Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri

(1)

Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005

(2)

USU Repository©2006

RINGKASAN

Penelitian tahun I mempunyai tujuan: memperoleh data keragaman bakteri kitinolitik

baik keragaman morfologi, biokimia, dan genetik; mengetahui aktifitas kitinase dari bakteri

yang diisolasi; dan mengetahui indikasi awal kemampuan menghambat pertumbuhan beberapa

jamur patogen tanaman dari bakteri yang diisolasi.

Untuk mencapai tujuan di atas dilakukan pekerjaan antara lain: melakukan penapisan

bakteri kitinolitik dari berbagai sumber, melakukan pengamatan morfologi dan biokimia

bakteri kitinolitik,mengukur aktifitas kitinase, melakukan uji indikasi penghambatan

pertumbuhan jamur patogen oleh bakteri kitinolitik, dan melihat keragaman genetik bakteri

kitinolitik. Semua pekerjaan ini sedang dan sudah dilakukan kecuali melihat keragaman

genetik.

Dari penelitian tahun I didapat sebanyak 41 bakteri kitinolitik yang berhasil diisolasi

dengan variasi bentuk dan warna koloni, bentuk sel, dan sifat biokimianya. Dari isolat yang

telah diuji terdapat 3 isolat yang memiliki aktifitas kitinase kasar tertinggi masing-masing

isolat BKO1, BKO2, dan PSO1. Pengujian isolat bakteri terhadap Jamur F. semitectum

mengindikasikan ada 5 isolat yang memperlihatkan kemampuan menghambat pertumbuhan

jamur tersebut.

Telaah yang dilakukan dalam penelitian ini pada gilirannya diharapkan memberikan informasi

tentang biodiversitas mikroba yang memiliki potensi (bioprospecting) sebagai model bagi

upaya pengelolaan sumber daya hayati khususnya di Sumatera, dengan keluaran yang

diharapkan berupa diketahuinya mikroba novel, dan diketahuinya mikroba yang mempunyai

potensi untuk dikembangkan sebagai agensia pengendali hayati jamur patogen tanaman dan

untuk dikembangkan di bidang industri terkait, baik dalam bentuk massa sel, enzim, atau gen.

(3)

DAFT AR ISI

Halaman

LEMBAR IDENTITAS DAN PENGESAHAN ... ii

RINGKASAN... ... .... ... iii

PRAKA T A ... ... . ... ... ... iv

DAFT AR ISI... v

DAFT AR T ABEL ... ... vi

DAFT AR GAMBAR ... ... ... ... vii

DAFT AR LAMPI RAN... ... ... viii

I. PENDAHULUAN... ... 1

II. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN TAHUN KE-1 ... 4

III. TINJAUAN PUST AKA ... ... ... ... 5

IV. METODE PENELITIAN ... ... ... 10

V. HASIL DAN PEMBAHASAN ... ... ... 13

VI.KESIMPULAN DAN SARAN ... 21

VII.RENCANAIPENELITJAN TAHUN II... 22

DAFTAR PUST AKA ... ... ... ... .. ... ... ... ... 23

LAMPI RAN ... ... ... ... ... ... 26

(4)

DAFT AR T ABEL

Halaman

Tabel 1. Hasil isolasi dan pengamatan morfologi serta uji biokimia

sederhana... 14

Tabel 2. Pengujian aktivitas kitinase bakteri kitinolitik setelah diinkubasi

selama 96 jam secara kualitatif ... 15

Tabel 3. Pengukuran aktivitas kitinase kasar pada sam pel secara

Kuantitatif……….. 18

Tabel 4. Pengujian kemampuan daya hambat isolat bakteri kitinolitik

terhadap pertumbuhan beberapa jamur patogen... 19

(5)

DAFT AR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Rantai polimer kitin ... ... 5

Gambar 2. Sel isolat Bangka 01, Bangka 02, dan Sidimpuan

diamati dengan mikroskop cahaya (perbesaran 10 x 100)... 17

(6)

I. PENDAHULUAN

Sebagai salah satu negara dengan biodiversitas sangat besar karena keragaman

lingkungan, Indonesia menyediakan banyak sumber isolat mikroba yang memiliki nilai

ekonomi penting. Pencarian isolat-isolat yang dapat digunakan dalam industri seperti isolat

yang mampu menghasilkan enzim-enzim komersial perlu diupayakan. Salah satu pendekatan

yang dapat dilakukan untuk mengeksplorasi kapasitas metabolisme mikroba adalah dengan

cara mempelajari gen yang menyandi enzim yang terlibat dalam proses-proses kimiawi khusus

(Cottrell et al. 2000).

Banyak organisme seperti bakteri, jamur, tumbuhan tingkat tinggi, dan hewan

menghasilkan kitinase yang mengkonversi kitin menjadi monomer atau oligomernya (Wen et

al. 2002; Tsujibo et a/. 2003). Organisme ini biasanya memiliki beragam gen kitinase yang

ekspresinya diinduksi oleh ekstraseluler kitin atau derivatnya. Bakteri memanfaatkan kitinase

untuk asimilasi kitin sebagai sumber karbon dan nitrogen. Pada tumbuhan, enzim ini

digunakan sebagai pertahanan melawan serangan organisme patogen yang mengandung kitin

(Fujii and Miyashita 1993; Wu et al. 2001). Jamur dan serangga menggunakan enzim ini

untuk morfogenesis dinding sel dan pembangun eksoskeleton (Shaikh and Desphande 1993).

