IDENTIFIKASI SPESIES
POLEROVIRUS
PADA TANAMAN
WORTEL MELALUI ANALISIS SEKUEN NUKLEOTIDA
GEN
COAT PROTEIN
INA RUBIATUL HASANAH
DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
ii
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA *
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul “Identifikasi Spesies Polerovirus pada Tanaman Wortel melalui Analisis Sekuen Nukleotida Gen Coat Protein” adalah benar karya saya dengan arahan dari pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya pada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Mei 2014
Ina Rubiatul Hasanah
NIM A34100091
ABSTRAK
INA RUBIATUL HASANAH. Identifikasi Spesies Polerovirus pada Tanaman Wortel melalui Analisis Sekuen Nukleotida Gen Coat Protein. Dibimbing oleh GEDE SUASTIKA.
Selama survei di sentra produksi wortel di Jawa Barat, beberapa tanaman ditemukan menunjukkan gejala mirip diinduksi virus. Tanaman yang sakit menunjukkan gejala kemerahan dan kekuningan pada daun, tetapi tanaman tidak tampak kerdil. Gejala ini mirip dengan penyakit yang telah dilaporkan terdapat di negara-negara lain, yang disebut “carrot motley dwarf”, dimana gejala kemerahan, kekuningan, dan pengerdilan sangat jelas. Penyakit ini dilaporkan disebabkan oleh infeksi campuran dari dua virus yang berbeda, yaitu Carrot red leaf virus (CtRLV), anggota dari genus Polerovirus dan Carrot mottle mimic virus
(CMoMV), anggota dari genus Umbravirus. Untuk mengetahui agen penyebab penyakit daun merah di Indonesia, RNA total diekstraksi dari daun tanaman wortel bergejala yang diperoleh dari pertanaman wortel di Cipanas, Cianjur, Jawa Barat untuk digunakan dalam proses reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Deteksi dilakukan dengan menggunakan pasangan primer spesifik untuk CtRLV. Namun virus tersebut gagal dideteksi, kemudian identifikasi lebih lanjut difokuskan pada virus lain dari spesies Polerovirus
dengan menggunakan sepasang primer CP-F (5'-AATTAAGGATCCAATACG GGAGGGGTTAGGAGAAAT-3') dan CP-R (5'-AATTAACTGCAGTTTCGG GTTGTGCAATTGCACAGTA-3'). RT-PCR berhasil mengamplifikasi pita DNA berukuran sekitar 650 bp, sesuai dengan estimasi ukuran primer yang dirancang. Produk RT-PCR kemudian disekuen dan 630 nukleotida berhasil dibaca. Analisis BLAST menunjukkan bahwa virus yang menjadi penyebab penyakit daun merah pada tanaman wortel di Jawa Barat adalah Pepper vein yellow virus (PeVYV). PeVYV adalah virus yang sudah ditemukan menginfeksi cabai di Bali. Hal ini merupakan laporan pertama mengenai PeVYV yang menginfeksi tanaman wortel di Indonesia.
ABSTRACT
INA RUBIATUL HASANAH. Identification of Polerovirus Species in Carrot by Analysing The Nucleotide Sequence of Coat Protein Gene. Supervised by GEDE SUASTIKA.
During survey on central production of carrot in West Java, some plants were found exhibiting virus-like induced symptoms. The diseased plants showed reddening and yellowing of leaves, but the plants were unlikely to be stunting. The symptom was resemble to the disease reported in other countries as „motley dwarf‟, in which the reddening, yellowing, and stunting is accentuated. The disease was reported to be caused by mixed infection of two different viruses that were Carrot red leaf virus (CtRLV), member of genus Polerovirus and Carrot mottle mimic virus (CMoMV), member of genus Umbravirus. To know the causal agent of the disease present in Indonesia, total RNA extraced from the symptom exhibiting carrot plants obtained from field in Cipanas, Cianjur, West Java was subjected to reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) using primer pair specific to CtRLV. Unfortunately, the virus was failed to be detected and therefore, further identification was focused on other virus. Using primer pair of CP-F (5‟-AATTAAGGATCCAATACGGGAGGGGTTAGGAGAAAT-3‟) and CP-R (5‟-AATTAACTGCAGTTTCGGGTTGTGCAATTGCACAGTA-3‟), that were specific to Polerovirus. RT-PCR was successfully amplified a DNA band of about 650 bp, the size which accordance with the designed primers. The RT-PCR product was then sequenced and the 630 nucleotides were succesfully read. The BLAST analysis of the nucleotide sequence revealed that the virus associated with red leaf disease on carrot in West Java was associated with Pepper vein yellow virus (PeVYV). PeVYV was a virus found previously infected chilli pepper in Bali. This is the first report concerning PeVYV infected carrot in Indonesia. Keywords: Pepper vein yellow virus, red leaf disease, reverse
IDENTIFIKASI SPESIES
POLEROVIRUS
PADA TANAMAN
WORTEL MELALUI ANALISIS SEKUEN NUKLEOTIDA
GEN
COAT PROTEIN
INA RUBIATUL HASANAH
