REKAYASA PROSES SINTESIS SENYAWA ANALOG
KURKUMIN DARI MINYAK LAWANG (Cinnamomum
cullilawan Blume) YANG BERPOTENSI SEBAGAI
ANTIKANKER
IMANUEL BERLY DELVIS KAPELLE
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Rekayasa Proses Sintesis Senyawa Analog Kurkumin dari Minyak Lawang (Cinnamomum
cullilawan Blume)yang Berpotensi Sebagai Antikanker adalah benar karya saya
dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, April 2016
Imanuel Berly Delvis Kapelle
RINGKASAN
IMANUEL BERLY DELVIS KAPELLE. Rekayasa Proses Sintesis Senyawa Analog Kurkumin dari Minyak Lawang (Cinnamomum cullilawan Blume) yang Berpotensi Sebagai Antikanker. Dibimbing oleh TUN TEDJA IRAWADI, MEIKA SYAHBANA RUSLI, DJUMALI MANGUNWIDJAJA dan ZAINAL
ALIM MAS‟UD.
Indonesia merupakan negara yang terkenal dengan jenis–jenis tumbuhan penghasil minyak atsiri namun pemanfaatannya tidak banyak digunakan untuk diolah menjadi produk jadi seperti obat–obatan. Salah satu minyak atsiri yang sangat potensial dan diproduksi di wilayah Indonesia Timur khususnya Maluku dan Papua adalah minyak lawang. Minyak lawang mengandung dua komponen utama yaitu eugenol dan safrol, dimana safrol memiliki cincin dioxolane yang sangat aktif sehingga dapat dijadikan sebagai prekursor obat sintetik. Salah satu cara untuk meningkatkan nilai tambah dari minyak lawang yaitu dengan mensintesis senyawa analog kurkumin sebagai obat antikanker. Tujuan penelitian ini secara umum adalah mensintesis senyawa analog kurkumin dari minyak lawang (Cinnamomum cullilawan Blume) yang berpotensi sebagai antikanker. Secara khusus penelitian ini bertujuan untuk; 1) memperoleh produk sintetik piperonal dari minyak lawang, 2) memperoleh produk AKS menggunakan metode gelombang mikro dan metode konvensional, 3) memperoleh produk AKAS menggunakan metode gelombang mikro dan metode konvensional, 4) mengetahui aktivitas sitotoksik produk sintetik analog kurkumin menggunakan metode in
vitro terhadap biakan sel kanker payudara T47D, dan 5) mengoptimasi kondisi
proses sintesis AKAS metode gelombang mikro menggunakan RSM serta menentukan model terbaik untuk memperoleh kondisi proses optimum.
Penelitian ini dilaksanakan dalam lima tahap, yaitu : (1) sintesis piperonal dari minyak lawang, (2) sintesis produk analog kurkumin simetris, (3) sintesis produk analog kurkumin tidak simetris, (4) uji aktivitas sitotoksik senyawa analog kurkumin menggunakan metode in vitro terhadap biakan sel kanker T47D, dan (5) optimasi kondisi proses sintesis AKAS-m. Setiap tahapan proses dianalisis karakterisasi fisik-kimia, rendemen, kemurnian menggunakan GC, GCMS, HPLC dan elusidasi strukur menggunakan FTIR, 1H-NMR dan LCMS. Untuk tahapan uji aktivitas dilakukan pengamatan efek sitotoksik dengan metode MTT dan penentuan konsentrasi penghambatan pertumbuhan 50% sel T47D (IC50) menggunakan analisis probit. Optimasi kondisi proses sintesis menggunakan RSM dan rancangan percobaan box-behnken design dengan tiga variabel bebas.
Kedua, metode proses dan produk analog kurkumin simetris
(1,5-bis-benzo[1,3]dioxol-5-yl-penta-1,4-dien-3-one) yang diperoleh dari reaksi
kondensasi antara piperonal dengan aseton. Rendemen produk menggunakan metode gelombang mikro pada daya 140 watt selama 2 menit adalah 53,3% (t.l=180 oC) dan metode konvensional selama 3 jam adalah 78,43% (titik leleh =191 oC). Ketiga, metode proses dan produk analog kurkumin tidak simetris
(5-benzo[1,3]dioxol-5-yl-1-phenyl-penta-2,4-dien-1-one). Produk analog kurkumin
tidak simetris menggunakan dua tahapan reaksi kondensasi, tahapan kondensasi yang pertama antara piperonal dengan asetaldehid menggunakan katalis basa dan metanol selama 3 jam diperoleh produk intermediate
(3-benzo[1,3]dioxol-5-yl-propenal) 70,28%. Reaksi kondensasi tahap kedua antara produk intermediate
dengan asetofenon menggunakan metode gelombang mikro pada daya 140 watt selama 2 menit diperoleh rendemen 82,82% (t.l = 104 oC) dan metode konvensional selama 3 jam diperoleh 99,55% (titik leleh = 111 oC).
Keempat, aktivitas sitotoksik produk sintetik analog kurkumin menggunakan metode in vitro terhadap biakan sel kanker payudara T47D. Uji sitotoksik keempat sampel menggunakan metode MTT menunjukan nilai IC50 yang terbaik adalah produk analog kurkumin tidak simetris (akas). Nilai IC50 untuk produk sintetik mulai dari yang tertinggi yaitu; AKAS-m = 7,247µg/ml; AKAS-k = 125,3µg/ml; AKS-m = 257,79µg/ml; AKS-k = 555,276µg/ml.
