• Tidak ada hasil yang ditemukan

Potensi Aktivitas Hipokolesterol Bakteri Asam Laktat Yang Diisolasi Dari Dangke Dan Daging Sapi

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2017

Membagikan "Potensi Aktivitas Hipokolesterol Bakteri Asam Laktat Yang Diisolasi Dari Dangke Dan Daging Sapi"

Copied!
35
0
0

Teks penuh

(1)

POTENSI AKTIVITAS HIPOKOLESTEROL BAKTERI ASAM

LAKTAT YANG DIISOLASI DARI DANGKE DAN

DAGING SAPI

HASNIAR BURHAN

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(2)
(3)

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER

INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Potensi Aktivitas Hipokolesterol Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Dangke dan Daging Sapi” adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

Bogor, Februari 2017

(4)

RINGKASAN

HASNIAR BURHAN. Potensi Aktivitas Hipokolesterol Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Dangke dan Daging Sapi. Dibimbing oleh IRMA ISNAFIA ARIEF dan EPI TAUFIK.

Faktor yang mempengaruhi timbulnya penyakit kardiovaskular, diantaranya adalah peningkatan kadar kolesterol khususnya LDL yang biasa disebut sebagai hiperkolesterolemia. Usaha yang dilakukan penderita hiperkolestrolemia untuk menurunkan kolesterol tubuh adalah dengan penggunaan beberapa jenis pangan fungsional dan obat-obatan antikolesterol. Fungsi Bakteri Asam Laktat (BAL) untuk jenis strain tertentu belakangan ini dikembangkan untuk membantu menurunkan kolestrol tubuh. Kemampuan dan sifat yang dimiliki oleh masing-masing strain bervariasi sehingga perlu dilakukan evaluasi mengenai kemampuan beberapa bakteri asam laktat isolat asal dangke dan daging sapi dalam menurunkan kolesterol.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan delapan strain BAL dalam menurunkan kolesterol secara in vitro. Lactobacillus fermentum A323L, L. fermentum B111K, L. fermentum B323K, L. fermentum C113L, dan L. fermentum C212L telah berhasil diisolasi dari dangke yang merupakan sejenis keju lunak yang berasal dari kabupaten Enrekang Provinsi Sulawesi Selatan (Syah et al 2016) dan Lactobacillus plantarum IIA-2C12, L. plantarum IIA-1A5, dan Lactobacillus acidophillus IIA-2B4 diisolasi dari daging sapi (Arief et al 2011). Parameter yang digunakan yaitu uji keberadaan gen Bile Salt Hydrolase (BSH) dengan Polymerase Chain Reaction (PCR), aktivitas BSH dianalisis secara deskriptif, dan asimilasi kolesterol dianalisis menggunakan ANOVA dan dilanjut dengan uji jarak berganda Duncan.

Hasil penelitian menunjukkan delapan strain bakteri asam laktat isolat dangke dan daging sapi yang berpotensi menurunkan kolesterol yaitu L. fermentum B111K dan L. plantarum IIA-1A5. L. fermentum B111K dibuktikan dengan kemampuannya mengasimilasi kolesterol dengan persentase 4.10% dengan jumlah kolesterol terasimilasi dalam 1010 sel yaitu 0.13 mg. L. plantarum

IIA-1A5 dibuktikan dengan memiliki gen BSH, positif memiliki aktivitas BSH serta mampu mengasimilasi kolesterol dengan persentase 8.10% dengan jumlah kolesterol terasimilasi dalam 1010 sel yaitu 0.06 mg. Kesimpulan yang diproses

dari penelitian ini adalah strain bakteri yang berpotensi menurunkan kolesterol yaitu L. fermentum B111K dan L. plantarum IIA-1A5.

(5)

SUMMARY

HASNIAR BURHAN. Potentials of Hipocholesterolemic activities of Lactic Acid Bacteria Isolated from Dangke and Indonesian Beef. Supervised by IRMA ISNAFIA ARIEF and EPI TAUFIK.

Increasing cholesterol level primarily LDL (low density lipoprotein), which is known as hypercholesterolemia, is considered as one of the factors inducing cardiovascular disease. Consumption of functional food and anti-cholesterol drugs has been used by people with hypercholesterolemia to attenuate their cholesterol level. Particular strains from Lactic Acid Bacteria (LAB) have been currently developed to lower the cholesterol level. These bacteria may have various properties and dissimilar effectivity, depending on their strains. Therefore, cholesterol-lowering properties of LAB isolated from dangke and Indonesian beef need to be observed.

This study was aimed to investigate the ability of eight LAB strains in lowering cholesterol level by using in vitro study. Those strains were L. fermentum A323L, L. fermentum B111K, L. fermentum B323K, L. fermentum C113L, and L. fermentum C212L were successfully isolated from dangke, which is a soft cheese like product originated from Enrekang, South Sulawesi. In addition, L. plantarum IIA-2C12, L. plantarum IIA-1A5 and L. acidophillus IIA-2B4 were isolated from beef were also used. Variables observed were identification of Bile Salt Hydrolase (BSH) gene by Polymerase Chain Reaction (PCR) and BSH activity using descriptive analysis, cholesterol assimilation statistic evaluated by analysis of variance (ANOVA) and if the differences found among treatments, Duncan test will be used as post-hoc test.

The results demonstrated that eight strains of LAB isolated from dangke and beef that potentially showed cholesterol-lowering effects were L. fermentum B111K and L. plantarum IIA-1A5. L. fermentum B111K was able to assimilate cholesterol of 4.10% with assimilated cholesterol of 0.13 mg in 1010 cells. In

addition, L. plantarum IIA-1A5 was reported to have BSH gene and BSH activity, as well as able to assimilate cholesterol of 8.10% with assimilated cholesterol 0.06 mg in 1010 cells. It is concluded that L. fermentum B111K and L. plantarum

IIA-1A5 have a potential as hyphocholesterol agent.

(6)

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2017

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB.

(7)

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains

Pada

Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan

POTENSI AKTIVITAS HIPOKOLESTEROL BAKTERI ASAM

LAKTAT YANG DIISOLASI DARI DANGKE DAN

DAGING SAPI

HASNIAR BURHAN

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(8)
(9)
(10)

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT, atas rahmat dan karunia yang telah diberikan-Nya, Shalawat dan salam semoga senantiasa dicurahkan kepada nabi Muhammad SAW sehingga penyusunan tesis ini dapat diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Desember 2015 sampai Mei 2016 adalah potensi hipokolesterol bakteri asam laktat,dengan judul Potensi Aktivitas Hipokolesterol Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Dangke dan Daging Sapi.

Terima kasih penulis ucapkan kepada pihak-pihak yang telah banyak membantu dalam proses penyelesaian tesis ini. Dr Irma Isnafia Arief, SPt MSi, selaku ketua komisi pembimbing, dan Dr Epi Taufik, SPt MVPH MSi, selaku anggota komisi pembimbing, atas dukungan selama melakukan bimbingan kepada penulis sejak penyusunan proposal dan pelaksanaan penelitian hingga selesainya penulisan tesis ini. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Dr Irmanida Batubara, Ssi Msi dan Dr Ir Salundik Msi yang telah banyak memberikan saran. Penghargaan kepada Dikti yang telah memberikan Beasiswa Fres Graduate (FG) kepada penulis dan kepada Dwi Febrianti, Isyana Khairunisa SPt MSi, K Shelvi dan seluruh staf Laboratorium Teknologi Hasil Ternak dan Laboratorium Fakultas Peternakan IPB atas bantuannya selama penulis melaksanakan penelitian. Ungkapan terima kasih kepada Ayahanda Burhan, S.Pd dan Ibu Hasnidah, S.Pd serta Suamiku Awaluddin Ridwan, AMdPi atas doa dan dukungan yang tiada henti untuk penulis, serta saudara penulis. Disamping itu, penghargaan kepada Rajmi Faridah, SPt MSi, Andi Nurul Mukhlisah SPt MSi, Fadliah SPt, Wahyuni SPt, Setiawan Putra Syah SPt MSi telah membantu dalam teknis, doa, serta dukunganya. Teman-teman angkatan 2014 Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan atas diskusi dan masukannya selama mengikuti pendidikan.