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk melakukan penelitian tugas akhir
pada
Departemen Proteksi Tanaman
DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
Disetujui oleh
Dr Ir Gede Suastika, MSc Dosen Pembimbing
Diketahui oleh
Dr Ir Abdjad Asih Nawangsih, MSi Ketua Departemen
Tanggal lulus:
Judul Usulan : Identifikasi Spesies Polerovirus pada Tanaman Wortel melalui Analisis Sekuen Nukleotida Gen Coat Protein
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan ke khadirat Allah SWT yang telah memberikan segala rahmat dan karunia-Nya sehingga dapat menyelesaikan skripsi ini yang berjudul “Identifikasi Spesies Polerovirus pada Tanaman Wortel melalui Analisis Sekuen Nukleotida Gen Coat Protein”. Penelitian dilakukan di Laboratorium Virologi, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini berlangsung mulai bulan September 2013 sampai Maret 2014.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada orang tua serta keluarga yang selalu memberikan doa, dukungan serta motivasi kepada penulis. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dr Ir Gede Suastika, MSc selaku dosen pembimbing skripsi yang memberikan banyak saran, pengetahuan, dan dukungan, Dr Ir Idham Sakti Harahap, MSi selaku dosen pembimbing akademik sekaligus dosen penguji tamu yang telah memberikan banyak kritik dan saran terhadap penulis. Terima kasih kepada Fitrianingrum Kurniawati, SP, MSi, Sari Nurulita, SP, Pak Heru, Mansyur Tri Widodo, dan teman-teman Laboratorium Virologi yang telah memberikan bimbingan dan membantu selama proses penelitian, serta teman-teman Proteksi Tanaman angkatan 47 dan teman-teman KC yang telah memberikan banyak dukungan dan motivasi selama perkuliahan hingga penelitian.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan yang perlu diperbaiki dalam skripsi ini, oleh karena itu penulis membutuhkan kritik dan saran yang bersifat membangun untuk mencapai tujuan yang diinginkan. Semoga skripsi ini bermanfaat.
Bogor, Mei 2014
vii
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL vii
DAFTAR GAMBAR vii
DAFTAR LAMPIRAN vii
PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 2
Tujuan 2
Manfaat Penelitian 2
BAHAN DAN METODE 3
Tempat dan Waktu Penelitian 3
Bahan dan Alat 3
Metode 3
Ekstraksi RNA Total 3
Sintesis Complementary (cDNA) 3
Amplifikasi DNA 4
Visualisasi Hasil RT-PCR 4 Sekuen Nukleotida dan Analisis Filogenetika 5
HASIL DAN PEMBAHASAN 6
Penyakit Daun Merah pada Tanaman Wortel 6 Virus yang Berasosiasi dengan Penyakit Daun Merah pada Tanaman
Wortel 7
Spesies Polerovirus Penyebab Daun Merah pada Tanaman Wortel 8
SIMPULAN DAN SARAN 11
1
Komposisi reaktan Reverse Transcription (RT) untuk satu kali reaksi Komposisi reaktan Polymerase chain reaction (PCR) untuk satu kali reaksi
Homologi sekuen nukleotida virus penyebab daun merah pada tanaman wortel di Jawa Barat (PeVYV-WJC) dengan virus-virus yang sudah dilaporkan dapat menginfeksi tanaman wortel
Homologi sekuen nukleotida virus penyebab daun merah pada tanaman wortel di Jawa Barat (PeVYV-WJC) dengan PeVYV yang sudah dilaporkan di beberapa negara lain
4 lapangan (A) gejala penyakit daun merah pada wortel (B) daun-daun semula berwarna kuning, daun-daun atas berubah warna menjadi kemerahan (C) daun-daun yang lebih muda menjadi keunguan
Hasil amplifikasi DNA virus dari sampel tanaman wortel bergejala penyakit daun merah. Lajur: (M) marker 1 kb DNA ladder
(Promega, US), (K-) kontrol negatif, (P) isolat PeVYV tanaman cabai, (I) isolat PeVYV-WJC tanaman wortel.
Pohon filogenetika isolat-isolat Pepper vein yellow virus berdasarkan sekuen nukleotida gen coat protein menggunakan program CLC
sequence viewer v 6.7.1 dengan pendekatan UPGMA. No aksesi PeVYV isolat ranti asal India adalah JX427531, PeVYV-Thailand-Cabai JX427541, PeVYV-Taiwan-PeVYV-Thailand-Cabai JX427542, PeVYV-Japan-Cabai AB594828, PeVYV-Israel-PeVYV-Japan-Cabai HM439608, PeVYV-China-Cabai AJ575129, dan PepLCV-Thailand-Cabai AF134484 digunakan sebagai outgroup. Israel, Jepang, Taiwan, Thailand, dan India menggunakan program
ClustalW Bioedit V.7.0.5.
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Wortel (Daucus carota L) merupakan salah satu tanaman sayuran dari famili Umbelliferae yang banyak dibudidayakan di Indonesia. Tanaman ini berasal dari Asia Tengah yang beriklim sedang. Di Indonesia tanaman ini ditanam di daerah dataran tinggi (ketinggian 1200-1500 m dpl), terutama di daerah dengan kondisi yang sesuai bagi pertumbuhannya, yaitu suhu optimum sekitar 15 sampai 21oC, pH tanah netral, drainase baik, dan bahan organik yang cukup (BPPP 2012).
