Imunoproteksi Vaksin Protein Toksoid Bakteri Streptococcus Agalactiae Pada Ikan Nila (Oreochromis Niloticus)

Teks penuh

(1)

BAKTERI

Streptococcus agalactiae

PADA IKAN NILA

(Oreochromis niloticus)

AMRULLAH

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(2)
(3)

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul “Imunoproteksi Vaksin Protein Toksoid Bakteri Streptococcus agalactiae pada Ikan Nila (Oreochromis niloticus)”, adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan dan tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

Bogor, Agustus 2014

(4)

AMRULLAH. Imunoproteksi Vaksin Protein Toksoid Bakteri Streptococcus agalactiaepada Ikan Nila (Oreochromis niloticus). Dibimbing oleh SUKENDA, ENANG HARRIS, ALIMUDDIN, ANGELA M. LUSIASTUTI

Salah satu penyakit infeksi yang sering menyerang ikan nila adalah penyakit streptococcosis yang diakibatkan oleh Streptococcus agalactiae dengan tingkat patogenisitas tinggi. Strategi utama yang telah lama digunakan untuk mengendalikan penyakit yang disebabkan oleh bakteri opurtunistik pada akuakultur adalah antibiotik. Namun penggunaan yang tidak terkendali telah menyebabkan resistensi antibiotik pada bakteri. Alternatif untuk mengendalikan penyakit ini telah dilakukan melalui pengembangan vaksin yang merupakan strategi preventif yang ditentukan oleh kemampuan antigen untuk merangsang sistem kekebalan tubuh hewan sasaran. Salah satu jenis vaksin yang mulai dikembangkan sekarang ini adalah vaksin protein. Protein yang dijadikan vaksin ini disekresikan oleh bakteri secara ekstraseluler (extracellular products, ECP) yang mengandung toksin sehingga dapat menginduksi antibodi antitoksin. Protein dari ECP ini lebih mudah menginduksi respons imun karena dikeluarkan dari sel sehingga lebih mudah bersentuhan dengan inang dan relatif lebih aman karena tidak terdapat lagi bakteri di dalamnya.

Penelitian ini bertujuan untuk menghasilkan vaksin protein toksoid dari produk ekstraseluler bakteri S. agalactiae tipe N14G untuk mencegah serangan penyakit streptococcosis pada ikan nila. Penelitian terdiri atas tiga tahap penelitian yaitu : 1) Karakteristik dan patogenisitas protein ECP S. agalactiae

pada ikan nila (Oreochromis niloticus), 2) Imunogenisitas protein toksin 89 kDa dari ECPS. agalactiae pada ikan nila dan 3) Efikasi vaksin toksoid ECP 89 kDa untuk pengendalian penyakit Streptococcosis pada ikan nila.

Penelitian pertama bertujuan untuk mengevaluasi toksisitas protein berbagai berat molekul protein ECP S. agalactiae hasil fraksinasi dengan SDS-PAGE. Protein dengan berat molekul 76,52 kDa (ECPP76,52), 89 kDa (ECPP89) dan 132,92 kDa (ECPP132,92) dari ECP pekat yang difraksinasi dengan SDS-PAGE dan diisolasi dari gel akrilamid. Ikan nila dengan bobot sekitar 25 g ek-1 masing-masing diinjeksi secara intraperitonial (i.p.) dengan protein dosis 1, 2, 4, 8 dan 16 µg-1mL-1. Sebagai kontrol positif ikan diinjeksi dengan bakteri utuhS. agalactiae 1x104 CFU mL-1 (WCB) dan ECP crude S. agalactiae (ECPC). Sebagai kontrol negatif ikan diinjeksi dengan larutan PBS. Ikan dipelihara selama 15 hari dengan kepadatan 10 ekor (70 L air). Hasil penelitian menunjukkan bahwa ikan nila yang diinjeksi dengan ECP89, WCB dan ECPC mengalami gejala khas penyakit S. agalactiae. Mortalitas pada perlakuan ECP89 secara umum lebih tinggi (p<0.05) dibandingkan dengan ECPC namun lebih rendah (p<0.05) dibandingkan dengan WCB. Gejala khas terserang S. agalactiae dan mortalitas ikan tidak terjadi pada perlakuan ECPP76,52; 132,92 kDa. Hasil ini menunjukkan bahwa ECP89 merupakan protein toksin dari ECPS. agalactiaeyang berpotensi sebagai antigen yang imunogenik.

(5)

ekor , diinjeksi secara i.p. 0,1 mL dengan ECP89 dosis 2 µg mL (ECP89-2), 4 µg mL-1 (ECP89-4), 6 µg mL-1 (ECP89-6) dan 8 µg mL-1 (ECP89-8). Sebagai kontrol positif ikan nila diinjeksi dengan vaksin sel utuhformalin-killedbakteriS. agalactiae 1x109 CFU mL-1 (WCV) dan vaksin ECP bakteri S. agalactiae (ECPV),sedangkan kontrol negatif ikan tidak diinjeksi dengan vaksin (UV). Ikan dipelihara selama 20 hari dengan kepadatan 30 ekor bak-1(195 L air). Pengamatan respons imun spesifik dan nonspesifik dilakukan setiap 5 hari. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penggunaan ECP89-4, ECP89-6 dan ECP89-8 dapat meningkatkan respons imun nonspesifik yaitu hemoglobin, persentase netrofil dan monosit, aktivitas fagositosis dan aktivitas lisozim. Respons imun spesifik berupa titer antibodi ikan juga lebih tinggi (p<0,05) dibandingkan dengan perlakuan ECP89-2, ECPV dan ikan yang tidak divaksin, namun lebih rendah dibandingkan perlakuan WCV. Dengan demikian, ECP89 dapat meningkatkan respons imun spesifik dan nonspesifik ikan nila sehingga berpotensi dijadikan sebagai vaksin pada ikan nila.

Penelitian ketiga bertujuan untuk menguji efikasi protein toksin ECP89 kDa terhadap serangan penyakit streptococcosis pada ikan nila. Empat dosis vaksin ECP89 yaitu dosis 2 µg mL-1 (ECP89-2), 4 µg mL-1 (ECP89-4), 6 µg mL-1 (ECP89-6) dan 8 µg mL-1 (ECP89-8) diinjeksikan pada ikan nila dengan bobot sekitar 25 g ekor-1secara i.p. sebanyak 0,1 mL. Sebagai kontrol positif ikan nila diinjeksi dengan vaksin WCV dan vaksin ECPV serta kontrol negatif ikan tidak divaksinasi (UV). Injeksi kedua sebagai booster dilakukan pada hari ke-7 setelah injeksi pertama. Ikan dipelihara selama 20 hari pasca imunisasi dan diuji tantang dengan bakteri S. agalactiaevirulen 1x104CFU mL-1secara i.p. pada hari ke-20. Ikan dipelihara kembali hingga hari ke-15 pasca uji tantang. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ikan nila yang divaksin dengan ECP89-6 dan ECP89-8 memiliki relative percent survival, masing-masing 62,00 dan 64,00, lebih tinggi (p<0,05) dibandingkan dengan perlakuan vaksin ECP89-4 (33,67), ECPV (24,33) dan ECP89-2 (11,00) setelah diuji tantang dengan S. agalactiae. Penelitian ini membuktikan bahwa vaksin ECP89 dapat menginduksi respons imun ikan nila dan menunjukkan fungsi protektif terhadapS. agalactiae.

Secara keseluruhan dapat disimpulkan bahwa vaksin protein toksoid yang dihasilkan dari produk ekstraseluler S. agalactiae dapat memproteksi ikan nila dari serangan penyakit streptococcosis.

(6)

AMRULLAH. The Immunoprotection of Toxoid Protein Vaccine from

Streptococcus agalactiae Bacteria in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Supervised by SUKENDA, ENANG HARRIS, ALIMUDDIN, ANGELA M. LUSIASTUTI.

One of the infectious diseases that often attacks Nile tilapia is streptococcosis which is caused by Streptococcus agalactiae which is highly pathogenic. The long-practiced main strategy employed in controlling diseases caused by opportunistic bacteria in aquaculture is using antibiotics. However, uncontrolled use of antibiotics has caused resistance in various bacteria. An alternative for controlling these diseases are by developing vaccines, a preventive

measure which is determined by the antigen’s ability to stimulate the target

animal’s immune system. One type of vaccine that is being developed now is the vaccine protein. Vaccines developed from proteins are currently being actively developed, namely extracellular proteins secreted by the bacteria which are metabolic products which contain toxins which can stimulate antitoxin antibodies.

These extracellular protein products (ECP) can easily activate the host’s immune response because they are secreted out of the cell, making contact with the host’s

cells easier and also making it relatively safer because there are no more bacteria contained in vaccine.