Kelima, kondisi optimum proses sintesis analog kurkumin tidak simetris menggunakan metode gelombang mikro (AKAS-m). Hasil analisis RSM dengan 3 variabel bebas yaitu daya, waktu dan konsentrasi diperoleh persamaan model matematika ;
. Data hasil
analisis menggunakan metode RSM diperoleh kondisi proses optimum dengan prediksi yield 97,47 % pada daya 140 watt, waktu 1 menit dan konsentrasi 46,98 mmol. Produk akas-m hasil validasi diperoleh yield 96,97% dengan perbedaan hasil prediksi sebesar 0,5%.
SUMMARY
IMANUEL BERLY DELVIS KAPELLE. Engineering Process Synthesis Curcumin Analogs from Culilawan Oil (Cinnamomum cullilawan Blume) Potential as an Anticancer. Supervised by TUN TEDJA IRAWADI, MEIKA SYAHBANA RUSLI, DJUMALI MANGUNWIDJAJA and ZAINAL ALIM
MAS‟UD.
Indonesia is state of being eminent with a kind of plant essential oil, but its use not much used to be changed into finished products like a medicine. One of the essential oils is highly potential and produced in eastern Indonesia especially Maluku and Papua is the culilawan oil. Culilawan oil containing two a major component namely eugenol and safrole, where safrole having an dioxolane ring that is especially active so that can be used as precursor synthetic drugs. One way to increase the value added from culilawan oil namely by synthesize curcumin analogues as an anticancer drug. The purpose of this research in general is synthesized of curcumin analogous from culilawan oil (Cinnamomum cullilawan
Blume) potential as an anticancer. The study specifically aims to; 1) obtain the product synthetic piperonal from culilawan oil, 2) obtain the product AKS using microwave and conventional methods, 3) obtaining the product AKAS using microwave and conventional methods, 4) determine the cytotoxic activity of products synthetic curcumin analog using in vitro against cultured breast cancer cells T47D, and 5) optimize process conditions synthesis AKAS methods microwave using the RSM as well as determine the best model to obtain optimum process conditions.
This research was conducted in five stages: (1) synthesis piperonal from culilawan oil. (2) Synthesis of symmetrical curcumin analog products. (3) Synthesis of asymmetrical curcumin analog products. (4) Cytotoxic activity test of curcumin analogues using in vitro method against cultured cancer cells T47D. (5) Optimization the condition of the process synthesis AKAS-m. Each stage of the process analyzed the physical-chemical characterization, yield, purity using GC, GCMS, HPLC and structure elucidation using FTIR, 1H-NMR and LCMS. For the
activity test phase‟s cytotoxic effect was observed with MTT method and
determining the concentration of 50% growth inhibition of T47D cells (IC50) using probit analysis. Optimization of synthesis process conditions using RSM and experimental design Box-Behnken with three independent variables..
This research has resulted in five main results. First, piperonal as a precursor of cancer drugs has been synthesized from culilawan oils with 3 stages of the process, namely the isolation safrole from culilawan oils, safrole isomerization and oxidation. Safrole isolated from culilawan oils using chemical methods (NaOH) and produce safrole 17.21%. Safrole isomerization process produces isosafrole using solvent-free systems with alkali catalyst (KOH) at a temperature of 120oC for 6 h obtained yield of 77.56%. Piperonal obtained from the oxidation reaction isosafrole using KMnO4 and obtained yield of 65.63%.
°C) and a conventional method for 3 hours was 78.43% (mp = 191 °C). Third, the process method and products of curcumin analogues asymmetrical (5-benzo[1,3]dioxol-5-yl-1-phenyl-penta-2,4-dien-1-one). Products curcumin analogues asymmetrical using two stages condensation reaction, the first stage of condensation between piperonal with acetaldehyde using alkaline catalyst and methanol for 3 hours obtained intermediate product (3-benzo [1,3] dioxol-5-yl-propenal) with yield of 70.28%. The second stage of condensation reaction between the intermediate product with acetophenone using a microwaves method at 140 watts for 2 minutes obtained yield of 82.82% (mp = 104 °C) and a conventional method for 3 hours was obtained yield of 99.55% (mp = 111 °C).
Fourth, the cytotoxic activity of products synthetic curcumin analogues using in vitro against cultured breast cancer cells T47D. Test cytotoxic to four samples using MTT method showed the best IC50 value is products curcumin analogues asymmetrical (akas). IC50 values for synthetic products ranging from the highest; akas-m = 7.247µg/ml; akas-k = 125.3µg/ml; aks-m = 257.79µg/ml; aks-k = 555.276µg/ml.
Fifth, the optimum conditions of synthesis process curcumin analogues asymmetrical using microwaves (akas-m). RSM analysis results with three independent variables (power, time and concentration) equation mathematical model;
. Data analysis using methods RSM obtained optimum process conditions with a predicted yield of 97.47% at 140 watts of power, a time of 1 minute and concentrations 46.98 mmol . Product akas-m validation results obtained yield of 96.97% with a difference of 0.5% predicted results.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada
Program Studi Teknologi Industri Pertanian
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2016
IMANUEL BERLY DELVIS KAPELLE
REKAYASA PROSES SINTESIS SENYAWA ANALOG
KURKUMIN DARI MINYAK LAWANG (Cinnamomum
Penguji pada Ujian Tertutup : Prof. Dr. Dra. Purwatiningsih Sugita, MS Prof. Dr. Wahono Sumaryono, Apt
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Kuasa atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Mei 2014 ini ialah produk turunan minyak lawang, dengan judul Rekayasa Proses Sintesis Senyawa Analog Kurkumin dari Minyak Lawang (Cinnamomum cullilawan Blume) yang Berpotensi Sebagai Antikanker.