Mengingat jumlah kitin yang melimpah di alam sebagai komponen penyusun dari berbagai

organisme, kitin diproduksi secara terus menerus. Dengan demikian kitin merupakan substrat

yang selalu tersedia sehingga sebagian mikroba tanah dan air merupakan pendegradasi kitin

yang baik.

Bakteri kitinolitik menarik untuk diisolasi karena kemampuannya dalam menghidrolisis

kitin menjadi derivat kitin. Derivat ini banyak dimanfaatkan dalam berbagai bidang seperti

biokimia, bioteknologi, farmakologi, medis, dan industri, misalnya sebagai bahan kosmetik,

kapsul obat, dan makanan hewan (Muzzarelli 1985). Kitin atau derivatifnya digunakan sebagai

bahan bakar biologis atau sebagai bahan berharga lainnya dalam industri seperti obat

anti-inflamatori, immunoajuvan, antitumor, flokulan dalam pengolahan limbah, agensia anti fungi

atau arthropoda hama, dan teknologi protoplast fungi (Sakka et al. 1991; Shaikh and

Deshpande 1993; Ohno at al. 1996; Patil at al. 2000).

(7)

Bakteri kitinolitik juga berperan dalam pengendalian hama dan penyakit tanaman. Pleban et

al. (1997) melaporkan Bacillus cereus strain 65 dapat melindungi tanaman kapas dari penyakit

busuk akar oleh Rhizoctonia solani.

Untuk mengaksas gen-gen kitinase pada bakteri dapat dilakukan dengan menggunakan

pendekatan PCR-based dengan primer konservatif (Cottrell et al. 2000). Kitinase terdapat

tersebar mulai dari bakteri, serangga, virus, tumbuhan, dan hewan (Fujii and Miyashita 1993;

Ohno et al. 1996), dan memainkan peran yang penting dalam fisiologi dan ekologi (Ohno et

al. 1996; Saito et al. 2001). Hal ini mungkin berhubungan dengan tersebarnya bahan kitin di

alam seperti pada jamur, alga, nematoda, kelompok artropoda dan krustacea, mollusca,

coelenterata, protozoa, dan fungi (Folders et al. 2001; Orikoshi et al. 2003). Meski demikian

gen-gen penyandi kitinase bagi organisme merupakan gen non esensial (Cottrell et al. 2000).

Metihat kenyataan ini eksplorasi kitinase dapat dilakukan dimana saja mulai dari tanah,

rizosfer, air tawar, air laut, dan tumbuhan. Akhir-akhir ini, kitinase kembali menjadi perhatian

karena adanya kemungkinan penggunaan enzim ini dalam pengendalian biologi organisme

yang mengandung kitin dan juga untuk eksploitasi bahan kitin alami (Ohno et al. 1996),

disamping kegunaan dalam bidang farmasi, dan industri (Sakka et al. 1991).

Karena besarnya keragaman struktur cincin yang ada, tidak mengejutkan bahwa bakteri

seringkali menghasilkan beberapa kitinase sekaligus (Svitil et al. 1997). Variasi dan korelasi

dari gen-gen non esensial dengan filogeni gen rRNA-nya bisa jadi berbeda dari filogeni gen

rRNA dari gen-gen esensial (Cottrell et al. 2000). Meskipun primer umum untuk gen kitinase

belum bisa dirancang karena beragamnya gen ini (Fujii and Miyashita 1993; Svitil et al. 1997;

Cotrell et al. 1999; Cottrell et al. 2000), namun dengan mengkaji semua bakteri penghasil

kitinase boleh jadi konservasi gen di antara semua bakteri ini makin jelas (Cottrell et al. 1999).

Kajian mengenai konservasi gen penghasil kitinase dapat dilakukan dengan membandingkan

gen-gen melalui amplifikasi dengan menggunakan beberapa primer sekaligus (Cottrell et al.

2000).

(8)

USU Repository©2006 Subjek penelitian

Uji aktifitas kitinase dari bakteri, uji kemampuan menghambat pertumbuhan beberapa

jamur patogen tanaman dari bakteri kitinolitik yang telah diisolasi, dan biologi molekuler

keragaman bakteri kitinolitik.

Lokasi penelitian

Laboratorium Mikrobiologi PS Biologi FMIPA, USU, Medan

Laboratorium Biologi RCMD FMIPA IPB, Bogor

Hasil yang ditargetkan

Tahun I: Memperoleh data keragaman bakteri kitinolitik baik keragaman morfologi,

biokimia, dan genetik.

Mengetahui aktifitas kitinase dari bakteri yang diisolasi

Mengetahui indikasi awal kemampuan menghambat pertumbuhan beberapa jamur

patogen tanaman dari bakteri yag diisolasi

Tahun II: Memperoleh gambaran dari kemampuan atau aktifitas masing-masing bakteri

kitinolitik dalam mendegradasi kitin dari beberapa jamur patogen tanaman pada

kondisi lingkungan (pH, suhu, dan kadar garam) yang berbeda.

Mengetahui gen penyandi bakteri kitinolitik yang potensial dalam mengendalikan

pertumbuhan jamurpatogen tanaman.

Keterlibatan mahasiswa

Penelitian ini melibatkan beberapa orang mahasiswa S1 PS Biologi FMIPA Universitas

Sumatera Utara untuk penyelesaian skripsi. Melalui proyek ini telah 1 orang mahasiswa

menyelesaikan studi S1. Satu orang mahasiwa baru mulai melakukan penelitian. Diharapkan

beberapa mahasiswa lagi pada tahun II terlibat dalam penelitian ini.