Semoga tesis ini bermanfaat bagi masyarakat dan perkembangan ilmu pengetahuan.

(11)

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL xi

DAFTAR GAMBAR xi

DAFTAR LAMPIRAN xi

1 PENDAHULUAN

Latar Belakang 1

Perumusan Masalah 2

Tujuan Penelitian 2

Manfaat Penelitian 2

Hipotesis 2

Ruang Lingkup 3

2 METODE

Tempat dan Waktu Penelitian 4

Bahan dan Perlatan 4

Prosedur Penelitian 4

Analisis Data 7

3 HASIL DAN PEMBAHASAN

Keberadaan Gen BSH dengan PCR 7

Aktivitas BSH (Bile Salt Hydrolase) 12

Asimilasi Kolesterol 13

4 SIMPULAN DAN SARAN 15

DAFTAR PUSTAKA 15

LAMPIRAN 18

(12)

DAFTAR TABEL

1. Uji aktivitas BSH isolat BAL 12

2. Jumlah kolesterol dan persentase kolesterol yang diasimilasi oleh isolat BAL serta jumlah kolesterol terasimilasi dalam 1010 sel bakteri pada

MRS yang mengandung kolesterol PEG 600 (100 µg/mL) selama 24 jam 14

DAFTAR

GAMBAR

1. Diagram alir penelitian 3

2. Elektroforesis agarosa gen BSH 8

3. Pensejajarangen BSH L. plantarum IIA-1A5 dengan gen BSH

L. plantarum Lp529 kode akses FJ439771 and FJ439775 dari GenBank 10 4. Pohon pilogeni BSH L. plantarum IIA-1A5 dengan gen BSH

L. plantarum Lp529 kode akses FJ439771 and FJ439775 dari GenBank 10 5. Pensejajaran sekuen asam amino BSH L. plantarum IIA-1A5 dengan

BSH L. plantarum Lp529 dengan kode akses FJ439775 dan FJ439771 11 6. Viabilitas bakteri pada media MRSB yang mengandung kolesterol

PEG 600 (100 µg/mL ) selama 24 jam 13

DAFTAR

LAMPIRAN

1. Elektroforesis ekstraksi DNA isolat BAL dangke dan daging sapi 19 2. Hasil blast urutan basa gen BSH L. plantarum IIA-1A5 19 3. Hasil blast urutan asam amino BSH L. plantarum IIA-1A5 20 4. ANOVA jumlah kolesterol yang diasimilasi oleh isolat BAL pada

MRS yang mengandung kolesterol PEG 600 (100 µg/mL) selama 24 jam 21 5. ANOVA persentase kolesterol yang diasimilasi oleh isolat BAL pada

MRS yang mengandung kolesterol PEG 600 (100 µg/mL) selama 24 jam 21 6. ANOVA jumlah kolesterol terasimilasi dalam 1010 sel bakteri pada MRS

yang mengandung kolesterol PEG 600 (100 µg/mL) selama 24 jam 21

(13)

1

1 PENDAHULUAN

Latar Belakang

Kardiovaskular diperkirakan WHO pada tahun 2030 masih penyebab kematian utama di dunia (FAO/WHO 2002). Faktor yang mempengaruhi timbulnya penyakit kardiovaskular, diantaranya adalah peningkatan kadar kolesterol khususnya LDL (Low Density Lipoprotein) yang biasa disebut sebagai hiperkolesterolemia. Hiperkolesterolemia terjadi jika kadar kolesterol melebihi batas normal. Penyebab meningkatnya kadar kolesterol dalam tubuh dikarenakan konsumsi kandungan nutrisi makanan yang mengandung kadar kolesterol yang tinggi. Kadar kolesterol LDL menjadi berlebih sedangkan kolesterol baik HDL (High Density Lipoprotein) cukup sedikit sehingga tidak mampu melawannya. Usaha yang dilakukan penderita hiperkolesterolemia untuk menurunkan kolesterol tubuh adalah dengan penggunaan beberapa jenis pangan fungsional dan obat-obatan antikolesterol. Penggunaan obat-obat-obatan tersebut dilaporkan menimbulkan efek samping terhadap penderitanya. Fungsi probiotik untuk jenis strain tertentu belakangan ini dikembangkan untuk membantu menurunkan kolesterol tubuh. Probiotik yaitu laktobasili mampu menurunkan kolesterol diduga karena adanya enzim Bile salt hydrolase (BSH) mengkonjugasi garam empedu serta mampu mengasimilasi kolesterol dalam usus halus. BAL (bakteri asam laktat) yang mampu menurunkan kolesterol memiliki sifat yaitu tahan terhadap garam empedu.

Sifat probiotik BAL salah satunya yaitu tahan terhadap asam dan garam empedu (Liévin-Le Moal dan Servin 2014; Setyawardani et al. 2014; Arief et al. 2015). Kemampuan mikroba usus mendekonjugasi asam empedu dipertimbangkan menjadi salah satu aktivitas probiotik (FAO/WHO 2002). Asam empedu disintesis di dalam hati dari kolesterol dan disekresi sebagai konjugat dari glisin maupun taurin ke dalam usus dua belas jari dan akan berperan dalam memfasilitasi penyerapan lemak dan mengikuti sirkulasi enterohepatik. Selama disirkulasi dalam saluran pencernaan, garam empedu dapat mengalami modifikasi oleh mikrobiota usus, yaitu dekonjugasi garam empedu oleh enzim hidrolisis garam empedu (BSH) dengan melepaskan residu asam amino dan terbentuk asam empedu terdekonjugasi (asam kolat) (Kumar et al 2012).

Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa beberapa BAL dapat menurunkan kolesterol secara in vitro maupun in vivo (Usman dan Hosono 1999: Liong dan Shah 2005; Begley et al., 2006; Kimoto-Nira et al., 2007; Lye et al. 2010). Pada subjek yang hiperlipidemik umumnya efek yang diberikan dari konsumsi probiotik adalah penurunan kadar kolesterol, sedangkan pada subjek yang normal, efek yang umumnya terjadi adalah penurunan kadar trigliserida (Pereira dan Gibson 2002).

(14)

2

P.pentosaceus 2-A16 yang mampu mengasimilasi paling besar. Beberapa BAL memiliki kemampuan dalam menurunkan kadar kolesterol. Kemampuan dan sifat yang dimiliki oleh masing-masing strain bervariasi sehingga perlu dilakukan seleksi keberadaan gen BSH pada isolat asal dangke (sejenis keju lunak yang berasal dari kabupaten Enrekang Provinsi Sulawesi Selatan) dan daging sapi (daging sapi yang bersal dari pasar tradisional Bogor Jawa Barat). Evaluasi mengenai kemampuan beberapa bakteri asam laktat isolat asal dangke dan daging sapi dalam menurunkan kolesterol, berdasarkan kemampuannya untuk mengasimilasi kolesterol dan aktivitas enzim BSH yang dimilikinya.