Jawa Barat merupakan salah satu sentra produksi wortel di Indonesia. Produktivitas wortel daerah ini tercatat pada tahun 2011 hingga 2013 adalah sekitar 17 ton/ha lebih tinggi dari rata-rata produksi secara nasional yang hanya sekitar 15 ton/ha pada tahun yang sama (BPS 2013). Produktivitas tanaman wortel sebesar ini tampaknya masih lebih rendah dari potensi produktivitas varietas yang dibudidayakan yaitu sebesar 20-25 ton/ha (Rukmana 1995). Hal tersebut dapat disebabkan oleh berbagai faktor, seperti kondisi lingkungan biotik dan abiotik yang tidak sesuai. Faktor biotik yang dapat berpengaruh terhadap produksi wortel adalah organisme pengganggu tumbuhan (OPT). Patogen merupakan salah satu OPT yang sulit dikendalikan. Beberapa penyakit pada tanaman wortel di Indonesia yang telah tercatat, antara lain bercak daun cercospora (Cercospora carotae), embung tepung (Oidium sp.), dan busuk daun bakteri (Erwinia carotovora pv. carotovora) (Semangun 1996).
Beberapa virus juga telah dilaporkan dapat menginfeksi tanaman wortel di berbagai negara, seperti Carrot latent virus (CtLV), Carrot mosaic virus (CtMV),
Carrot mottle mimic virus (CMoMV), Carrot mottle virus (CMoV), Carrot red leaf virus (CtRLV), Carrot temperate virus (CtTV), Carrot thin leaf virus
(CTLV), dan Carrot yellow leaf virus (CYLV) (Fauquet et al. 2005).
Pada tanaman wortel penyakit yang disebut Carrot motley dwarf banyak dilaporkan di beberapa negara seperti Australia, Eropa, Jepang, Israel, Amerika Utara, Inggris, Belgia, dan di Afrika (Bunwaree et al. 2009). Penyakit ini dilaporkan disebabkan oleh asosiasi antara CtRLV dari genus Polerovirus dan CMoMVdari genus Umbravirus (Murant et al. 1985). Infeksi kedua virus ini secara bersama-sama menyebabkan daun wortel menguning sampai kemerahan, pertumbuhan tanaman terhambat hingga nampak kerdil, dan dapat menyebabkan kehilangan hasil yang cukup signifikan (Bunwaree et al. 2009). Di Indonesia, gejala penyakit seperti di atas sudah banyak ditemukan di beberapa daerah sentra produksi wortel di Jawa Barat (pengamatan penulis), namun laporan mengenai penyebabnya belum pernah ada. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian untuk mengidentifikasi virus yang menyebabkan gejala kuning kemerahan pada tanaman wortel yang ditemukan di Jawa Barat.
2
Tujuan
Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi spesies Polerovirus penyebab penyakit daun merah pada tanaman wortel di Jawa Barat melalui RT-PCR dan sekuen nukleotida.
Manfaat Penelitian
3
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu
Survei dan pengambilan sampel tanaman wortel yang bergejala dilakukan di pertanaman wortel di daerah Cipanas-Cianjur, Lembang-Bandung Barat, dan Cikajang-Garut. Identifikasi virus dilakukan di Laboratorium Virologi Tumbuhan Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini berlangsung mulai bulan September 2013 hingga Maret 2014.
Metode Penelitian Ekstraksi RNA Total
Ekstraksi RNA total dilakukan dengan menggunakan RNeasy Plant Mini Kits (Phille Korea Technology). Sebanyak 0.1 gram daun wortel bergejala digerus dalam nitrogen cair dengan mortar dan pistil dengan penambahan nitrogen cair, kemudian ditambahkan 500 µL Plant RNA Lysis Solution dan 5 µL (1%) β -merkaptoetanol. Sap dimasukkan ke dalam tabung effendorf (volume 1.5 ml) dan diinkubasi pada suhu 56 oC selama 3 menit, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 14 000 rpm (20 000 x g) selama 5 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung effendorf baru dan ditambahkan 250 µL etanol 96%. Siapan dipindahkan ke dalam kolom purifikasi dan disentifugasi dengan kecepatan 11 000 rpm (12 000 x g) selama 1 menit. Supernatan dibuang lalu ditambahkan 700 µL Wash buffer 1 pada kolom dan disentrifugasi dengan kecepatan 11 000 rpm (12 000 x g) selama 1 menit. Supernatan dibuang kembali lalu ditambahkan 500 µL Wash buffer 2 pada kolom dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 11 000 rpm (12 000 x g) selama 1 menit. Supernatan dibuang dan diulangi langkah sebelumnya, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 14 000 rpm selama 1 menit. Selanjutnya, dipindahkan ke kolom purifikasi pada tabung effendorf baru, kemudian tambahkan 50 µL Nuclease free water pada bagian tengah kolom purifikasi lalu disentrifugasi dengan kecepatan 11 000 rpm (12 000 x g) selama 1 menit. Hasil ekstraksi RNA disimpan di dalam -80 oC sebelum digunakan.
Sintesis Complementary (c) DNA
4
Tabel 1 Komposisi reaktan Reverse Transcription (RT) untuk satu kali reaksi (Thermo Scientific, US).
Tabel 2 Komposisi reaktan polymerase chain reaction (PCR) untuk satu kali reaksi (Thermo Scientific, US). menit untuk, dan elongasi (sintesis untaian DNA baru) pada suhu 72 oC selama 1 menit, tahap pascaelongasi pada72 oC selama 10 menit, dan penyimpanan pada suhu 4 oC.