(9)

II. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN TAHUN KE-1

TUJUAN KHUSUS

Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh data keragaman morfologi, biokimia, dan

genetik bakteri kitinolitik, dan mengetahui aktifitas enzim kitinase dari bakteri hasil isolasi,

danmengetahui indikasi awal kemampuan bakteri kitinolitik dalam menghambat pertumbuhan

beberapa jamur patogen tanaman.

MAN FAAT PENELITIAN

Secara umum penelitian tentang biokimia dan biologi molekular kitinase di Indonesia

seringkali ditekankan hanya pada 1 jenis kitinase yang berasal dari satu bakteri atau dari satu

sumber (contoh Wenuganen 1997; Yurnaliza 2001). Telaah lebih menyeluruh akan

memberikan gambaran sebaran gen ini di lingkungan serta memberikan pilihan yang lebih

banyak dalam upaya pemanfaatan sumber daya genetik khususnya gen-gen kitinase untuk

tujuan ilmu pengetahuan dan komersial seperti untuk agensia anti fungi atau arthropoda hama,

obat anti-inflamatori, immunoajuvan, antitumor, flokulan dalam pengolahan limbah, dan

teknologi protoplast fungi (Sakka et al. 1991; Shaikh & Deshpande 1993; Ohno et al. 1996;

Patil et al. 2000) di Indonesia.

Pemanfaatan mikroorganisme untuk mengendalikan penyakit tanaman merupakan

bidang yang relatif baru. Pengendalian hayati jamur penyakit tanaman acap dilakukan dengan

menggunakan mikroorganisme seperti jamur dan bakteri. Sekitar 40 produk pengendalian

hayati penyakit tanaman kini beredar di dunia (Fravel et al. 1998), tidak diketahui mengenai

produk serupa yang berasal dari Indonesia.

Telaah yang akan dilakukan ini pada gilirannya diharapkan memberikan informasi

tentang biodiversitas mikroba yang memiliki potensi (bioprospecting) sebagai model bagi

upaya pengelolaan sumber daya hayati khususnya di Sumatera. Keluaran yang diharapkan

berupa diketahuinya mikroba novel, dan diketahuinya mikroba yang mempunyai potensi untuk

dikembangkan sebagai agensia pengendali hayati jamur patogen tanaman dan untuk

dikembangkan di bidang industri terkait, baik dalam bentuk massa sel, enzim, atau gen.

(10)

III. TINJAUAN PUSTAKA

Struktur dan Sumber-Sumber Kitin di Alam

Kitin mempunyai rumus empiris (C6H9O4.NHCOCH3)n, merupakan zat padat yang

tidak larut dalam air, pelarut organik, alkali pekat, asam mineral lemah, tetapi larut dalam

asam-asam mineral yang pekat. Polisakarida ini mempunyai berat molekul tinggi dan

merupakan polimer berantai lurus dengan nama lain -(1-4 )-2-asetamida-2-dioksi-D-glukosa

(N-asetil-D-Glukosamin).

Rantai kitin antara satu dengan yang lainnya berasosiasi dengan ikatan hidrogen yang

sangat kuat antara gugus N-H dari satu rantai dan gugus C=O dari rantai yang berdekatan.

Ikatan hidrogen menyebabkan kitin tidak dapat larut dalam air dan membentuk formasi

serabut (fibril). Berdasarkan penyusun rantai polimernya, kitin fibril dibedakan menjadi tiga

jenis yaitu -kitin, -kitin dan -kitin (Cabib 1987).

Pada serangga lebih dari 80% komponen kutikulanya merupakan kitin. Pada Crustacea,

kitin melekat pada suatu matriks dari CaCO3 dan fosfat. Pada serangga matriksnya berupa

proteinaceous yaitu protein yang sudah mengalami pentaninan (Cabib 1987). Kitin pada alga

terutama ditemukan pada diatom laut dengan kandungan 10-15% berat kering. Lebih dari

80.000 ton kitin per tahun dihasilkan di perairan (Patil et al. 2000). Kitin pada jamur

berbentuk mikrofibril yang memiliki panjang yang berbeda tergantung pada spesies dan lokasi

selnya. Mikrofibril merupakan struktur utama dari dinding sel jamur yang terdiri atas jalinan

rantai polisakarida yang saling bersilangan membentuk anyaman. Kandungan kitin pada jamur

bervariasi dari 4-9% berat kering sel (Rajarathanam et al. 1998).

5

(11)

USU Repository©2006 Kitinase

Sistem tata nama kitinase masih menimbulkan kerancuan. Harman et a/. (1993) serta

Sahai and Manocha (1993) membagi kitinase dalam tiga tipe yaitu:

1. Endokitinase (EC 3.2.1.14), yaitu kitinase yang memotong secara acak ikatan -1,4 bagian

internal mikrofibril kitin. Produk akhir yang terbentuk bersifat mudah larut berupa

oligomer pendek N-asetilglukosamin (GIcNAc) yang mempunyai berat molekul rendah

seperti kitotetraose.

2. Eksokitinase (EC 3.2.1.14) dinamakan juga kitobiosidase atau kitin 1,4- -kitobiosidase,

yaitu enzim yang mengkatalisis secara aktif pembebasan unit-unit diasetilkitobiose tanpa

ada unit-unit monosakarida atau oligosakarida yang dibentuk. Pemotongan hanya terjadi

pada ujung non reduksi mikrofibril kitin dan tidak secara acak.

3. -1,4-N-asetilglukosaminidase (EC 3.2.1.30) merupakan suatu kitinase yang bekerja pada

pemutusan diasetilkitobiose, kitotriose, dan kitotetraose dengan menghasilkan

monomer-monomer GIcNAc.

