AKTIVITAS ANTIOKSIDASI DAN ANTIKANKER
EKSTRAK KULIT BATANG LANGSAT
[Lansium Domesticum L.]
MOKOSULI YERMIA SEMUEL
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Aktivitas antioksidasi dan antikanker ekstrak kulit batang Langsat (Lansium domesticum L.) adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Februari 2008
ABSTRACT
MOKOSULI YERMIA SEMUEL. Antioxidation and anticancer activity of tree barks of Langsat (Lansium domesticum L.). Under direction of MARIA BINTANG and MEGA SAFITHRI.
Oxidative stress by radical oxygen species (ROS) caused cell damaged and cancer. The objective of this research was to know the activity of etanol extract of tree barks from Langsat (Lansium domectisumL.) dried (KBLK) and wet (KBLB) as antioxidation and anticancer. This research consisted of four steps, the first step was extration and phytochemistry analysis using Harborne method. The second step was Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) to know the toxicity of the extract using Mc Laughlin method. The third step was examination of antioxidation activity using DPPH method and TBA method and the last step was examination of anticancer activity of the extract using murine leukimia P388 cell line. The result of this research showed that etanol extract of tree barks of L. domesticum L. had antioxidation and anticancer activity. The IC50 of BSLT was 93.48 µg/ml and 100,37 µg/ml respectively. The IC50 of antioxidation activity using DPPH method was 174,19 µg/ml and 205,38 µg/ml respectively. Inhibition of linoleat oxidation by TBA method was 82,83% and 85,22%. The IC50 of anticancer test was 12.00 µg/ml and 15.48 µg/ml. The result of phytochemistry analysis showed KBLK and KBLB have alkaloid, flavonoid, saponin and tanin compounds. The conclusion of this experiment ware etanol extract of KBLK and KBLB have a strong anticancer and antioxidation activity.
RINGKASAN
MOKOSULI YERMIA SEMUEL. Aktivitas antioksidasi dan antikanker ekstrak kulit batang langsat (Lansium domesticum L.) dibimbing oleh MARIA BINTANG dan MEGA SAFITHRI.
Kematian akibat kanker di Amerika Serikat menempati posisi kedua setelah penyakit jantung. Diperkirakan satu dari tiga orang di AS mengalami perkembangan kanker dalam tubuhnya (Cooper, 1993). Kanker menyebabkan lebih dari 500.000 kematian tiap tahun di Amerika Serikat (Katzung, 1995). Insiden kanker di Indonesia diperkirakan 100 per 100.000 penduduk per tahun atau sekitar 200.000 penduduk per tahun (Puspitasari et al. 2003).
Akhir-akhir ini upaya pengobatan kanker dengan kemoterapi banyak dilakukan. Bahan kemoterapi dari tumbuhan mempunyai prospek sebagai penghambat kanker yang lebih sedikit efek sampingnya. Distribusi senyawa fitokimia yang memiliki aktivitas antikanker sangat luas dalam tumbuh-tumbuhan. National Cancer Institute melakukan skreening sekitar 114.000 ekstrak tumbuhan dari tahun 1960 sampai 1982 dan menemukan sekitar 35.000 sampel tumbuhan memiliki aktivitas antikanker. Tahun 1991 sekitar 28.000 sampel tumbuhan dari seluruh dunia telah dikoleksi karena memiliki aktivitas antikanker. Sekitar 62 % dari 87 jenis obat antikanker berasal dari bahan alam (Cragg, 1993). Salah satu tanaman asli Indonesia yang diduga memiliki potensi anti kanker adalah langsat (L. domesticum L). Secara empiris tanaman ini telah digunakan masyarakat pedalaman Kalimantan dan Minahasa sebagai obat antimalaria, tumor dan kanker. Biji tanaman ini secara tradisional telah digunakan untuk mengobati penyakit parasit malaria. Namun belum ada laporan ilmiah pemanfaatan ekstrak bagian tanaman ini sebagai obat antikanker. Kearifan budaya etnomedikal masyarakat Indonesia yang diperoleh turun temurun perlu dilestarikan dan dikembangkan sehingga dapat bermanfaat bagi kesejahteraan manusia. Untuk membuktikan secara ilmiah dilakukan penelitian dengan tujuan mengetahui kandungan senyawa fitokimia yang memiliki aktivitas antioksidan dan antikanker dari ekstrak kulit pohon langsat [L. domesticum L] dan mengetahui aktivitas in vitro antioksidasi dan aktivitas antikanker ekstrak kulit pohon Langsat [L. domesticum L.] pada sel kanker murine leukimia P-388.
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka IPB dan Laboratorium Kimia Bahan Alam Institut Teknologi Bandung. Penelitian dimulai bulan September 2007 sampai dengan Januari 2008. Kulit batang langsat (L. domesticum L.) diperoleh dari perkebunan rakyat Minahasa Utara propinsi Sulawesi Utara. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain pareaksi Dragendorff, pareaksi Mayers, pareaksi Wagner, etanol 95%, HCL, logam Mg, Na2CO3, FeCl3, H2SO4 dan anhidrida asetat. 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), butil hidroksi toluena (BHT), NaOH 10 % asam asetat anhidrida, kertas saring, air bebas ion, etanol 75%, etanol absolut, asam linoleat, buffer fosfat 0.1 M pH 7, Fe CL2.4H2O, HCL, amonium tiosianat, α-tokoferol, 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP) 6 M, asam tiobarbiturat (TBA), asam asetat 50 % dan asam trikloroasetat (TCA) 20 %. Sel kanker murine leukimia P-388, media RPMI, serum fetal bovine,
analitik, pH indikator, botol gelap berulir, inkubator, sentrifuse model 800, spektrofotometer UV-Vis U-2800 Hitatchi, perangkat sumur kultur, mikropipet dan microplate reader.
Penelitian ini terdiri atas empat tahap yaitu : (1) Ekstraksi dan analisis fitokimia (2) Uji toksisitas metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) (3) Analisis potensi antioksidasi in vitro menggunakan metode DPPH dan metode TBA dan (4) Analisis potensi antikanker secara in vitro menggunakan sel murine leukimia P388.
Hasil analisa fitokimia pada ekstrak etanol 70% dan kloroform:air menunjukkan adanya senyawa fitokimia golongan alkaloid, flavonoid, saponin dan tanin. Senyawa triterpenoid dan steroid hanya dalam intensitas yang sedikit. Berdasarkan nilai LC50 dari hasil uji BSLT ekstrak KBLK EtOH (LC50 93,48 ppm) dan KBLB (LC50 100,37 ppm) menunjukkan aktivitas toksisitas yang kuat. Suatu ekstrak tumbuhan berpotensi antikanker dengan uji BSLT menurut NCI jika nilai LC50<1000 ppm. Hasil analisis antioksidasi dengan metode DPPH ekstrak KBLK EtOH dan KBLB EtOH (IC50 174,19 ppm dan 205,38 ppm) menunjukkan aktivitas peredaman radikal bebas yang kuat dibandingkan dengan kontrol BHT (IC50 398,45). Dengan metode TBA ekstrak KBLK EtOH dan KBLB EtOH juga menunjukkan aktivitas penghambatan oksidasi asam linoleat yang kuat pada konsenterasi 200 ppm (82,83% dan 85,22%) dibandingkan dengan kontrol α -tokoferol pada konsenterasi yang sama (77,81%).
Pengujian aktivitas antikanker menunjukkan bahwa ekstrak KBLK EtOH dan KBLB EtOH memiliki aktivitas sitotoksik yang kuat pada sel murine leukimia P388 yaitu masing-masing 12 ppm dan 15,48 ppm. Menurut NCI ekstrak kasar digolongkan berpotensi antikanker apabila nilai IC50< 20 ppm. Terdapat hubungan aktivitas antioksidasi, toksisitas BSLT, aktivitas antikanker dan kandungan fitokimia ekstrak. Aktivitas antioksidasi dan antikanker dari ekstrak KBLK EtOH dan KBLB EtOH disebabkan oleh kandungan alkaloid, flavonoid saponin dan tanin yang terdapat pada ekstrak tersebut. Ekstrak kulit batang langsat berpotensi dikembangkan sebagai sumber senyawa fitokimia antikanker.
© Hak cipta milik IPB, tahun 2008
Hak cipta dilindungi undang-undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber.
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu makalah.
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.
AKTIVITAS ANTIOKSIDASI DAN ANTIKANKER
EKSTRAK KULIT BATANG LANGSAT
[Lansium Domesticum L.]
MOKOSULI YERMIA SEMUEL
Tesis
Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Biokimia
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul : Aktivitas Antioksidasi dan Antikanker Ekstrak Kulit Batang Langsat [Lansium domesticum L.]
Nama : Mokosuli Yermia Semuel NRP : G851060061
Disetujui :
Komisi Pembimbing
Prof. Dr. drh. Maria Bintang, MS Mega Safithri, S.Si, M.Si Ketua Anggota
Diketahui :
Ketua Program Studi Biokimia Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Prof.Dr.drh.Maria Bintang, MS Prof.Dr.Ir.Khairil Anwar Notodiputro, MS
PRAKATA
Saya sangat bersyukur kepada TUHAN karena tanpa anugerahNya saya tidak pernah mendapat kesempatan studi di Institut Pertanian Bogor dan dapat menyelesaikan tugas akhir program magister biokimia. Suatu kebanggaan bagi saya untuk dapat belajar biokimia di Institut Pertanian Bogor. Atas ketertarikan penulis dalam bidang pemanfaatan bahan tumbuhan sebagai sumber obat maka penulis melakukan penelitian tentang aktivitas antioksidasi dan antikanker ekstrak kulit batang Langsat [Lansium domesticum L.]. Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan September 2007 sampai awal Februari 2008.