Penulisan disertasi ini tidak mungkin diselesaikan sendiri oleh penulis tanpa bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu penulis menyampaikan rasa terima kasih yang tulus dan penghargaan yang setinggi-tingginya kepada:
1. Prof. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi, MS selaku ketua komisi pembimbing yang telah membantu penulis, mulai dari saat masuk pada IPB dengan memberikan rekomendasi, arahan serta bimbingan dalam penyusunan konsep sampai akhir penelitian dan penulisan disertasi ini.
2. Dr. Ir. Meika Syahbana Rusli, MSc selaku anggota komisi pembimbing telah membantu penulis, mulai dari saat masuk pada IPB dengan memberikan rekomendasi, bimbingan dan arahan dalam penyusunan konsep sampai akhir penelitian dan penulisan disertasi ini.
3. Prof. Dr. Ir. Djumali Mangunwidjaja, DEA selaku anggota komisi pembimbing yang telah memberikan bimbingan, arahan serta masukan untuk dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan disertasi ini.
4. Drs. Zainal Alim Mas‟ud, DEA, Ph.D selaku anggota komisi pembimbing atas bantuan, bimbingan serta dorongan dalam menyelesaikan penelitian dan penulisan disertasi ini.
5. Prof. Dr. Ir. Erliza Noor; Dr. Ir. A.E. Zainal Hasan, M.Si; Dr. Ir. Titi Candra Sunarti, M.Si yang telah bersedia menjadi penguji luar komisi pada ujian kualifikasi serta memberikan saran dan perbaikan untuk kesempurnaan karya tulis ini.
6. Prof. Dr. Dra. Purwatiningsih Sugita, MS; Prof. Dr. Wahono Sumaryono, Apt; Prof. Dr. P. Kakisina, Spd, M.Si yang telah bersedia menjadi penguji luar komisi pada ujian tertutup ataupun pada ujian terbuka serta memberikan saran dan perbaikan untuk kesempurnaan karya tulis ini.
7. Ketua Program Study Teknologi Industri Pertanian beserta staf dosen dan staf penunjang yang sudah banyak membantu dan memberi pelayanan yang baik selama penulis menjadi mahasiswa.
8. Rektor Universitas Pattimura dan Dekan FMIPA atas ijin dan kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk melanjutkan jenjang pendidikan S3. 9. Prof. Dr. H.J. Sohilait, MS selaku kepala Laboratorium Kimia Organik
FMIPA Unpatti yang telah mengijinkan penulis melakukan penelitian serta telah memberikan saran dan masukan dalam pelaksanaan penelitian.
doa dan pengorbanan serta motivasi yang telah diberikan untuk penyelesaian studi penulis.
11. Rekan-rekan kerja Nini M Renur, ST, M.Si; Rachel Turalely, Spd, M.Biotech; Yanes Ralahalo, Buce Talakua, Johanis Wairata S.Si, M.Sc yang telah memberikan bantuan selama penelitian.
12. Seluruh rekan kuliah di Program Studi Teknologi Industri Pertanian, khususnya rekan-rekan TIP 2013 atas dukungan, kebersamaan dan semangat saling menguatkan untuk menyelesaikan pendidikan ini.