Kitinase telah banyak dilaporkan dan diklasifikasikan dalam dua famili yaitu 18 dan 19

berdasarkan kemiripan sekuen asam amino (Tsujibo et al 2003). Famili 18 meliputi kitinase

dari virus, bakteri, jamur, dan hewan, serta klas III dan V kitinase dari tumbuhan. Famili 19

mencakup klas I, II dan IV telah diidentifikasi dari tumbuhan. Baru-baru ini ditemukan klas IV

famili 19 yang tersebar luas pada Streptomyces sp. (Watanabe et a/., 1999). Famili 18 dibagi

dalam tiga subfamili yaitu A, B, dan C (Gao et a/. 2003).

Bakteri kitinolitik seringkali menghasilkan berbagai gen kitinase, walaupun konstribusi

enzim untuk degradasi kitin belum diketahui seeara menyeluruh (Tsujibo et a/. 2003). Kitinase

yang dihasilkan mikroba memiliki berat molekul yang berkisar antara 20.000-120.000. Pada

bakteri berat molekulnya antara 60.000-110.000, sedangkan aktinomisetes yaitu 30.000 atau

lebih rendah. Pada jamur berat molekulnya lebih tinggi dari 30.000 dan pada tumbuhan sekitar

30.000 (Wang and Chang 1997).

Mikroba Yang Menghasilkan Kitinase

Aktinomisetes, bakteri, dan jamur merupakan organisme yang mampu memanfaatkan

kitin sebagai sumber karbon dan nitrogen. Genus bakteri yang sudah banyak dilaporkan

(12)

memiliki kitinase antara lain Aeromonas, Alteromonas, Chromobacterium, Enterobacter,

Ewingella, Pseudoalteromonas, Pseudomonas, Serratia, Vibrio (Chernin et al., 1998),

Bacillus (Pleban et al. 1997), dan Pyrococcus (Gao et al. 2003).

Koloidal kitin merupakan salah satu substrat yang dapat digunakan untuk menginduksi

kitinase pada bakteri, jamur, dan aktinomisetes. Substrat ini mampu menginduksi enzim

hidrolitik seperti N-asetilglukosamin, endokitinase dan kitobiosidase pada Aeromonas caviae

(Inbar and Chet 1991), Enterobacter agglomerans (Chernin et a/. 1995), dan Bacillus cereus

(Pleban et a/. 1997).

Pengukuran Aktivitas Kitinase

Pengukuran aktivitas kitinase dalam memecah substrat dapat dilakukan dengan

beberapa cara seperti yang disebutkan dalam Jeaniaux (1966) dan Cabib (1987), yaitu:

1. Berdasarkan pengurangan substrat

a. Metode viskosimetri yaitu aktivitas kitinase terhadap kitosan, glikol kitin atau

karboksimetil kitin yang ditunjukkan oleh terjadinya penurunan viskositas substrat.

b. Metode nefelometri (turbidimetri) yaitu pengukuran variasi kekeruhan suspensi koloidal

kitin selama kitinolisis. Metode ini bersitat cepat dan akurat tetapi hanya cocok untuk

enzim dengan aktivitas relatif tinggi.

2. Berdasarkan pembentukan produk akhir yaitu GIcNAc yang dibebaskan dari kitin dapat

ditentukan dengan metode kolorimetrik dengan penambahan p-dimetilaminobenzaldehida

(Metode Reissig, 1955). Satu unit aktivitas kitinase dinyatakan sebagai mol GlcNAc yang

dibebaskan selama 1 jam dalam kondisi yang ditetapkan.

3. Pengujian spektrofotometri yaitu menggunakan kromogen

3,4-dinitrofenil-tetra-N-asetikitotetraose sebagai substrat.

4. Pengujian sensitifitas kitinase menggunakan radiometri yaitu substrat diberi label 14C atau

3

H. Kadar produk diuji dengan menentukan radioaktifitasnya setelah penghilangan kitin

yang belum dipecah dengan penyaringan atau dengan cara disentrifugasi.

(13)

Manfaat Kitinase dan Bakteri Kitinolitik

Kitinase terdapat tersebar mulai dari bakteri, serangga, virus, tumbuhan, dan hewan

(Fujii & Miyashita 1993; Ohno et al. 1996), dan memainkan peran yang penting dalam

fisiologi dan ekologi (Ohno et a/. 1996; Saito et a/. 2001). Hal ini mungkin berhubungan

dengan tersebarnya bahan kitin di alam seperti pada jamur, alga, nematoda, kelompok

artropoda dan krustacea, mollusca, coelenterata, protozoa, dan fungi (Folders et al. 2001;

Orikoshi et a/. 2003). Meski demikian gen-gen penyandi kitinase bagi organisme merupakan

gen non esensial (Cottrell et al. 2000). Melihat kenyataan ini eksplorasi kitinase dapat

dilakukan dimana saja mulai dari tanah, rizosfer, air tawar, air laut, dan tumbuhan.

Kitinase berguna dalam produksi kitooligosakarida. Kitooligosakarida berperan sebagai

pertahanan tanaman, juga digunakan dalam kesehatan manusia. Sebagai contoh, kitoheksaose

dan kitoheptaose memperlihatkan aktivitas anti tumor. GlcNAc berguna sebagai obat anti

inflamasi. Senyawa ini dalam tubuh manusia disintesis dari glukosa dan digabungkan dengan

glikoprotein dan glikosaminoglikan (Patil et al. 2000).