Perumusan Masalah

Pengembangan fungsi probiotik untuk jenis strain tertentu belakangan ini meluas salah satunya untuk tujuan penurunan kolestrol. Untuk mengetahui aktivitas fungsional isolat BAL lokal sebagai penurun kolestrol, perlu diketahui: 1. Adakah gen BSH pada isolat BAL asal dangke dan daging sapi?

2. Bagaimana analisis aktivitas enzim BSH dari masing-masing isolat BAL asal dangke dan daging sapi?

3. Bagaimana analisis kemampuan isolat BAL asal dangke dan sapi dalam mengasimilasi kolesterol secara in vitro.

Tujuan Penelitian

Secara umum penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi kemampuan BAL menurunkan kolestrol. Adapun tujuan khusus dari penelitian ini adalah sebagai berikut:

1. Seleksi dan mengindentifikasi keberadaan gen BSH pada isolat BAL asal dangke dan daging sapi

2. Menganalisis aktivitas isolat BAL asal dangke dan daging sapi.

3. Menganalisis kemampuan isolat BAL asal dangke dan daging sapi dalam mengasimilasi kolesterol.

Manfaat Penelitian

Hasil penelitian diharapkan dapat bermanfaat dan berperan penting dalam penambahan wawasan ilmu pengetahuan, khususnya dalam bidang mikrobiologi. Penelitian ini dapat menjadi bahan yang menyediakan informasi tentang kemampuan BAL dalam menurunkan kolestrol yang diperoleh dari isolat asal dangke dan daging sapi lokal.

Hipotesis

(15)

3

Ruang Lingkup

Penelitian ini meliputi seleksi keberadaan gen BSH, uji aktivitas BSH dan uji asimilasi kolestrol pada isolat BAL asal dangke dan daging sapi. Berikut disajikan diagram alir penelitian (Gambar 1)

Gambar 1. Diagram alir penelitian Isolat BAL asal

dangke dan daging sapi

Uji keberadaan gen

BSH Uji Aktivitas BSH Uji Asimilasi kolestrol

Analisis: Zona Perisipitasi pada

Media Analisis: Konsentrasi Kolestrol terasimilasi Elektroforesis Agarosa

Amplifikasi PCR Ekstraksi DNA

Isolat BAL berpotensi sebagai

hipokolestrol Sekuensing gen

(16)

4

2 METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Divisi Teknologi Hasil Ternak, Laboratorium Genetika Molekuler, Laboratorium Terpadu Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Waktu pelaksanaan penelitian ini dari bulan Desember 2015 – Mei 2016.

Bahan dan Peralatan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri atas kultur bakteri asam laktat isolat dangke dan daging, Tris HCl buffer, EDTA, glukosa, NaOH, SDS, KCH3COO, asam asetat, akuades, cloroform, RNAse, 2-propanol, etanol

70%, Tris EDTA buffer, primer forward, primer reverse, dNTPs, MgCl2, phire hot start II DNA polymerase, phire buffer reaction 5x, double destilled H2O, gel

agarose, buffer TBE, loading dye, bile salt, CaCl2, de Mann Rogosa Sharpe Broth (MRSB) (Oxoid), de Mann Rogosa Sharpe Agar (MRSA) (Oxoid), Bakteriologi Agar (BA), kertas saring, gas generating kit, kolesterol PEG 600 (Sigma-Aldrich 250 mg), KOH, Etanol 90%, hexan, gas N2, o-phthalaldehyde, H2SO4, buffer

pepton water (Oxoid), kertas saring, spiritus, aluminium foil, gloves, alkohol. Alat-alat yang digunakan terdiri atas sentrifus, mikropipet, vorteks, rak tabung, mesin PCR, alat elektroforesis, neraca analitik, microwave, tabung reaksi, tip, waterbath, laminar, inkubator, magnetik stirer, spectrofotometer, bunsen, autoklaf, vial.

Prosedur Penelitian

Pemilihan BAL yang digunakan yaitu BAL yang memiliki sifat tahan terhadap garam empedu. Jenis BAL yang dijadikan materi utama dalam penelitian ini adalah:

1. BAL asal dangke yang dipilih yaitu L. fermentum A323L, L. fermentum B111K, L. fermentum B323K, L. fermentum C113L, dan L. fermentum C212L (Syah et al 2016).

2. BAL asal daging sapi: L. plantarum IIA-2C12, L. plantarum IIA-1A5, dan L. acidophillus IIA-2B4 (Arief et al 2011).

(17)

5

Uji Keberadaan Gen BSH dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) Ekstraksi DNA (Modifikasi Sambrook dan Russell 2001)

Kultur BAL yang diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37 °C

disentrifugasi dengan suhu 4 °C 10.000 x g selama 1 menit dan supernatannya

dibuang. Kemudian endapan ditambahkan 200 µl larutan I (25 mM Tris- HCl buffer pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0, 50 mM glukosa) campuran kemudian diresuspensi dengan mempipet dan diinkubasi selama 5 menit dengan suhu ruang. Selanjutnya ditambahkan 400 µl larutan II (1.2 N NaOH dan 1% SDS), campur dengan pelan dan diinkubasi dengan es selama 5 menit. Kemudian ditambahkan larutan III (60 ml 5 M KCH3COO, 11.5 ml asam asetat, 28.5 ml dH2O) sebanyak

300 µl divorteks dan diinkubasi 5 °C dengan suhu 4 °C 10.000 x g selama 1 menit. Pindahkan supernatan pada vial yang baru dan ditambahkan 1 µl dengan 1 mg/ml RNAse, dicampur dengan pelan dan diinkubasi dengan suhu ruang selama 15 menit. Kemudian ditambahkan 2-propanol dan dicampur dengan pelan dan sentrifugasi selama 10 menit dengan suhu 4 °C 10000 x g supernatan dibuang. Selanjutnya ditambahkan 500 µl etanol 70% dan dicampur dengan pelan dan disentrifugasi selama 1 menit dan supernatan dibuang selanjutnya dikeringkan sampai kering. Kemudian dilarutkan dengan Tris EDTA buffer sebanyak 100 μl sebelum digunakan untuk PCR.

Amplifikasi PCR (Polymerase Chain Reaction) (Modifikasi Kim et al. 2004)

Seleksi gen BSH dilakukan dengan PCR dengan primer universal yang digunakan oleh Kim et al. (2004),BSH F 1-24 (5' AGTCCATATGTGCACTGGT GTCCGTTTCTCC-3') BSH R 951–931(5'-AGTCAAGCTTCAATCGGCGGTG terdiri dari tahap denaturasi 94 °C selama 1 menit tahap annealing dengan suhu 55 °C selama 30 detik. Tahap ekstensi dengan suhu 72 °C selama 1 menit. Tahap post

esktensi selama 10 menit pada suhu 72 °C. Produk PCR diambil dan disimpan pada suhu 4°C untuk selanjutnya diperiksa dengan menggunakan elektroforesis agarosa 1%.

Elektroforesis Agarosa

Elektroforesis agarosa dengan modifikasi dari Arief et al. (2015). Sebanyak 1% agarosa (b/v) dipanaskan hingga mendidih dengan pelarut buffer Tris asetat (TAE) 1×. Campuran kemudian didinginkan dan diputar dengan magnetic stearer pada kecepatan 1000 x g. Larutan yang masih hangat dituangkan ke dalam tray elektroforesis, lalu dibiarkan sampai dingin dan memadat selama lebih kurang 1 jam, lalu sisir diangkat. Buffer TAE 1× pada elektroforesis dituangkan, kemudian tray yang berisi agarosa padat ditempatkan pada alat elektroforesis sampai terendam oleh buffer.