Terima kasih dan penghargaan yang sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada Ibu Prof Dr. drh. Maria Bintang, MS dan Ibu Mega Safithri, SSi, MSi selaku pembimbing atas segala arahan dan bimbingan selama penelitian serta kepercayaan dan kesabaran dalam membimbing sampai terselesaikannya penyusunan tesis ini. Ucapan terima kasih disampaikan kepada Rektor Universitas Negeri Manado bapak Prof.Drs.J.L.L.Lombok,SH yang memberikan kesempatan belajar di IPB Bogor dengan biaya BPPS Direktorat Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional.
Semasa studi ada banyak orang yang membantu saya namun tidak ada yang melebihi bantuan isteri tercinta Reinny S. Tuegeh, SSi yang dengan tekun dan sabar memberi semangat serta mendoakan keberhasilan studi juga orang tua yang turut menopang dalam doa. Kepada teman-teman Biokimia angkatan 2006 disampaikan terima kasih atas bantuan dan dukungan selama studi. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Februari 2008
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Tambun Kabupaten Bolaang Mongondow pada tanggal 21 Maret 1980 dari Ayah Benyamin Gayus Mokosuli dan Ibu Mien Ritha Suoth. Penulis adalah putera pertama dari tiga bersaudara.
AKTIVITAS ANTIOKSIDASI DAN ANTIKANKER
EKSTRAK KULIT BATANG LANGSAT
[Lansium Domesticum L.]
MOKOSULI YERMIA SEMUEL
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Aktivitas antioksidasi dan antikanker ekstrak kulit batang Langsat (Lansium domesticum L.) adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Februari 2008
ABSTRACT
MOKOSULI YERMIA SEMUEL. Antioxidation and anticancer activity of tree barks of Langsat (Lansium domesticum L.). Under direction of MARIA BINTANG and MEGA SAFITHRI.
Oxidative stress by radical oxygen species (ROS) caused cell damaged and cancer. The objective of this research was to know the activity of etanol extract of tree barks from Langsat (Lansium domectisumL.) dried (KBLK) and wet (KBLB) as antioxidation and anticancer. This research consisted of four steps, the first step was extration and phytochemistry analysis using Harborne method. The second step was Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) to know the toxicity of the extract using Mc Laughlin method. The third step was examination of antioxidation activity using DPPH method and TBA method and the last step was examination of anticancer activity of the extract using murine leukimia P388 cell line. The result of this research showed that etanol extract of tree barks of L. domesticum L. had antioxidation and anticancer activity. The IC50 of BSLT was 93.48 µg/ml and 100,37 µg/ml respectively. The IC50 of antioxidation activity using DPPH method was 174,19 µg/ml and 205,38 µg/ml respectively. Inhibition of linoleat oxidation by TBA method was 82,83% and 85,22%. The IC50 of anticancer test was 12.00 µg/ml and 15.48 µg/ml. The result of phytochemistry analysis showed KBLK and KBLB have alkaloid, flavonoid, saponin and tanin compounds. The conclusion of this experiment ware etanol extract of KBLK and KBLB have a strong anticancer and antioxidation activity.
RINGKASAN
MOKOSULI YERMIA SEMUEL. Aktivitas antioksidasi dan antikanker ekstrak kulit batang langsat (Lansium domesticum L.) dibimbing oleh MARIA BINTANG dan MEGA SAFITHRI.
Kematian akibat kanker di Amerika Serikat menempati posisi kedua setelah penyakit jantung. Diperkirakan satu dari tiga orang di AS mengalami perkembangan kanker dalam tubuhnya (Cooper, 1993). Kanker menyebabkan lebih dari 500.000 kematian tiap tahun di Amerika Serikat (Katzung, 1995). Insiden kanker di Indonesia diperkirakan 100 per 100.000 penduduk per tahun atau sekitar 200.000 penduduk per tahun (Puspitasari et al. 2003).
Akhir-akhir ini upaya pengobatan kanker dengan kemoterapi banyak dilakukan. Bahan kemoterapi dari tumbuhan mempunyai prospek sebagai penghambat kanker yang lebih sedikit efek sampingnya. Distribusi senyawa fitokimia yang memiliki aktivitas antikanker sangat luas dalam tumbuh-tumbuhan. National Cancer Institute melakukan skreening sekitar 114.000 ekstrak tumbuhan dari tahun 1960 sampai 1982 dan menemukan sekitar 35.000 sampel tumbuhan memiliki aktivitas antikanker. Tahun 1991 sekitar 28.000 sampel tumbuhan dari seluruh dunia telah dikoleksi karena memiliki aktivitas antikanker. Sekitar 62 % dari 87 jenis obat antikanker berasal dari bahan alam (Cragg, 1993). Salah satu tanaman asli Indonesia yang diduga memiliki potensi anti kanker adalah langsat (L. domesticum L). Secara empiris tanaman ini telah digunakan masyarakat pedalaman Kalimantan dan Minahasa sebagai obat antimalaria, tumor dan kanker. Biji tanaman ini secara tradisional telah digunakan untuk mengobati penyakit parasit malaria. Namun belum ada laporan ilmiah pemanfaatan ekstrak bagian tanaman ini sebagai obat antikanker. Kearifan budaya etnomedikal masyarakat Indonesia yang diperoleh turun temurun perlu dilestarikan dan dikembangkan sehingga dapat bermanfaat bagi kesejahteraan manusia. Untuk membuktikan secara ilmiah dilakukan penelitian dengan tujuan mengetahui kandungan senyawa fitokimia yang memiliki aktivitas antioksidan dan antikanker dari ekstrak kulit pohon langsat [L. domesticum L] dan mengetahui aktivitas in vitro antioksidasi dan aktivitas antikanker ekstrak kulit pohon Langsat [L. domesticum L.] pada sel kanker murine leukimia P-388.
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka IPB dan Laboratorium Kimia Bahan Alam Institut Teknologi Bandung. Penelitian dimulai bulan September 2007 sampai dengan Januari 2008. Kulit batang langsat (L. domesticum L.) diperoleh dari perkebunan rakyat Minahasa Utara propinsi Sulawesi Utara. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain pareaksi Dragendorff, pareaksi Mayers, pareaksi Wagner, etanol 95%, HCL, logam Mg, Na2CO3, FeCl3, H2SO4 dan anhidrida asetat. 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), butil hidroksi toluena (BHT), NaOH 10 % asam asetat anhidrida, kertas saring, air bebas ion, etanol 75%, etanol absolut, asam linoleat, buffer fosfat 0.1 M pH 7, Fe CL2.4H2O, HCL, amonium tiosianat, α-tokoferol, 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP) 6 M, asam tiobarbiturat (TBA), asam asetat 50 % dan asam trikloroasetat (TCA) 20 %. Sel kanker murine leukimia P-388, media RPMI, serum fetal bovine,
analitik, pH indikator, botol gelap berulir, inkubator, sentrifuse model 800, spektrofotometer UV-Vis U-2800 Hitatchi, perangkat sumur kultur, mikropipet dan microplate reader.
Penelitian ini terdiri atas empat tahap yaitu : (1) Ekstraksi dan analisis fitokimia (2) Uji toksisitas metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) (3) Analisis potensi antioksidasi in vitro menggunakan metode DPPH dan metode TBA dan (4) Analisis potensi antikanker secara in vitro menggunakan sel murine leukimia P388.
Hasil analisa fitokimia pada ekstrak etanol 70% dan kloroform:air menunjukkan adanya senyawa fitokimia golongan alkaloid, flavonoid, saponin dan tanin. Senyawa triterpenoid dan steroid hanya dalam intensitas yang sedikit. Berdasarkan nilai LC50 dari hasil uji BSLT ekstrak KBLK EtOH (LC50 93,48 ppm) dan KBLB (LC50 100,37 ppm) menunjukkan aktivitas toksisitas yang kuat. Suatu ekstrak tumbuhan berpotensi antikanker dengan uji BSLT menurut NCI jika nilai LC50<1000 ppm. Hasil analisis antioksidasi dengan metode DPPH ekstrak KBLK EtOH dan KBLB EtOH (IC50 174,19 ppm dan 205,38 ppm) menunjukkan aktivitas peredaman radikal bebas yang kuat dibandingkan dengan kontrol BHT (IC50 398,45). Dengan metode TBA ekstrak KBLK EtOH dan KBLB EtOH juga menunjukkan aktivitas penghambatan oksidasi asam linoleat yang kuat pada konsenterasi 200 ppm (82,83% dan 85,22%) dibandingkan dengan kontrol α -tokoferol pada konsenterasi yang sama (77,81%).
Pengujian aktivitas antikanker menunjukkan bahwa ekstrak KBLK EtOH dan KBLB EtOH memiliki aktivitas sitotoksik yang kuat pada sel murine leukimia P388 yaitu masing-masing 12 ppm dan 15,48 ppm. Menurut NCI ekstrak kasar digolongkan berpotensi antikanker apabila nilai IC50< 20 ppm. Terdapat hubungan aktivitas antioksidasi, toksisitas BSLT, aktivitas antikanker dan kandungan fitokimia ekstrak. Aktivitas antioksidasi dan antikanker dari ekstrak KBLK EtOH dan KBLB EtOH disebabkan oleh kandungan alkaloid, flavonoid saponin dan tanin yang terdapat pada ekstrak tersebut. Ekstrak kulit batang langsat berpotensi dikembangkan sebagai sumber senyawa fitokimia antikanker.
© Hak cipta milik IPB, tahun 2008
Hak cipta dilindungi undang-undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber.
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu makalah.
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.
AKTIVITAS ANTIOKSIDASI DAN ANTIKANKER
EKSTRAK KULIT BATANG LANGSAT
[Lansium Domesticum L.]
MOKOSULI YERMIA SEMUEL
Tesis
Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Biokimia
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul : Aktivitas Antioksidasi dan Antikanker Ekstrak Kulit Batang Langsat [Lansium domesticum L.]