Visualisasi Hasil RT-PCR
Visualisasi hasil RT-PCR dilakukan dengan elektroforesis gel agarose 1%. Pembuatan gel dilakukan dengan 0.3 g agarose dicampur dengan 30 ml buffer
TBE 10% (Tris boric acid EDTA) dan dipanaskan dengan microwave selama 3 menit. Setelah itu, larutan agarose didinginkan hingga hangat kuku, kemudian larutan tersebut dituangkan ke dalam cetakan dan didiamkan hingga padat. Setelah gel terbentuk, DNA ladder 1 kb (Thermo Scientific, US) sebanyak 5 µL dimasukkan ke dalam sumur gel dan 7 μL DNA hasil PCR ke dalam masing -masing sumur gel.
5 menit, gel direndam di dalam air selama 5 menit, divisualisasi dengan UV transiluminator, dan didokumentasikan.
Analisis Sekuensing Nukleotida dan Filogenetika
Analisis sekuen nukleotida dilakukan dengan pembuatan produk PCR sampel yang positif mengandung virus sebanyak 50 μL. Sampel tersebut kemudian dikirim ke PT Genetika Science Indonesia untuk dilakukan sekuen nukleotida.
Hasil sekuen nukleotida kemudian digunakan untuk analisis kesejajaran dengan sikuen nukleotida lain yang telah dipublikasikan di GeneBank dengan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tools) (NCBI 2014). Data sekuen nukleotida yang terpilih kemudian dimodifikasi dan analisis spesifisitas nukleotida dilakukan dengan program multiple alignment, ClustalW dengan
6
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penyakit Daun Merah pada Tanaman Wortel
Survei telah dilakukan di beberapa lokasi pertanaman wortel di Cipanas-Cianjur, Lembang-Bandung Barat, dan Cikajang-Garut. Beberapa tanaman wortel di lahan petani ditemukan gejala yang memperlihatkan seperti terinfeksi virus. Daun-daun tanaman wortel yang sakit berubah warna secara bertahap dari kuning menjadi merah kemudian ungu. Daun-daun yang lebih tua berwarna kuning, kemudian daun-daun yang lebih atas (muda) memperlihatkan perubahan warna menjadi kemerahan, dan daun-daun yang lebih muda lagi menjadi ungu. Daun-daun yang paling muda (pucuk) umumnya tetap berwarna hijau. Warna merah keunguan pada tanaman sakit tampak sangat dominan, sehingga pada laporan ini disebut „Penyakit daun merah‟.
Gambar 1 Gejala pada daun wortel (Daucus carota L) yang ditemukan di lapangan (A) gejala penyakit daun merah pada wortel (B) daun-daun semula berwarna kuning, daun-daun atas berubah warna menjadi kemerahan (C) daun-daun yang lebih muda menjadi keunguan.
Gejala penyakit daun merah yang terjadi pada tanaman wortel di Jawa Barat ini sangat mirip dengan deskripsi gejala penyakit Carrot motley dwarf (CMD) yang telah dilaporkan di beberapa negara penghasil wortel dunia (Bunwaree et al.
2009). Menurut Murant et al. 1985, CMD dapat disebabkan oleh asosiasi dari CtRLV dari genus Polerovirus dan CMoMV dari genus Umbravirus. Penyakit ini dapat disebabkan oleh infeksi tunggal dari CtRLV maupun kombinasi dengan CMoMV. CtRLV merupakan helper dari CMoMV dalam hal penularannya melalui serangga vektor. Kedua virus ini persisten di dalam tubuh serangga vektornya, yaitu kutu Cavariella aegopodii (Elnagar et al. 2008).
Walaupun karakteristik gejala penyakit daun merah dan CMD relatif mirip, namun terdapat perbedaan yang signifikan dalam hal penghambatan pertumbuhan tanaman. Pada CMD karakter dwarf (kerdil) menjadi hal yang dominan, namun pada penyakit daun merah tidak terlihat perbedaan tinggi antara tanaman sakit dan tanaman sehat (data tidak diperlihatkan). Banyak faktor yang mungkin berhubungan dengan perbedaan gejala ini, seperti akibat reaksi varietas tanaman wortel yang berbeda, isolat virus atau mungkin juga jenis virus yang berbeda, dan kondisi lingkungan yang berbeda.
7 Virus yang berasosiasi dengan Penyakit Daun Merah
pada Tanaman Wortel
Berdasarkan simptomatologi, penyakit daun merah pada tanaman wortel yang ditemukan di Jawa Barat diduga sama dengan CMD yang telah dilaporkan terjadi di beberapa negara penghasil wortel dunia. Pada penelitian ini, deteksi virus difokuskan pada deteksi CtRLV dan CMoMV yang telah diketahui berasosiasi dengan penyakit CMD.
Deteksi virus telah dilakukan dengan teknik RT-PCR menggunakan primer spesifik untuk CtRLV (Morton et al. 2003) dan CMoMV (Bunwaree et al. 2009). RT-PCR telah dilakukan beberapa kali terhadap RNA total yang diekstraksi dari contoh tanaman wortel sakit yang berbeda. Pita DNA tidak teramplifikasi (data tidak ditampilkan). Banyak faktor yang dapat menyebabkan RT-PCR gagal menghasilkan pita DNA yang diharapkan, salah satunya adalah tidak adanya RNA virus target dalam RNA total yang digunakan sebagai template. Hal ini berarti bahwa CtRLV dan CMoMV tidak ditemukan pada tanaman wortel sampel. Hasil ini mengindikasikan bahwa CtRLV maupun CMoMV mungkin bukan merupakan penyebab penyakit daun merah pada tanaman wortel di Jawa Barat.