(18)

6

menit. Hasil elektroforesis agarosa kemudian direndam di dalam ethidium bromide selama 10 menit.

Sekuensing

Sekuensing produk PCR sampel BAL gen BSH dilakukan dengan menggunakan mesin sekuenser (ABI Prims 3100 - Avant Genetic Analyzer) pada fragmen forward dan reverse melalui jasa dari First Base di Selangor, Malaysia. Hasil sekuensing dirubah dalam bentuk asam amino dan disejajarkan dengan menggunakan MEGA 6

Uji Aktivitas Bile Salt Hydrolase (BSH)

Uji aktivitas enzim BSH menggunakan metode modifikasi Sedlackova (2014). MRSA dengan pH 5.6 (MRSB, BA, bile salt 0.3% w/v) dan CaCl2 (0.375 g/l)). Kemudian cawan petri dinkubasi dengan secara anaerob pada suhu 37 °C

selama 48 jam. BAL diinokulasi pada MRSA dengan cara meletakkan 80 µl kultur dalam sumuran pada media kontrol dan media uji dan diinkubasi selama 72 jam dengan suhu 37 °C. Adanya aktivitas BSH dalam mengkonjugasi garam empedu ditandai dengan terbentuknya zona presipitasi (endapan) disekitar koloni pada media agar yang mengandung CaCl2 dan bile salt, karena asam kolat hasil dekonjugasi oleh enzim BSH akan bereaksi dengan CaCl2 membentuk garam

yang mengendap.

Uji Asimilasi Kolesterol in vitro

Uji asimilasi dilakukan dengan metode Tomaro-Duchesneau (2014) yaitu dengan menggunakan kolesterol PEG 600 ditambahkan ke dalam MRSB dengan konsentrasi akhir 100 µg/ml. Sebanyak 1% (v/v) inokulum BAL probiotik yang disegarkan selama 24 jam pada suhu 37 °C. Setelah inkubasi 24 jam viabilitas

bakteri diukur dengan metode hitung cawan. Untuk analisis kolesterol, suspensi probiotik disentrifugasi dengan 4000 x g selama 10 menit pada suhu 4 °C untuk

memperoleh supernatannya.

Supernatan yang diperoleh dipindahkan pada vial baru sebanyak 500 µl kemudian ditambahkan 500 µl KOH 33% dan 1 ml etanol. Larutan kemudian divorteks selama 1 menit dan diinkubasi dengan suhu 37 °C selama 15 menit

biarkan dalam suhu ruang. Pada fase separasi larutan ditambahkan 1 ml H2O dan 1.5 ml hexane dan divorteks selama 1 menit. Fase larutan air dan larutan hexane menjadi dua fase, bagian atas larutan dipindakhan pada vial baru sebanyak 500 µl untuk kemudian dievaporasi dengan gas Nitrogen. Setelah kering ditambahkan 1

ml 50 mg/dl pereaksi o-phthalaldehyde yang dilarutkan dengan asam asetat dan dicampukan dengan sampel. Setelah bercampur ditambahkan H2SO4 pekat

sebanyak 250 µl pada sampel dan divorteks selama 1 menit. Sampel kemudian diinkubasi selama 20 menit pada suhu ruang kemudian absorbansinya diukur dengan panjang gelombang 570 nm menggunakan spektrofotometer UV.

(19)

7

Asimilasi Kolesterol (mg/mL) Viabilitas sel (cfu/mL)×1010

Viabilitas sel BAL (cfu/mL) x 7.81; 15.6; 31.25; 62.5; 125; 250; dan kolesterol pada MRSB (R2=0.9875). Asimilasi kolesterol oleh strain BAL probiotik ditentukan sebagai berikut:

1. Asimilasi kolesterol (µg/ml)=[kolesterol (µg/ml)]0jam–[Kolesterol (µg/ml)]24jam

2. Persentase asimilasi kolesterol = � � � � � µg/

� � � µg/ 0 �

×

%

3. Asimilasi kolesterol dalam 1010 sel =

Analisis Data

Analisis data secara deskriptif digunakan pada parameter uji keberadaan gen BSH dan aktivitas BSH. Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) untuk uji asimilasi kolesterol. Data yang diperoleh dianalisis ragam ANOVA diikuti oleh uji lanjut dengan delapan perlakuan dengan 3 ulangan (Steel dan Torrie,1995). Model statistik yang digunakan yaitu:

Yij = µ + τi + εij; τi = Pengaruh strain isolat BAL dangke dan daging ke-i

εij = Pengaruh galat percobaan dari spesies isolat ke-i dan ulangan ke-j

3 HASIL DAN PEMBAHASAN Keberadaan Gen BSH dengan PCR

Hasil ekstraksi DNA pada isolat BAL menghasilkan konsentrasi DNA yang berbeda-beda. Ekstraksi DNA dielektroforesis dan hasil elektroforesis menunjukkan DNA berhasil diisolat, hal ini ditunjukkan adanya pita DNA yang terdeteksi pada gel agarose. Hal tersebut menunjukkan bahwa metode ekstaksi DNA yang digunakan baik untuk isolat BAL yang diisolasi dari dangke dan daging sapi. Hasil elektrforeisis ekstraksi DNA dapat dilihat pada Lampiran 1.

(20)

8

982 bp

Gambar 2 Elektroforesis agarosa gen BSH. Keterangan:M : Marker (DNA ladder 100 bp)(1) L. fermentum C222L (2) L. plantanrum IIA-1A5 (3) L. fermentum C113L (4) L. fermentum B111K (5) L. fermentum B323K (6) L. plantarum IIA-2C12 (7) L. fermentum A323L (8) L. acidophillus IIA-2B4

Pada Gambar 2 menunjukkan bahwa dari hasil PCR tidak semua BAL yang diisolasi pada dangke dan daging sapi terlihat pita DNA yang tunggal. Pita DNA yang terlihat pada hasil uji elektroforesis menunjukkan bahwa hanya L. plantarum IIA-1A5 yang terlihat pita tunggal. Amplifikasi fragmen L. plantarum IIA-1A5 berada pada kisaran 900-1000 bp. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa bakteri L. plantarum memiliki gen BSH dan letak pita DNA gen BSH berada pada kisaran 800-1000 bp (Bin dan Jiang 2011; Kim et al. 2004).

Produk PCR pita DNA yang terlihat, dilanjutkan dengan sekuensing. Sekuensing merupakan salah satu cara untuk mengidentifikasi suatu gen. Identitas suatu gen yang telah diketahui sekeunnya dapat ditentukan dengan membandingkan data sekuen isolat BAL internasional yang terdeposit di GenBank. Panjang produk DNA gen BSH L. plantarum IIA-1A5 yaitu 982 bp. Analisis kemiripan dilakukan dengan menggunakan program BLAST NCBI (secara online) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Hasil blast gen BSH L. plantarum IIA-1A5 menunjukkan kedekatannya dengan L. plantarum Lp529 dengan kode akses FJ439771 and FJ439775 ditunjukkan pada Lampiran 2. Proses selanjutnya adalah melakukan alignment atau pensejajaran urutan basa gen. Hasil alignment menunjukkan bahwa urutan basa dari gen BSH L. plantarum IIA-1A5 BAL mampu disejajarkan dengan baik dan mempunyai susunan basa tetap atau sama sesuai analisis dengan menggunakan ClustalW. Pensejajaran gen BSH L. plantarum IIA-1A5 disajikan pada Gambar 3.