Nama : Mokosuli Yermia Semuel NRP : G851060061
Disetujui :
Komisi Pembimbing
Prof. Dr. drh. Maria Bintang, MS Mega Safithri, S.Si, M.Si Ketua Anggota
Diketahui :
Ketua Program Studi Biokimia Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Prof.Dr.drh.Maria Bintang, MS Prof.Dr.Ir.Khairil Anwar Notodiputro, MS
PRAKATA
Saya sangat bersyukur kepada TUHAN karena tanpa anugerahNya saya tidak pernah mendapat kesempatan studi di Institut Pertanian Bogor dan dapat menyelesaikan tugas akhir program magister biokimia. Suatu kebanggaan bagi saya untuk dapat belajar biokimia di Institut Pertanian Bogor. Atas ketertarikan penulis dalam bidang pemanfaatan bahan tumbuhan sebagai sumber obat maka penulis melakukan penelitian tentang aktivitas antioksidasi dan antikanker ekstrak kulit batang Langsat [Lansium domesticum L.]. Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan September 2007 sampai awal Februari 2008.
Terima kasih dan penghargaan yang sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada Ibu Prof Dr. drh. Maria Bintang, MS dan Ibu Mega Safithri, SSi, MSi selaku pembimbing atas segala arahan dan bimbingan selama penelitian serta kepercayaan dan kesabaran dalam membimbing sampai terselesaikannya penyusunan tesis ini. Ucapan terima kasih disampaikan kepada Rektor Universitas Negeri Manado bapak Prof.Drs.J.L.L.Lombok,SH yang memberikan kesempatan belajar di IPB Bogor dengan biaya BPPS Direktorat Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional.
Semasa studi ada banyak orang yang membantu saya namun tidak ada yang melebihi bantuan isteri tercinta Reinny S. Tuegeh, SSi yang dengan tekun dan sabar memberi semangat serta mendoakan keberhasilan studi juga orang tua yang turut menopang dalam doa. Kepada teman-teman Biokimia angkatan 2006 disampaikan terima kasih atas bantuan dan dukungan selama studi. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Februari 2008
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Tambun Kabupaten Bolaang Mongondow pada tanggal 21 Maret 1980 dari Ayah Benyamin Gayus Mokosuli dan Ibu Mien Ritha Suoth. Penulis adalah putera pertama dari tiga bersaudara.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ... DAFTAR GAMBAR ... DAFTAR LAMPIRAN ...
xi xii xiii
PENDAHULUAN ... 1
TINJAUAN PUSTAKA
Tanaman Langsat ... Radikal Bebas ... Antioksidan ... Kanker ... 6 7 9 13
BAHAN DAN METODE
Waktu dan tempat ... Bahan dan alat ... Diagram alir penelitian ... Ekstraksi kulit batang Lansium domesticum L. ... Analisisi fitokimia ... Uji toksisitas metode BSLT ... Uji aktivitas antioksidasi ... Uji aktivitas antikanker pada sel murine leukimia P388 ... Analisis data ...
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi ... Analisis fitokimia ... Aktivitas toksisitas metode BSLT ... Aktivitas antioksidasi metode DPPH ... Aktivitas antioksidasi metode TBA ... Aktivitas antikanker pada sel murine leukimia P388 ...
SIMPULAN DAN SARAN ... 25 25 26 27 27 28 28 30 30 32 33 34 36 40 46 51
DAFTAR PUSTAKA ... LAMPIRAN ...
DAFTAR TABEL
Halaman
1. Klasifikasi umum agen karsinogenesis ... 2. Flavonoid antikanker ... 3. Rendemen ekstrak KLBB dan KLBK ...
15 21 32 4. Hasil analisis fitokimia KLBB dan KLBK ... 5. Nilai LC50 ekstrak etanol KBLK dan KBLB ... 6. Nilai IC50 aktivitas antioksidan ekstrak metode DPPH dibandingkan
dengan kontrol BHT ...
7. Aktivitas inhibisi ekstrak terhadap radikal DPPH ... 8. Konsenterasi MDA oksidasi asam linoleat metode TBA ... 9. Perbandingan aktivitas antioksidasi, toksisitas dan antikanker
ekstrak etanol kulit batang langsat ... 33 35
36 37 41
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Batang, daun dan buah langsat (Lansium domesticul L.) ………….. 2. Interaksi species oksigen reaktif (ROS) terhadap biomolekul di
dalam sel ... 3. Keseimbangan radikal bebas-antioksidan sangat diperlukan di
dalam tubuh ... 4. Mutasi dan proses perkembangan kanker hati ... 5. Tipe progresi tumor ... 6. Ceflatonin dan phenoxodiol, obat antikanker dari tumbuhan ... 7. Diagram alir penelitian ... 8. Histogram mortalitas A. Salina Leach pada berbagai konsenterasi
ekstrak ... 9. Reaksi antara DPPH dan antioksidan ... 10.Struktur flavonoid dengan aktivitas antiradikal yang tinggi ... 11.Reaksi Scavenging radikal bebas DPPH* oleh flavonoid ... 12.Daya hambat oksidasi asam linoleat ekstrak. (a) KBLK EtOH
(b) KBLB EtOH ... 13.Peroksidasi lipid pada asam lemak tak jenuh rantai panjang ... 14.Reaksi MDA dan TBA ... 15.Perbandingan aktivitas antioksidasi metode DPPH dan TBA ... 16.Perbandingan aktivitas toksisitas ekstrak metode BSLT dan
sitotoksik in vitro pada sel murine leukimia P388 ... 6
9
11 14 15 22 26
35 37 39 39
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Diagram alir penelitian ... 2. Ekstraksi kulit batang Lansium domesticum L. ……… 3. Analisis antioksidasi metode TBA ... 4. Pengambilan sampel dan eksraksi ... 5. Hasil ekstraksi dan analisis fitokimia ... 6. Analisis hasil uji toksisitas metode BSLT ... 7. Analisis hasil uji antioksidasi metode DPPH ... 8. Analisis hasil uji antioksidasi metode TBA ... 9. Hasil uji sitotoksik in vitro pada sel murine leukimia P388 ... 10.Formulasi media RPMI ...
PENDAHULUAN
Kanker adalah penyakit yang ditandai dengan pembelahan sel yang tidak
terkendali dengan kemampuan sel-sel tersebut untuk menyerang jaringan biologis
lainnya, baik dengan pertumbuhan langsung di jaringan yang bersebelahan
(invation) atau dengan migrasi sel ke tempat yang jauh (metastasis). Pertumbuhan yang tidak terkendali tersebut disebabkan oleh kerusakan DNA yang
mengakibatkan mutasi pada gen vital yang mengontrol pembelahan sel. Beberapa
kejadian mutasi dapat mentransformasi materi genetik sel normal menjadi sel
kanker. Mutasi-mutasi tersebut dapat diakibatkan oleh agen kimia, biologi
maupun fisik yang disebut karsinogen. Mutasi dapat terjadi secara spontan
(diperoleh) ataupun diwariskan (mutasi germline).
Kanker telah menjadi penyakit yang sangat ditakuti saat ini. Kematian
akibat kanker di Amerika Serikat menempati posisi kedua setelah penyakit
jantung. Diperkirakan satu dari tiga orang di AS mengalami perkembangan kanker
dalam tubuhnya (Cooper, 1993). Kanker menyebabkan lebih dari 500.000
kematian tiap tahun di Amerika Serikat (Katzung, 1995). Laporan berbagai
lembaga riset penelitian kanker di Indonesia menyatakan prevelensi penyakit
kanker di Indonesia cenderung meningkat. Insiden kanker di Indonesia
diperkirakan 100 per 100.000 penduduk per tahun atau sekitar 200.000 penduduk
per tahun (Puspitasari et al. 2003).
Kanker terjadi pada sel-sel normal melalui suatu kesalahan genetika,
kemudian berubah menjadi sel-sel ganas yang berploriferasi dengan cepat. Kanker
lebih mudah tejadi pada sel yang terus menerus membelah dan memperbanyak
diri, misalnya sel-sel kulit, sel-sel epitel lambung, saluran pencernaan dan
paru-paru sebagai akibat hubungan yang sangat intensif dengan faktor lingkungan
(udara dan makanan) sehingga lebih mudah dipengaruhi senyawa karsinogenik.
Proses perubahan ini dikenal dengan istilah karsinogenesis. Karsinogenesis dibagi
dalam beberapa tahap yaitu inisiasi, promosi dan progresi (Contran et al. 1994). Tumor (bahasa Latin = pembengkakan) menunjukan massa jaringan yang tidak
2
kanker). Tumor ganas yang mampu menyerang jaringan lainnya ataupun
bermetastasis.
Perubahan pola makan di negara-negara berkembang seperti Indonesia
mulai meninggalkan makanan tradisional ke makanan cepat saji (fast food)
memberikan efek yang tidak baik bagi kesehatan. Makanan yang disukai
masyarakat Indonesia pada umumnya saat ini adalah makanan dengan kandungan
lemak/minyak tinggi (gorengan), daging dan produk olahan daging, makanan
dengan kandungan garam/penyedap tinggi serta makanan olahan dengan
pengawet. Jenis-jenis makanan tersebut telah menjadi makanan idola jajanan
anak-anak sekolah maupun masyarakat umum. Akibatnya muncul penyakit non
infektif seperti penyakit jantung, tekanan darah tinggi dan kanker.
Disamping hal tersebut di atas, Indonesia sebagai negara dengan wilayah
laut yang luas sehingga masyarakat sangat menyukai mengkonsumsi ikan.
Konsumsi ikan laut sangat baik bagi kesehatan karena mengandung protein tinggi
dan asam lemak esensial yang dibutuhkan oleh tubuh. Namun bentuk olahan ikan
yang mudah dan umum dilakukan dengan panggangan dan pengasapan. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa ikan atau daging yang hangus setelah dipanggang
mengandung senyawa polisiklik aromatik hidrokarbon yang merupakan
karsinogen kuat. Proses pengasapan daging atau ikan membentuk benzo(a)pirene
yang bersifat karsinogen kuat. Penggunaan minyak goreng berulang kali dapat
menyebabkan terjadinya oksidasi atau polimerisasi menghasilkan asam lemak
trans atau bentuk-bentuk senyawa radikal bebas yang bila dikonsumsi dapat menimbulkan kerusakan seluler (Greenwald, 1996).