Spesies Polerovirus yang pernah dilaporkan sudah terdapat di Indonesia adalah Pepper vein yellow virus (PeVYV) yang ditemukan menginfeksi tanaman cabai di daerah Bali (Suastika et al. 2012). Primer yang didesain untuk mengamplifikasi gen coat protein (CP) secara utuh telah tersedia di Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, IPB. Primer tersebut adalah CP-F (5‟-AATTAAGGATCCAATACGGGAGGGGTTAGGAGAAAT-3‟) dan CP-R (5‟-AATTAACTGCAGTTTCGGGTTGTGCAATTGCACAGTA-3‟) yang mempunyai prediksi produk PCR sebesar ±650 pb. RT-PCR yang telah dilakukan menggunakan primer ini mengamplifikasi DNA berukuran sesuai dengan prediksi dan sama dengan hasil amplifikasi PeVYV isolat cabai yang digunakan sebagai kontrol positif (Gambar 2). Hasil penelitian ini mengindikasikan bahwa kemungkinan spesies virus yang berasosiasi dengan penyakit klorosis pada tanaman cabai di Bali sama dengan spesies virus yang bersosiasi dengan penyakit daun merah pada tanaman wortel di Jawa Barat. Isolat virus ini untuk selanjutnya disebut PeVYV-WJC.
Gambar 2 Hasil amplifikasi DNA virus dari sampel tanaman wortel bergejala penyakit daun merah. Lajur: (M) marker 1 kb DNA ladder
(Promega, US), (K-) kontrol negatif, (P) isolat PeVYV tanaman cabai, (I) isolat PeVYV-WJC tanaman wortel.
M P K- I
7
52 ±
8
Spesies Polerovirus Penyebab Penyakit Daun Merah pada Tanaman Wortel
Produk RT-PCR dari sampel tanaman wortel bergejala penyakit daun merah berhasil disekuen di PT Genetika Science, Indonesia. Hasil sekuen nukleotida tersebut (lampiran) terdiri dari pita DNA berukuran sekitar 630 pb sesuai dengan estimasi ukuran pita DNA hasil RT-PCR. Analisis tingkat homologi sekuen nukleotida merupakan cara yang sahih digunakan untuk mengidentifikasi spesies virus (Barton 1998). Pada analisis tersebut sekuen nukleotida PeVYV-WJC dibandingkan dengan sekuen nukleotida padanannya dari spesies virus yang telah dilaporkan dapat menginfeksi tanaman wortel, yaitu CtRLV (Huang et al. 2005),
CMoV (Menzel et al. 2008), CMoMV (Gibbs et al. 1996), CTLV (Xu et al.
2012), CYLV (Menzel et al. 2009), danPeVYV dari genus Polerovirus yang menginfeksi tanaman cabai (Murakami et al. 2005).
.
Tabel 3 Homologi sekuen nukleotida virus penyebab daun merah pada tanaman wortel di Jawa Barat (PeVYV-WJC) dengan virus-virus yang sudah dilaporkan dapat menginfeksi tanaman wortel.
No Aksesi Spesies virus Homologi (%) AB594828 PeVYV 97.4
Hasil perbandingan (Tabel 3) menunjukkan bahwa virus yang berasosiasi dengan penyakit daun merah pada tanaman wortel di Jawa Barat memiliki tingkat kesamaan sekuen nukleotida yang sangat rendah, yaitu kurang dari 60% dengan CtRLV, virus yang semula diduga sebagai penyebab penyakit daun merah. Spesies virus lain yang telah dilaporkan dapat menginfeksi wortel di luar negeri, seperti CMoV, CMoMV, CTLV, dan CYLV masing-masing hanya memiliki homologi kurang dari 50%. Hal tersebut mengindikasikan bahwa virus penyebab penyakit daun merah pada wortel di Jawa Barat bukan salah satu spesies virus yang sudah dilaporkan dapat menginfeksi tanaman wortel di belahan lain dunia. Hasil yang tidak terduga dari penelitian ini adalah bahwa virus yang diteliti ini merupakan salah satu isolat PeVYV yang hanya dilaporkan dapat menginfeksi tanaman cabai karena memiliki tingkat homologi yang sangat tinggi, yaitu 97.4% (Tabel 3).
9 Tabel 4 Homologi sekuen nukleotida virus penyebab daun merah pada tanaman
wortel di Jawa Barat (PeVYV-WJC) dengan PeVYV yang sudah dilaporkan oleh beberapa negara lain.
No Nama Isolat Homologi (%)
1 2 3 4 5 6 7 1 PeVYV-WJC-JawaBarat-Wortel ID 91.6 92.5 97.4 97.2 97.0 96.4 2 PeVYV-China-Cabai ID 90.9 93.1 93.7 93.7 93.1 3 PeVYV-Israel-Cabai ID 94.2 94.2 94.2 93.8 4 PeVYV-Japan-Cabai ID 99.4 98.1 97.9 5 PeVYV-Taiwan-Cabai ID 98.3 98.1 6 PeVYV-Thailand-Cabai ID 99.4
7 PeVYV-India-Ranti ID
Hasil analisis dengan program BLAST dan BioEdit v 7.05 memastikan bahwa PeVYV-WJC mempunyai tingkat homologi sekuen nukleotida pada daerah CP lebih dari 90% dengan semua PeVYV isolat cabai (Capsicum spp.) yang dilaporkan di Jepang, Israel, Taiwan, Thailand, dan China, serta PeVYV pada tanaman ranti (Solanum nigrum) di India (Knierim et al. 2012) (Tabel 4).