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

5 15 25 35 45 55 BSH_Lp.IIA ATGTGTACTA GTTTTACGAT TCAAACCACG GCGGGTGATC AGTTTTAAGC ACGCACCATG

FJ439771.1 ATGTGTACTA GTTTAACGAT TCAAACCACG GCGGGTGATC AGTTTTTAGC ACGCACCATG FJ439775.1 ATGTGTACTA GTTTAACGAT TCAAACCACG GCGGGTGATC AGTTTTTAGC ACGCACCATG Clustal Co ********** **** ***** ********** ********** ****** *** **********

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

65 75 85 95 105 115 BSH_Lp.IIA GACTTTGCTT TTGAACTTGG TGGTCGACCA GTGGCAATCC CACGGAATCA ACATTTTGAC

(21)

9

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

125 135 145 155 165 175 BSH_Lp.IIA AGTGTTACCA ATGCGGACGG TTTGGATAGC CCGTATAGCT TTGTTGGAAC GGGCCGTGAC

FJ439771.1 AGTGTTACCA ATGCGGACGG TTTTGATAGC CCGTATAGCT TTGTTGGAAC GGGCCGTGAC FJ439775.1 AGTGTTACCA ATGCGGACGG TTTTGATAGC CCGTATAGCT TTGTTGGAAC GGGCCGTGAC Clustal Co ********** ********** *** ****** ********** ********** **********

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

185 195 205 215 225 235 BSH_Lp.IIA TTAAATGGCT ATATCTTTGT CGATGGTGTC AAGGAGCACG GGGTCAGTGC TGCTGCACTC

FJ439771.1 TTAAATGGCT ATATCTTTGT CGATGGTGTC AATGAGCACG GGGTCAGTGC TGCTGCACTC FJ439775.1 TTAAATGGCT ATATCTTTGT CGATGGTGTC AATGAGCACG GGGTCAGTGC TGCTGCACTC Clustal Co ********** ********** ********** ** ******* ********** **********

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

245 255 265 275 285 295 BSH_Lp.IIA TATTTCTCGG GACAAGCTCA CTTTACTCAG CAAACTAAGG CTGGCAAGGT TAACTTCGCA

FJ439771.1 TATTTCTCGG GACAAGCTCA CTTTACTCAG CAGACTAAGG CTGGCAAGGT TAACTTGGCA FJ439775.1 TATTTCTCGG GACAAGCTCA CTTTACTCAG CAGACTAAGG CTGGCAAGGT TAACTTGGCA Clustal Co ********** ********** ********** ** ******* ********** ****** ***

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

305 315 325 335 345 355 BSH_Lp.IIA CCCCACGAAG TTTTAATGTG GATTTTAGGA ACCGTGAAGA GCACCGCTGA ATTACGCGAA

FJ439771.1 CCCCACGAAG TTTTAATGTG GATTTTAGGA AACGTGAAGA GCACCGCTGA ATTAGGCGAA FJ439775.1 CCCCACGAAG TTTTAATGTG GATTTTAGGA AACGTGAAGA GCACCGCTGA ATTAGGCGAA Clustal Co ********** ********** ********** * ******** ********** **** *****

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

365 375 385 395 405 415 BSH_Lp.IIA CGGATTGCTG ACTTGAACGT GATGTAAGCC GCCGCGCCAC TATTGAATAT TGTGGTACCA

FJ439771.1 CGGATTGCTG ACTTGAACGT GATGGAAGCC GCCGCGCCAC TATTGAATAT TGTGGTACCA FJ439775.1 CGGATTGCTG ACTTGAACGT GATGGAAGCC GCCGCGCCAC TATTGAATAT TGTGGTACCA Clustal Co ********** ********** **** ***** ********** ********** **********

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

425 435 445 455 465 475 BSH_Lp.IIA CTAAACTGGA TCATTAGTGA CAAGAGTGGT TCTACTTACG TCTTAGAATT GGAAAATGAC

FJ439771.1 CTACACTGGA TCATTAGTGA CAAGAGTGGT TCTACTTACG TCTTAGAATT GGAAAATGAC FJ439775.1 CTACACTGGA TCATTAGTGA CAAGAGTGGT TCTACTTACG TCTTAGAATT GGAAAATGAC Clustal Co *** ****** ********** ********** ********** ********** **********

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

485 495 505 515 525 535 BSH_Lp.IIA GGGGTTCACT ACATGAAGAA TCCGGTGGGC GTCATGACGA ACACACCAGA ATTTGAATGG

FJ439771.1 GGTGTTCACT ACATGAAGAA TCCGGTGGGC GTCATGACGA ACACACCAGA TTTTGAATGG FJ439775.1 GGTGTTCACT ACATGAAGAA TCCGGTGGGC GTCATGACGA ACACACCAGA TTTTGAATGG Clustal Co ** ******* ********** ********** ********** ********** *********

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

545 555 565 575 585 595 BSH_Lp.IIA CATCTCAAGA ATTTGAGTAA TTACGTCAAC TTACAACCCG GCCCTCATCC TAGTCGTCAA

FJ439771.1 CATCTCAAGA ATTTGAGTAA TTACGTCAAC TTACAACCCG GCCCTCATCC TAGTCGTCAA FJ439775.1 CATCTCAAGA ATTTGAGTAA TTACGTCAAC TTACAACCCG GCCCTCATCC TAGTCGTCAA Clustal Co ********** ********** ********** ********** ********** **********

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

605 615 625 635 645 655 BSH_Lp.IIA TACGGTGACA TGACGGTGAA TCCTTTCGGT CCTGGAACTG GGGCGTTGGG AATGCCTGGT

FJ439771.1 TACGGTGACA TGACGGTGAA TCCTTTCGGT CCTGGAACTG GGGCGTTGGG AATGCCTGGT FJ439775.1 TACGGTGACA TGACGGTGAA TCCTTTCGGT CCTGGAACTG GGGCGTTGGG AATGCCTGGT Clustal Co ********** ********** ********** ********** ********** **********

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

665 675 685 695 705 715 BSH_Lp.IIA GGCTATACGT CAGTTGCACG CTTCGTTCGG ACGGTCTTCA TGCGTGAACA TACGGATGCA

(22)

10

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

725 735 745 755 765 775 BSH_Lp.IIA GGAACGACTG ATGCAGAAGC TGTAAACGCA TTATCACACA TGCTGAACTC AGTGGAGATT

FJ439771.1 GTAACGACTG ATGCAGAAGC TGTCAACGCA TTATCACACA TGCTGAACTC AGTGGAGATT FJ439775.1 GTAACGACTG ATGCAGAAGC TGTCAACGCA TTATCACACA TGCTGAACTC AGTGGAGATT Clustal Co * ******** ********** *** ****** ********** ********** **********

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

785 795 805 815 825 835 BSH_Lp.IIA CCTAAGGGCG TTAAGATGCA AGATAACGGG ACGCCAGATT ATACCCAGTA CCGCGCCTAT

FJ439771.1 CCTAAGGGCG TTAAGATGCA AGATAACGGG ACGCCAGATT ATACCCAGTA CCGCGCCTAT FJ439775.1 CCTAAGGGCG TTAAGATGCA AGATAACGGG ACGCCAGATT ATACCCAGTA CCGCGCCTAT Clustal Co ********** ********** ********** ********** ********** **********

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

845 855 865 875 885 895 BSH_Lp.IIA ATGAGCATGA ATGAACCAGC ATTTTACATG CAACCATACG GGGATCAGAC GATTACGCGG

FJ439771.1 ATGAGCATGA ATGAACCAGC ATTTTACATG CAACCATACG CGGATCAGAC GATTACGCGG FJ439775.1 ATGAGCATGA ATGAACCAGC ATTTTACATG CAACCATACG CGGATCAGAC GATTACGCGG Clustal Co ********** ********** ********** ********** ********* **********