Karsinogenesis berlangsung dalam waktu yang lama sekitar 10 sampai 20
tahun tetapi dapat juga terjadi lebih cepat tergantung pada intensitas paparan
agen-agen karsinogenik. Kanker dapat menyebabkan banyak gejala yang berbeda,
bergantung pada lokasinya dan karakter dari keganasan dan apakah ada
metastasis. Sebuah diagnosis yang menentukan biasanya membutuhkan
pemeriksaan mikroskopik jaringan yang diperoleh dengan biopsi. Setelah
didiagnosis, penderita kanker biasanya dirawat dengan operasi, kemoterapi atau
3
Akhir-akhir ini upaya pengobatan kanker dengan kemoterapi banyak
dilakukan. Bahan kemoterapi dari tumbuhan mempunyai prospek sebagai
penghambat kanker yang lebih sedikit efek sampingnya. Distribusi senyawa
fitokimia yang memiliki aktivitas antikanker sangat luas dalam
tumbuh-tumbuhan. NCI (National Cancer Institute) melakukan skrining sekitar 114.000 ekstrak tumbuhan dari tahun 1960 sampai 1982 dan menemukan sekitar 35.000
sampel tumbuhan memiliki aktivitas antikanker. Tahun 1991 sekitar 28.000
sampel tumbuhan dari seluruh dunia telah dikoleksi karena memiliki aktivitas
antikanker. Sekitar 62% dari 87 jenis obat antikanker berasal dari bahan alam
(Cragg, 1993).
Hasil penelitian menunjukkan jenis buah-buahan dan sayuran segar
berpotensi preventif dan antikanker. Konsumsi sayur dan buah yang mengandung
flavonoid dapat menekan perkembangan kanker (Chatterjee, 1999). Apel kaya
akan serat dan flavonoid. Flavonoid apel tertinggi dibandingkan dengan jenis
buah-buahan lainnya. Flavonoid dilaporkan mampu menahan resiko terkena
kanker paru-paru sampai 50%. Penelitian Cornell University membuktikan bahwa zat fitokimia yang terdapat dalam apel tersebut menghambat pertumbuhan sel
kanker usus sebesar 43%. Apel juga memiliki komponen fitokimia antikanker
seperti asam elegat, asam kafeat, asam klorogenat dan glutation. Asam elagat
berperan sebagai "obat" antikanker generasi baru, dengan kerja utama melindungi
kromosom dari kerusakan dan menghambat kerja dari banyak karsinogen, seperti
asap rokok (dikenal secara kolektif sebagai polycylic aromatic hydrocarbons dan bahan-bahan kimia beracun seperti benzopyrene). Sementara glutation adalah bahan antikanker penting yang menangkal efek racun dari logam berat, seperti
timah hitam. Zat tersebut juga dapat mengeliminasi pestisida dan bahan pelarut.
Selain apel, jeruk juga dilaporkan mengandung glutation (senyawa antikanker dan
antioksidan yang amat kuat) dengan kadar tinggi (Cooper, 1993).
Beberapa tumbuhan memiliki komponen antitumor berupa senyawa
fitokimia yang dikenal dengan pencegah kanker (cancer chemoprevention).
Pencegahan kanker menggunakan senyawa fitokimia adalah salah satu upaya
menggunakan bahan kimia alam yang diharapkan dapat mencegah tahap awal dari
4
dan antikanker pada tanaman diantaranya indol isothiosianat, dithiolthion dan organo sulfur yang banyak pada crucifera. Murakami et al, (1999) menyatakan bahwa dari 107 species tanaman yang diuji sebagai antitumor berasal dari famili
Zingiberaceae dan Umbelliferae. Eksrak lengkuas mengandung ACA (1’asetoksi khavikol asetat). Kandungan tertinggi pada eksrak etil asetat dengan waktu maserasi 48 jam sekitar 1,62 ± 0,02 %. Memiliki potensi mengambat semua jenis
alur sel kanker dan sel kanker primer manusia. Aktivitas antikanker ekstrak
lengkuas disebabkan oleh kemampuan ekstrak ini meningkatkan interferon-y
(INF-y) oleh alir sel kanker paru-paru, leukimia, melanoma primer, melanoma
metastase dan kanker serviks (Rusmarilin, 2003). Kandungan isoflavon terdapat
dalam tanaman sayuran, buah-buahan, padi-padian dan kacang-kacangan terutama
banyak pada kedelai. Geneistein pada dosis 37 mM mampu menghambat aktivitas
tirosin kinase, konsenterasi 20 mM menghambat proliferasi sel dan sel MCF-7
(sel kanker payudara). Daun, buah dan kulit batang tumbuhan mengandung
senyawa golongan flavonoid dan polifenol (Sarjono, 2004; Harborne, 1996).
Bioprospeksi dan eksplorasi tumbuhan yang berpotensi preventif kanker
dan antikanker perlu terus dilakukan mengingat penyakit kanker diperkirakan
prevelensinya akan terus meningkat di negara-negara berkembang termasuk
Indonesia. Sebagian besar bahan bioaktif farmasi atau produk jadinya sebagai obat
antioksidasi dan terapi kanker masih diimpor dan juga harganya sangat mahal.
Salah satu tanaman asli Indonesia yang diduga memiliki potensi anti
kanker adalah langsat (Lansium domesticum L.). Daun tanaman langsat mengandung alkaloida, saponin, flavonoida dan polifenol. Secara empiris tanaman
ini telah digunakan masyarakat pedalaman Kalimantan dan Minahasa Utara
sebagai obat antimalaria, tumor dan kanker. Biji tanaman ini secara tradisional
telah digunakan untuk mengobati penyakit parasitologis malaria. Namun belum
ada laporan ilmiah pemanfaatan ekstrak bagian tanaman ini sebagai obat
antikanker. Kearifan budaya etnomedikal masyarakat Indonesia yang diperoleh
turun temurun perlu dilestarikan dan dikembangkan sehingga dapat bermanfaat
bagi kesejahteraan manusia. Adanya kandungan alkaloid, flavonoid dan polifenol
5
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kandungan senyawa fitokimia
yang memiliki potensi antioksidasi dan antikanker dari ekstrak kulit batang
langsat [L. domesticum L.] dan mengetahui aktivitas antioksidasi dan antikanker ekstrak kulit batang langsat [L. domesticum L.] in vitro pada sel kanker murine leukimia P388.
Dalam penelitian ini dirumuskan hipotesis bahwa terdapat senyawa
fitokimia yang bersifat antikanker dari ekstrak kulit batang langsat [L. domesticum
L.]. Senyawa tersebut memiliki aktivitas antioksidasi dan aktivitas antikanker
yang kuat. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah tentang
TINJAUAN PUSTAKA
Tanaman Langsat
Tanaman langsat adalah tanaman buah yang cukup dikenal di Indonesia. Tanaman ini dibudidayakan masyarakat dengan tujuan utama memanen buahnya saja. Tanaman ini berhabitus pohon dengan tinggi sekitar 15-20 meter. Berakar tunggang, batang berkayu, bulat, bercabang dan putih kotor. Daun majemuk, bulat telur, ujung meruncing, pangkal runcing, panjang sekitar 20 cm, lebar 10 cm, bertangkai dan berwarna hijau. Bunga majemuk, bentuk tandan pada batang dan cabang, menggantung dengan panjang sekitar 10-30 cm. Buah buni, bulat, berdiameter 2-4 cm, beruang lima, kuning kecoklatan. Rasa buah muda asam dan bergetah dengan biji berwarna hijau dan berasa pahit. Kulit batang berasa lebih pahit dibandingkan dengan biji (Simbala et al. 2004).
Dari segi kandungan fitokimia, belum banyak dilaporkan. Daun tumbuhan ini diduga mengandung alkaloida, saponin, flavonoida dan polifenol. Biji langsat telah dimanfaatkan masyarakat sebagai obat cacing, obat demam dan obat diare. Menurut Simbala et al. (2004) tanaman langsat diklasifikasikan sebagai berikut:
Dunia : Plantae Divisi : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida Ordo : Sapindales Famili : Meliaceae Genus : Lansium
Species : Lansium domesticum L.
7
Radikal bebas
Radikal bebas adalah substansi reaktif yang dibentuk dalam sel-sel tubuh sebagai hasil proses metabolisme. Pada tahun 1954 Gerschman dan timnya pertama mengemukakan teori pembentukan radikal bebas. Radikal bebas adalah molekul dengan satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan pada orbitalnya. Banyak dari molekul ini adalah spesies oksigen. Radikal bebas oksigen dan produk non radikalnya dikelompokkan dalam spesies oksigen reaktif (reactive oxygen species (ROS)). Radikal bebas sangat reaktif, merupakan molekul yang tidak stabil dan bereaksi dengan cepat pada biomolekul melalui banyak jenis reaksi antara lain penangkapan hidrogen, donasi elektron dan penggunaan elektron bersama. Radikal bebas akan melepaskan elektron pada molekul sekitarnya untuk menghasilkan pasangan elektron agar menjadi molekul yang stabil (Hosseinian, 2006 ; Maxwell & Lip, 1997).