13. Semua pihak yang telah membantu dan memberikan masukan dalam penelitian hingga tersusunnya disertasi ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Maret 2016
DAFTAR ISI
Reaksi Isomerisasi Safrol 5
Reaksi Oksidasi 6
Gelombang Mikro 7
Analog Kurkumin 8
Aktivitas Sitotoksik Sel Kanker Payudara T47D 10
Response Surface Methodology, RSM 11
3 METODOLOGI 11
Kerangka Pemikiran 11
Bahan Penelitian 13
Alat Penelitian 13
Prosedur Penelitian 13
Penelitian Tahap I : Sintesis piperonal sebagai prekursor antikanker
dari minyak lawang 13
Karakterissasi bahan baku 13
Proses isolasi safrol dari minyak lawang 14
Proses isomerisasi safrol 15
Proses sintesis piperonal 15
Penelitian Tahap II : Sintesis produk analog kurkumin simetris
menggunakan metode gelombang mikro dan konvensional 17 Proses sintesis analog kurkumin simetris metode gelombang mikro 17 Proses sintesis analog kurkumin simetris metode konvensional 17 Penelitian Tahap III : Sintesis produk analog kurkumin simetris
menggunakan metode gelombang mikro dan konvensional 18
Pembuatan produk intermediate 18
Proses sintesis analog kurkumin tidak simetris metode konvensional 18 Proses sintesis analog kurkumin tidak simetris metode
gelombang mikro 20
biakan sel kanker payudara T47D 20 Penelitian Tahap V : Optimasi proses sintesis analog kurkumin tidak
simetris metode gelombang menggunakan RSM 22
Parameter Pengamatan 23
Analisis Data 23
4 HASIL DAN PEMBAHASAN 24
Penelitian Tahap I : Sintesis piperonal sebagai prekursor antikanker
dari minyak lawang 24
Penelitian Tahap II : Sintesis produk analog kurkumin simetris
menggunakan metode gelombang mikro dan konvensional 32 Penelitian Tahap III : Sintesis produk analog kurkumin simetris
menggunakan metode gelombang mikro dan konvensional 36 Penelitian Tahap IV : Uji sitotoksisitas senyawa analog
kurkumin menggunakan metode in vitro terhadap
biakan sel kanker payudara T47D 41
Penelitian Tahap V : Optimasi proses sintesis analog kurkumin tidak
simetris metode gelombang menggunakan RSM 44
Diversifikasi Produk dari Minyak Lawang 48
5 SIMPULAN DAN SARAN 49
Simpulan 49
Saran 50
DAFTAR PUSTAKA 50
LAMPIRAN 58
RIWAYAT HIDUP 97
DAFTAR TABEL
1 Karakteristik minyak lawang 5
2 Kisaran nilai variabel bebas 22
3 Rancangan percobaan optimasi 22
4 Data GCMS minyak lawang 24
5 Harga m/z ion molekul dan ion fragmen analog kurkumin
simetris metode konvensional 34
6 Harga m/z ion molekul dan ion fragmen analog kurkumin
simetris metode gelombang mikro 34
7 Data absorbansi kontrol 41
8 Data absorbansi hasil uji sitotoksik T47D 41
9 Hasil uji probit analog kurkumin 43
DAFTAR GAMBAR
1 Tanaman lawang 5
2 Struktur eugenol dan safrol 5
3 Reaksi oksidasi ikatan π tanpa/dengan pemutusan ikatan σ 6
4 Reaksi oksidasi alkena 6
5 Reaksi oksidasi dengan kalium permanganat 7
6 Spektrum elektromagnetik 7
7 Struktur kimia kurkumin dan analog kurkumin 8
8 Mekanisme reaksi kondensasi aldol 9
9 Sel kanker payudara T47D 10
10 Diagram alir tahapan penelitian 12
11 Diagram alir proses isolasi safrol dari minyak lawang 14 12 Diagram alir proses isomerisasi safrol menjadi isosafrol 15 13 Diagram alir proses sintesis piperonal dari isosafrol 16 14 Diagram alir proses sintesis analog kurkumin simetris menggunakan
metode gelombang mikro 17
15 Diagram alir proses sintesis analog kurkumin simetris menggunakan
metode konvensional 18
16 Diagram alir proses pembuatan produk intermediate 19 17 Diagram alir proses sintesis analog kurkumin simetris menggunakan
metode konvensional 19
18 Diagram alir proses sintesis analog kurkumin tidak simetris
menggunakan metode gelombang mikro 20
19 Diagram alir tahapan uji sitotoksik metode MTT 21 20 Diagram alir optimasi proses sintesis analog kurkumin tidak simetris
menggunakan metode gelombang mikro 23
21 Produk a) Minyak lawang. b) Safrol. c). Isosafrol. d) Piperonal. 24 22 Spektrum GC safrol hasil pemisahan dengan metode kimia 25 23 Rendemen hasil isolasi safrol dari minyak lawang 25
24 Mekanisme tahap 1 reaksi isomerisasi 26
25 Mekanisme tahap 2 reaksi isomerisasi 27
26 Rendemen hasil isomerisasi safrol dari isosafrol pada kondisi proses
yang berbeda 27
27 Struktur kimia KTF tween 80 28
28 Reaksi oksidasi isosafrol menjadi piperonal dengan bantuan tween 80 29
29 Mekanisme reaksi sintesis piperonal tahap 1 29
30 Mekanisme reaksi sintesis piperonal tahap 2 30
31 Spektrum 1H-NMR safrol, isosafrol dan piperonal 31 32 Rendemen hasil oksidasi isosafrol menjadi piperonal pada kondisi