This study aims to produce toxoid protein vaccine from S. agalactiae

extracellular products against streptococcosis in tilapia.This research divided into three steps of study: 1) Characterization and pathogenicity of S. agalactiae

protein ECP, on Nile tilapia (Oreochromis niloticus), 2) Immunogenicity of the 89 kDa toxin protein from extracellular products of streptococcus in Oreochromis niloticus, 3) Protective efficacy of the 89 kDa protein vaccine from the extracellular products ofS. agalactiaein Nile tilapia (O. niloticus)

The first step was to determine the toxicity of the protein with a molecular weight of 89 kDa from S. agalactiae ECP, produced trough fractionation using SDS-PAGE (ECPP89). The proteins had molecular weights of 76.52 kDa (ECPP76.52), 89 kDa (ECPP89) and 132.92 kDa (ECPP132.92) from dense ECP which was fractionated using SDS-PAGE and isolated from the acrylamide gel. Nile tilapia weighing approximately 25 g each were injected intraperitoneally (i.p.) with ECPP89 protein at doses of 1, 2, 4, 8, and 16 µg mL-1. The positive controls fish were injected with 1x104CFU mL-1S. agalactiaewhole-cell bacteria (WCB) and S. agalactiae crude ECP (ECPC). The negative control fish was injected with PBS solution. The fish were kept for 15 days at a density of 10 individuals per 70 L water. The results of this study showed that Nile tilapia injected with ECP89, WCB and ECPC demonstrated specific signs of S. agalactiae infection. The mortality in the ECP89 treatment was generally higher (p<0.05) than the ECPP treatment, but it was lower than the WCB treatment. Clinical signs ofS. agalactiaeinfection and fish mortality were not demonstrated by fish treated with ECPP76.52, 132.92 kDa and the negative control injected with PBS. These results showed that ECP89 was a toxin protein ECP produced by

(7)

non-specific immune responses after the administration of 89 kDa toxin protein, extracellular products (ECP89) of the Streptococcus agalactiae bacteria. Nile tilapias weighing approximately 25 g received 0.1 mL fish-1 i.p.l injection doses with 2 µg mL-1 ECP89 (ECP89-2), 4 µg mL-1 (ECP89-4), 6 µg mL-1 (ECP89-6) and 8 µg mL-1 (ECP89-8). The positive controls were fish injected with the whole-cell S. agalactiae vaccine (WCV) and the ECP S. agalactiae bacteria vaccine (ECPV). The negative controls were unvaccinated (UV). The fish were kept for 20 days with a population density of 30 fish per 195 L holding tank. The observation of specific and nonspecific immune responses were done every 5 days. The results of the study showed that the administration of ECP89-4, ECP89-6 and ECP89-8 could increase non-specific immune responses such as hemoglobin count, neutrophil and monocyt percentages, phagocytosis index and lysozyme

activity. Specific immune response in the form of the fish’s antibody titer was also

significantly higher (p<0.05) compared to ECP89-2, ECPV and PBS, but lower than the ones treated with WCV. It could be concluded that the ECP89 was able to increase specific and nonspecific immune response in the Nile tilapia. Therefore, it has a great potential to be developed as a vaccine against S. agalactiaeinfection.

The third step was to evaluated the efficacy of the 89 kDa toxoid vaccine from

S. agalactiae extracellular products (ECP89) against streptococcosis in tilapia. Four dosages of ECP89 vaccine, 2 µg mL-1 (ECP89-2), 4 µg mL-1 (ECP89-4), 6 µg mL-1(ECP89-6), and 8 µg mL-1(ECP89-8), were injected 0.1 mL i.p. to tilapia weighing approximately 25 g. The positive controls were given 1x109 CFU mL-1 of S. agalactiae formalin-killed whole-cell vaccine (WCV) and crude S. agalactiae bacteria ECP vaccine (ECPV). Negative controls were unvaccinated (UV). The second injection, the booster, was given 7 days after the first. The fish were kept for 20 days then challenged with virulentS. agalactiae1x104CFU mL-1 i.p. then kept for 15 days. Tilapias vaccined with ECP89-6 and ECP89-8 had higher relative percent survival (RPS) (62.00 and 64.00, respectively) (p<0.05) than those vaccinated with the ECP89-4 (33.67), ECPV (24.33) and ECP89-2 (11.00) vaccines after the challenge. These results suggested that the ECP89 vaccine could effectively stimulate immune responses and protect against S. agalactiae.

In conclusion, the vaccine of toxoid protein resulted from the ECP of S. agalactiaecould protect the fish,O. niloticusagainst streptococcosis infection.

(8)
(9)

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebahagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB.

(10)
(11)

BAKTERI

Streptococcus agalactiae

PADA IKAN NILA

(Oreochromis niloticus)

AMRULLAH

Disertasi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada

Program Studi Ilmu Akuakultur

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(12)

Staf Pengajar Departemen Budidaya Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB 2. Dr. Irvan Faizal, M. Eng

Staf Peneliti Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi

Penguji pada Ujian Tertutup : 1. Dr. Munti Yuhana, S.Pi, M.Sc

Staf Pengajar Departemen Budidaya Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB 2. Dr. Ir. Slamet Soebjakto, M.Si

(13)

agalactiaepada Ikan Nila (Oreochromis niloticus)

Nama : Amrullah

NRP : C161100011

Disetujui oleh

Komisi Pembimbing

Dr Ir Sukenda, MSc Prof Dr Ir Enang Harris, MS

Ketua Anggota

Dr Alimuddin, SPi MSc Dr drh Angela M Lusiastuti, MSi

Anggota Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana

Ilmu Akuakultur

Dr Ir Widanarni, MSi Dr Ir Dahrul Syah, MSc Agr

(14)
(15)

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul penelitian yang ditulis

dalam karya ilmiah ini adalah “Imunoproteksi Vaksin Protein Toksoid Bakteri Streptococcus agalactiae pada Ikan Nila (Oreochromis niloticus)”, dilaksanakan sejak bulan April 2012 hingga Januari 2014. Disertasi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Ilmu Akuakultur, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Disertasi ini terdiri atas 3 artikel. Artikel pertama berjudul “Karakteristik dan patogenisitas protein ECP Streptococcus agalactiae pada ikan nila (Oreochromis niloticus), artikel kedua berjudul “Imunogenisitas protein toksin 89 kDa dari ECP Streptococcus agalactiae pada ikan nila (Oreochromis niloticus) dan artikel ketiga berjudul “Efikasi vaksin toksoid ECP 89 kDa untuk pengendalian penyakit streptococcosis pada ikan nila (Oreochromis niloticus).

Penulis menyadari sepenuhnya bahwa proses penelitian dan penulisan disertasi ini tidak akan dapat berjalan lancar tanpa dukungan banyak pihak, oleh karena itu penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Ir. Sukenda, M.Sc; Prof. Dr. Ir. Enang Harris, MS; Dr. Alimuddin, S.Pi, M.Sc dan Dr. drh. Angela Mariana Lusiastuti, M.Si selaku pembimbing yang memberi saran dan masukan mulai dari penyusunan proposal, pelaksanaan penelitian hingga penulisan disertasi ini.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Eddy Supriyono, M.Sc dan Ibu Dr. Sri Nuryati, S.Pi, M.Si. sebagai penguji pada ujian Kualifikasi, Ibu Dr. Sri Nuryati, S.Pi, M.Si. dan Bapak Dr. Irvan Faizal, M. Eng sebagai penguji luar komisi pada Ujian Tertutup dan Ibu Dr. Munti Yuhana, S.Pi. M.Sc dan Bapak Dr. Ir. Slamet Soebjakto, M.Si sebagai penguji luar komisi pada Ujian Terbuka.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Dekan Sekolah Pascasarjana IPB, Dekan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB, Ketua Program Studi Ilmu Akuakultur dan Ketua Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB serta semua Staf Pengajar dan Staf Administrasi atas berkenannya menerima penulis sebagai mahasiswa IPB, mendapat pelayanan, fasilitas pendidikan dan pengajaran yang baik. Terima kasih kepada Direktur Politani Negeri Pangkep yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk mengikuti pendidikan Program Doktor di IPB. Terima kasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Kementerian Pendidikan dan Kebudayaan Republik Indonesia atas beasiswa Biaya Pendidikan Pascasarjana (BPPS).

(16)

AKU 2010, Ibu Eka Rosyida, Bapak Heppi Iromo dan Bapak Armen Nainggolan semoga kerjasama kita tetap terjalin. Secara khusus ungkapan terimakasih juga disampaikan kepada kedua orang tua tercinta (Alm. Abdul Manika dan Alm. Hj. Rugaia Mahmud), Istri tercinta Wahidah Nurdin, S.Pi, M.Si, Ananda A. Nurramadhan Alda Manika, A. Nurramadhani Alda Manika dan A. Nurrakhana Alda Manika, Ibu dan Bapak Mertua, Saudara, Adik Ipar serta seluruh keluarga atas doa dan motivasi yang selalu memberikan semangat.

Terimakasih atas segala dukungan, semangat dan ukhuwah yang luar biasa, semoga Allah SWT membalas semua kebaikan yang telah diberikan. Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam tulisan ini, oleh karena itu saran dan kritik yang membangun sangat diharapkan. Penulis berharap semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.

Bogor, Agustus 2014

(17)

Halaman

ECPS. agalactiae PADA IKAN NILA (Oreochromis niloticus) Pendahuluan

4 IMUNOGENISITAS PROTEIN TOKSIN 89 kDa DARI ECP Streptococcus agalactiaePADA IKAN NILA,

Oreochromis niloticus

5 EFIKASI VAKSIN TOKSOID ECP 89 kDa

(18)

Halaman

1 Konsentrasi protein total ECP crude bakteri S. agalactiae isolat N14G sebelum fraksinasi menggunakan standar protein bovine serum albumin (BSA)

2 Perubahan anatomi luar, pola renang, pola makan dan mortalitas ikan nila (Oreochromis niloticus) setelah penginfeksian protein. 3 Titer antibodi serum ikan nila dengan metodedirectagglutinasi dan

antibodi spesifik Streptococcus agalactiae, (optical density; OD

indirect-ELISA) sebelum uji tantang (pasca vaksinasi 20 hari)* dan pasca uji tantang dengan Streptococcus agalactiae (15 hari pasca-uji tantang), mortalitas danrelative percent survival(RPS) (15 hari pasca uji tantang).