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

905 915 925 935 945 955 BSH_Lp.IIA GTCGAATTGA CACCAGCTTT AATGACGGCC GCGCAACCGA CTGAATTTGA ATTAAAGACA

FJ439771.1 GTCGAATTGA CACCAGCTTT AATGACGGCC GCGCAACCGA CTGAATTTGA ATTAAAGACA FJ439775.1 GTCGAATTGA CACCAGCTTT AATGACGGCC GCGCAACCGA CTGAATTTGA ATTAAAGACA Clustal Co ********** ********** ********** ********** ********** ********** plantarum Lp529 kode akses FJ439771 and FJ439775 dari GenBank Penyusunan pohon filogenetik dilakukan dengan menggunakan program perangkat lunak MEGA6 . Hasil pohon filogeni disajikan pada Gambar 4. Pohon filogeni menunjukkan bahwa L.plantarum IIA-IA5 98% homolog dengan gen BSH L. plantarum Lp529 dengan kode akses FJ439771 and FJ439775 dari GenBank. Kesamaan antara L.plantarum IIA-IA5 dengan L. plantarum Lp529 bsh FJ439771 and FJ439775 memiliki nilai boostrap lebih dari 95%. Nilai boostrap tersebut mempunyai arti bahwa topologi percabangan tersebut sangat akurat, konsisten atau tidak akan berubah walaupun dilakukan dengan metode penyusunan pohon filogenetik lainnya (Horiike et al. 2009).

(23)

11

Gen BSH pada L. plantarum IIA-1A5 dengan panjang produk 982 bp ditranslate ke urutan asam amino. Hasil blast asam amino tersebut menghasilkan (Ntn-hydrolase superfamily) menunjukkan bahwa urutan asam amino tersebut merupakan enzim BSH. Blast dari GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) urutan asam amino L. plantarum IIA-1A5 disajikan pada Lampiran 3. Menurut Tanaka et al (2000) ikatan C-24 N-acyl dihidrolisis oleh BSH yang terhubung asam empedu dengan konjugasi asam amino. N-terminal nucleophilic hydrolases (Ntn) diklarifikasikan sebagai enzim BSH, yang sama dengan penicillin amidases, keduanya sama-sama memiliki catalytic N-terminal cysteine residu.

Proses selanjutnya adalah melakukan pensejajaran urutan asam amino dari gen BSH L. plantarum IIA-1A5 dengan urutan asam amino BSH L. plantarum Lp529 dengan kode akses FJ439771 and FJ439775. Urutan asam amino mampu disejajarkan dengan baik dan mempunyai susunan asam amino tetap atau sama sesuai analisis dengan menggunakan ClustalW. Pensejajaran urutan asam amino BSH L.plantarum IIA-1A5 disajikan pada Gambar 5.

10 20 30 40 50 60

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| BSH Lp IIA 1A5 MCTSGTIQTT AGDQFDARTM DFAFELGGRP VAIPRNSHFD SVTNADAFDS PYSFVGTGRD BSH FJ439775 MCTSLTIQTT AGDQFLARTM DFAFELGGRP VAIPRNHHFD SVTNADGFDS PYSFVGTGRD BSH FJ439771 MCTSLTIQTT AGDQFLARTM DFAFELGGRP VAIPRNHHFD SVTNADGFDS PYSFVGTGRD

70 80 90 100 110 120 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

BSH Lp IIA 1A5 LNGYIFVDGL NEHGVSAAAL YFSGQAHFTQ QTKAGKVTLY PHEVLMWILA NVKSTAEEGE BSH FJ439775 LNGYIFVDGV NEHGVSAAAL YFSGQAHFTQ QTKAGKVNLA PHEVLMWILG NVKSTAELGE BSH FJ439771 LNGYIFVDGV NEHGVSAAAL YFSGQAHFTQ QTKAGKVNLA PHEVLMWILG NVKSTAELGE

130 140 150 160 170 180 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

BSH Lp IIA 1A5 RIADLNVLEA AAPLLNIVVP LLWIISDKSG STYVLELEND KVHYMKNPVG VMTNTPDTEW BSH FJ439775 RIADLNVMEA AAPLLNIVVP LHWIISDKSG STYVLELEND GVHYMKNPVG VMTNTPDFEW BSH FJ439771 RIADLNVMEA AAPLLNIVVP LHWIISDKSG STYVLELEND GVHYMKNPVG VMTNTPDFEW

190 200 210 220 230 240 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

BSH Lp IIA 1A5 HLKNLSNYVN LQPGPHPSRQ YGDMTVNPFG PGTGALGMPG DYTSVARFVR TVFMREHTDA BSH FJ439775 HLKNLSNYVN LQPGPHPSRQ YGDMTVNPFG PGTGALGMPG DYTSVARFVR TVFMREHTDA BSH FJ439771 HLKNLSNYVN LQPGPHPSRQ YGDMTVNPFG PGTGALGMPG DYTSVARFVR TVFMREHTDA

250 260 270 280 290 300 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

BSH Lp IIA 1A5 VTTDEEAVNA LSHMLNSVEI PKGVKMQDNG TPDYTQYRAY MSMNEPAFYM QPYADQTITR BSH FJ439775 VTTDAEAVNA LSHMLNSVEI PKGVKMQDNG TPDYTQYRAY MSMNEPAFYM QPYADQTITR BSH FJ439771 VTTDAEAVNA LSHMLNSVEI PKGVKMQDNG TPDYTQYRAY MSMNEPAFYM QPYADQTITR

310 320 ....|....| ....|....| ....|... BSH Lp IIA 1A5 VFLTSALMTA AQPTEFELKT TQQFRNAN BSH FJ439775 VELTPALMTA AQPTEFELKT TQQFRLAN BSH FJ439771 VELTPALMTA AQPTEFELKT TQQFRLAN

Gambar 5 Pensejajaran sekuen urutan basa BSH L. plantarum IIA-1A5 dengan BSH L. plantarum Lp529 dengan kode akses pada Gen Bank FJ439775 dan FJ439771.

(24)

12

dibuktikan dari kesesuaian urutan asam amino BSH C1, D20, Y82, N175, dan R228 yang menunjukkan bahwa sangat konsisten serta karakterisasi struktur dan kesesuaian urutan BSH mendukung peran asam amino di dalam katalisis.

L. plantarum Lp529 merupakan BAL yang diisolasi dari feses manusia yang memiliki susunan basa gen BSH dengan kode akses FJ439775 dan FJ439771 (Jiang et al. 2010). Enzim BSH pada bakteri memberikan keuntungan khusus bagi bakteri probiotik yang tumbuh pada lingkungan yang penuh persaingan seperti saluran pencernaan dengan memberikan daya tahan yang lebih baik terhadap garam empedu. Hal tersebut membantu menurunkan kolesterol (Begley et al. 2006).

Aktivitas BSH (Bile Salt Hydrolase)

Pengujian aktivitas BSH pada penelitian ini dilakukan secara in vitro, dengan melihat zona endapan putih yang terbentuk pada media MRSA yang telah ditambahkan bile salt dan CaCl2. Hasil pengujian aktivitas BSH secara in vitro pada delapan strain BAL yang disajikan pada Tabel 1:

Tabel 1 Uji aktivitas BSH isolat BAL

No. Isolat BAL Endapan garam

Keterangan: N = Negatif garam, P = Positif garam

L. plantarum IIA-1A5 yang positif memiliki aktivitas BSH dari 8 isolat yang diuji. Hal ini ditunjukkan dengan adanya garam yang berwarna putih. Kondisi ini menandakan adanya aktivitas BSH dapat diketahui dengan terbentuknya endapan putih disekitar koloni, karena asam empedu hasil dekonjugasi (garam empedu bebas) oleh enzim BSH akan bereaksi dengan CaCl2

(25)

13

membebaskan 1 μmol asam amino per menit dari substrat yangdiberi perlakuan. Hasil pengujian tersebut menunjukkan adanya aktivitas BSH pada L. acidophilus, L. casei, dan L. bulgaricus yang berkisar antara 0.25-1.81 U/mL.