Gambar 3 Pohon filogenetika isolat-isolat Pepper vein yellow virus berdasarkan sekuen nukleotida gen coat protein menggunakan program CLC
sequence viewer v 6.7.1 dengan pendekatan UPGMA. No aksesi PeVYV isolat ranti asal India adalah JX427531, PeVYV-Thailand-Cabai JX427541, PeVYV-Taiwan-PeVYV-Thailand-Cabai JX427542, PeVYV-Japan-Cabai AB594828, PeVYV-Israel-PeVYV-Japan-Cabai HM439608, PeVYV-China-Cabai AJ575129, dan PepLCV-Thailand-PeVYV-China-Cabai AF134484 digunakan sebagai outgroup.
10
berperan sebagai serangga vektor PeVYV adalah Aphis gossypii (Murakami et al.
11
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Berdasarkan hasil sekuen nukleotida dapat disimpulkan bahwa spesies
Polerovirus yang berasosiasi dengan penyakit daun merah pada tanaman wortel adalah Pepper vein yellow virus. Virus ini memiliki kekerabatan paling dekat dengan PeVYV isolat cabai.
Saran
12
DAFTAR PUSTAKA
Agrios GN. 2005. Plant Pathology. 5thed. New York (US): Academic Press.
Barton GJ. 1998. Protein sequence alignment techniques. Acta Cryst. D54:1139-1146. Blackman RL, Fastop VF. 1941. Aphids on The World’s Crop. 2nd ed. London (GB):
The Natural History Museum.
[BPPP] Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. 2012. Teknologi Budidaya Sayuran. Jakarta (ID): Pusat Perpustakaan dan Penyebaran Teknologi Pertanian, Kementrian Pertanian.
Elnagar S, Murant AF. 1978. Relations of carrot red leaf and carrot mottle virus
with thei aphid vector, Caveriella aegopodii. Ann Appl Biol. 89(2):237-244.
Fauquet CM, Mayo MA, Maniloff J, Desselberger U, Ball LA. 2005. Virus Taxonomy Eight Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. San Diego (US): Virology Division International Union of Microbiological Societies.
Gibbs MJ, Cooper JI, Waterhouse PM. 1996. The genome organization and affinities of an Australian isolate of carrot mottle umbravirus. J Virol. 224 (1):310-313.
Huang LF, Naylor M, Pallet DW, Reeves J, Cooper JI, Wang H. 2005. The complete genome sequence, organization and affinities of Carrot red leaf virus. Arch Virol. 150:1845-1855. doi: 10.1007/s00705-005-0537-6.
Knierim D, Tsai WS, Kenyon L. 2012. Analysis of sequences from field samples reveals the presence of the recently described Pepper vein yellows virus (genus Polerovirus) in six additional countries. Arch Virol. 158(6):137-41. doi: 10.007/s00705-012-1598-y.
Menzel W, Mais E, Vetten HJ. 2008. Complete nucleoide sequence of a carrot isolate of Carrot mottle virus from Germany. Arch Virol. 153(11):2163-2165.
Menzel W, Goetz R, Lesemann DE, Vetten HJ. 2009. Molecular characterization of a Closterovirus from carrot and its identification as a German isolate of Carrot yellow leaf virus. Arch Virol. 154(8):1343-1347.
Morton A, Spence NJ, Boonham N, Barbara DJ. 2003. Carrot red leaf assosiated RNA in carrots in the United Kingdom. Plant Pathology. 52(1):795.
Murakami R, Nakshima N, Hinomoto N, Kawano S, Toyosato T. 2011. The genome sequence of Pepper vein yellow virus (family Luteoviridae, genus
Polerovirus). Arch Virol. 156(5):921-923. doi: 10.007/s00705-011-0956-5. Murant AF, Waterhouse PM, Raschke JH, Robinson D.J. 1985. Carrot red leaf
13 Narayanasamy P. 2011. Microbial Plant Pathogens-Detection and Disease
Diagnosis. Edisi ke-3. New York (US): Springer.
Rukmana R. 1995. Bertanam Wortel. Yogyakarta (ID): Kanisius.
Semangun H. 1996. Penyakit-Penyakit Tanaman Hortikultura. Yogyakarta (ID): Gadjah Mada University Press.
Suastika G, Hartono S, Nyana IDN, Natsuaki T. 2012. Laporan Pertama tentang Infeksi Polerovirus pada Tanaman Cabai di Daerah Bali, Indonesia.J FitopatolIndones. 8(5):151-154.