DAFTAR GAMBAR

1 Kerangka berpikir penelitian vaksin protein toksoid dari produk ekstraseluler (ECP) bakteri S. agalactiae untuk mencegah penyakit streptococcosis pada ikan nila (Oreochromis niloticus).

2 Vivaspin untuk memekatkan ECP dan pemotongan gel akrilamid hasil fraksinasi SDS-PAGE

3 Kurva standar protein total ECP crude bakteri Streptococcus agalactiaeisolat N14G.

4 Hasil fraksinasi dengan metode SDS-PAGE protein toksin dari ECP bakteriStreptococcus agalactiaeyang dipekatkan dengan vivaspin. 5 Perubahan anatomi luar ikan nila (Oreochromis niloticus) setelah

penginfeksian ECPP89, WCB dan ECPC

6 Pengerutan mata ikan nila (Oreochromis niloticus) setelah penginfeksian ECPP89, WCB dan ECPC.

7 Histologi ikan nila (Oreochromis niloticus) akibat penginfeksian ECPP89, WCB dan ECPC

8 Mekanisme masuknya toksin ke reseptor sel yang dimediasi oleh endositosis (Todar 2012)

9 Kadar hemoglobin ikan nila setelah diinjeksi dengan berbagai dosis protein toksin 89 kDa

10 Penjenisan leukosit terdiri atas persentase monosit (A), persentase netrofil (B) dan persentase limfosit (C) ikan nila setelah diinjeksi dengan berbagai dosis protein toksin 89 kDa

11 Persentase aktivtas fagositosis ikan nila setelah diinjeksi dengan berbagai dosis protein toksin 89 kDa

(19)

berbagai dosis protein toksin 89 kDa

14 OD-ELISA titer antibodi ikan nila setelah diinjeksi dengan berbagai dosis protein toksin 89 kDa

15 Kematian kumulatif harian ikan nila,Oreochromis niloticuspasca uji tantang dengan bakteriStreptococcus agalactiae

16 Kadar hemoglobin ikan nila (Oreochromis niloticus) pasca uji tantang dengan bakteriStreptococcus agalactiae

17 Penjenisan leukosit terdiri atas persentase monosit (A), persentase netrofil (B) dan persentase limfosit (C) ikan nila (Oreochromis niloticus) pasca uji tantang dengan bakteri Streptococcus agalactiae

18 Aktivitas fagositosis ikan nila (Oreochromis niloticus) pasca uji tantang dengan bakteriStreptococcus agalactiae

19 Aktivitas lisozim serum ikan nila (Oreochromis niloticus) pasca uji tantang dengan bakteriStreptococcus agalactiae

DAFTAR LAMPIRAN

1 Pengukuran hematologi ikan

2 Pengukuran titer antibodi metodedirectagglutinasi 3 Purifikasi immunoglobulin G (IgG) ikan

4 Produksi antibodianti-tilapiapada kelinci

5 Jadwal, dosis IgM dan adjuvant serta jenis adjuvant pada vaksinasi kelinci

6 Pengukuran titer antibodi metodeindirectELISA

41

49

50

51

52

52

75 76 76 76 77

(20)

1 PENDAHULUAN

Latar Belakang

Penyakit infeksi merupakan masalah penting yang telah mengakibatkan kerugian dalam industri akuakultur yang disebabkan oleh berbagai organisme patogen. Salah satu penyakit infeksi yang sering menyerang ikan nila adalah penyakit streptococcosis yang diakibatkan oleh Streptococcus agalactiae dengan tingkat patogenisitas tinggi. Penyakit ini dapat menyebabkan kematian hingga 60% pada budidaya ikan nila di Sumatera Selatan (Yuasa et al.2008). Di Cina, streptococcosis menyebabkan penyakit secara sporadis pada industri pemuliaan ikan nila dari tahun 2001 hingga 2006 dan menyebabkan kematian kumulatif sebesar 5-15% pada tingkat pembudidaya (Li et al. 2009). Pada budidaya skala besar wabah streptococcosis terus-menerus terjadi dengan mortalitas yang tinggi (30-80%) pada tahun 2009-2011. Hasil diidentifikasi menunjukkan bahwa mortalitas ini disebabkan oleh S. agalactiae sebesar 97,7 % dan S. iniae sebesar 2,3 %. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa terjadi perubahan penyebab streptococcosis yang didominasi oleh S. iniae sebelum tahun 2009, namun pada tahun 2009-2011 penyakit streptococcosis telah didominasi oleh S. agalactiae

(Chenet al. 2012).

Strategi utama yang telah lama digunakan untuk mengendalikan penyakit yang disebabkan oleh bakteri opurtunistik pada akuakultur adalah antibiotik. Namun penggunaan yang tidak terkendali telah menyebabkan resistensi antibiotik pada bakteri. Selain itu, resistensi antibiotik dapat ditransfer ke dalam lingkungan budidaya dan patogen pada manusia. Di sisi lain, residu antibiotik pada lingkungan akuakultur dan produk ikan dapat menyebabkan efek yang merugikan kesehatan ekologi dan masyarakat (Jones et al. 2004; Cabello et al. 2006). Alternatif untuk mengendalikan penyakit ini telah dilakukan melalui pengembangan vaksin sebagai metode pencegahan yang berkelanjutan (Zhang et al. 2014) sehingga akuakultur akan tetap sustainabel dan merupakan salah satu metode yang paling menjanjikan (Gudding et al. 1999). Vaksin merupakan strategi preventif yang ditentukan oleh kemampuan antigen untuk merangsang sistem kekebalan tubuh hewan sasaran, stimulasi sistem kekebalan tubuh inang secara kontinu dan lama waktu perlindungan yang dihasilkan vaksin lebih baik dibandingkan dengan antibiotik.

Vaksin dari protein yang disekresikan bakteri secara ekstrasellular belakangan ini juga mulai dikembangkan (Songet al. 2013). Produk ekstraselluler bakteri merupakan produk metabolisme bakteri yang mengandung bahan toksin yang dapat merangsang terbentuknya antibodi antitoksin. Protein extracellular products (ECP) ini mudah mengaktifkan respons imun inang karena dikeluarkan dari sel sehingga lebih mudah bersentuhan dengan inang (Zhang et al. 2012). Kelebihan lain dari metode vaksinasi ECP adalah bahan yang digunakan merupakan bahan toksin sehingga relatif lebih aman karena tidak terdapat lagi bakteri di dalamnya.

(21)

inang dan identifikasi protein antigenik yang sangat penting dalam rangka pengembangan vaksin (Shin et al. 2007). Efikasi vaksin dari ECP crude S. agalactiae yang mengandung toksin telah dilakukan oleh Pasnik et al. (2005), Klesius et al. (2007) dan Hardi (2011). Meskipun efektivitas vaksin ECP crude

ini sudah baik, namun komponen spesifik yang berperan sebagai antigenik belum diketahui dan dipelajari. Oleh karena itu dilakukan penelitian untuk mendapatkan protein imunogenik dalam ECP.

Identifikasi protein antigenik dari ECP crude dapat dilakukan melalui fraksinasi protein dari ECP bakteri S. agalactiae melalui proses pemisahan dan pemurnian protein toksin berdasarkan berat molekulnya. Pemurnian protein merupakan serangkaian proses yang dilakukan untuk mengisolasi suatu jenis protein dari campuran yang kompleks. Sodium dedocyl sulfate-polyacrylamide gels (SDS-PAGE) merupakan teknik yang digunakan untuk memisahkan protein berdasarkan panjang rantai polipeptida atau bobot molekulnya. Pemisahan protein berdasarkan ukurannya ini dilakukan dalam medan listrik. Campuran protein yang akan dipisahkan dilarutkan dalam SDS, suatu jenis detergen anionik. SDS ini akan mendenaturasi struktur sekunder dan ikatan non-disulfida dari struktur tersier menjadi struktur linear/primer. Fraksi protein yang telah dimurnikan akan dilihat kemampuan dan potensinya sebagai agen infeksi yang bersifat imunogenik yang pada akhirnya dapat digunakan sebagai vaksin untuk menanggulangi penyakit streptococcosis pada ikan nila.

Rumusan Masalah

Streptococcosis merupakan bakteri patogen yang memiliki distribusi geografi yang luas pada lingkungan akuatik, dapat menyerang ikan liar maupun ikan budidaya pada perairan tawar dan laut (Pereira et al. 1998; Colorni et al. 2002) dan telah menyebabkan kerugian ekonomi yang besar. Ikan nila merupakan ikan yang paling rentan terhadap infeksi streptococcosis dan menimbulkan wabah yang sangat mematikan (Pretto-Giardano et al. 2010). Setelah Streptococcus spp masuk ke dalam media budidaya maka akan sangat sulit untuk memberantasnya, sehingga kemungkinan terjadinya wabah streptococcosis akan meningkat jika ikan mengalami stress misalnya karena suhu air yang tidak optimal, oksigen terlarut rendah, nitrit tinggi dan kepadatan tinggi (Bunch & Bejerano 1997; Pereira et al

1997; Shoemaker et al. 2000). Oleh karena itu streptococcosis menjadi masalah utama dalam budidaya ikan nila (Pereiraet al. 2010).

Selama ini pengobatan dilakukan dengan antibiotik, hasilnya cukup efektif namun menyebabkan resistensi antibiotik pada bakteri. Selain itu, resistensi antibiotik dapat ditransfer ke dalam lingkungan budidaya dan patogen pada manusia. Di sisi lain, residu antibiotik pada lingkungan akuakultur dan produk ikan dapat menyebabkan efek yang merugikan kesehatan ekologi dan masyarakat (Joneset al.2004; Cabelloet al. 2006). Salah satu alternatif untuk mengendalikan penyakit ini adalah dengan meningkatkan resistensi ikan terhadap penyakit melalui aplikasi vaksin.