Mekanisme penurunan kolesterol oleh aktivitas BSH diketahui mampu meningkatkan sekresi enzim Bile Salt Hydolase. Hal ini akan mengakibatkan terjadinya dekonjugasi asam empedu dalam bentuk asam kolat bebas. Zat tersebut menjadi sulit diabsorsi kembali melalui sirkulasi enterohepatic dan akan lebih banyak asam empedu yang disekresikan melalui feses. Kondisi ini akan berakibat kebutuhan kolesterol dalam tubuh meningkat dan akibatnya kadar kolesterol dalam darah akan berkurang (Surono 2004).

Asimilasi Kolesterol

Pertumbuhan BAL pada MRSB yang mengandung kolesterol ditunjukkan pada Gambar 6. BAL mampu tumbuh pada media MRSB yang mengandung kolesterol PEG 600 selama 24 jam dengan suhu 37 ºC dengan rataan pertumbuhan dipangkat 109. L. plantanrum IIA-1A5 kemampuan pertumbuhannya lebih tinggi yaitu sebesar 2.54×109 cfu/mL. L. fermentum B111K kemampuan

pertumbuhannya rendah yaitu sebesar 1.17×109 cfu /mL.

Gambar 6 Viabilitas bakteri pada media MRSB yang mengandung kolesterol PEG 600 (100 µg/mL ) selama 24 jam. (a) L. fermentum A323L (b) L. fermentum B111K (c) L. fermentum B323K (d) L. fermentum C113L (e) L. fermentum C222L (f) L. plantanrum IIA-1A5 (g) L.acidophillus IIA-2B4 (h) L. plantarum IIA-2C12

(26)

14

sesuai dengan penelitian (Tomaro-Duchesneau et al., 2014) bahwa persentase asimilasi kolesterol Lactobacillus reuteri NCIMB 702656 lebih tinggi dari L. plantarum ATCC 14917 sedangkan pada jumlah kolesterol terasimilasi dalam 1010 sel L. plantarum ATCC 14917 lebih tinggi dari L. reuteri NCIMB 702656.

Tabel 2 Jumlah kolesterol dan persentase kolesterol yang diasimilasi oleh isolat BAL serta jumlah kolesterol terasimilasi dalam 1010 sel bakteri pada

MRS yang mengandung kolesterol PEG 600 (100 µg/mL) selama 24 jam

No. Isolat BAL Jumlah Kolesterol Terasimilasi (µg/mL)

Keterangan: Superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0.05)

Kemampuan mengasimilasi kolesterol pada delapan strain yang diisolasi pada dangke dan daging sapi disajikan pada Tabel 2. L. fermentum B111K dan L. plantarum IIA-1A5 mampu mengasimilasi kolesterol dengan jumlah kolesterol yang diasimilasi 33.14 µg/mL dan 17.18 µg/mL. Data ini secara statistik menunjukkan perbedaan yang nyata terhadap jumlah kolesterol yang diasimilasi pada MRS yang mengandung kolesterol PEG 600 (100 µg/mL) selama 24 jam. Perbedaan kemampuan mengasimilasi pada isolat tersebut sama dengan penelitian Tomaro-Duchesneau et al. (2014) bahwa jumlah kolesterol yang diasimilasi oleh setiap kultur berbeda-beda. L. fermentum B111K dan L. plantarum IIA-1A5 merupakan isolat yang mampu mengasimilasi kolesterol yaitu sebesar 4.10% dan 8.10%. Tabel 2. secara statistik menunjukkan bahwa kedua starin yaitu L. fermentum B111K dan L. plantarum IIA-1A5 berbeda nyata terhadap persentase kolesterol yang terasimilasi (P<0.05). L. plantarum IIA-1A5 secara signifikan lebih tinggi persentase kolesterol yang terasimilasi. Jumlah kolesterol terasimilasi dalam 1010 sel bakteri pada L. fermentum B111K dan L. plantarum IIA-1A5 yaitu

sebesar 0.13 mg/1010cfu dan 0.06 mg/1010cfu. Data ini secara statistik berbeda nyata terhadap jumlah kolesterol terasimilasi dalam 1010 sel bakteri dalam satuan

(mg/1010 cfu).

(27)

15

menurunkan konsentrasi kolesterol yang beredar dalam pembuluh darah. Hal ini berimplikasi menurunkan penyakit degeneratif hiperkolesterolemia (Liong dan Shah 2005; Lye et al. 2010)

4 SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Strain bakteri asam laktat yang berpotensi menurunkan kolesterol adalah L. fermentum B111K dan L. plantarum IIA-1A5 dengan beberapa mekanisme. L. fermentum B111K mempunyai sifat hipokolesterol dengan cara mengasimilasi kolesterol. L. plantarum IIA-1A5 mempunyai dua mekanisme hipokolesterol yaitu memiliki gen dan aktivitas bile salt hydrolase serta mampu mengasimilasi kolesterol.

Saran

Strain L. plantarum IIA-1A5 diuji secara in vivo kemudian dikembangkan dengan mengaplikasikan pada produk pangan seperti minuman probiotik. Minuman probiotik yang mempunyai biofungsional yaitu mampu menurunkan kolesterol (hipokolesterol).

DAFTAR PUSTAKA

Arief II, Jenie BSL, Astawan M, Fujiyama K, Witarto AB. 2015. Identification and probiotic characteristics of lactic acid bacteria isolated from Indonesian local beef. Asian J Anim Sci. 9(1):25-36. doi: 10.3923/ajas.2015.25-36.

Begley M, Hill C, Cormac GMG. 2006. Bile salt hydrolase activity in probiotics. Microbiol. 72(3):1729-1738:doi: 10.1128/AEM.72.3.1729-1738.2006. Bin L & Yujun J. 2011. Cloning of Bile Salt Hydrolase Gene and Its Expression

in Lactic Acid Bacteria. J of Northeast Agr U.18(2): 48-53.

FAO/WHO. 2002. WHO working group report on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food. London Ontario, Canada30.

Hae-Keun O, Ji YL, Soo JL, Min JK, Geun-Bae K, Jung HK, Soon-Kwang H, Dae-Kyung K. 2008. Molecular cloning and characterization of bile salt hydrolase from Lactobacillus acidophilus PF01. J Microbial Biotec. 18:449-456.

(28)

16

Jiang J, Hang X, Zhang M, Liu X, Li D, Yang H. 2010. Diversity of bile salt hydrolase activities in different lactobacilli toward human bile salts. Ann Microbiol. doi 10.1007/s13213-009-0004-9. 60:81–88

Kim G, Miyamoto CM, Edward A, Meighen, Lee BH. 2004. Cloning and characterization of the Bile Salt Hydrolase Genes (BSH) from Bifidobacterium bifidum Strains. Am Society for Microbiol. DOI: 10.1128/AEM.70.9.5603–5612.2004.