14
15
....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
5 15 25 35 PeVYV-WJC-Wortel ATTAAGGATC CAATACGGGA GGGGTTAGGA GAAATAATAA
PeVYV-China-Cabai GATCGTTAAT GAATACGGGC GGAGCTAGGA GAAACAACAA PeVYV-Israel-Cabai GATCGTTAAT GAATACGGAA GGGGTTAGGA GAAATAATAA PeVYV-Japan-Cabai AATCGTTAAT GAATACGGGA GGGGTTAGGA GAAATAATAA PeVYV-Taiwan-Cabai AATCGTTAAT GAATACGGGA GGGGTTAGGA GAAACAATAA PeVYV-Thailand-Cabai GATCGTTAAT GAATACGGGA GGAGTTAGGA GAAACAATAA PeVYV-India-Ranti GATCGTTAAT GAATACGGGA GGAGTTAGGA GAAACAATAA Clustal Co * * ******* ** * ***** **** ** **
....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
45 55 65 75 PeVYV-WJC-Wortel TGGAAATGGT GGATCACGTA ACACCCGCCG TCGTAGACGC
PeVYV-China-Cabai TGGAAATGGT GGATCACGAA GCACCCGCCG TCGCAGACGC PeVYV-Israel-Cabai TGGAAATGGT GGATCACGCG GCACCCGCCG TCGTAGACGC PeVYV-Japan-Cabai TGGAAATGGT GGATCACGTA ACACCCGCCG TCGTAGACGC PeVYV-Taiwan-Cabai TGGAAATGGT GGATCACGTA ACACCCGCCG TCGTAGACGC PeVYV-Thailand-Cabai TGGAAATGGT GGATCACGTA ACACCCGCCG TCGTAGACGC PeVYV-India-Ranti TGGAAATGGT GGATCACGTA ACACCCGCCG TCGTAGACGC Clustal Co ********** ******** ********* *** ******
....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
85 95 105 115 PeVYV-WJC-Wortel CCACGACAGG TTCGCCCTGT CGTTGTGGTC GCACCCCCTG
PeVYV-China-Cabai CCAAGACAGG TTCGCCCTGT CGTTGTGGTC GCACCCTCTG PeVYV-Israel-Cabai CCACGACAGG TTCGCCCTGT CGTTGTGGTC GCACCCCCTG PeVYV-Japan-Cabai CCACGACAGG TTCGCCCTGT CGTTGTGGTC GCACCCCCTG PeVYV-Taiwan-Cabai CCACGACAGG TTCGCCCTGT CGTTGTGGTC GCACCCCCTG PeVYV-Thailand-Cabai CCACGACAGG TTCGCCCTGT CGTTGTGGTC GCACCCCCTG PeVYV-India-Ranti CCACGACAGA TTCGCCCTGT CGTTGTGGTC ACACCCCCTG Clustal Co *** ***** ********** ********** ***** ***
....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
125 135 145 155 PeVYV-WJC-Wortel GGCGCACACG GCGAGGAAAT CGAAGACGAC GAAATGGAGG
PeVYV-China-Cabai GGACAGCACG GCGTGGAGGT CGAAGACGAC GAAGTGGAGG PeVYV-Israel-Cabai GGCGCACACG GCGGGGAAAT CGAAGACGAC GAAGTGGAGG PeVYV-Japan-Cabai GGCGCACACG GCGAGGAAAT CGAAGACGAC GAAATGGAGG PeVYV-Taiwan-Cabai GGCGCACACG GCGAGGAAAT CGAAGACGAC GAAATGGAGG PeVYV-Thailand-Cabai GGCGCACACG GCGCGGAAAT CGAAGACGAC GAAATGGAGG PeVYV-India-Ranti GGCGCACACG GCGCGGAAAT CGAAGACGAC GAAATGGAGG Clustal Co ** **** *** *** * ********** *** ******
....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
165 175 185 195 PeVYV-WJC-Wortel CCGGAACCGA AGAAGCCGAA ATAGAGTTGG AGGAAGGTCG
16
....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
205 215 225 235 PeVYV-WJC-Wortel AGCAACAGCG AAACTTTCGT CTTCAACAAG GACTCAATCA
PeVYV-China-Cabai AGCAACAGCG AGACTTTCAT CTTCAACAAG GACTCAATCA PeVYV-Israel-Cabai AGCAACAGCG AAACTTTCAT CTTCAACAAG GACTCAATCA PeVYV-Japan-Cabai AGCAACAGCG AAACTTTCAT CTTCAACAAG GACTCAATCA PeVYV-Taiwan-Cabai AGCAACAGCG AAACTTTCAT CTTCAACAAG GACTCAATCA PeVYV-Thailand-Cabai AGCAACAGCG AAACTTTCGT CTTCAACAAG GACTCAATCA PeVYV-India-Ranti AGCAACAGCG AAACTTTCGT CTTCAACAAG GACTCAATCA Clustal Co ********** * ****** * ********** **********
....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
245 255 265 275 PeVYV-WJC-Wortel AGGATAGTTC CTCAGGAGCT GTCACCTTCG GGCCGTCTCT
PeVYV-China-Cabai AGGATGGTTC CTCAGGAGCT ATCACCTTCG GGCCGTCTCT PeVYV-Israel-Cabai AGGATAGTTC CTCAGGAACT GTCACCTTCG GGCCGTCTCT PeVYV-Japan-Cabai AGGATAGTTC CTCAGGATCT GTCACCTTCG GGCCGTCTCT PeVYV-Taiwan-Cabai AGGATAGTTC CTCAGGATCT GTCACCTTCG GGCCGTCTCT PeVYV-Thailand-Cabai AGGATAGTTC CTCAGGAGCT GTCACCTTCG GGCCGTCTCT PeVYV-India-Ranti AGGATAGTTC CTCAGGATCT GTCACCTTCG GGCCGTCTCT Clustal Co ***** **** ******* ** ********* **********