ROS dihasilkan baik melalui faktor eksogen maupun endogen yang secara langsung mempengaruhi kehidupan sel. Sumber penting radikal bebas dalam tubuh dihasilkan oleh sistem enzim prooksidatif seperti lipooksigenase, metabolisme obat, polutan, dan senyawa kimia asing bagi tubuh (xenobitotik). Di dalam sel manusia, mitokondria menggunakan oksigen lebih dari 90%, mitokondria menjadi sumber utama ROS dan radikal bebas. Sekitar 1–5% oksigen yang digunakan oleh mitokondria direduksi dan dikonversi menjadi ROS. Reduksi tetravalen oksigen dalam transpor elektron mitokondria sangat penting untuk menghasilkan energi seluler, akan tetapi reduksi ini tidak seratus persen efesien, sebagian membentuk radikal superoksida (O2*-). Radikal superoksida didismutasi oleh superoksida dismutase membentuk H2O2. Substansi ini sangat oksidan, interaksi dengan ion logam seperti Fe2+ dan Cu+ menghasilkan radikal hidroksil yang sangat reaktif (OH*), akhirnya dapat menyebabkan banyak kerusakan jaringan biologis (Young et al. 2002; Hosseinian, 2006; Maxwell & Lip, 1997).
8
inisiasi oleh radikal bebas pada reaksi peroksidasi lipid. Selama oksidasi lipid akan terbentuk malondialdehid (MDA) yang dapat bereaksi dengan gugus amino bebas pada protein, fosfolipid dan asam nukleat sehingga merusak struktur dan fungsinya (Young et al. 2002; Maxwell & Lip, 1997).
ROS dapat dikelompokkan menjadi radikal oksigen dan kelompok derivat non radikal oksigen. Kelompok radikal oksigen terdiri dari O2-(superoksid), HO2- (hidroperoksil), OH-(hidroksil), L(R)OO-(peroksil) serta NO-(nitrit oksid) sedangkan yang derivat non radikal oksigen antara lain ONOO- (peroksi nitrit), -OCl (hipoklorit), 1-O2-(oksigen singlet), L(R)OOH (hidroperoksida) dan H2O2 (hidrogen peroksida) (Abuja & Albertini, 2001; Hosseinian, 2006).
Sasaran utama reaksi radikal bebas di dalam sel adalah ikatan-ikatan rangkap dari lipida yang terdapat di dalam membran sel. Akibatnya fluiditas membran akan berkurang dan sederetan reseptor selular akan berkurang. Serangan radikal bebas juga dapat menimbulkan penumpukan kalsium dan lipofusin. Radikal bebas dapat pula menjadikan enzim dan protein thiol (-SH) tidak aktif dengan cara pembentukan ikatan silang maupun denaturasi. Akibatnya sintesis dan degradasi protein terganggu. Jika radikal bebas menyerang asam-asam nukleat akan menimbulkan gangguan terhadap molekul DNA yang berakibat terbentuknya mutasi basa-basa nitrogen serta berakhir dengan pembentukan karsinogenesis. ROS juga dapat menginduksi apoptosis, menggangu jalur signal seluler, menggangu reaksi oksidasi reduksi sel dan meningkatkan kecepatan mutasi DNA (Harliansyah, 2001; Valko et al. 2006).
9
Gambar 2 Interaksi spesies oksigen reaktif (ROS) terhadap biomolekul di dalam sel (Mates & Gomez 1999).
Antioksidan
Antioksidan didefinisikan sebagai senyawa yang dapat menunda, memperlambat dan mencegah proses oksidasi lipid walaupun dalam konsenterasi yang sedikit (Sampels, 2005). Antioksidan adalah substansi yang diperlukan tubuh untuk menetralisir radikal bebas dan mencegah kerusakan yang ditimbulkan oleh radikal bebas terhadap sel normal, protein dan lemak. Antioksidan menstabilkan radikal bebas dengan melengkapi kekurangan elektron yang dimiliki radikal bebas dan menghambat terjadinya reaksi berantai dari pembentukan radikal bebas yang dapat menimbulkan stres oksidatif. Antioksidan dapat berperan sebagai peredam radikal bebas (free radical scavenger), dekomposer peroksida, mereduksi singlet oksigen dan menghambat enzim (Dean, 2003; Simpson, 2006).
ROS Kerusakan oksidatif pada protein Stres oskidatif menginduksi protein dan gen
Perubahan kimia pada basa nitrogen materi genetik
Menginduksi peroksidasi lipid
Perubahan konformasi DNA
Regulasi
* pertumbuhan sel * diferensiasi sel
* kematian sel oleh apoptosis dan nekrosis
Aktifasi dari :
* transduksi sinyal * proliferasi sel
Penurunan efesiensi dari :
* DNA polimerase * Repair DNA
Perluasan/peningkatan ”hot spot” mutagenitas
Perubahan ikatan -H
Penghambatan dalam replikasi
Replikasi tidak akurat
10
Tubuh manusia memiliki aktivitas antioksidan endogenus. Enzim-enzim antioksidan seperti superoksida dismutase (SOD), katalase (CAT) dan glutation peroksidase (GPX) berperan dalam meredam oksidan dan mencegah sel dari kerusakan. Disamping enzim-enzim tersebut molekul non enzim dalam sel seperti thioredoksin, thiol dan ikatan disulfida berperan dalam sistem pertahanan antioksidan tubuh. Hasil studi epidemilogi mekanisme antioksidan endogenus ini tidak mampu mengimbangi jumlah radikal bebas yang dihasilkan tubuh dan pada kondisi tertentu aktivitasnya menjadi tidak efisien sehingga radikal bebas tersebut menyebabkan kerusakan oksidatif pada biomolekul (Yang et al. 2007; Aqil et al. 2006; Mosquiera et al. 2007).
Ketidakseimbangan jumlah radikal bebas dan sistem antioksidan endogenus menyebabkan terjadinya stres oksidatif. Untuk mencegah stres oksidatif maka dibutuhkan antioksidan non enzimatis dari luar tubuh. Substansi yang terkandung dari sayuran dan buah seperti α-tokoferol, β-karoten asam askorbat, flavonoid dan senyawa fenolik, zink dan selenium termasuk dalam kelompok antioksidan eksogenus (Simpson, 2006).
11
Gambar 3 Keseimbangan radikal bebas-antioksidan mencegah stres oksidatif.
Aktivitas antioksidan memiliki dua fungsi. Fungsi pertama merupakan fungsi utama dari antioksidan yaitu sebagai pemberi atom hidrogen. Antioksidan (AH) yang mempunyai fungsi utama tersebut sering disebut sebagai antioksidan primer. Senyawa ini dapat memberikan atom hidrogen secara cepat ke radikal lipida (R*, ROO*) atau mengubahnya ke bentuk lebih stabil, sementara turunan radikal antioksidan (A*) tersebut memiliki keadaan lebih stabil dibanding radikal lipida. Fungsi kedua merupakan fungsi sekunder antioksidan, yaitu memperlambat laju autooksidasi dengan berbagai mekanisme diluar mekanisme pemutusan rantai autooksidasi dengan pengubahan radikal lipida ke bentuk lebih stabil (Simpson, 2006; Harliansjah, 2007).
Penambahan antioksidan primer (AH) dengan konsentrasi rendah pada lipida dapat menghambat atau mencegah reaksi autooksidasi lemak dan minyak. Penambahan tersebut dapat menghalangi reaksi oksidasi pada tahap inisiasi maupun propagasi. Radikal-radikal antioksidan (A*) yang terbentuk pada reaksi tersebut relatif stabil dan tidak mempunyai cukup energi untuk dapat bereaksi dengan molekul lipida lain membentuk radikal lipida baru (Harliansjah, 2007). Reaksi penghambatan antioksidan primer terhadap radikal lipid adalah :
Inisiasi : R* + AH ---> RH + A* radikal lipida antioksidan
Propagasi : ROO* + AH ---> ROOH + A*
12
sebagai prooksidan pada konsenterasi yang tinggi (Sampels, 2005; Harliansjah, 2007).
AH + O2 ---> A* + HOO* AH + ROOH ---> RO* + H2O + A*
Telah diketahui mutasi gen dapat terjadi melalui mekanisme kesalahan replikasi dan kesalahan genetik yang berkisar antara 10-15 %, atau faktor dari luar yang merubah struktur DNA seperti virus, polusi, radiasi, dan senyawa xenobiotik dari konsumsi pangan sebesar 80-85 %. Jadi jelas bahwa radikal bebas dan reaksi oksidasi berantai yang dihasilkan besar pengaruhnya pada proses mutasi. Kerusakan oksidatif DNA merupakan bagian dari karsinogenesis yang memberi pengaruh sangat besar saat ini dengan banyaknya komponen xenobiotik pada makanan yang membentuk radikal bebas dalam tubuh. Konsumsi antioksidan alami dapat berperan sebagai biopreventif kanker (Silalahi, 2006; Harliansjah, 2007).
Senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami umumnya berasal dari tumbuhan. Angiospermae memiliki kira-kira 250.000 sampai 300.000 spesies dan dari jumlah ini kurang lebih 400 spesies yang telah dikenal dapat menjadi bahan pangan manusia. Isolasi antioksidan alami telah dilakukan dari tumbuhan yang dapat dimakan, tetapi tidak selalu dari bagian yang dapat dimakan. Antioksidan alami tersebar di beberapa bagian tanaman, seperti pada kayu, kulit kayu, akar, daun, buah, bunga, biji dan serbuk sari (Mosquiera et al. 2007; Harliansjah, 2007).
13
gingerol dan empat macam diarilheptanoid yang memiliki aktivitas antioksidan kuat (Harliansjah, 2007).
Ada beberapa senyawa fenolik yang memiliki aktivitas antioksidan telah berhasil diisolasi dari kedelai (Glycine max L.), salah satunya adalah flavonoid. Flavonoid kedelai unik dimana dari semua flavonoid yang terisolasi dan teridentifikasi adalah isoflavon. Pada dosis 2,24 mg/0,2 ml isolat flavonoid dari herba benalu mangga mampu menghambat pertumbuhan kanker pada hewan uji mencit. Senyawa flavonoid dari benalu adalah senyawa kuersetin yang bersifat inhibitor terhadap enzim DNA topoisomerase I sel kanker (Sukardiman et al. 1995).