Dalam teknologi protoplas jamur, dibutuhkan bantuan kitinase untuk mengisolasi

protoplas jamur. Protoplas digunakan untuk mempelajari sintesis dinding sel, sekresi enzim,

transformasi steroid, dan mutagenesis. Kitinase juga berperan dalam produksi protein sel

tunggal dari limbah kitin untuk makanan hewan (Shaikh and Desphande, 1993).

Kitinase digunakan dalam pertanian sebagai pengendalian jamur patogen tanaman dan

hama serangga. Organisme ini memiliki kitin pada penutup tubuhnya sehingga dapat

didegradasi oleh enzim tersebut (Patil et al. 2000). Pseudomonas flourescens dapat

mengendalikan Pythium ultimum dan Rhizoctonia solani dengan menekan pertumbuhannya

(Nielsen et al. 1998). Sampson and Gooday (1998) meneliti kitinase dari Bacillus

thuringiensis yang diujikan terhadap Culicoides nubeculosus dan Spodoptera littoralis,

sedangkan Regev et al. (1996), meneliti sinergisme -endotoksin B. thuringiensis dan

endokitinase bakteri terhadap larva S. littoralis. Menurut mereka kitinase yang dihasilkan

bakteri dapat membunuh serangga sehingga dapat dijadikan agen pengendali biologis.

Kombinasi dari -toksin dan kitinase dilaporkan lebih efektif dalam membunuh hama

serangga (Patil et al. 2000).

Akhir-akhir ini, kitinase kembali menjadi perhatian karena adanya kemungkinan

penggunaan enzim ini dalam pengendalian biologi organisme yang mengandung kitin seperti

jamur dan serangga dan juga untuk eksploitasi bahan kitin alami (Ohno et al. 1996),disamping

(14)

kegunaan dalam bidang farmasi, dan industri (Sakka et al. 1991).

Pengendalian hayati jamur dengan menggunakan mikroorganisme kitinolitik didasarkan

pada kemampuan mikroorganisme menghasilkan kitinase dan -1,3-glucanase yang dapat

melisis sel jamur (EI-Katatny et al. 2000). Kemampuan kitinolitik bakteri Aeromonas caviae

telah digunakan untuk mengendalikan beberapa jamur patogen tanaman (Inbar & Chet 1995).

Galur Serratia marcescens telah dimanfaatkan untuk mengendalikan jamur patogen seperti

Sclerotium rolfsii (Ordentlich et al. 1988). Gen chiA dari S. marcescens telah pula

dimanfaatkan melalui kloning pada Pseudomonas fIuorescens (Downing & Thomson 2000).

Bakteri lain yang juga digunakan sebagai pengendali hayati komersial seperti P. syringae,

Burkholderia cepacia, Bacillus subtilis, Agrobacterium radiobacter, Enterobacter cloacae,

dan Streptomyces griseoviridis (Fravel et al 1998; McQuilken et at. 1998). Strategi untuk

seleksi strain mikroorganisme berdasarkan kepada kriteria kemampuan kolonisasi,

kemampuan kompetisi dan kemampuan menyesuaikan diri di lingkungan. (McQuilken et al.

1998).

(15)

IV. METODE PENELITIAN

Pengambilan Contoh

Contoh diambil dari berbagai habitat. Untuk bakteri tanah, contoh diambil di permukaan

tanah, rizosfer, atau lumpur perairan. Untuk bakteri pada tumbuhan diambil di lubang

tampungan air di pohon atau dalam tumbuhan pemakan serangga (Nephentes sp.). Sampai saat

ini telah diperoleh isolat bakteri kitinase dari tanah pertanian, tanah lumpur, dan lubang

tampungan air di pohon. Pengambilan contoh tanah, tumbuhan, dan air seperti dari hutan

Taman Nasional Gunung Leuser (TNGL) Tangkahan Langkat dan Taman Nasional Batang

Gadis Madina telah dilakukan. Pekerjaan isolasi sampai saat ini tetap masih dilakukan

Penapisan Bakteri Penghasil Kitinase

Bakteri kitinolitik biasa dijejak dengan pembentukan zona bening pada medium kitin

atau dengan melihat kemampuan hidrolisis pada subtrat fluorogenik analog kitin (Cotrell et al.

1999). Dalam penelitian ini mikroba kitinolitik ditapis dengan menggunakan medium

mengandung kitin. Mikroba diisolasi dari contoh dengan menggunakan medium garam

koloidal kitin disesuaikan dengan kondis! lingkungan (kadar garam dan pH) dari mana isolat

berasa!. Pembentukan halo di sekitar koloni sebagai hasil degradasi kitin dievaluasi. Nilai

aktivitas hidrolisis secara kualitatif diperoleh dengan membagi diameter zona hidrolisis di

sekitar koloni dengan besarnya diameter koloni isolat pada hari ke-4 (96 jam) setelah inkubasi

(Widhyastuti and Dewi, 2001). Aktivitas enzim kasar kultur bebas sel ditentukan dengan

menggunakan substrat koloidal kitin. Aktivitas khitinase dihitung berdasarkan selisih antara

kadar N-asetil glukosamin (GlcNAc) yang dibebaskan pada perlakuan dengan kadar GlcNAc

yang terdapat dalam kitinase kasar yang tidak diperlakukan (kontrol). GlcNAc yang dihasilkan

dianalisis secara kolorimetri dengan metode Reissig (1955) dalam Jeaniaux (1966).