proses yang berbeda 31
33 Produk analog kurkumin simetris (1,5-bis-benzo[1,3]dioxol -5-yl-penta-1,4-dien-3-one). (a) Metode gelombang mikro.
(b) Metode konvensional. 32
34 Mekanisme reaksi sintesis analog kurkumin (1,5-Bis-benzo[1,3]
dioxol-5-yl-penta-1,4-dien-3-one) 33
35 Spektrum FTIR senyawa analog kurkumin simetris metode gelombang
36 Struktur kimia senyawa analog kurkumin simetris 35 37 Rendemen hasil sintesis analog kurkumin simetris metode konvensional 35 38 Rendemen hasil sintesis analog kurkumin simetris metode gelombang
mikro 36
39 Produk intermediate (3-benzo[1,3]dioxol-5-yl-propenal) 36
40 Reaksi sintesis produk intermediate 37
41 Produk analog kurkumin tidak simetris (5-benzo[1,3]dioxol-5-yl-1-phenyl-penta-2,4-dien-1-one) (a) Metode gelombang mikro. (b) Metode
konvensional 37
42 Mekanisme reaksi sintesis analog kurkumin tidak simetris tahap adisi 38 43 Mekanisme reaksi sintesis analog kurkumin tidak simetris tahap
dehidrasi 38
44 Spektrum FTIR senyawa analog kurkumin tidak simetris metode
gelombang mikro dan konvensional 39
45 Struktur kimia senyawa analog kurkumin tidak simetris 39 46 Rendemen hasil sintesis analog kurkumin tidak simetris metode
konvensional 40
47 Rendemen hasil sintesis analog kurkumin tidak simetris metode
gelombang mikro 40
48 Serapan pigmen ungu MTT untuk (a) Kontrol sel T47D, konsentrasi 100 µg/mL; (b) Aks-k. (c) Aks-m. (d) Akas-m. (e) Akas-k 42 49 Grafik hubungan seri konsentrasi sampel VS persen kematian sel T47D
(a) Aks-k. (b) Aks-m. (c) Akas-m. (d) Akas-k 43
50 Struktur kimia senyawa (a) AKS dan (b) AKAS 44
51 Produk optimasi proses sintesis AKAS-m 45
52 Hubungan kemurnian dan titik leleh produk AKAS 46 53 Plot kontur (a) uji kenormalan. (b) prediksi model vs data aktual yield 46 54 Plot kontur (a) permukaan respons (b) hubungan antara daya gombang
mikro dan waktu terhadap yield produk sintetik analog kurkumin 47 55 Plot kontur (a) permukaan respons (b) hubungan antara daya gombang
mikro dan konsentrasi terhadap yield senyawa analog kurkumin. 47 56 Plot kontur (a) permukaan respons (b) hubungan antara waktu dan
konsentrasi terhadap yield produk sintetik analog kurkumin. 47 57 Transformasi produk sintetik analog kurkumin dari minyak lawang 49
DAFTAR LAMPIRAN
1 GCMS minyak lawang 57
2 Perhitungan rendemen 58
3 GC Safrole hasil isolasi 62
4 FTIR Safrole hasil isolasi 63
5 1H-NMRSafrole hasil isolasi 64
6 GC Isoafrole 65
7 FTIRIsosafrol 66
8 1H-NMR Isosafrol 67
9 GCMS Piperonal 68
11 LCMS analog kurkumin simetris metode konvensional 70 12 FTIR analog kurkumin simetris metode konvensional 71 13 LCMS analog kurkumin simetris metode gelombang mikro 72 14 FTIR analog kurkumin simetris metode gelombang mikro 73
15 GCMS produk inntermediate 74
16 LCMS analog kurkumin tidak simetris metode gelombang mikro 75 17 FTIR analog kurkumin tidak simetris metode gelombang mikro 76 18 LCMS analog kurkumin tidak simetris metode konvensional 77 19 FTIR analog kurkumin tidak simetris metode konvensional 78
20 HPLC analog kurkumin tidak simetris 79
21 HPLC Optimasi proses 80
22 Analisis keragaman (ANOVA) terhadap model respon
permukaan kubik untuk yield analog kurkumin 89
23 HPLC Validasi model 90
24 Diagram proses diversifikasi produk dari minyak lawang 91
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Indonesia merupakan negara yang terkenal dengan jenis–jenis tumbuhan penghasil minyak atsiri namun pemanfaatannya tidak banyak digunakan untuk diolah menjadi produk jadi seperti obat–obatan. Minyak atsiri umumnya di ekspor untuk kemudian diolah menjadi produk jadi dan masuk ke Indonesia dengan harga yang berlipat ganda. Berdasarkan data Kementrian Perindustrian RI tahun 2014 tercatat nilai ekspor untuk minyak atsiri sebesar 260.894.363 US$ dengan angka pertumbuhan pertahun sebesar 0,22%. Salah satu minyak atsiri yang sangat potensial dan diproduksi di wilayah Indonesia Timur khusunya Maluku dan Papua adalah minyak lawang. Minyak lawang diperoleh dari destilasi kulit kayu tanaman lawang (Cinnamomum cullilawan Blume) dengan rendemen 1,49–3,80% (Ketaren 1985).
Minyak lawang memiliki dua komponen utama yaitu eugenol (69,0%) dan safrol (21,0%) (Sastrohamidjojo 2014). Eugenol dan safrol memiliki perbedaan struktur pada subtituenya, dimana safrol memiliki cincin dioxolane yang sangat aktif sehingga dapat dijadikan sebagai prekursor obat sintetik. Safrol merupakan senyawa utama minyak sasafras dan sering digunakan sebagai prekursor obat sintesis 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA) (Swist et al.2005; Stojanovska et al.2013) dan 3,4-methylenedioxyphenyl-2-propanone (MDP2P) (Cox et al.2006).
Bahan alam yang memiliki cincin dioxolane yang sama dengan safrol serta memiliki aktivitas sebagai anti kanker adalah piperine (Soliman 2005). Piperine merupakan senyawa alkaloid yang telah diuji aktivitasnya sebagai antitumor dengan metode in vivo dapat menghambat 56,8% (Bezerra et al.2006), efek antioksidan dan hepatoprotektif (Mehta et al.2012) serta dapat meningkatkan bioavailabilitas (Jin et al.2013). Kereaktifan dari cincin dioxolane yang dimiliki oleh safrol dapat dimanfaatkan dengan cara dikonversi menjadi produk senyawa antikanker turunan analog kurkumin.