Flavonoid yang terdapat pada buah-buahan dan sayuran memberi pengaruh yang menguntungkan dan sebagai antioksidan. Antioksidan dari flavonoid tergantung pada struktur molekulnya. Flavonoid adalah substansi polifenolik yang banyak terdapat pada tumbuhan; berdasarkan struktur kimia yang termasuk dalam golongan flavonoid adalah flavonol, flavon, flavanon, isoflavon, katekin, antosianidin dan kalkon. Sekitar 4000 flavonoid telah diidentifikasi banyak yang berasal dari sayuran, buah, teh, kopi, bir, wine dan minuman sari buah. Secara epidemologi konsumsi sayur dan buah segar secara rutin menekan resiko kanker dan penyakit degeneratif akibat spesies radikal bebas. Konsumsi sayuran, buah dan ramuan obat herbal yang kaya kandungan flavonoid menekan resiko terserang penyakit jantung dan kanker (Buhler & Miranda, 2000; Okawa et al. 2001).
Kanker
Kanker dianggap suatu kelompok penyakit seluler dan genetik karena dimulai dari satu sel yang telah mengalami mutasi DNA sebagai komponen dasar gen. Sel-sel yang mengalami kerusakan genetik tidak peka lagi terhadap mekanisme regulasi siklus sel normal sehingga akan terus melakukan proliferasi tanpa kontrol (Silalahi, 2006). Kerusakan dalam struktur DNA dapat berakibat pertumbuhan sel yang tidak terkendali yang dikenal dengan penyakit kanker.
14
dalam hubungan dengan proses terjadinya tumor. Mutasi yang terjadi pada DNA di dalam gen yang meregulasi siklus sel (pertumbuhan, kematian dan pemeliharaan sel) akan menyebabkan penyimpangan siklus sel, dan salah satu akibatnya adalah pembentukan kanker atau karsinogenesis. Ada tiga cara atau faktor penting dalam proses terjadinya mutasi gen yaitu: (1) faktor lingkungan yang meliputi nutrisi, agen infektor, gaya hidup; (2) faktor kebetulan, dan (3) faktor keturunan atau bawaan (Silalahi, 2006).
[image:38.595.194.484.234.434.2]
Gambar 4 Mutasi dan proses perkembangan kanker hati (Ren et al. 2003)
Karsinogenesis atau proses perkembangan pembentukan kanker terdiri atas tiga tahapan yaitu inisiasi, promosi dan progresi. Tahap inisiasi ditandai dengan perubahan permanen pada sel. Inisiasi ini disebabkan oleh agen karsinogen baik endogen maupun eksogen yang menyebabkan perubahan sel-sel di jaringan, penghambatan metabolisme DNA yang menyebabkan terjadinya perubahan susunan DNA sel awal atau disebut mutasi (Pitot & Dragan, 1991). Agen-agen karsinogen ditunjukan pada tabel 1.
Sel sehat
Kerusakan pada sel
Akumulasi kesalahan genetik
Sel yang tidak sehat mengalami pembelahan dengan cepat dan menjadi sel kan ker Liver sehat
15
Tabel 1 Klasifikasi umum agen Karsinogenik (Pitot & Dragan, 1991).
Kelas Contoh Massa relatif molekuler (dalton)
I. Kimia Hidrokarbon polisiklik, amina dan halida aromatik, hormon, logam dan polimer permukaan
5 x 10 – 5 x 104
II. Radiasi Ionisasi ( sinar x, gama, partikel radiasi) dan radiasi ultraviolet
<<< 1-1
III. Biologis Virus (papova, herpes, retrovirus dan hepadna virus)
3 x 106 – 170x106 (genom viral)
IV. Genetik Transgenik melalui (enhancer – promotor-oncogene constructs; selective breeding)
~ 106 - 108
Tahap promosi, ditandai dengan karakter tahap inisasi yang bersifat reversibel. Pada tahap ini sel-sel yang telah termutasi dipapar lagi oleh agen-agen lain dari lingkungan. Frekuensi agen-agen mutagenik mempengaruhi sel-sel inisiasi, perubahan susunan genetik sel melalui mekanisme reseptor. Pada tahap ini agen-agen promosi (agen karsinogenik) meningkatkan resiko perkembangan kanker dengan kecepatan proliferasi sel-sel yang terinisiasi. Pada tahap ini sel-sel akan bertumbuh menjadi tumor (Pitot & Dragan, 1991). Tumor dapat mengalami perubahan genetik multipel (Yokota & Sugimura, 1991). Kanker akan terjadi dengan cepat apabila agen promosi meningkat dan pada konsenterasi yang tinggi dalam sel. Agen-agen karsinogenik yang menginduksi langsung perubahan struktur DNA antara lain polipeptida dan hormon steroid, minuman beralkohol, defisiensi metil dan galaktosamin.
Tahap progresi, tahap ini dicirikan dengan perubahan kariotipe, perkembangan sel yang telah bersifat irreversibel, aneuploid malignan neoplasma, perubahan mekanisme biokimia sel yang disebabkan oleh perubahan kariotipe. Pada tahap ini radikal bebas memacu progresi kanker (Pitot & Dragan, 1991).
16
1 2 3
A.
1 2 3
[image:40.595.111.514.82.193.2]B.
Gambar 5 Tipe progresi tumor (Pitot & Dragan, 1991)
Gambar A, model genetik dari progresi kanker manusia. Tumor dapat dibagi menjadi 3 kelompok yaitu lesi prakanker, karsinoma dam metastasis. Lesi prakanker tidak dapat dideteksi secara klinis. Pada gambar A progresi tumor dengan lesi prakanker. Pada gambar B progresi tumor tanpa lesi prakanker. Kejadian genetik ditunjukkan dengan nomor 1-3. Walaupun jumlah kejadian genetik minimum terjadi pada konversi sel normal menjadi karsinoma belum banyak diketahui, beberapa bukti menyatakan bahwa dua gen yaitu RB dan p53 berperan dalam represi sel kanker (Yakota & Sugimura, 1993).
Ada tiga kelompok utama gen yang terlibat dalam regulasi pertumbuhan sel yaitu proto-onkogen, gen penekan tumor (tumor suppresor gene (TSG)) dan gen penjaga (gatekeeper gene). Proto-onkogen menstimulasi dan meregulasi pertumbuhan dan pembelahan sel. Gen penekan tumor biasanya menghambat pertumbuhan sel atau menginduksi apoptosis. Kelompok gen ini dikenal sebagai anti-onkogen, karena berfungsi melakukan kontrol negatif (penekanan) pada pertumbuhan sel. Gen p53 merupakan salah satu dari TSG yang menyandi protein penekan tumor dengan berat molekul 53 kDa. Gen p53 juga berfungsi mendeteksi kerusakan DNA, menginduksi reparasi DNA. Gen penjaga berfungsi mempertahankan integritas genomik dengan mendeteksi kesalahan pada genom dan memperbaikinya. Mutasi pada gen-gen ini karena berbagai faktor membuka peluang terbentuknya kanker (Mc Kelvery, et al. 2003; Gondhowiarjo, 2004).
Pada keadaan normal, pertumbuhan sel akan terjadi sesuai dengan kebutuhan melalui siklus sel normal yang dikendalikan secara terpadu oleh fungsi ketiga gen yaitu proto-onkogen, gen penekan tumor dan gen penjaga secara seimbang. Jika terjadi ketidakseimbangan fungsi ketiga gen ini, atau salah satu tidak berfungsi dengan baik karena mutasi, maka keadaan ini akan menyebabkan
Sel normal Lesi prakanker Karsinoma Metastasis
17
penyimpangan siklus sel. Pertumbuhan sel tidak normal pada proses terbentuknya kanker dapat terjadi melalui tiga mekanisme yaitu perpendekan waktu siklus sel, sehingga akan menghasilkan lebih banyak sel dalam satuan waktu tertentu, penurunan jumlah kematian sel akibat gangguan proses apoptosis, dan masuknya kembali populasi sel yang tidak aktif berproliferasi ke dalam siklus proliferasi. Sebagai contoh pada kondisi TSG kurang aktif atau proto-onkogen terlalu aktif. Gabungan mutasi dari ketiga kelompok gen ini akan menyebabkan kelainan siklus sel, yang sering terjadi adalah mutasi gen yang berperan dalam mekanisme kontrol sehingga tidak berfungsi baik, akibatnya sel akan berkembang tanpa kontrol (yang sering terjadi pada manusia adalah mutasi gen p53). Akhirnya akan terjadi pertumbuhan sel yang tidak diperlukan, tanpa kendali dan karsinogenesis dimulai (McKelvery, et al. 2003; Gondhowiarjo, 2004, Walker & Blackburn, 2004).
RB dan dan gen p53 adalah dua dari banyak target perubahan genetik pada kanker manusia. Hasil kajian beberapa tahun terakhir ini menunjukkan bahwa mekanisme biokimia dari gen-gen ini berperan sebagai tumor supressor. Gen p53 adalah monitor signal biokimia dalam sel yang dapat mengindikasikan kerusakan DNA atau mutasi. Produk gen p53 adalah hasil dari transkripsi multifaktor yang meregulasi induksi apoptosis dalam sel dalam perusakan DNA, dengan demikian mencegah propagasi kerusakan DNA sel lain. Lebih dari 50% tumor pada manusia, termasuk jenis-jenis sarkoma mengalami mutasi pada gen p53 (Nambiar,
18
Gen p53 dapat mengalami modifikasi jika diserang oleh gugus kimia tertentu. Pada kondisi tertentu, protein p53 sangat tidak stabil dan ditemukan dalam jumlah sangat sedikit dalam sel. Tetapi pada saat sel mengarah pada kerusakan DNA, dengan perlahan di degradasi p53, sehingga protein p53 akan meningkat dan berperan melindungi. Pada saat kandungan p53 lebih tinggi dari normal berperan sebagai supresor tumor, berikatan dengan banyak sisi regulasi dalam sel genom untuk mengaktifasi produksi protein lain yang dapat menghentikan pembelahan sel jika DNA yang rusak dapat diperbaiki. Apabila kerusakan terlampau besar sehingga tidak dapat direpair, protein ini akan mengarahkan pada program kematian sel (apoptosis) (SIBS, 2005).