Penampakan Morfologi dan Uji Biokimia Bakteri Penghasil Kitinase

Karakterisasi sifat morfoJogi mencakup bentuk dan warna koloni, motilitas, bentuk sel,

dan sifat gram. Motilitas diamati dengan menggunakan medium semi padat sulfide indole

motility (SIM). Pewarnaan Gram dengan menggunakan kristal violet dan safranin digunakan

untuk menentukan sifat gram. Sifat biokimia yang diamati mencakup uji sitrat dengan medium

Simmons' Citrate agar, uji gelatin dengan medium nutrien gelatin, dan uji katalase dengan

(16)

menggunakan larutan 3% H2O2 (Cappuccino and Sherman, 1983).

Pengukuran Aktivitas Kitinase Kasar

Kitinase kasar diperoleh dari kultur 96 jam (Pleban et al., 1997). Kitinase kasar dari

masing-masing Isolat dan substrat kitin (1% koloidal kitin (b/v) dalam 50 mM buffer fosfat,

pH 6,8) dicampur dengan volume yang sama dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 60 menit.

Reaksi dihentikan dengan memanaskan campuran dalam air mendidih selama 15 menit dan

kemudian disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 20 menit. Aktivitas khitinase

dihitung berdasarkan selisih antara kadar N-asetil glukosamin (GlcNAc) yang dibebaskan

pada perlakuan dengan kadar GlcNAc yang terdapat dalam kitinase kasar yang tidak

diperlakukan (kontrol). GlcNAc yang dihasilkan dianalisis secara kolorimetri dengan metode

Reissig (1955) dalam Jeaniaux (1966). Satu unit aktivitas kitinase didefenisikan sebagai

jumlah enzim yang membebaskan sebanyak 1 mol GlcNAc/jam pada kondisi tertentu (Singh

et al., 1999).

Uji Penghambatan Pertumbuhan Beberapa Jamur Patogen Tanaman

Hifa jamur Fusarium semitectum, Ganoderma boninense, dan Penicillium citrinum

yang ditumbuhkan dalam media nutrien broth yang ditambah dengan 3% potato dextrose agar

diambil seukuran 0.5x0.5 em, kemudian dikulturkan dalam media garam kitin. Inkubasi

dilakukan pada suhu kamar (28°C) selama 2 hari. Setelah jamur terlihat tumbuh kira-kira 0.5

cm dari hifa-terluar digores lurus bakteri kitinolitik dari hasil isolasi. Pengamatan dilakukan

dengan melihat ada tidaknya zona hambat pertumbuhan setelah diinkubasi selama 2 hari.

Ekstraksi DNA

DNA genom total dari bakteri terkulturkan akan diekstraksi sebagai yang digambarkan

oleh Sambrook et al. (1989).

(17)

Melihat Keragaman Genetik Bakteri Penghasil Kitinase Melalui Gen 168 rRNA

Amplifikasi gen 16S-rRNA dilakukan dengan primer 63f dan 1387r (Marchesi et al.,

1998) menggunakan Ready- To-GO PCR Beads (Pharmacia-Biotech, Uppsala, Sweden). DNA

yang teramplifikasi akan diklon pada pGEM-T dan ditransfer dalam E. coli DH5

menggunakan metode yang digambarkan oleh Sambrook et al. (1989). Analisis Restriction

Fragment Length Polymorphism (RFLP) dilakukan dengan menggunakan metode seperti yang

dilakukan oleh Desiliyarni et al. (1999) dengan elekroforesis minigel. Hubungan kekerabatan

antar isolat dianalisis dengan program komputer Treecon (Van de Peer and De Wachter 1994).

Isolat dengan pola pita yang berbeda digunakan untuk analisis selanjutnya.

Hambatan Dalam Pekerjaan

Sangat terlambatnya pencairan dana penelitian menyebabkan berubahnya beberapa

rencana pekerjaan dalam hal metode dan waktu pelaksanaan. Dana penelitian baru diterima

peneliti tanggal 13 September 2005, sedang laporan kemajuan harus diserahkan ke LP USU

paling lambat tanggal 20 September 2005. Namun demikian perubahan rencana pekerjaan dan

jadwal tidak merubah keseluruhan ini dari penelitian ini. Diharapkan sekali untuk tahun-tahun

berikutnya dana penelitian dapat diterima peneliti secepat mungkin.

Seberapa pekerjaan dalam metode yang berubah mencakup tidak digunakannya

substrat p-nitrophenyl-N-acetyl- -D-glucosamine (pNP-GlcNAc) dan p-nitrophenyl-

-D-N,N',N"-triacetylchitotriose [pNP-(GlcNAc)3 seperti yang dilakukan Folders et al. (2001)

untuk mengukur aktivitas eksokitinase dan endokitinase. Dalam tahap pengerjaan Saat ini

dilakukan uji penghambatan pertumbuhan terhadap jamur patogen tanaman seperti Fusarium

semitectum, Ganoderma boninense, dan Penicillium citrinum yang merupakan jamur-jamur

penyebab penyakit. Pekerjaan analisis genom yang dijadwalkan tengah JuliAgustus terpaksa

ditunda dan dijadwal ulang, karena pekerjaan ini melibatkan institusi lain yaitu RCMD,

Fakultas MIPA, IPS. Pekerjaan identifikasi dan uji aktivitas kitinase tetap dilakukan pada

isolat-isolat yang baru didapat.