(22)

yang efisien maka identifikasi antigen yang bersifat imunogenik menjadi sangat penting.

Efikasi vaksin dari ECP crude S. agalactiae yang mengandung toksin telah dilakukan oleh Pasnik et al. (2005), Klesius et al. (2007), Hardi (2011). Meskipun efektivitas vaksin ECPcrudeini sudah baik, namun komponen spesifik yang berperan sebagai antigenik belum diketahui dan dipelajari. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui protein imunogenik dalam ECP dan selanjutnya dilakukan evaluasi terhadap imunoproteksinya pada ikan nila.

Identifikasi imunogen dapat dimulai dengan mengkultur bakteri S. agalactiae selama 72 jam untuk menghasilkan ECP crude yang maksimal. Selanjutnya ECP crude dipekatkan dan difraksinasi dengan SDS-PAGE, selanjutnya diisolasi dari gel akrilamid dengan electro-elution. Fraksi protein yang dihasilkan ini diuji toksisitasnya terhadap ikan nila untuk mendapatkan protein toksin.

Protein toksin yang dihasilkan dibuat vaksin protein dengan menambahkan

neutral buffer formalin (NBF) 10% untuk menonaktifkan toksinnya. NBF dibuat dengan mencampurkan 0,4 g NaH2PO4 + 0,65 g Na2HPO4 + 10 ml formaldehid 37% + 90 ml akuades steril. Pengujian imunogenisitas vaksin protein dilakukan dengan cara menginjeksi ikan nila dan dipelihara selama 20 hari. Setelah diketahui imunogenisitas vaksin tersebut maka dilanjutkan dengan uji tantang. Hasil dari uji tantang menjadi informasi bahwa vaksin protein yang dihasilkan memiliki kemampuan untuk melindungi ikan dari serangan penyakit streptococcosis yang disebabkan oleh bakteri S. agalactiae. Dengan demikian vaksin yang dihasilkan dapat mengendalikan serangan penyakit yang disebabkan oleh bakteri S. agalactiae yang merupakan permasalahan utama dalam budidaya ikan nila.

Tujuan Penelitian

Tujuan umum penelitian ini adalah menghasilkan vaksin protein toksoid dari produk ekstraseluler bakteri S. agalactiae tipe N14G untuk mencegah serangan penyakit streptococcosis pada ikan nila. Secara khusus penelitian ini dilakukan untuk mengkaji hal-hal sebagai berikut :

- Mengidentifikasi protein toksin berdasarkan berat molekul dari produk ekstraselluler bakteri S. agalactiae tipe N14G melalui fraksinasi dengan metodeSodium dedocyl sulfate-polyacrylamide gels (SDS-PAGE) (Bio-Rad). - Mengisolasi protein hasil fraksinasi dari gel akrilamid berdasarkan ukuran

berat molekul menggunakanelectro-eluter.

- Mengkaji toksisitas masing-masing protein secara in vivo dengan mengamati gejala klinis ikan yang meliputi tingkah laku makan, tingkah laku renang, perubahan pada anatomi luar ikan dan mengidentifikasi kerusakan otak, mata dan ginjal ikan melalui gambaran histologi.

- Mengkaji imunogenisitas protein toksin pada ikan nila dengan mengamati respons imun spesifik dan nonspesifik

(23)

meliputi pengamatan kadar hemoglobin, aktivitas fagositik, penjenisan leukosit, aktivitas lisozim dan pengukuran antibodi.

Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian diharap protein dari ECP dapat memberikan proteksi terhadap serangan penyakit streptococcosis oleh bakteri S. agalactiae pada ikan nila

Hipotesis

Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah protein dengan berat molekul tertentu dari hasil fraksinasi protein toksin dari ECP bakteriS. agalactiae

dapat bersifat imunoprotektif sehingga akan dapat dijadikan vaksin yang efektif memproteksi serangan penyakit streptococcosis pada ikan nila.

Kebaharuan Penelitian

Kebaharuan (novelty) dari penelitian ini adalah :

- Protein dengan berat molekul tertentu dari ECP crude S. agalactiae yang bersifat toksik pada ikan nila.

- Imunogenisitas protein toksin ECP bakteriS. agalactiaepada ikan nila.

- Imunoproteksi vaksin protein toksoid dari ECP bakteri S. agalactiae yang dapat mencegah penyakit streptococcosis pada ikan nila.

Kerangka Pemikiran

Kerangka berfikir pada penelitian untuk mengetahui potensi imunoproteksi vaksin protein toksoid dari ECP bakteri S. agalactiae tipe N14G dijabarkan pada Gambar 1. Penelitian ini dimulai dengan mengisolasi ECP S. agalactiae

berdasarkan pola pertumbuhan populasi maksimal yaitu 72 jam pasca inokulasi pada media BHI. ECP yang diperoleh difraksinasi dengan SDS-PAGE sehingga diperoleh protein dengan berat molekul yang berbeda dan selanjutnya diisolasi dan dimurnikan. Hasil isolasi protein ini merupakan protein yang bersifat toksik.

(24)

Keterangan : RPS =relative percent survival

Gambar 1. Kerangka berpikir penelitian vaksin protein toksoid dari produk ekstraseluler (ECP) bakteri Streptococcus agalactiae untuk mencegah penyakit streptococcosis pada ikan nila (Oreochromis niloticus)

Bakteri S. agalactiae

Isolasi ECP

Fraksinasi protein dengan SDS-PAGE (Berbagai berat molekul)

Isolasi Protein

Kerusakan histologi

RPS IKAN NILA TINGGI

Uji toksisitas

in vivo

Ikan resisten pada

S. agalactiae

Kelainan patologi

Imun ikan tinggi

Uji tantang dengan

S. agalactiae

Efikasi vaksin pada ikan nila

Ya

Ya

Ya

Tidak Tidak

Tidak

Protein

(25)

2 TINJAUAN PUSTAKA

Penyakit Streptococcosis

Bakteri streptococcus grup B S. agalactiae bersifat patogen pada banyak spesies ikan, termasuk ikan nila (Oreochromis niloticus, L.) dan belanak (Liza klunzingeri, Day) (Evans et al. 2002), golden shiners (Notemigonus crysoleucas, Mitchill) (Robinson & Meyer 1966), menhaden (Brevoortia patronus, Goode) (Plumb et al. 1974), dan bullminnows (Fundulus grandis Baird & Girard) (Rasheed & Plumb 1984). Menurut Pretto-Giardanoet al.(2010), ikan nila sangat rentan terhadap infeksi Streptococcosis dan menimbulkan wabah yang sangat mematikan, tidak patogen pada ikan channel catfish terutama S. iniae dan S. agalactiae.

Streptococcussp. merupakan bakteri penyebab penyakit infeksi yang serius dan telah diisolasi dari beberapa jenis ikan air tawar dan ikan laut. Penyakit tersebut dikenal sebagai streptococcosis dan telah menjadi masalah utama dalam budidaya ikan tilapia (Pereira et al. 1994; Evans et al. 2004a; Evan et al. 2006a, Suanyuk et al. 2008; Pereira et al. 2010; Ye et al. 2011). Infeksi menyebabkan kematian ikan nila sekitar 50% sejak bulan pertama dan meningkat hampir menjadi 80% sampai akhir masa pemeliharaan dalam karamba di Filipina (Clark

et al. 2000), menyebabkan kematian ikan 90% dalam 6 hari pascainjeksi dalam pengujian toksisitas (Evans et al. 2006), menyebabkan kematian hingga 60% pada budidaya ikan nila di Sumatera Selatan (Yuasa et al. 2008). Streptococcus menyebabkan penyakit secara sporadis pada industri pemuliaan ikan nila di Cina dari tahun 2001 hingga 2006 dan menyebabkan kematian kumulatif sebesar 5-15% pada tingkat petani (Liet al.2009) dan pada skala besar wabah streptokokus terus menerus terjadi dengan mortalitas yang tinggi (30-80%) pada tahun 2009-2011 (Chenet al. 2012).

Streptococcosis pada ikan menurut Toranzo (2009), merupakan infeksi dari beberapa jenis bakteri Streptococcus sp. dengan gejala penyakit yang hampir sama pada setiap spesies bakteri dan dapat mengakibatkan kerusakan sistem saraf pusat yang terkarakterisasi dari gejala klinis berupa adanya eksophthalmia ( pop-eye) dan meningoensefalitis. Pada kondisi perairan yang hangat (warm water) dapat menyebabkan kematian pada suhu di atas 15 ºC yang disebabkan oleh

Lactococcus garvieae,S. iniae,S. agalactiaedanS. parauberis.

Patogenesis pada ikan melibatkan septikemia, tanda klinis muncul segera setelah infeksi, termasuk depresi atau rangsangan, anoreksia, tubuh berbentuk C, berenang dan berputar-putar tidak menentu dan kematian (Bayaet al. 1990; Eldar

et al. 1994; Evans et al. 2002). Sementara itu Musa et al. (2009) menyatakan bahwa ikan yang terinfeksi Streptococcosis menunjukkan gerakan renang erratic,

whirling, perdarahan pada mata, katarak, pop-eye, atau terdapat perdarahan di sekitar anus dan pangkal sirip. Bagian internal tubuh mengalami perubahan, bagian otak menjadi lembek dan berair, serta hati membengkak dan berwarna pucat.