Faktor lingkungan seperti gaya hidup dan pola makan berkorelasi dengan insiden kanker misalnya paparan sinar ultraviolet dengan kanker kulit, merokok dengan kanker paru-paru. Tetapi tidak semua perokok akan mengidap kanker paru-paru atau berjemur akan selalu menderita kanker kulit; berarti ada faktor lain di luar faktor lingkungan yakni kesalahan replikasi DNA dan bawaan (McKelvery, et al. 2003; Go, et al. 2003; Milner, 2004, dan Nowell, et al. 2004).
Adanya faktor kebetulan dapat diterangkan sebagai berikut. Tubuh mengadakan replikasi DNA secara akurat, tetapi masih terjadi kesalahan satu kali dari 10 juta pasangan basa. Kemudian 99,9% dari yang salah dalam replikasi, dikoreksi dan diperbaiki, berarti replikasi DNA yang salah masih ada tersisa. Di samping itu, proses metabolisme normal dalam tubuh menghasilkan radikal bebas yang reaktif dan menimbulkan kerusakan oksidatif terhadap DNA secara terus-menerus. Kanker dapat terjadi akibat akumulasi DNA termutasi dalam gen terutama yang mengatur proses siklus dan pertumbuhan sel. Mekanisme ke tiga cara terjadinya mutasi DNA adalah melalui faktor keturunan atau bawaan, yang menyebabkan 5-10% kanker. Mutasi yang terjadi pada DNA di dalam gen yang meregulasi siklus sel akan mengakibatkan penyimpangan, dan salah satu dampak negatifnya adalah pembentukan kanker atau karsinogenesis (McKelvery, et al. 2003;Silalahi, 2006).
19
berakhir pada mutagenesis. Sel yang telah berubah ini tumbuh lebih cepat dibandingkan dengan sel normal di sekitarnya. Pada tahap ini proses mutasi akan mengaktivasi atau menghambat proto-onkogen.
Faktor yang mengubah fungsi proto-onkogen dan TSG antara lain adalah karsinogen yang mengubah struktur DNA, radiasi yang memicu pembentukan spesies kimia reaktif dan radikal bebas, dan virus. Tahap inisiasi berlangsung dalam satu sampai beberapa hari. Tahap promosi berlangsung lama bisa lebih dari sepuluh tahun. Suatu proses panjang yang disebabkan oleh kerusakan yang melekat dalam materi genetik di dalam sel. Melalui mekanisme epigenetik akan terjadi ekspansi sel-sel rusak membentuk premalignansi dari populasi multiseluler tumor yang melakukan proliferasi (Lee, et al. 2004).
Senyawa-senyawa yang merangsang pembelahan sel disebut promotor atau epigenetik karsinogen. Pada tahap perkembangan (progression), terjadi insta-bilitas genetik yang menyebabkan perubahan-perubahan mutagenik dan epigenetik. Proses ini akan menghasilkan klon baru sel-sel tumor yang memiliki aktivitas proliferasi, bersifat invasif (menyerang) dan potensi metastatiknya meningkat. Selama tahapan ini, sel-sel malignan berkembang biak menyerbu jaringan sekitar, menyebar ke tempat lain. Jika tidak ada yang menghalangi pertumbuhannya, akan terbentuk dalam jumlah yang cukup besar untuk mempengaruhi fungsi tubuh, dan gejala-gejala kanker muncul. Tahap terakhir ini berlangsung selama lebih dari satu tahun, sehingga seluruh karsinogenesis dapat berlangsung selama dua puluh tahun (Silalahi, 2003). Insiden kanker pada orang yang lebih tua lebih tinggi daripada orang muda karena perubahan DNA akibat paparan lingkungan berisiko dan kesempatan akumulasi yang lebih besar seiring dengan bertambahnya usia, oleh karena itu jika timbul kanker pada usia muda patut diselidiki adanya faktor keturunan. Pengenalan lebih dini risiko kanker pada satu keluarga sangat penting untuk manajemen pencegahan dan terapi (McKelvery, et al. 2003;Silalahi, 2006).
20
penyakit. Tes ini biasanya dilakukan terhadap DNA dan kromosom yang diisolasi dari sampel darah atau sel tumor (Keku et al, 2003).
Kanker dapat menyebabkan banyak gejala yang berbeda, bergantung pada lokasinya dan karakter dari keganasan dan apakah ada metastasis. Sebuah diagnosis yang menentukan biasanya membutuhkan pemeriksaan mikroskopik jaringan yang diperoleh dengan biopsi. Setelah didiagnosis, penderita kanker biasanya dirawat dengan operasi, kemoterapi dan atau radiasi.
Pengobatan kanker yang umum dilakukan saat ini adalah dengan cara kemoterapi. Kemoterapi adalah terapi kimia dengan menggunakan zat-zat kemoterapi untuk menekan pertumbuhan kanker. Zat-zat kimia yang digunakan dapat dari hasil sintesis kimia, semisintetik, fitokimia, bioaktif hewan dan dari mikroorganisme.
Metode kemoterapi dilakukan dengan cara memberikan obat dalam bentuk senyawa kimia untuk membunuh sel-sel kanker dalam tubuh pasien. Kemoterapi dapat diberikan melalui mulut atau injeksi, kadang-kadang dapat juga langsung pada bagian tubuh yang terkena kanker. Kebanyakan kemoterapi diberikan secara infus melalui pembuluh darah vena. Namun, teknik kemoterapi di samping membunuh sel-sel kanker juga dapat mengakibatkan rusaknya sel-sel normal yang kebetulan menyerap obat tersebut. Efek samping pengobatan ini cukup berat, misalnya mual, muntah, rambut rontok, dan lain-lain.
Operasi bedah merupakan pilihan efektif untuk tipe kanker yang tidak terikat erat pada jaringan tubuh lainnya, serta sel-sel kankernya terbungkus dalam satu kesatuan. Namun, teknik pembedahan ini menjadi kurang menguntungkan pada jenis kanker terbuka, karena dapat meninggalkan sisa-sisa sel kanker yang dapat tumbuh kembali di kemudian hari. Teknik operasi bedah juga tidak dapat digunakan untuk jenis kanker yang sudah bermetastasis. Saat ini dengan mahalnya obat kemoterapi sintetik dan meningkatnya kasus penyakit kanker maka pengobatan kanker difokuskan pada komponen fitokimia dan bioaktif dari mikroba dan hewan yang berpotensi menekan pertumbuhan sel normal atau reaksi metabolik.
21
yang berkhasiat sebagai antikanker dari beberapa tanaman telah berhasil diisolasi oleh Mc Laughlin dkk, dimana pencarian senyawa bioaktif tersebut dilakukan setelah dalam praskrining aktivitas terhadap ekstrak tanaman menunjukkan hasil positif atau aktif (Mc Laughlin, 1991). Saat ini teridentifikasi ada sekitar 400 ribu tumbuhan obat, 60% diantaranya berpotensi sebagai antikanker; 75% berpotensi antiinfeksi. Sekitar 107 spesies tanaman yang diuji sebagai antitumor berasal dari famili zingiberaceae dan umbelliferae (Murakami et al. 1999).
[image:45.595.108.514.392.621.2]Tumbuhan memiliki komponen pencegah tumor berupa senyawa fitokimia atau dikenal dengan cancer chemoprevention. Pencegahan kanker menggunakan senyawa fitokimia adalah salah satu upaya menggunakan bahan kimia alam yang diharapkan dapat mencegah tahap awal dari suatu karsinogenesis, sebelum terjadi penyebaran lebih jauh. Senyawa kanker pada tanaman diantaranya indol isothiosianat, dithiolthion dan organo sulfur yang banyak pada crucifera (Rusmarilin, 2003).
Tabel 2 Flavonoid Antikanker
Jenis Kanker Sel Jenis Flavonoid
Kanker mulut HSC-2, HSG, SCC-25 Flavanon, isoflavon, EGC, chalcones, EGCG, curcumin, genistein, ECG, quercetin,
cisplatin.
Kanker payudara MCF-7 Flavanon, daidzein, genistein, quercetin, luteolin.
Kanker tiroid ARO, NPA, WRO Genistein, apigenin, kaempfrol, chrysin, luteolin, biochanin A
Kanker Paru-paru SK-LU1, SW900, H441, H661, haGo-K-1, A549
Flavon, quercetin.
Kanker Prostat
LNCaP, PC3, DU145
Catechin, epicatechin, quercetin, kaempferol, luteolin, genistein, apigenin, myricetin, ilymarin.
Kanker Usus Caco-2, HT-29, IEC-6,
HCT-15 Flavon, quercetin, genistein, anthocyanin. Leukimia
HL-60, K562, Jurkat Apigenin, quercetin, myricetin, chalcones.
Melanoma Mencit B16 4A5 Chalcones Sumber: Ren et al. 2003.
22
hexandrum sebagai prekursor obat kanker etoposide, teniposide dan etopophose (Farkya, et al. 2007). Homoharringtonine (Ceflatonin) alkaloid yang diisolasi dari
Cephalotaxus harringtonia sebagai obat antikanker yang telah memiliki merek dagang. Aktivitas Ceflatonin sebagai inhibitor sintesis protein. Phenoxodiol adalah derivat dari isoflavon dan daidzein diisolasi dari kacang-kacangan berperan sebagai inhibitor NADH oksidase (Williams, 2005).
Ceflatonin Phenoxodiol
Gambar 6 Obat antikanker yang berasal dari tumbuhan dan telah memiliki merek dagang.
