupakan konsentrasi spermatozoa setelah pemberian androgen/progestin selama 36 minggu dan Gambar 2 (B) merupakan data yang dikumpulkan berdasarkan kelompok perlakuan yakni praperlakuan, penekanan, dan pemulihan.
- Regresi linear apoptosis sel germinal dengan konsentrasi spermatozoa
Pada Gambar 3 terlihat hubungan regresi linear antara apoptosis sel germinal dengan konsentrasi spermatozoa.
- Korelasi apoptosis sel germinal dengan konsentrasi spermatozoa
Pada Tabel 1 dapat dilihat korelasi antara apoptosis sel germinal dengan konsentrasi spermatozoa.
Tahap pemberian Androgen/ProgestIn (minggu)
%
Praperlakuan Penekanan Pemeliharaan
K K P K P P
Gambar 1. (A) Rata-Rata Sel Germinal TUNEL (+)/400 Tubulus Seminiferus Selama Pemberian Androgen/ Progestin (Minggu) dan (B) Data A Dikelompokkan Berdasarkan Tahap Perlakuan
0
Lama Pemberian Androgen/Progestin (minggu)
K Tahap Pemberian Androgen/Progestin (minggu)
Ko
Gambar 2. (A) Rata-Rata Konsentrasi Spermatozoa Selama Pemberian Androgen/Progestin (Minggu) dan (B) Data A Dikelompokkan Berdasarkan Tahap Perlakuan
Syafruddin Ilyas dan Nursal JURNAL PENELITIAN REKAYASA
Volume 1, Nomor 1 Juni 2008
63
Rata-rata sel germinal TUNEL (+) 20 40 60 80 100 0
K
o
n
s
e
n
tr
a
s
i
S
p
e
rm
a
to
z
o
a
(J
t/
m
L
)
200
100
0
-100
Y = 125jt - 1,6jtX (r= -0,75;P<0,05 )
Gambar 3. Regresi Linear antara Rata-Rata Apoptosis Sel Germinal vs Konsentrasi Spermatozoa (jt/mL) Selama 36 Minggu
Tabel 1. Hasil Analisis Korelasi antara Apoptosis Sel Germinal vs Konsentrasi Spermatozoa Correlations
TUNEL Kons.Sperma
Spearman's rho TUNEL Correlation Coefficient 1,000 -0,554** Sig. (2-tailed) . 0,001 N 35 35 Kons.Sperma Correlation Coefficient -0,554** 1,000 Sig. (2-tailed) 0,001 . N 35 35
** Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).
K
o
n
tr
o
l
Pe
rl
a
k
u
a
n
C
A
B
E
F
D
Praperlakuan Penekanan Pemeliharaan
Gambar 4. Lokalisasi Sel Germinal TUNEL (+) pada Tahap Praperlakuan (A, Kontrol; D, Perlakuan), Penekanan (B, Kontrol; E, Perlakuan), dan Tahap Pemeliharaan (C, Kontrol; F, Perlakuan), Tanda Panah Kuning = Sel Germinal Tidak Apoptosis, Panah Biru dan Merah = Sel Germinal yang Apoptosis, – 25 um
Syafruddin Ilyas dan Nursal JURNAL PENELITIAN REKAYASA
Volume 1, Nomor 1 Juni 2008
64
- Lokalisasi apoptosis sel germinal
Pada Gambar 4 terlihat lokalisasi apoptosis sel germinal dan perbandingan antara perlakuan dengan kontrol.