Kimoto-Nira H, Mizumachi K, Nomura M, Kobayashi M, Fujita Y, Okamoto T, Suzuki, Noriko M. TS Ohmomo. 2007. Lactococcus sp. as potential probiotic lactic acid bacteria.Jpn Agr Res Q. 41: 181–189.

Kumar M, Nagpal R, Kumar R, Hemalatha R, Verma V, Kumar A,Chakraborty C, Singh B, Marotta F, Jain S, Yadav H. 2012. Cholesterol-lowering probiotics as potential biotherapeutics for metabolic diseases. Exp Diabetes Res. 14: 902917.

Liévin-Le Moal V, Servin AL. 2014. Anti-Infective activities of Lactobacillus strains in the human intestinal microbiota: from probiotics to gastrointestinal anti-Infectious biotherapeutic agents. Clin Microbiol Rev. 27(2):167-199. doi:10.1128/CMR.00080-13.

Liong MT, Shah NP. 2005. Acid and bile tolerance and cholesterol removal ability of Lactobacilli strains. J Dairy Sci. 88:55-66.

Lye HS, Ali GRR, Liong MT. 2010. Mechanisms of cholesterol removal by Lactobacilli under conditions that mimic the human gastrointestinal tract. Int Dairy J. 20: 169-175.

Mahrous H. 2011. Probiotik bacteria from Egyptian infants cause cholesterol removal in media and survive in yoghurt. JFNS. 2:150-155. doi: 10.4236/fns.2011.22021.

Nuraida L, Siti W, Hana, Endang P. 2011. Evaluasi in vitro terhadap isolat bakteri asam laktat asal air susu ibu untuk mengasimilasi kolestrol dan mendekonjugasi garam empedu. J Tekno Indust Pangan.22:46-58.

Pereira DIA, Gibson GR. 2002.Cholesterol assimilation by lactic acid bacteria and Bifidobacteria isolated from the Human Gut. Appl Environ Microbiol. 68(9): 4689–469.

Ridlon JM, Spencer CH, Shiva B, Dae-joong K, Philip BH. 2016. Consequences of bile salt biotransformations by intestinal bacteria. J Gut Microbes. 7(1):22-39. doi.org/10.1080/19490976.2015.1127483

Sambrook J and Russel DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 3, A8.46-47. Sedlackova P, Horackova S, Tiange SHI, Kosova M, Plockova M. 2014. Two

Different methods for screening of bile salt hydrolase activity in Lactobacillus Strains. Czech J Food Sci. 33:13-18. doi: 10.17221/299/2014-CJFS.

Steel RGD dan Torrie JH. 1995. Prinsip dan Prosedur Statistika Suatu Pendekatan Biometri Edisi Kedua. Terjemahan Bambang S. Jakarta (ID): PT Gramedia Pustaka Utama,.

Surono, IS. 2004. Probiotik Susu Fermentasi dan Kesehatan. Jakarta (ID): YAPMMI

(29)

17

a traditional cheese from Enrekang, South Sulawesi. Pakistan J Nutr: in press.

Tanaka H, Honoo H, Jan K, Iqor M. 2000. Bile Salt Hydrolase of Bifidobacterium longum—Biochemical and Genetic Characterization. J Appl Environ Microbiol. 66(6): 2502–2512

Tomaro-duchesneuau C, Jones ML, Shah D. Jain P, Saha S, Prakash S. 2014. Cholesterol assimilation by Lactobacillus probiotic bacteria: an In Vitro investigation. BioMed R Int 2014: 9.

(30)

18

(31)

19

Lampiran 1 Elektroforesis ekstraksi DNA isolat BAL dangke dan daging sapi

(32)

20

Lampiran 3 Hasil blast urutan asam amino L. plantarum IIA-1A5

(33)

21

Lampiran 4 ANOVA jumlah kolesterol yang diasimilasi oleh isolat BAL pada MRS yang mengandung kolesterol PEG 600 (100 µg/mL) selama 24 jam

Sumber Keragaman Derajat Bebas Jumlah Kuadrat Kuadrat tengah F P Perlakuan Isolat 1 254.7570679 254.7570679 23.76 0.0396

Galat 2 21.4417901 10.7208951

Total 3 276.1988580

Uji Lanjut

Perlakuan Rataan Homogeneous Groups

L. fermentum B111K 33.14 A

L. fermentum IIA-1A5 17.18 B

Lampiran 5 ANOVA persentase kolesterol yang diasimilasi oleh isolat BAL pada MRS yang mengandung kolesterol PEG 600 (100 µg/mL) selama 24 jam

Sumber Keragaman Derajat Bebas Jumlah Kuadrat Kuadrat tengah F P Perlakuan Isolat 1 13.61610000 13.61610000 20.94 0.0446

Galat 2 1.30050000 0.65025000

Total 3 14.91660000

Uji Lanjut

Perlakuan Rataan Homogeneous Groups

L. fermentum B111K 4.10 a

L. fermentum IIA-1A5 8.10 b

Lampiran 6 ANOVA jumlah kolesterol terasimilasi dalam 1010 sel bakteri pada MRS yang mengandung kolesterol PEG 600 (100 µg/mL) selama 24 jam

Sumber Keragaman Derajat Bebas Jumlah Kuadrat Kuadrat tengah F P Perlakuan Isolat 1 0.00422500 0.00422500 9.94 0.0495

Galat 2 0.00085000 0.00042500

Total 3 0.00507500

Uji Lanjut

Perlakuan Rataan Homogeneous Groups

L. fermentum B111K 0.13 a

(34)

22

Lampiran 7 Gambar uji aktivitas BSH

L. fermentum A323L L. fermentum B111K

L. fermentum B323K L. fermentum C113L

L. fermentum C222L

L. plantarum IIA-1A5

(35)

23

RIWAYAT HIDUP

Gambar

Gambar 1. Diagram alir penelitian
Gambar 2  Elektroforesis agarosa gen BSH. Keterangan:M : Marker (DNA ladder
Gambar 3 Pensejajaran gen BSH L. plantarum IIA-1A5 dengan gen BSH L.
Gambar 5  Pensejajaran sekuen urutan basa BSH L. plantarum IIA-1A5 dengan

Referensi

Dokumen terkait

Pada tahun 1717 Gong Goan atau Dewan Cina ( Chineesen Road ) didirikan dan kapten Cina diberi kekuasaan untuk memberi ijin dan mensahkan pernikahan dan

Perubahan sosio-kultural di Keraton Yogyakarta mencakup perubahan dalam wujud pemikiran/pandangan atau ide yang diimplemetasikan secara tegas dengan sikap demokrasi Sultan

(Jakarta: Pustaka populer obor.. Alasan seorang remaja awal tidak dapat berperilaku asertif adalah karena mereka belum menyadari bahwa mereka memiliki hak untuk

Meskipun dokumen ini telah dipersiapkan dengan seksama, PT Manulife Aset Manajemen Indonesia tidak bertanggung jawab atas segala konsekuensi hukum dan keuangan

Di lain pihak, individual capability, individual motivation dan workgroup effectiveness tidak memiliki pengaruh yang signifikan terhadap kinerja auditor. Dari segi

Ini menunjukkan bahwa pekerja bergilir bagian Central Processing Area di JOB P-PEJ pada saat bekerja shift malam memiliki tugas-tugas yang lebih banyak dari biasanya

Berdasarkan uji statistik variasi jarak kait klem selang terhadap kuat lekat bambu dengan beton belum memiliki pengaruh yang signifikan karena koefisien variasi

Berdasarkan Perhitungan Capital Budgeting, Peneliti hanya menggunakan salah satu perhitungan saja, yaitu ilustrasi perhitungan Net Present Value untuk mengetahui kelayakan terhadap