(26)

Secara makroskopik terjadi pendarahan kulit, splenomegali, hepatomegali. Pada hari pertama setelah pemaparan ikan berenang lesu di bagian bawah tangki, mengalami perubahan warna kulit dan anoreksia. Sedangkan pada hari ke-2, gejala klinis semakin jelas seperti berenang tidak menentu, unilateral dan

bilateral exophthalmia,opacity kornea dan peregangan rongga visceral. Pasnik et al. (2009) menyatakan bahwa pada hari ke-7 pasca uji tantang, ikan nila menunjukkan tanda-tanda klinis seperti nafsu makan yang rendah, pergerakan lesu,exophthalmia bilateral, berenang tidak menentu dan akhirnya mati.

Hal yang sama tentang gejala yang ditimbulkan pada tingkat serangan yaitu kronis dan akut (Evans et al. 2006), di mana pada tingkat kronis, gejala yang nampak yaitu adanya memar seperti luka di permukaan tubuh, bercak merah pada sirip, berenang lambat dan lebih sering berada di dasar akuarium, juga menyebabkan nafsu makan menurun. Gejala lain yang sering muncul adalah mata menonjol (eksopthalmia) dan berenang whirling. Apabila serangan akut terjadi, maka akan terjadi kematian yang diduga karena adanya toksin, kehilangan cairan pada saluran pencernaan dan tidak berfungsinya sebagian organ. Penularan dapat terjadi melalui persinggungan dengan ikan sakit. Pada beberapa kasus, infeksi menyebabkan kerusakan patologi yang berbeda pada ikan tilapia, bergantung pada tipe sel.

Di antara bakteri grup B streptococcus yang patogen pada ikan telah dilaporkan rentan pada sejumlah antibiotik, termasuk oxytetracycline, penisilin, tiprofloxacin, kloramfenikol dan rifampisin (Baya et al. 1990; Evanset al. 2002). Penyebab virulensi dari streptococcal adalah komponen galaktosa dan asam sialik (Pasnik et al. 2005). Asam sialik dapat menginduksi imun karena mengontrol konformasi epitop imunodominan (Jennings et al. 1992; Baker et al. 1993). Protein toksin yang disekresikan oleh bakteri yang hidup pada masa pertumbuhan eksponensial merupakan penentu utama virulensi. Biasanya lokasi kerusakan yang disebabkan oleh toksin menunjukkan lokasi target toksin tersebut yang spesifik. Namun beberapa jenis toksin memiliki aktivitas sitotoksik yang cukup luas dan menyebabkan kematian nonspesifik dari berbagai jenis sel atau kerusakan jaringan, yang pada akhirnya mengakibatkan nekrosis (Todar 2012).

Imunologi Ikan

Respons pertahanan ikan terdiri atas respons humoral dan respons selular (Anderson 1974). Mekanisme kerja respons tersebut saling menunjang, di antaranya melalui mediator limfokin dan sitokin. Sistem pertahanan ini diperlukan untuk proteksi tubuh terhadap serangan virus, bakteri, jamur dan parasit (Anderson 1990).

(27)

antibodi sangat penting dan banyak digunakan secara in vitro untuk tujuan diagnostik. Penggunaan reaksi in vitro antara antigen-antibodi disebut serologi (Baratawidjaja 2006). Tujuan pembentukan antibodi adalah untuk melumpuhkan patogen agar tidak menyebar dan menurunkan toksisitas racun sehingga mudah diserang sel fagosit, selain itu antibodi berfungsi pula mengaktifkan sistem komplemen sehingga patogen menjadi lisis.

Menurut Lin et al. (2005) sel spesifik dan jaringan dari sistem imun pada teleostei terletak pada organ limfomeiloid primer, sekunder dan tersier. Organ limfoid primer pada teleost adalah timus dan ginjal bagian depan yang berfungsi untuk hematopoiesis dan pembentukan sel baru. Organ sekunder adalah limpa dan kelenjar getah bening yang berfungsi untuk regenerasi pada respons imun dengan melibatkan interaksi antara beberapa tipe sel dan respons imun spesifik untuk melawan serangan antigen. Lebih lanjut Fange (1982) menjelaskan bahwa respons imunitas dibentuk oleh jaringan limfoid pada ikan, jaringan limfoidnya menyatu dengan jaringan myeloid, sehingga dikenal sebagai jaringan limfomyeloid. Organ limfoid pada ikan teleost adalah gut associated limfoid tissue(GALT). Produk jaringan limfoid adalah sel-sel darah dan respons imunitas baik seluler maupun humoral. Respons ini meliputi pertahanan mekanik dan kimiawi (mukus, kulit, sisik dan insang) dan pertahanan seluler (sel makrofag, lekosit seperti monosit, netrofil, eosinofil dan basofil).

Sistem kekebalan spesifik pada ikan, organ dalam sistem kekebalan ikan adalah sistem reticulo endothelial, limfosit, plasmosit, dan fraksi serum protein tertentu. Sistem reticulo endothelial ikan terdiri atas bagian depan ginjal, timus, limpa dan hati (pada awal perkembangan), jaringan menyerupai limfoid pada usus ikan, sel limfosit, limfosit B dan limfosit T. Aktivitas sel T pada ikan berperan dalam sistem kekebalan seluler/imun perantara sel (cell mediated immunity) sedangkan sel B berperan dalam produksi Ig melalui rangsangan antigen tertentu pada limpa dan hati (Anderson 1974).

Tanggapan kebal respons imun buatan pada kelompok teleost dapat dideteksi dalam beberapa hari bahkan 4-6 minggu setelah terjadinya infeksi atau peradangan awal, tergantung pada suhu lingkungan. Tanggap kebal adaptif terdiri atas jaringan sel protein komplek, pengantar pesan biokimia (sitokin), dan gen yang bekerja sama untuk menghasilkan suatu induksi tanggap kebal spesifik yang memerlukan antibodi spesifik (abs) dan antigen spesifik (ags) (Press & Evenson 1999).

Pada respons imun buatan yang bersifat spesifik, makrofag berperan melawan sel antigen, sedangkan limfosit B terlibat dalam produksi antibodi. Limfosit T berperan dalam imunitas melalui diferensiasi dan proliferasi dari limfosit B. Antibodi akan diproduksi terhadap patogen spesifik yang akan mengikat dan merusak patogen melalui aktivasi sistem komplemen dengan cara klasik (Liet al.2006).

Bakteri yang berhadapan dengan sel-sel imunitas akan didegradasi oleh makrofag dan menghasilkan reruntuhan (debris) yang akan dikeluarkan oleh makrofag, tetapi fragmen peptida dari protein bakteri akan ditransfer ke permukaan makrofag. Selanjutnya akan dibentuk kompleks peptida-major histocompability complex (MHC). Kompleks ini akan menstimulasi sel T. helper

(28)

Proteksi tubuh terhadap bakteri dimulai dengan adhesi, dilanjutkan dengan perlekatan, opsonisasi dan selanjutnya fagositosis. Proses adhesi menurut Christensen & Beachey (1984) merupakan tahap awal dalam kolonisasi bakteri pada permukaan sel inang. Adhesi memperpendek jarak antara bakteri dengan permukaan tubuh inang sehingga mempermudah melekatnya toksin yang dihasilkan bakteri pada reseptornya. Perlekatan bakteri pada sel inang merupakan langkah awal proses infeksi, proses ini dipengaruhi oleh interaksi komponen permukaan bakteri dan sel inang dengan faktor lingkungan yang dapat mendukungnya seperti fibrinectin (suatu protein yang bersifat adhesif),

fibrinogen, vitronektin dan laktoferin (Mims 1982). Struktur yang mungkin bertanggung jawab terhadap sifat adhesi bakteri adalah adhesin fimbriae, asam lipoteikoat dan protein adhesin. Interaksi yang terlibat dalam adhesin sebagian besar disebabkan oleh struktur permukaan hidrofob (Doyle & Rosenberg 1990).

Selanjutnya opsonisasi merupakan pengikatan partikel oleh molekul

immunoglobulin(Ig) atau komplemen ketiga (C3). Opsonisasi dipermudah dengan adanya reseptor untuk fragmen crystallizable (FC), Ig dan C3 pada permukaan sel membran makrofag. Opsonisasi antigen oleh immunoglobulin meningkatkan fagositosis, mempermudah antigen presenting cell (APC) memproses dan menyajikan antigen ke sel T dan meningkatkan fungsi sel natural killer (NK) dalam mekanisme antibodi dependent cytotoxicity (ADCC) (Kresno 2001). Mekanisme opsonisasi dapat melalui beberapa cara yaitu (1) antibodi spesifik yang berfungsi sebagai opsonin, (2) ikut campurnya komponen C3b sistem komplemen, mirip dengan kemotaksis, dan (3) bantuan substansi yang berasal dari protein serum berupaheat-labile factordan bersifat opsonin (Shwatz & Lazar 1980).

Tahap terakhir pertahanan tubuh adalah proses fagositosis yang merupakan suatu proses penangkapan dan penghancuran benda asing yang dilakukan oleh sel-sel fagositik. Banyak faktor yang mempengaruhi proses fagositosis antara lain pergerakan sel fagositik karena rangsangan benda asing dan kerentanan benda asing untuk difagositosis (Kindt et al. 1997). Dalam kerjanya, sel fagosit juga berinteraksi dengan komplemen dan sistem imun spesifik.

(29)

berdiferensiasi sebagai sel B memori yang akan menyimpan “ingatan” tentang

kejadian ini sehingga pada paparan berikutnya dengan antigen yang sama, tanggapannya akan jauh lebih efisien (Tizard 2004). Mekanisme pertahanan nonspesifik humoral dan seluler merupakan pertahanan pertama dan garis pertahanan paling primitif terhadap patogen yang menyerang ikan, peranannya pada ikan lebih penting dibandingkan pada mamalia (Wuet al. 2013).