Senyawa analog (homolog) kurkumin merupakan senyawa yang memiliki kemungkinan sifat farmakologis yang sama atau bahkan lebih baik bila dibandingkan dengan senyawa induk (Yang et al.2013). Senyawa kurkumin merupakan serbuk berwarna kuning dari tanaman curcuma longa (Linn) (Narlawar et al.2007; Dandawate et al.2012; Yanga et al.2013) yang memiliki aktivitas sebagai obat diabetes (Kanitkar et al.2008) dan anti kanker (Punithavathi
et al.2003; Aggarwal 2010; Irving et al.2011; Xiang et al.2012; Moorthi et
Diversifikasi produk berbasis minyak lawang menjadi produk antikanker analog kurkumin melalui beberapa tahapan proses antara lain isolasi safrol dari minyak lawang, isomerisasi safrol, oksidasi dan kondensasi. Safrol dapat diisolasi dari minyak lawang menggunakan metode kimia dan fisik. Metode kimia dengan menggunakan NaOH (Kapelle et al.2010; Sastrohamidjojo 2014) sedangkan metode fisik berdasarkan pada perbedaan titik didih komponen. Reaksi isomerisasi safrol menggunakan katalis basa pada suhu proses 120oC selama 6 jam (Kapelle et al.2010) dengan reaksi tanpa pelarut atau dengan pelarut butanol (Heather et al.2015). Proses oksidasi isosafrol menghasilkan piperonal merupakan reaksi oksidasi alkena, dimana produk yang dihasilkan tergantung pada kondisi reaksi dan struktur alkena yang digunakan. Reaksi oksidasi dilakukan dengan menggunakan KMnO4 sebagai pengoksidasi dalam sistem dua fasa yaitu air dan fasa organik, maka untuk meningkatkan reaksi ditambahkan katalis transfer fase (Sastrohamidjojo 2004).
Produk analog kurkumin yang disintesis memiliki perbedaan struktur yaitu produk simetris (1,5-bis-benzo[1,3]dioxol-5-yl-penta-1,4-dien-3-one, AKS) dan tidak simetris (5-benzo[1,3]dioxol-5-yl-1-phenyl-penta-2,4-dien-1-one, AKAS) dengan bahan dasar piperonal dari minyak lawang. Reaksi sintesis analog kurkumin merupakan proses reaksi kondensasi antara dua senyawa karbonil yang berbeda dan umumnya menggunakan dua kondisi reaksi yaitu kondisi asam dan kondisi alkali (Yin et al.2013). Reaksi pada kondisi alkali sering digunakan karena dapat memberikan hasil yang lebih baik (Yadav et al.2010; Chen et al.2011). Proses reaksi kondensasi dapat dipercepat dengan menggunakan radiasi gelombang mikro pada 160 watt selama 1-2 menit (Azarifar et al.2003; Elavarasan et al.2013). Metode proses sintesis analog kurkumin dapat memberikan pengaruh terhadap produk baik itu rendemen hasil maupun aktivitas biologis.
Pengembangan obat antikanker baru sebagai agen-agen kemoterapi kanker perlu dilakukan evaluasi praklinik untuk mengetahui potensi aktivitas neoplastiknya. Evaluasi yang telah terstandarisasi untuk menentukan apakah suatu material mengandung bahan yang berbahaya (toksik) secara biologis disebut uji sitotoksisitas. Salah satu metode yang umum digunakan untuk menetapkan jumlah sel adalah metode MTT (Yu et al.2012). Produk yang memiliki aktivitas penghambatan yang terbaik dilakukan optimasi tahapan proses, khususnya pada tahapan reaksi kondensasi.
Reaksi kondensasi dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti metode pemanasan dan kondisi proses (suhu/daya, waktu, dan konsentrasi prekursor) sehingga optimasi terhadap faktor-faktor tersebut perlu dilakukan. Salah satu metode optimasi yang efisien adalah metode respon permukaan (Response Surface
Methodology, RSM). RSM merupakan metode gabungan teknik statistika dan
Perumusan Masalah
Minyak lawang dapat dibuat produk turunannya dengan pendekatan sintesis kimia. Produk obat kanker sintetik analog kurkumin dapat disintesis dengan beberapa tahapan proses, setiap proses memberikan pengaruh terhadap rendemen hasil. Tahapan proses sintesis khususnya reaksi kondensasi dengan menggunakan metode konvensional maupun gelombang mikro memberikan pengaruh terhadap produk dan aktivitas sitotoksik. Sitotoksisitas produk sintetik analog kurkumin dipengaruhi oleh struktur kimianya. Produk dengan struktur kimia simetris (AKS) dan tidak simetris (AKAS) dapat memberikan aktivitas sitotoksik yang berbeda-beda. Produk analog kurkumin sintetik yang memiliki aktivitas terbaik yang diuji terhadap sel kanker T47D secara in vitro akan dipilih untuk di optimasi tahapan prosesnya. Optimasi proses dilakukan pada tahapan terakhir proses sintesis analog kurkumin yaitu tahapan proses reaksi kondensasi. Kondisi proses reaksi kondensasi dipengaruhi oleh suhu/daya, waktu dan konsentrasi prekursor. Optimasi proses reaksi kondensasi menggunakan RSM serta menentukan model terbaik untuk memperoleh kondisi proses optimum.