....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
285 295 305 315 PeVYV-WJC-Wortel ATCAGAGAGC ATCGCGCTTT CAGGTGGAGT TCTCAAAGCC
PeVYV-China-Cabai ATCAGAGAGC GTCGCGCTTT CAGGTGGAGT TCTCAAAGCC PeVYV-Israel-Cabai ATCAGAGAGC ATCGCGCTTT CAGGTGGAGT TCTCAAAGCC PeVYV-Japan-Cabai ATCAGAGAGC GTCGCGCTTT CAGGTGGAGT TCTCAAAGCC PeVYV-Taiwan-Cabai ATCAGAGAGC GTCGCGCTTT CAGGTGGAGT TCTCAAAGCC PeVYV-Thailand-Cabai ATCAGAGAGC ATCGCGCTTT CAGGTGGAGT TCTCAAAGCC PeVYV-India-Ranti ATCAGAGAGC ATCGCGCTTT CAGGTGGAGT TCTCAAAGCC Clustal Co ********** ********* ********** **********
....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
325 335 345 355 PeVYV-WJC-Wortel TACCATGAAT ATAAGATCAC AATGGTCAAC ATACGCTTCG
PeVYV-China-Cabai TACCATGAGT ATAAGATCAC AATGGTCAAC ATACGCTTCA PeVYV-Israel-Cabai TACCATGAGT ATAAAATCAC AATGGTTAAT ATACGCTTCG PeVYV-Japan-Cabai TACCATGAAT ATAAGATCAC AATGGTCAAC ATACGCTTCG PeVYV-Taiwan-Cabai TACCATGAAT ATAAGATCAC AATGGTCAAC ATACGCTTCG PeVYV-Thailand-Cabai TACCATGAAT ATAAGATCAC AATGGTCAAC ATACGCTTCG PeVYV-India-Ranti TACCATGAAT ATAAGATCAC AATGGTCAAC ATACGCTTCG Clustal Co ******** * **** ***** ****** ** ********* ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
365 375 385 395 PeVYV-WJC-Wortel TCAGTGAATC CTCTTCCACA GCGGAGGGCT CCATCGCTTA
17
....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
405 415 425 435 PeVYV-WJC-Wortel CGAGCTGGAC CCCCACTGCA AGCTTACTAG TCTCCAATCC
PeVYV-Chin-Cabai CGAGCTGGAC CCCCACTGCA AGCTTACTAG CCTCCAATCC PeVYV-Israel-Cabai CGAGCTGGAC CCCCACTGCA AGCTTACTAG TCTCCAATCC PeVYV-Japan-Cabai CGAGCTGGAC CCCCACTGCA AGCTTACTAG TCTCCAATCC PeVYV-Taiwan-Cabai CGAGCTGGAC CCCCACTGCA AGCTTACTAG TCTCCAATCC PeVYV-Thailand-Cabai CGAGCTGGAC CCCCACTGCA AGCTTACTAG TCTCCAATCC PeVYV-India-Ranti CGAGCTGGAC CCCCACTGCA AGCTTACTAG TCTCCAATCC Clustal Co ********** ********** ********** *********
....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
445 455 465 475 PeVYV-WJC-Wortel ACCCTGCGTA AATTCCCCGT CACCAAAGGC GGGCAAGCGA
PeVYV-China-Cabai ACCCTGCGTA AGTTCCCCGT CACCAAAGGC GGGCAAGCTA PeVYV-Israel-Cabai ACCCTGCGCA AGTTCCCCGT CACCAAAGGC GGGCAAGCGA PeVYV-Japan-Cabai ACCCTGCGTA AGTTCCCCGT CACCAAAGGC GGGCAAGCGA PeVYV-Taiwan-Cabai ACCCTGCGTA AGTTCCCCGT CACCAAAGGC GGGCAAGCGA PeVYV-Thailand-Cabai ACCCTGCGCA AGTTCCCCGT CACCAAAGGC GGGCAAGCGA PeVYV-India-Ranti ACCCTGCGCA AGTTCCCCGT CACCAAAGGC GGGCAAGCGA Clustal Co ******** * * ******** ********** ******** *
....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
485 495 505 515 PeVYV-WJC-Wortel CTTTTCGGGC TTCGCAGATT AACGGGGTAG AGTGGCATGA
PeVYV-Chin-Cabai CGTTCCGGGC TGCGCAGATT AATGGGGTAG AGTGGCATGA PeVYV-Israel-Cabai CCTTTCGGGC TTCGCAGATT AATGGGGTAG AGTGGCACGA PeVYV-Japan-Cabai CTTTTCGGGC TTCGCAGATT AACGGGGTAG AGTGGCATGA PeVYV-Taiwan-Cabai CTTTTCGGGC TTCGCAGATT AACGGGGTAG AGTGGCATGA PeVYV-Thailand-Cabai CTTTTCGGGC TTCGCAGATT AACGGGGTAG AGTGGCATGA PeVYV-India-Ranti CTTTTCGGGC TTCGCAGATT AACGGGGTAG AGTGGCATGA Clustal Co * ** ***** * ******** ** ******* ******* **
18
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Purwakarta pada tanggal 06 September 1992, anak sulung dari pasangan Bapak Yayat Hidayat dan Ibu Eli Setia Nurul Hilal. Penulis telah menempuh pendidikan di TK Sejahtera pada tahun 1998, SD Negeri 2 Wanayasa pada tahun 2004, SMP Negeri 1 Wanayasa pada tahun 2007, dan SMA Negeri 1 Purwakarta pada tahun 2010, pada tahun yang sama penulis diterima di Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Ujian talenta mandiri IPB (UTMI).