Imunoglobulin M (IgM) adalah isotipe universal pada semua spesies vertebrata, ditemukan dalam serum sebagai antibodi alami bahkan sebelum kontak dengan antigen (Boes 2000). Pada semua organisme, IgM memiliki karakter yang luas, berperan pada innate imun dan adaptif imun (Boes 2000; Ehrenstein and Notley 2010) dan aktif menyelesaikan fungsi komplemen (Magnadottir et al.

1997; Boshra et al. 2004), aglutinasi, binding mannose binding lectin (Arnold et al. 2006) dan mediasi sitotoksisitas seluler (Nayaket al. 2010; Merrillet al. 1981) berperan untuk mengaktivasi komplemen terhadap opsonisasi patogen yang merupakan penghubung antara imunitas bawaan dan adaptif (Jianmin et al. 2013). Antibodi IgM teleostei juga berperan memediasi opsonisasi antigen spesifik dan fagositosis terhadap bakteri patogen pada Francisella asiatica (Soto

et al.2011; Sotoet al. 2011) danPhotobacterium damsela(Arijoet al. 1998) oleh makrofag .

Sistem imun terdiri atas komponen innate immune dan acquired immune

(Wuet al. 2013). Sistem kekebalan tubuh bawaan umumnya mendahului respons adaptif, mengaktifkan dan menentukan sifat respons adaptif dan membantu dalam mempertahankan homeostasis (Fearonet al. 1996). Beberapa faktor imun bawaan diantaranya lisozim adalah indikator peranan sistem kekebalan tubuh terhadap penyakit ikan (Magnadóttir 2006). Lisozim adalah enzim yang memecah peptidoglikan dalam dinding sel bakteri, sehingga menghambat penularan bakteri. Enzim terlibat dalam opsonisasi yang memfasilitasi fagositosis. Lisozim memainkan peran penting dalam pertahanan terhadap penyakit, aktivitasnya meningkat dalam darah ikan dan memiliki aktivitas antibakteri yang cukup besar (Saurabh & Sahoo 2008). Neutrofil ikan memiliki sifat fagositosis, chemotactic, bakterisida,respiratory burstdan aktivitas myeloperoxidase (Ellis 1999).Reactive oxygen species (ROS) dan reactive nitrogen species (RNS) diproduksi oleh neutrofil dan makrofag teraktivasi mampu membatasi pertumbuhan patogen (Densen 1990). ROS yang dihasilkan oleh neutrofil dan makrofag teraktivasi menghancurkan patogen dan merupakan indikator penting dari sistem pertahanan nonspesifik ikan (Miyazaki 1998).

Toksisitas bakteri ditandai dengan proses lisosomal yang tidak stabil, fagositosis yang tidak berhasil dan perubahan fungsi fagositosis sel. Hal ini menyebabkan kemampuan hewan untuk mempertahankan diri terhadap patogen dan penyakit menular secara signifikan berkurang (Jovanovi et al. 2012). Meskipun mekanisme patogenitas bakteri belum diketahui dengan tepat (Wanget al. 2010), namun beberapa faktor virulensi bakteri seperti protein eksotoksin dapat mematikan inang melalui aktivitas protease, dermatotoxin, hemolisin, siderophore dan resistensi terhadap fagosit (Supraptoet al.1996).

(30)

rohu (Sahu et al. 2011) dan ikan lele (Pridgeon et al. 2013), toksin dengan berat molekul 37 kDa dalam ekstraseluler dan intraselulerE. tardamematikanJapanese eeldanJapanese flounder(Supraptoet al.1995; Supraptoet al.1996), eksotoksin

Streptococcus pyrogenic A dan C yang diproduksi oleh kelompok A streptococci memainkan peran penting pada patogenesis streptococcus toxic shock syndrome

melalui induksi nitric oxide synthase (iNOS ) dan TNF (Christ et al. 1997) dan toksin NUF251 dari ECPE. tardayang sangat virulen (Wanget al.2010).

ECP yang disekresikan bakteri A. hydrophila, terdiri atas faktor virulensi seperti metalloproteases, glycerophospholipid-cholesterol acyltransferase, hemolysin, aerolysin dan lipases, juga protein untuk pencernaan seperti amilase and citinase serta protein untuk perlekatan pada sel inang seperti Slayer dan flagella yang seluruhnya berperan penting pada distribusi, adaptasi dan patogenisitas (Zhang et al. 2014). Faktor virulensi yang bertanggung jawab pada patogenesis E. tarda diantaranya adalah dermatotoxin (Ullah et al 1993), hemolisis (Hirono et al 1997), kemampuan untuk menyerang sel-sel epitel (Ling

et al 2000) dan kemampuan bertahan dalam fagosit (Srinivasa et al. 2003).

Enolase (EN), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) dan

fructose-bisphosphate aldolase (FBA) adalah protein yang merupakan faktor virulensi pada whole-cell S. iniae (Klesius et al. 1999; Shin et al. 2007) yang dapat bersifat immunogenik.

Limfosit dalam Sistem Imun

Limfosit adalah bagian dari sel darah putih yang merupakan sel kunci dalam proses imun spesifik seluler maupun humoral untuk mengenali antigen melalui reseptor antigen. Berdasarkan fungsinya, limfosit dikelompokkan atas limfosit sel T, sel B dan sel NK. Sel B dan sel T memiliki reseptor pada permukaan yang mampu mengenali antigen tertentu, termasuk dalam sistem pertahanan spesifik sedangkan sel NK tidak mempunyai reseptor untuk mengenal antigen termasuk sistem pertahanan nonspesifik (Kindtet al. 2007).

Sel limfosit T merupakam sistem pertahanan selular termasuk leukosit non-fatogenik yang berasal dari stem sel (sumsum tulang belakang), bermigrasi ke organ timus untuk menjadi dewasa. Sel T membelah diri di dalam organ timus, dalam proses pendewasaan mengalami diferensiasi menjadi tiga bentuk yaitu sel T

(31)

Limfosit B menurut Sheeler & Bianchi (1982) merupakan sel yang berasal dari sel stem dalam sumsum tulang belakang yang tumbuh menjadi sel plasma yang pada akhirnya akan menghasilkan antibodi dan sel memori. Limfosit B termasuk sistem pertahanan humoral yaitu tidak menggunakan sel dalam melawan antigen tetapi menghasilkan berbagai jenis antibodi untuk melawan antigen. Sel limfosit B dewasa memiliki imunoglobulin permukaan atau Surface Imunoglobulin (sIg) yang bertindak sebagai reseptor antigen spesifik, terdapat sejumlah 1.5 x 105molekul sIg pada permukaan membran sel B yang memiliki status peningkatan sesuai dengan antigen tertentu. Sel limfosit B dewasa bergerak ke jaringan limfoid primer dan sekunder untuk dapat memberikan respons terhadap rangsangan antigenik dengan cara pembelahan dan diferensiasi menjadi sel plasma dan sel memori di bawah kontrol sitokin, khususnya limfokin yang disekresi oleh sel T (Roitt & Delves 2001).

Sel NK termasuk sel nul karena tidak memiliki reseptor antigen pada permukaan tetapi memiliki reseptor untuk komplemen (C) dan fragmen molekul antibodi (Kresno 1996). Sel NK memiliki granula yang banyak seperti granula azurofilik dan ukuran lebih besar dari sel limfosit B dan T sehingga dikenal dengan large granulocytic lymphocyte (LGL). Sel NK berfungsi sebagai sel efektor sitolitik yang dapat menyerang dan melisis sel target yaitu sel abnormal seperti sel neoplastik, sel terinfeksi virus/patogen seluler, dan sel normal yang tidak dewasa (Roitt & Delves 2001).

Proliferasi limfosit adalah suatu fungsi biologis, yaitu proses perbanyakan sel melalui pembelahan sel atau mitosis sebagai respons terhadap antigen atau mitogen. Pada proses tersebut dihasilkan sel-sel efektor atau sel plasma yang berperan dalam respons spesifik dan nonspesifik. Respons proliferasi limfosit digunakan untuk menggambarkan fungsi limfosit dan status imun individu (Zakariaet al.2003).

Limfosit yang mengikat antigen dirangsang untuk berkembangbiak dan berdiferensiasi, sehingga terbentuk klon limfosit yang masing-masing memiliki reseptor pada membran sel induknya. Selama proses perbanyakan berlangsung, sel berdiferensiasi menjadi sel efektor dan sel memori. Sel memori memilki reseptor sama dengan limfosit tetuanya. Sel tersebut akan berdiferensiasi kemudian ada antigen yang mempunyai determinan antigen sama dengan reseptornya akan dihasilkan antibodi spesifik. Dengan demikian akan dihasilkan bermacam-macam antibodi. Antibodi/imunoglobulin merupakan kumpulan protein yang sangat heterogen dan heterogenitas ini disebabkan antara lain oleh perbedaan susunan asam anino. Akibat perbedaan asam amino, struktur molekul menjadi berbeda. Selanjutkan akan menimbulkan keragaman dalam determinan antigenik imunoglobulin yaitu isotipe, alotipe dan idiotipe (Tizard 2004).

Vaksinasi pada Streptococcosis

(32)

(bibit penyakit) ke dalam tubuh inang untuk memberikan kekebalan terhadap penyakit tersebut (Kindtet al. 2007).

Tujuan melakukan vaksinasi adalah untuk menstimulasi sistem imun dengan cara meningkatkan resistensi ikan terhadap jenis patogen tertentu. Vaksin pada industri budidaya ikan biasanya menggunakan formula dari bakterin (yang diinaktifasi dengan formalin atau pemanasan bakteri sel utuh), sel bakteri hidup yang tidak virulen, toksin bakteri, vaksin rekombinan dan menggunakan asam nukleat dari bakteri. Preparasi antigen vaksin dibuat dari bakteri patogen yang telah dibuat menjadi non-patogen dengan berbagai macam metode (Skinner 2009).