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini secara umum adalah mensintesis senyawa analog kurkumin dari minyak lawang (Cinnamomum cullilawan Blume) yang berpotensi sebagai antikanker. Untuk mendapatkan tujuan tersebut maka dilakukan beberapa tahapan penelitian dengan tujuan khusus sebagai berikut:
1. Memperoleh produk sintetik piperonal dari minyak lawang.
2. Memperoleh produk AKS menggunakan metode gelombang mikro dan metode konvensional.
3. Memperoleh produk AKAS menggunakan metode gelombang mikro dan metode konvensional.
4. Mengetahui aktivitas sitotoksik produk sintetik analog kurkumin menggunakan metode in vitro terhadap biakan sel kanker payudara T47D. 5. Mengoptimasi kondisi proses sintesis AKAS metode gelombang mikro
menggunakan RSM serta menentukan model terbaik untuk memperoleh kondisi proses optimum.
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat digunakan dalam pengembangan proses produksi senyawa antikanker analog kurkumin khususnya dari bahan dasar safrol dari minyak lawang secara efisien sehingga mampu meningkatkan nilai tambah.
Kebaruan Penelitian
dan analog kurkumin tidak simetris (AKAS) dari minyak lawang (Cinnamomum
cullilawan Blume) menggunakan metode konvensional dan metode gelombang
mikro. Produk AKAS menggunakan metode gelombang mikro pada daya 140 watt selama 2 menit berpotensi sebagai antikanker yang di uji sitotoksisitas dengan nilai IC50 7,247 µg/ml menggunakan metode in vitro terhadap biakan sel kanker payudara T47D. Model hubungan 3 variabel (daya gelombang mikro, waktu dan konsentrasi prekursor) dengan yield pada sintesis AKAS lewat reaksi kondensasi antara asetofenon dengan produk intermediate (3-benso[1,3]dioxol-5-yl-propenal) dan dari model tersebut dapat diprediksi kondisi optimum proses sintesis AKAS.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahapan proses untuk menghasilkan produk sintetik analog kurkumin yang aktif sebagai antikanker dengan kualitas yang baik. Adapun ruang lingkup penelitian ini adalah sebagai berikut:
1. Minyak lawang yang digunakan merupakan minyak atsiri hasil destilasi kulit kayu tanaman lawang (Cinnamomum cullilawan Blume) produksi dari Propinsi Maluku.
2. Mengukur tingkat aktivitas sitotoksik produk sintetik analog kurkumin menggunakan metode in vitro terhadap biakan sel kankerpayudara T47D. 3. Rancangan percobaan menggunakan Box-Behnken Design dengan 3 variabel
bebas yaitu suhu/daya, waktu dan konsentrasi.
4. Parameter respon yang diukur untuk menentukan model dan kondisi proses optimum tahapan reaksi kondensasi adalah kemurnian dan rendemen hasil.
2
TINJAUAN PUSTAKA
Minyak Lawang
Tanaman lawang termasuk dalam famili Lauraceae dan kelompok kayu manis dengan ciri-ciri daun berlendir, kayu berwarna putih dan rapuh serta tumbuh liar di hutan (Gambar 1). Minyak lawang diperoleh dari penyulingan kulit kayu dengan karakterisasi seperti disajikan pada Tabel 1. Minyak lawang mengandung dua komponen utama yaitu eugenol dan safrol (Kapelle et al.2010).
Tabel 1 Karakteristik minyak lawang
Eugenol dan safrol memiliki perbedaan struktur, dimana safrol memiliki cincin dioxolane yang sangat aktif (Gambar 2). Eugenol dapat diisolasi dari minyak lawang menggunakan larutan NaOH sedangkan safrol tidak beraksi sehingga dapat dipisahkan dengan menggunakan pelarut organik. Safrol pada suhu kamar merupakan minyak yang tidak berwarna, tetapi dapat berubah menjadi kuning jika terkena sinar matahari dan pada temperatur rendah safrol merupakan kristal berwarna putih (Villegas et al.2011).
O
Gambar 2. Struktur eugenol dan safrol (Sastrohamidjojo, 2004) Safrol umumnya terdapat dalam minyak yang mudah menguap contohnya, minyak sasafras Amerika, minyak sasafras Brazil (Ocotea pretiasa), minyak star anise (Illidium Verum) dan dalam minyak kampor, safrol berada dalam jumlah yang besar. Safrol terdapat dalam jumlah yang kecil pada minyak yang mudah menguap lainnya seperti dalam minyak pala, minyak ylang-ylang, minyak kayu manis, minyak daun salam california. Safrol terdapat dalam jumlah yang sangat besar yaitu 90% dalam minyak Illicium parviflorum Michx (Sastrohamidjojo 2004). Penggunaan safrol saat ini sebagai zat aditif makanan telah dilarang karena dapat berinteraksi dengan tubuh, bersifat karsinogenik (Liu et al.2000; Schaffer et al.2013), dan badan internasional untuk penelitian kanker menggolongkan safrol pada kelompok 2B karsinogenik (Fan et al.2012). Safrol juga digunakan untuk pembasmi serangga S.zeamais dan T.castaneum (Chu et al.2011). Safrol merupakan bahan baku yang penting untuk pembuatan isosafrol (Gimeno et al.2005).