(18)

V. HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Kitinolitik

Isolasi yang telah dilakukan sampai saat ini dari contoh tanah, lumpur, dan cekungan

penampung air pada tumbuhan dari beberapa daerah di Sumatera Utara dan Bangka,

memperoleh 41 isolat bakteri kitinolitik, yaitu 22 isolat dari Sumatera Utara, 12 isolat dari

Bangka, dan 7 isolat belum diberi kode. Beberapa sampel yang sudah diambil dari lapangan

sedang dalam tahap isolasi bakteri kitinolitik. Diharapkan akan ada tambahan jumlah dan jenis

bakteri kitinolitik setelah pekerjaan penapisan dan isolasi selesai. Berdasarkan tempat sampel,

3 isolat diisolasidari lubang tampungan air pada tumbuhan, 2 sampel dari lumpur, sisanya dari

tanah.

Berdasarkan pengamatan morfologi yang telah dilakukan terhadap 34 isolat tersebut,

diperoleh bentuk koloni yang bervariasi, yaitu 27 isolat berbentuk bulat, 5 isolat berbentuk

bulat berombak, dan 2 isolat tidak teratur. Warna koloni barvariasi pula, yaitu 2 isolat

berwarna putih bening, 3 isolat berwarna putih kuning, 1 isolat berwarna merah muda, dan 10

isolat berwarna krem.

Dari 17 isolat yang telah dilakukan pewarnaan gram, 7 isolat bersifat gram positif dan

10 isolat bersifat gram negatif, dengan bentuk sel basil, pseudobasil, dan kokus. Umumnya

semua isolat mempunyai sel berbentuk basil kecuali isolat BK01 dan TU01 berbentuk pse

udobasil , serta isolat BK04 berbentuk kokus. Uji motilitas yang dilakukan terhadap semua

isolat ini menunjukkan bahwa 12 isolat bersifat motil ditandai dengan adanya jejak pergerakan

bakteri di dalam medium, sedangkan 5 isolat lainnya tidak motil. Isolat lainnya sedang dalam

pengamatan sifat gram dan bentuk sel.

Uji biokimia sederhana yang telah dilakukan terhadap 17 isolat seperti uji motilitas ,

gelatin, sitrat, oksidase, dan katalase, menunjukkan 3 isolat yaitu DS01, LK01, dan BK02,

memperlihatkan reaksi positif terhadap semua uji yang dilakukan. Hasil uji katalase dengan

penambahan larutan 3% H2O2 mengindikasikan bahwa semua isolat memiliki enzim katalase,

ditandai dengan terbentuknya gelembung udara di sekitar koloni. Umumnya isolat

menunjukkan oksidase positif ditandai dengan perubahan warna pada strip Bactident®

(19)

Oxidase menjadi warna biru atau biru-violet. Uji oksidase digunakan untuk melihat adanya

enzim sitokrom oksidase sedangkan uji katalase membuktikan adanya enzim katalase yang

berfungsi dalam penguraian H2O2 yang bersifat racun. Dari uji gelatinase dan uji sitrat,

diketahui umumnya isolat tidak mampu menghidrolisis gelatin dan menggunakan sitrat.

Menurut Cappuccino and Sherman (1983), uji positif gelatinase ditandai dengan medium

gelatin yang tetap cair setelah dimasukkan ke dalam lemari pendingin selama 30 menit,

sedangkan keadaan positif pada uji sitrat ditandai dengan berubahnya medium dari hijau

menjadi biru karena terjadi penghilangan asam dan peningkatan pH dalam media. Pengujian

biokimia terhadap isolat-isolat lainnya sedang dilakukan. Hasil pengamatan morfologi dan uji

biokimia sederhana selengkapnya ditunjukkan pada Tabel 1.

Tabel 1. Hasil isolasi dan pengamatan morfologi serta uji biokimia sederhana

14

(20)

Semua isolat merupakan bakteri kitinolitik yang ditunjukkan dengan terbentuknya

zona hidrolisis di sekitar koloni bakteri pada medium campuran kitin agar dan nutrient broth

(3:1) setelah masa inkubasi 96 jam (Tabel 2). Isolat-isolat tersebut menunjukkan kemampuan

yang berbeda-beda dalam merombak kitin. Aktivitas hidrolisis tertinggi dijumpai pada isolat

KR04, SPO1, BKO1, dan BKO2, sedangkan yang paling rendah dijumpai pada isolat BKO7

dan BKO9. Aktivitas hidrolisis merupakan gambaran dari kemampuan isolat bakteri kitinolitik

dalam merombak kitin, semakin besar nilai aktivitas hidrolisis, semakin besar diameter zona

bening yang terbentuk di sekitar koloni.

Tabel 2. Pengujian aktivitas kitinase bakteri kitinolitik setelah diinkubasi selama 96 jam secara kualitatif

15

(21)

Menurut Chemin et al. (1995), bakteri dapat menghidrolisis koloidal kitin setelah 72-96 jam

yang ditumbuhkan pada campuran semiminimal agar dan nutrient broth dengan perbadingan

3:1, yang dicampur dengan koloidal kitin sebagai sumber karbon. Pleban et al. (1997)

melaporkan zona jernih yang terbentuk di sekitar pertumbuhan bakteri menandakan adanya

aktivitas kitinolitik di medium pertumbuhan. Besamya nilai perbandingan zona bening dengan

zona pertumbuhan koloni bakteri menunjukkan besamya aktivitas nisbi enzim (Widhyastuti

and Dewi 2001).

16

(22)

Tiga isolat yang menunjukkan aktivitas hidrolisis yang paling tinggi yakni SPO1,

BKO1, dan BKO2 telah dilakukan pengujian aktivitas enzim kasar, sedang isolat KRO4 belum

dilakukan uji aktivitasnya. Ketiga isolat ini memiliki bentuk koloni dan warna koloni yang

sama yaitu bulat dan krem. Isolat BKO1 dan BKO2 bersifat gram negatif (-) dengan sel

berbentuk basil dan pseudobasil, sedangkan SPO1 bersifat gram positif (+) dengan sel

berbentuk basil (Gambar 2).