Imunologi dan analisis transkripsi menunjukkan bahwa dengan vaksinasi dapat: (i) menginduksi respons chemiluminescence yang lebih kuat dan lebih tinggi dalam produksi nitrit oksida dan aktivitas asam fosfatase pada makrofag ginjal anterior, (ii) memproduksi serum antibodi spesifik, yang akan memberikan immunoproteksi ketika diberikan imunisasi pasif pada ikan, (iii) regulasi ekspresi gen pengkode protein yang berperan dalam respons imun bawaan dan respons imun dapatan. Ketiga faktor tersebut akan memegang peranan dalam membuktikan bahwa vaksinasi pada ikan dapat mengontrol penyakit Streptococcosis pada lingkungan budidaya (Sunet al. 2010).

Faktor penentu virulensi bakteri yang kemudian dapat digunakan sebagai kandidat sediaan vaksin untuk menanggulangi infeksi bakteri yang homolog maupun heterolog diantaranya adalah enzim ekstraselular, kapsul polisakarida, lipopolisakarida (LPS) dan membran luar bakteri. Preparasi mikroorganisme dan produk sisa metabolismenya dapat digunakan sebagai agen yang dapat menstimulasi pembentukan antibodi dan penghancuran antigen melalui efektor makrofag dalam perlakuan uji tantang (Shoemaker & Klesius 1997).

Penelitian vaksin menggunakan sel utuh telah banyak dilakukan dan menunjukkan hasil yang cukup baik, diantaranya killed vaccine S. agalactiae

(Pasniket al. 2005), vaksin padaS. difficile (Eldaret al. 1995),S. iniae (Evanset al. 2004; Evans et al. (2004a), vaksin pada Enterococcus sp. (Romalde et al. 1996) dan vaksin pada Streptococcus sp. (Akhlaghi et al. 1996) serta vaksinasi ikan nila dengan vaksin sel utuh (formalin killed) bakteriS. agalactiae(Giordano

et al.2010).

Penelitian yang dikembangkan dengan menggunakan protein bakteri, diantaranya isolasi dan karakterisasi outer membrane protein E. tarda (Kumar et al. 2007), outer membrane protein OmpK, sebagai kandidat vaksin V. harveyi

pada orange-spotted grouper (Epinephelus coioides) (Ningqiu et al. 2008), penggunaan outer membrane proteins V. alginolyticus (Xiong et al. 2010), respons immunoproteomik antibodi ikan nila yang di vaksinS. iniae (LaFrentzet al. 2011), ekspresi ompK V. harveyi terhadap penyakit vibriosis (Mao et al.

2011),outer membrane proteinK sebagai vaksin subunit terhadap V. anguillarum

(Hamodet al. 2012), identifikasi antigenik protein permukaanE. tarda(Yuet al.

(33)

Penelitian efikasi vaksin ECP S. agalactiae dan vaksin utuh S. agalactiae

yang diinaktifkan dengan formalin (formalin-killed) yang telah disimpan pada suhu 4° C selama 1 tahun dibandingkan dengan yang masih segar, telah dilakukan oleh Pasniket al. (2005). Hasil penelitian menunjukkan bahwa ECPS. agalactiae

danformalin-killedsel utuh yang telah melalui proses penyimpanan tidak mampu mencegah morbiditas dan mortalitas di antara ikan yang divaksinasi dengan persentase relatif kelangsungan hidup sebesar 29%. Respons antibodi secara signifikan lebih sedikit dibandingkan ikan yang diimunisasi dengan penambahan ECP dan sel utuh S. agalactiae yang masih segar. Hasil silver staining SDS-PAGE dan imunostaining western blot menunjukkan bahwa pita dengan berat molekul 54 dan 55 kDa dominan terdapat pada penambahan ECP baru, namun pita 55 kDa tidak ditemukan pada ECP yang disimpan dan pita-pita baru kurang dari 54 kDa muncul pada western blot. Hasil ini menunjukkan korelasi antara proteksi dan produksi antibodi pada ECP dan pentingnya antigen dengan berat molekul 55 kDa untuk keberhasilan vaksin.

Penelitian vaksin dengan memanfaatkan ECP yang diproduksi dari bakteri

S. agalactiaetipe β-hemolitik dan nonhemolitik telah dilakukan. Bakteri tipe non-hemolitik lebih banyak ditemukan menginfeksi ikan nila. Vaksinasi gabungan antara vaksin sel utuh dengan vaksin ECP dari S. agalactiae tipe β-hemolitik mampu meningkatkan respons imun spesifik dan nonspesifik serta mampu memberikan proteksi terbaik pada ikan nila terhadap infeksi S. agalactiae

dibandingkan dengan vaksin ECP secara tunggal (Hardi 2011). Sementara itu penelitian yang dilakukan oleh Dwinanti (2011) dengan melihat toksisitas dan imunogenesitas produk ekstrasellular S. agalactiae tipe nonhemolitik pada ikan nila menunjukkan bahwa protein dari produk ekstrasellular ini dapat menyebabkan penyakit streptococcosis sehingga dapat dijadikan kandidat vaksin untuk memproteksi ikan nila.

Produk ekstraseluler adalah faktor virulen penting dari patogen ikan dan cukup imunogenik untuk memberikan proteksi pada ikan saat uji tantang. Efikasi vaksin ini sering ditingkatkan melalui seleksi dan pemekatan konsentrasi antigen ECP dan terbukti sangat imunogenik dan protektif (Pasnik et al. 2006). Antigen ECP telah dikembangkan sebagai vaksin V. harveyi (Zorrilla, 2003) dan

Flavobacterium psychrophilum (LaFrentz, 2004). Vaksinasi ikan channel catfish

dengan ECP dilakukan oleh Zhang et al. (2014) menunjukkan bahwa ikan yang telah divaksinasi dengan ECP dapat mengembangkan respons imun terhadap A. hydrophila dan dapat ditransfer melalui serum. Serum anti-ECP memiliki aktivitas aglutinasi berbeda terhadap isolat virulen yang berbeda dari A. hydrophila dan spesies yang berbeda dalam genus Aeromonas. Analisis imunobloting menunjukkan bahwa serum anti-ECP yang terkandung dalam antibodi terikat pada target spesifik, termasuk protein danlipopolysaccharide-like molecules dalam ECP. Analisisa mass spectrometric mengidentifikasi protein yang diduga dapat berfungsi sebagai immunogen penting adalah chitinase, chitodextrinase, outer membrane protein85, putative metalloprotease,

extracellularlipase, hemolysin dan elastase.

Pemberian vaksin selain meningkatkan respons imun spesifik dapat pula meningkatkan respons imun nonspesifik, diantaranya aktivitas superoxide dismutase, aktivitas lisozim dan aktivitas fagositosis limfosit meningkat pada

(34)

proteins (OMPs) 38 A. hydrophila (Wang et al. 2013), peningkatan respiratory burst (letupan respirasi) (John et al. 2002), stimulasi makrofag yang dapat meningkatkan reduksi nitroblue tetrazolium (NBT) (Chung & Secombes 1987), peningkatan aktivitas letupan respirasi, aktivitas komplemen dan α2 -macroglobulin, aktivitas lisozim serum dan aktivitas antiprotease (Harikrishnanet al. 2012).

ECP dapat menjadi kunci untuk memperbaiki proteksi-silang dengan modifikasi bakteri S. agalactiae (mengandung ECP) memberikan perlindungan pada uji tantang yang homolog dan heterolog tanpa boosterpada ikan nila (Evans

et al, 2004). Sehingga ECP berpotensi sebagai pelopor dalam pengembangan vaksin dengan proteksi silang terhadap berbagai agen streptococcocal (Nhoet al. 2011).

Pemurnian Protein

Pemurnian protein merupakan serangkaian proses yang dilakukan untuk mengisolasi suatu jenis protein dari campuran yang kompleks. Berbagai langkah dalam proses pemurnian akan melepaskan protein dari matriks yang mengikatnya dan memisahkan protein dan bagian yang bukan protein dari campuran larutan sehingga diperoleh protein yang diinginkan dan telah murni (Coliganet al. 1995).

Menurut Lehninger (1993) fraksinasi protein merupakan metode pemisahan dan pemurnian protein dari senyawa dengan berat molekul rendah yang ada dalam ekstrak sel atau jaringan. Analisis dan fraksinasi protein ini dapat dilakukan dengan elektroforesis, dimana elektroforesis ini merupakan suatu molekul yang bermuatan akan bergerak dalam medan listrik, fenomena ini dikenal sebagai elektroforesis, dapat digunakan untuk memisahkan protein atau makromolekul lain seperti DNA dan RNA.

Sodium dedocyl sulfate-polyacrylamide gels (SDS-PAGE) merupakan teknik yang digunakan untuk memisahkan protein berdasarkan panjang rantai polipeptida atau bobot molekulnya. Pemisahan protein berdasarkan ukurannya ini dilakukan dalam medan listrik. Campuran protein yang akan dipisahkan dilarutkan dalam SDS, suatu jenis detergen anionik. SDS ini akan mendenaturasi struktur sekunder dan ikatan non-disulfida dari struktur tersier menjadi struktur linear/primer. Selain itu SDS juga akan memberikan muatan negatif pada struktur linear protein dengan perbandingan bergantung pada bobot protein (Coligan et al. 1995).