Pembahasan
Pemberian androgen/progestin cukup efektif dalam menekan konsentrasi spermatozoa. Penekanan tersebut sangat berhubungan dengan meningkatnya apoptosis sel germinal mulai dari awal perlakuan (12 minggu) sampai perlakuan berakhir (minggu ke 36) (Gambar 1A). Peningkatan apoptosis lebih jelas terlihat ketika data dikelompokkan (Gambar 1B). Peningkatan tersebut kemungkinan karena adanya pengaruh kombinasi hormon yang disuntikkan sehingga testosteron intratestikular menjadi menurun karena adanya negatif feed back poros hipotalamus-hipofisis dan testis. Pengurangan testosteron intratestikular menyebabkan terganggunya proses spermatogenesis karena testosteron berfungsi pada proliferasi dan diferensiasi sel germinal. Seperti laporan Meistrich and Shetty (2003), bahwa rendahnya testosteron dapat menghambat penyempurnaan spermatogenesis (Meistrich, M.L and Gunapala Shetty, 2003). Testosteron intratestikular yang kurang juga dapat memicu terjadinya apoptosis karena ketika testosteron meningkat maka terjadi reduksi apoptosis (Vigier et al., 2004). Terdapat hubungan yang signifikan (P<0,01; Gambar 3) dan korelasi negatif kuat dan signifikan (r= -0,60, P<0,01; Tabel 1) antara apoptosis sel germinal dengan konsentrasi spermatozoa. Apoptosis yang terjadi terlihat pada beberapa tahap spermatogenesis, seperti spermatogonia, spermatosit, dan spermatid (Gambar 4). Chang et al., (2004) melaporkan bahwa sel sertoli yang kurang suplai testosteron karena dibuat menjadi AR knockout (KO) menyebabkan terjadinya apoptosis pada spermatosit dan spermatid. Telah diketahui bahwa spermatid merupakan cikal bakal spermatozoa. Pengurangan spermatid akan berefek langsung pada spermatozoa yang dihasilkan.
Kesimpulan
Berdasarkan dari hasil pengamatan terdapat peningkatan apoptosis sel germinal setelah pemberian androgen/progestin sehingga menurunkan konsentrasi spermatozoa. Apoptosis sel germinal dapat terjadi pada spermatogonia, spermatosit, dan
spermatid. Adanya regresi linear dan korelasi negatif yang signifikan antara apoptosis sel germinal dengan konsentrasi spermatozoa.
DAFTAR PUSTAKA
Allan, D.J., B.V. Harmont, S.A. Roberts. 1992. Spermatogonial apoptosis has three morphologically recognizable phases and shows no circadian rhythm during normal spermatogenesis in the rat, Cell Prolif. 25 241–250.
Chang, C., Y.T. Chen, S.D. Yeh, Q. Xu, R.S. Wang, F. Guillou, H. Lardy, and S. Yeh. 2004. Infertility with defective spermatogenesis and hypotestosteronemia in male mice lacking the androgen receptor in Sertoli cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101:6876–6881.
Henriksen, K., et al., 1996. In vitro, follicle-stimulating hormone prevents apoptosis and stimulates deoxyribonucleic acid synthesis in the rat seminiferous epithelium in a stage-specific fashion, Endocrinology 137. 2141– 2149.
Kim, J.M., et al., 2001. Caspase-3 and caspase-activated deoxyribonuclease are associated with testicular germ cell apoptosis resulting from reduced intratesticular testosterone, Endocrinology 142; 3809– 3916.
Meistrich, M.L and Gunapala Shetty. Inhibition of Spermatogonial Differentiation by Testosterone. Journal of Andrology, March/April 2003. Vol. 24, No. 2.
Shikone, T., H. Billig, A.J.W. Hsueh. 1994. Experimentally induced cryptorchidism increases apoptosis in rat testis, Biol. Reprod. 51; 865–872.
Troiano, L., et al., 1994. Apoptosis and spermatogenesis: evidence from an in vivo model of testosterone withdrawal in the adult rat, Biochem. Biophys. Res. Commun. 202 1315– 1321.
Vigier, M., M Weiss, M H Perrard, M Godet and P Durand. 2004. The effects of FSH and of testosterone on the completion of meiosis and the very early steps of spermiogenesis of the rat: an in vitro study Journal of Molecular Endocrinology; 33, 729–742.