Pengujian Aktivitas Kitinase

Ketiga isolat yang terpilih di atas ditumbuhkan pada medium kitin cair untuk

mengetahui kemampuannya dalam merombak kitin secara kuantitatif. Menurut Shaikh and

Deshpande (1993), degradasi kitin secara enzimatik untuk menghasilkan GlcNAc bebas

dilakukan oleh sistem kitinolitik, yang telat ditemukan pada mikroba, tumbuhan-tumbuhan

dan hewan. Connell et al. (1998) mengatakan degradasi kitin oleh prokariot dan eukariot

terjadi dalam dua tahap yang prosesnya melibatkan hidrolisis ikatan -1,4 glikosida yang

menghubungkan subunit GlcNAc. Pertama, endokitinase mengikat tetramer dan polimer

GlcNAc untuk menghasilkan disakarida kitobiose. Kitobiase menghidrolisis kitobiose menjadi

monomer GlcNAc pada tahap kedua. Enzim pendegradasi kitin umumnya oleh beberapa

organisme diinduksi oleh kitosan, kitobiose, GlcNAc atau glukosamin.

17

(23)

Hasil pengujian aktivitas kitinase kasar menuniukkan isolat BKO1 memiliki aktivitas

enzim yang tertinggi yaitu 0,0636 Unit, sedangkan aktivitas enzim terendah dihasilkan oleh

isolat BK02 yaitu 0,0452 Unit. Isolat SP01 dengan aktivitas hidrolisis tertinggi yaitu 2,942

hanya menghasilkan aktivitas enzim sebesar 0,0550 Unit, sedangkan isolat BK01 dengan

aktivitas hidrolisis 2,253 temyata menghasilkan aktivitas enzim tertinggi yaitu 0,0636 Unit

(Tabel 3). Menurut Yurnaliza (2001), beberapa faktor yang diduga menjadi penyebab tidak

berkolerasinya nilai aktivitas hidrolisis secara kualitatif dengan nilai aktivitas enzim secara

kuantitatif adalah perbedaan jenis mikroba, kecepatan pertumbuhan setiap isolat pada medium

padat dan cair, jumlah inokulum yang diberikan pada kedua medium, dan tipe enzim kitinase

yang dihasilkan.

Tabel 3. Pengukuran aktivitas kitinase kasar pada sampel secara kuantitatif

Kehadiran enzim kitinolitik pada medium pertumbuhan yang diuji dapat dilihat dari

reaksi pelepasan GlcNAc dari koloidal kitin. Jeuniaux (1966), melaporkan endokitinase adalah

spesifik untuk polimer linier dari N-asetil-D glokosamin, tetapi tidak memutuskan kitobiose.

Enzim ini menghidrolisis kitin menjadi kitobiose, kitotrinose, dan asetilglukosamin bebas juga

dapat diproduksi ketika substrat adalah koloidal kitin.

Uji Penghambatan Pertumbuhan Beberapa Jamur Patogen Tanaman

Hasil pengujian daya hambat pertumbuhan beberapa jamur patogen tanaman

mengindikasikan ada 5 isolat bakteri kitinolitik yang mampu menghambat pertumbuhan jamur

ini. Pengujian baru dilakukan terhadap 1 jenis jamur saja (F. semitectum), dan 2 jenis jamur

lainnya sedang dimulai untuk dilakukan pengujian. Diharapkan dan pengujian ini akan ada

beberapa jenis isolat bakteri kitinolitik yang mampu menghambat pertumbuhan 2 jenis jamur

ini. Kemungkinan adanya 1 isolat yang mampu menghambat pertumbuhan 2 atau 3 jenis jamur

patogen ini sekaligus masih harus menunggu hasil uji.

18

(24)

19

(25)

Keragaman Genetik Bakteri Penghasil Kitinase Melalui Gen 16S rRNA

Pengamatan terhadap keragaman genetik bakteri penghasil kitinase melalui gen 16S

rRNA belum dapat dilakukan karena keterlambatan pencairan dana. Diharapkan pekerjaan ini

dapat dilakukan setelah semua sampel telah ditapis. Perkiraan pekerjaan dapat dilakukan di

bulan Desember 2005.

(26)

VII. RENCANA /PENELITIAN TAHUN II

Penelitian tahun II bertujuan untuk melihat pengaruh lingkungan terhadap kemampuan

bakteri menghidrolisis kitin jamur patogen dan kitin lainnya, dan memperoleh data keragaman

gen penyandi kitinase dari bakteri kitinolitik yang berpotensi sebagai agen pengendali hayati

jamur patogen tanaman dengan menganalisis keragaman genetik dengan teknik PCR-RFLP

dari gen kitinase yang diamplifikasi dengan menggunakan primer gen chiA, chiB, dan chiC.

Dari kegiatan pokok tersebut diharapkan dapat menjadi dasar bagi pengembangan strain-strain

lokal, atau gen penyandi kitinase untuk pengendalian jamur patogen tanaman atau tujuan lain

proteksi tanaman.

Untuk mencapai tujuan di atas disusun metode seperti: asai keriap, asai pada beberapa

jamur patogen tanaman in vitro, asai aktivitas antifungi filtrat kultur isolat bakteri, asai

pengaruh lingkungan terhadap aktivitas hidrolitik isolat bakteri, PCR dan kloning gen

penyandi kitinase, dan melihat keragaman genetik gen kitinase.