(35)

konsentrasi akrilamid dan metilenbisakrilamida (reagen pengikat) pada saat polimerisasi (Stryer 2000).

Sampel protein dimasukkan pada salah satu ujung lapisan gel poliakrilamid yang terendam dalam larutan bufer berarus listrik yang menyebabkan protein bermuatan negatif bermigrasi ke katoda. Tegangan listrik yang digunakan juga akan berpengaruh terhadap pergerakan protein. Dengan demikian protein akan memiliki pergerakan yang berbeda berdasarkan ukuran, dimana protein yang lebih kecil akan bergerak jauh di bawah gel, sedangkan yang lebih besar akan tetap lebih dekat ke titik asal. Pada akhirnya protein dapat dipisahkan sesuai dengan ukuran berat molekul. Setelah elektroforesis, gel dapat diwarnai dengan

coomassie brilliant blueatau silvers staining untuk visualisasi protein yang telah dipisahkan atau diproses lebih lanjut dengan western blot. Setelah pewarnaan, protein yang berbeda akan muncul sebagai band/pita yang berbeda dalam gel yang dapat dibandingkan dengan protein penanda (marker) yang telah diketahui berat molekulnya (Molecularstation 2008).

Gel poliakrilamida tersusun atas monomer akrilamid yang akan membentuk ikatan silang dengan bantuan ammonium persulfat (APS) dan TEMED

(36)

KARAKTERISASI DAN PATOGENISITAS PROTEIN ECP

Streptococcus agalactiae

PADA IKAN NILA

(Oreochromis niloticus)

Abstrak

Pengembangan vaksin dari toksin protein dapat dilakukan dengan mengetahui fraksi protein dalam ECP yang berperan terhadap respons imun ikan nila. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi toksisitas protein ECP S. agalactiae hasil fraksinasi dengan SDS-PAGE. Protein dengan berat molekul 76,52 kDa (ECPP76,52); 89 kDa (ECPP89) dan 132,92 kDa (ECPP132,92) dari ECP pekat yang difraksinasi dengan SDS-PAGE dan diisolasi dari gel acrilamid. Ikan nila berat 25 g secara intraperitonial (i.p.) masing-masing diinjeksi dengan protein dosis 1, 2, 4, 8 dan 16 µg mL-1. Sebagai kontrol positif ikan diinjeksi dengan bakteri utuh S. agalactiae 1x104 CFU mL-1 (WCB) dan ECP crude S.

agalactiae (ECPC). Sebagai kontrol negatif ikan diinjeksi larutan PBS. Ikan dipelihara selama 15 hari dengan kepadatan 10 ekor (70 L air). Hasil penelitian menunjukkan bahwa ikan nila yang diinjeksi dengan ECP89, WCB dan ECPC mengalami gejala khas penyakit S. agalactiae. Mortalitas pada perlakuan ECP89 secara umum lebih tinggi (p<0.05) dibandingkan dengan ECPC namun lebih rendah (p<0.05) dibandingkan dengan WCB. Gejala khas terserang S. agalactiae

dan mortalitas ikan tidak terjadi pada perlakuan ECPP76,52; 132,92 kDa dan kontrol PBS. Hasil ini menunjukkan bahwa ECPP89 merupakan protein toksin dari ECP S. agalactiae yang berpotensi sebagai antigen yang imunogenik, sehingga perlu diuji sebagai kandidat vaksin protein.

Kata kunci : patogenisitas, ikan nila, Streptococcus agalactiae, produk ekstraselular

Abstract

The development of the vaccine from a toxin protein started with identifying the antigenic proteins in crude extracellular products (ECP) by testing the toxicity of proteins with different molecular weights. This purpose of study was to evaluate the toxicity of the protein with various molecular weight ofS. agalactiae

(37)

treatments were not distinct but it were significantly higher than in ECPC and the other two dosages of ECPP89 (p<0.05). The negative control fish did not die or demonstrate clinical changes. This suggests that ECPP89 is a toxin ECP protein ofS. agalactiae.

Keywords: pathogenicity, Nile tilapia, Streptococcus agalactiae, extracellular products

Pendahuluan

Patogenisitas merupakan kemampuan mikroba untuk menyebabkan suatu penyakit pada organisme inang. Mikroba mengekspresikan patogenitasnya melalui virulensi yang berbanding lurus dengan kemampuan organisme menyebabkan penyakit. Tingkat virulensi bakteri yang tinggi ditentukan oleh kemampuan bakteri menghasilkan toksin yang merupakan mekanisme penting pada hampir semua bakteri patogen penyebab penyakit. Toksin merupakan zat racun yang dibentuk dan dikeluarkan oleh organisme yang dapat menyebabkan kerusakan radikal secara struktural, merusak secara keseluruhan tubuh inang atau efektifitas bagian tertentu dari organisme.

Toksin yang berasal dari bakteri adalah komponen racun terlarut yang diproduksi oleh bakteri dan menyebabkan pengaruh negatif terhadap sel-sel inang dengan cara mengubah metabolisme normal dari sel inang tersebut. Toksin yang berhubungan dengan sel bakteri disebut sebagai endotoksin sedangkan toksin yang dapat berdifusi secara ekstraselular disebut sebagai eksotoksin. Eksotoksin biasanya protein yang bertindak secara enzimatik atau bertindak secara langsung pada sel inang dan merangsang berbagai respons inang (Todar 2012).

Toksisitas bakteri ditandai dengan proses lisosomal yang tidak stabil, fagositosis yang tidak berhasil dan perubahan fungsi fagositosis sel. Hal ini menyebabkan kemampuan hewan untuk mempertahan diri terhadap patogen dan penyakit menular secara signifikan berkurang (Jovanovi et al. 2012). Meskipun mekanisme patogenik bakteri belum diketahui dengan tepat (Wang et al. 2010), namun beberapa faktor virulensi bakteri seperti protein eksotoksin dapat mematikan inangnya melalui aktivitas protease, dermatotoxin, hemolisin, siderophore dan resistensi terhadap fagosit (Supraptoet al.1996).

Figur

Gambar 1.Kerangka berpikir penelitian vaksin protein toksoid dari produk

Gambar 1.Kerangka

berpikir penelitian vaksin protein toksoid dari produk p.24
Gambar 2. Vivaspin untuk memekatkan ECP dan pemotongan gel akrilamid hasil

Gambar 2.

Vivaspin untuk memekatkan ECP dan pemotongan gel akrilamid hasil p.40
Gambar 3.Kurva standar protein total ECP crude bakteri Streptococcus

Gambar 3.Kurva

standar protein total ECP crude bakteri Streptococcus p.41
Gambar 4.Hasil fraksinasi protein toksin dari ECP bakteri Streptococcus

Gambar 4.Hasil

fraksinasi protein toksin dari ECP bakteri Streptococcus p.42
Tabel 1.Konsentrasi protein total  ECP crude bakteri S. agalactiae isolat N14G

Tabel 1.Konsentrasi

protein total ECP crude bakteri S. agalactiae isolat N14G p.42
Gambar 5. Perubahan anatomi luar ikan nila (Oreochromis niloticus) setelah

Gambar 5.

Perubahan anatomi luar ikan nila (Oreochromis niloticus) setelah p.45
Gambar 6.Pengerutan

Gambar 6.Pengerutan

p.46
Gambar 7.Histologi ikan nila (Oreochromis

Gambar 7.Histologi

ikan nila (Oreochromis p.47
Gambar 8. Mekanisme masuknya toksin ke sel inang yang dimediasi oleh

Gambar 8.

Mekanisme masuknya toksin ke sel inang yang dimediasi oleh p.50
Gambar 9.Kadar hemoglobin ikan nila setelah diinjeksi dengan berbagai dosis

Gambar 9.Kadar

hemoglobin ikan nila setelah diinjeksi dengan berbagai dosis p.56
Gambar 10. Penjenisan leukosit terdiri atas persentase monosit (A), persentase

Gambar 10.

Penjenisan leukosit terdiri atas persentase monosit (A), persentase p.57
Gambar 11. Persentase aktivitas fagositosis ikan nila setelah diinjeksi dengan

Gambar 11.

Persentase aktivitas fagositosis ikan nila setelah diinjeksi dengan p.58
Gambar 12. Aktivitas lisozim serum ikan nila setelah diinjeksi dengan berbagai

Gambar 12.

Aktivitas lisozim serum ikan nila setelah diinjeksi dengan berbagai p.59
Gambar 14. OD-ELISA titer antibodi ikan nila setelah diinjeksi dengan berbagai

Gambar 14.

OD-ELISA titer antibodi ikan nila setelah diinjeksi dengan berbagai p.60
Gambar 13. Titer aglutinasi antibodi ikan nila setelah diinjeksi dengan berbagai

Gambar 13.

Titer aglutinasi antibodi ikan nila setelah diinjeksi dengan berbagai p.60
Gambar 15.Kematian kumulatif harian ikan nila (Oreochromis  niloticus) pasca

Gambar 15.Kematian

kumulatif harian ikan nila (Oreochromis niloticus) pasca p.68
Gambar 17.Penjenisan leukosit terdiri atas persentase monosit (A), persentase

Gambar 17.Penjenisan

leukosit terdiri atas persentase monosit (A), persentase p.70
Gambar 19. Aktivitas lisozim serum ikan nila (Oreochromis  niloticus) pasca uji

Gambar 19.

Aktivitas lisozim serum ikan nila (Oreochromis niloticus) pasca uji p.71
Gambar 18.Aktivitas fagositosis ikan nila (Oreochromis  niloticus) pasca uji

Gambar 18.Aktivitas

fagositosis ikan nila (Oreochromis niloticus) pasca uji p.71

Referensi

Memperbarui...