Beberapa penelitian yang melaporkan potensi fitokimia tumbuhan sebagai obat antikanker adalah :
1. Kunyit dapat mencegah kanker usus dengan cara menginhibisi enzim-enzim lipid peroksidase dan siklooksigenase-2 yang merupakan implikasi perkembangan kanker dan menginduksi enzim glutation-S-transferase. Induksi siklooksigenase-2 dihubungkan dengan produksi prostaglandin (hormon pengatur gerakan otot). Kunyit juga menunjukkan aktivitas sebagai antioksidan yang dihubungkan dengan mekanisme pemadaman singlet O2 yang dapat merusak DNA, namun sifat antioksidan ini bukan sebagai penghambatan superoksida anion atau radikal bebas hidroxil (Didinkaem, 2007).
2. Daun Eupatorium triplinerve Vahl. Ekstrak heksana daun E. triplinerve Vahl. mempunyai aktivitas hambatan pertumbuhan terhadap kultur sel mieloma
dengan metode viabilitas sel dengan nilai ED50 = 5,85 μg/ml (Hidayat, 2002).
23
4. Katekin dan polifenol dari ekstrak teh hijau menunjukkan aktivitas antikanker yang kuat (Colic & Pavelic, 2004).
5. Eksrak lengkuas mengandung ACA= 1’asetoksi khavikol asetat. Kandungan tertinggi pada eksrak etil asetat dengan waktu maserasi 48 jam sekitar 1,62 +- 0,02%. Memiliki potensi menghambat semua jenis alur sel kanker dan sel kanker primer manusia. Aktivitas antikanker ekstrak lengkuas disebabkan oleh kemampuan ekstrak ini meningkatkan INF-y oleh alir sel kanker paru-paru, leukimia, melanoma primer, melanoma matastase dan kanker serviks (Rusmarilin, 2003).
Dalam pencarian bahan bioaktif yang mempunyai aktivitas antikanker digunakan beberapa metode skrining aktivitas biologis sebagai berikut: (i) Uji kematian larva udang laut (Brine shrimp lethality test (BSLT)), (ii) Uji hambatan tumor pada lempeng kentang (Potato disc crow gall tumor inhibition assay), (iii) Uji proliferasi kuncup lemna (Lemna frond proliferation assay), (iv) Uji sitotoksik
in vitro dan in vivo (Hidayat, 2002).
Dalam kajian penemuan obat antikanker, banyak sistem bioassay yang telah diketahui. Secara in vitro dapat dibagi menjadi 2 kelompok yaitu pengujian seluler (cellular assays) dan pengujian mekanisme (molecular assays). Pengujian seluler juga dapat dibagi menjadi pengujian sitotoksisitas dan pengujian morfologi sel. Contoh dari pengujian sitotoksisitas adalah mengukur konsenterasi sampel yang dibutuhkan untuk menghambat pertumbuhan sel sebanyak 50% dalam kultur sel tunggal (single cell line). Pada tahun 1956 NCI menseleksi L1210 (leukimia tikus) sebagai screen utama dan kemudian pada tahun 1971 digantikan oleh P388 (lymphocystic leukimia) untuk pengujian in vitro antikanker. Kultur sel ini lebih sensitif dibandingkan L1210 tetapi memiliki karakteristik yang mirip. Pertama kali digunakan untuk skrining pada tahun 1985. Karena sitotoksisitas konsisten maka sitotoksisitas menjadi bioassay yang memiliki keuntungan utama yaitu semua mekanisme potensial pada proliferasi seluler dapat dimonitoring secara simultan (Suffness, 1987).
24
menggunakan tikus putih (Ratus novergicus) galur Sprague-Dawley yang berumur lima minggu dengan berat 100-150 gram yang diinduksi dengan DMBA (7,12 dimetilbenz(a)antrasen). Tikus dibagi dalam beberapa kelompok yaitu kelompok kontrol, kelompok perlakuan dengan berbagai konsenterasi sari buah merah dan kontrol normal yang hanya diberi 1 ml minyak wijen. Pengamatan aktivitas dilakukan dengan melihat kerusakan histologi paru-paru.
25
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September 2007 sampai dengan Januari 2008. Ekstraksi kulit batang langsat, analisis fitokimia, uji toksisitas metode BSLT dan uji antioksidasi dilaksanakan di Pusat Studi Biofarmaka IPB Bogor. Uji in vitro antikanker pada sel murine leukimia P388 dilaksanakan di Laboratorium Kimia Bahan Alam ITB Bandung.
Bahan dan Alat
Sampel kulit batang pohon langsat (Lansium domesticum L.) diperoleh dari perkebunan rakyat di Minahasa Utara dan Arboretum Jurusan Biologi FMIPA UNIMA yang telah dideterminasi. Sampel kulit batang basah adalah sampel kulit batang langsat tanpa perlakuan pengeringan sedangkan sampel kulit batang kering adalah kulit batang langsat dengan kadar air 10%.
Ekstraksi. Bahan kimia yang digunakan adalah etanol 70% , kloroform, air
bebas ion. Alat yang digunakan adalah oven, penggiling, blender, neraca analitik,
labu ukur, corong pisah, labu bulat, rotavapor dan erlenmeyer.
Analisis fitokimia. Bahan kimia yang digunakan pareaksi Dragendorff,
pareaksi Mayer’s, pareaksi Wagner, etanol 95%, HCL, logam Mg, Na2CO3, FeCl3,
H2SO4 dan anhidrida asetat. Alat yang digunakan adalah tabung reaksi, rak tabung
reaksi, gelas ukur, erlenmeyer, pengaduk, hot plate dan neraca analitik.
Uji toksisitas menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).
Bahan dan alat yang digunakan antara lain larva udang (Artemia salina Leach.), aerator, wadah penetasan, erlenmenyer, timbangan analitik, lup, lampu, perangkat vial uji dan mikropipet.
Uji aktivitas antioksidasi. Bahan yang digunakan antara lain ekstrak kulit
batang langsat, 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), butil hidroksi toluena (BHT),
26
(TCA) 20%. Alat yang digunakan adalah botol gelap berulir berpenutup, tabung reaksi, gelas ukur, inkubator, pH indikator, sentrifuse model 800 dan
spektrofotometer UV-Vis U-2800 Hitachi.
Uji aktivitas antikanker. Bahan yang digunakan adalah sel kanker murine leukimia P388 dari Laboratorium Kimia Bahan Alam ITB, media Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, serum fetal bovine, kanamisin, reagen pewarna [3-(4,5-dimetil thiazol-2-il)-2,5 difenil tetrazolium bromida], larutan 10% SDS-0,01 N HCL. Alat yang digunakan adalah microplate 550 nm, inkubator CO2 perangkat sumur kultur, mikropipet, microplate reader dan alat-alat gelas.
Diagram Alir Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dalam lima tahap yaitu pertama ekstraksi kulit batang langsat, kedua analisis fitokimia, ketiga uji toksisitas ekstrak etanol dengan metode BSLT, keempat uji aktivitas antioksidasi ekstrak kasar dengan dua metode yaitu metode DPPH dan metode TBA dan terakhir uji aktivitas antikanker in vitro
metode sitotoksik pada sel murine leukimia P388 (gambar 7).
Gambar 7 Diagram alir penelitian
Ekstraksi kulit batang L. domesticum L. (Harborne, 1996)
Bahan tanaman yang digunakan yaitu kulit batang langsat [L. domesticum
L.] basah (KBLB) dan kering (KBLK) yang dibersihkan. Kulit batang langsat Ekstraksi Kulit Batang L. domesticum L.
Analisis fitokimia
Uji toksisitas metode BSLT
Uji aktivitas antioksidasi
27
basah diblender sampai halus sedangkan untuk kulit batang kering dihaluskan dengan mesin penggiling dan diayak dengan saringan berukuran 100 mesh.
Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi. Dimasukkan sebanyak 40 g serbuk kulit batang kering ke dalam erlenmeyer, tuangi pelarut etanol 70% sebanyak 250 ml kemudian ditutup rapat sambil sesekali digoyang selama 24 jam. Saring dengan kertas saring Buchner. Diperoleh filtrat (F1) dan residu. Residu diekstraksi kembali dengan kloroform:air 1:1 diperoleh filtrat (F2) dan residu. Dengan cara yang sama dilakukan pada kulit batang basah sehingga hasil akhirnya diperoleh F1, F2, F3 dan F4. Masing-masing filtrat di rotapavor atau dibeku keringkan dengan alat freeze dryer sehingga diperoleh ekstrak kasar (lampiran 3).
Analisis fitokimia (Harborne 1996)
Uji alkaloid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan 3 mL kloroform dan 3 tetes amoniak. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan 10 tetes H2SO4 2 M. Fraksi asam diambil, kemudian ditambahkan pareaksi Meyer dan Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih oleh pareaksi Meyer dan endapan coklat oleh pareaksi Wegner. Sebagai pembanding gunakan tapak darah.
Uji Saponin dan Flavonoid. Sebanyak 1 gram ekstrak dimasukkan dalam gelas piala kemudian ditambahkan 100 ml air panas dan didihkan selama 5 menit, setelah itu disaring dan filtratnya digunakan untuk pengujian. Uji saponin dilakukan dengan pengocokkan 10 ml filtrat dalam tabung reaksi tertutup selama 10 detik kemudian dibiarkan selama 10 menit. Adanya saponin ditunjukkan dengan terbentuknya buih/busa yang stabil.
Sebanyak 10 ml filtrat yang lain ditambahkan 0.5 gram serbuk magnesium, 2ml alkohol karbohidrat (campuran HCL 37% dan etanol 95% dengan perbandingan 1:1) dan 20 ml amil alkohol kemudian dikocok kuat. Terbentuknya warna merah, kuning dan jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid.
28
Uji Triterpenoid dan Steroid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambah 2 mL etanol 30 % lalu dipanaskan dan disaring. Filtratnya diuapkan kemudian ditambah eter 1:1. Lapisan eter ditambah pareaksi Lieberman Burchard ( 3 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes H2SO4 pekat). Warna merah dan warn