Reaksi Isomerisasi Safrol
Safrol dapat dikonversi menjadi isosafrol dengan menggunakan reaksi isomerisasi menggunakan katalis basa (Gimeno et al.2005). Isomerisasi safrol dapat dianalogkan dengan isomerisasi olefin. Safrol akan mengalami perubahan struktur karena pengaruh basa, sehingga akan terjadi perpindahan ikatan rangkap
dari rantai lurus ke arah mendekati cincin benzen dalam posisi terkonjugasi (Sastrohamidjojo 2004). Mekanisme reaksi isomerisasi safrol melalui zat antara karbokation yang merupakan penentu laju reaksi dan menentukan produk isomer yang terbentuk (Cox et al.2008).
Reaksi Oksidasi
Oksidasi didefinisikan sebagai reaksi kehilangan elektron (Hoffman 2004). Oksidasi alkena dapat menjadi produk lain tergantung pada pereaksi yang digunakan, kondisi reaksi dan jenis alkena yang dioksidasi. Reaksi oksidasi dibagi menjadi 2 kelompok yaitu oksidasi ikatan π tanpa pemutusan ikatan σ dan pemitusan ikatan π dengan pemutusan ikatan σ. Produk oksidasi tanpa pemutusan ikatan σ dalam pembentukan 1,2 diol atau epoksida (Gambar 3a) dan jika ikatan π putus maka akan menghasilkan keton, aldehid atau asam karboksilat (Gambar 3b)
C C
Gambar 3 Reaksi oksidasi ikatan π tanpa/dengan pemutusan ikatan σ (Fessenden
et al.1992).
Produk yang dihasilkan tergantung pada kondisi reaksi dan struktur alkena yang digunakan. Struktur alkena yang menentukan produk adalah ada tidaknya atom hydrogen pada Csp2. Jika tiap karbon alkena tidak mengikat atom hydrogen, tiap karbon tersubsitusi, maka pemutusan ikatan oksidasi menghasilkan sepasang molekul keton. Sebaliknya jika alkena mempunyai satu atom hydrogen yang terikat pada Csp2, maka produk berupa aldehid atau asam karboksilat bergantung pada kondisi reaksi. Jika satu ikatan rangkap tersubsitusi sedangkan sisi lain termonosubsitusi maka pemaksapisahan oksidatif akan menghasilkan suatu keton dari disubsitusi dan suatu aldehid atau asam karboksilat dari sisi monosubsitusi (Gambar 4).
Reaktifitas KMnO4 sebagai oksidator tergantung pada pH, pelarut, konsentrasi dan temperatur. Oksidasi ikatan rangkap pada alkena KMnO4 encer akan menghasilkan diol. Kedua gugus OH pada senyawa diol terletak pada sisi yang sama (Morrison et al.1987). Mekanisme reaksi ini digambarkan melalui bentuk ester siklik mangan seperti terlihat pada Gambar 5.
C C KMnO4 / H+
Panas
C C
O O
Mn
O O
C
OH C
OH H2O
+ MnO3
-Gambar 5 Reaksi oksidasi dengan kalium permanganat (Morrison et al.1987)
Gelombang Mikro
Pemanasan gelombang mikro (microwave) didefinisikan sebagai gelombang elektromagnetik pada frekuensi 915 MHz dan 2,45 GHz (Gambar 6). Gelombang mikro merupakan gelombang radio pendek berfrekuensi tinggi yang terletak di antara gelombang berfrekuensi sangat tinggi (infrared) dan gelombang radio konvensional. Dalam spektrum frekuensi, gelombang mikro terletak antara gelombang radio dan inframerah (Lam et al.2012).
Gambar 6 Spektrum elektromagnetik (Lam et al.2012).
partikel dan ketahanan elektrik) yang menahan gerakan partikel dan membangkitkan gerakan acak menghasilkan panas (Luo et al.2012). Energi gelombang mikro adalah radiasi non-ionisasi yang menyebabkan pergerakan molekul, yaitu interaksi antara komponen listrik dari gelombang dengan partikel bermuatan berupa migrasi dari ion-ion dan rotasi dari dipol-dipol dari sampel dengan tidak merubah struktur molekul. Perubahan energi gelombang mikro menjadi panas dapat diketahui dari dua mekanisme, yaitu konduksi ionik dan rotasi dipolar (Lam et al.2012).
Analog Kurkumin
Analog kurkumin merupakan produk sintetik yang dibuat dengan maksud agar memberikan efek seperti produk kurkumin. Terdapat perbedaan struktur antara kurkumin dan analog kurkumin, yakni pada penghubung antara dua cincin benzen (Gambar 7). Perbedaan struktur pada kedua senyawa dapat memberikan aktivitas farmakologi yang berbeda. Aktivitas farmakologi dari setiap produk analog kurkumin berbeda tergantung dari gugus fungsi dan strukturnya (Anand et al.2008a). Analog kurkumin dengan bentuk siklik juga memberikan aktivitas antikanker yang diuji secara in vitro (Youssef et al.2007). Sisi aktif dari analog kurkumin adalah gugus fenolik dan ikatan ganda terkonjugasi (Devasena et al.2002). Berdasarkan data hubungan struktur aktivitas menunjukan bahwa subtituen yang memiliki sifat penarik elektron di cincin benzena mempengaruhi sifat anti-inflamasi (Zhao et al.2010). Analog kurkumin menunjukan aktivitas biologis dan bioavilibilitas yang tinggi tanpa meningkatkan toksisitas (Liu et al.2012) dan menghambat pertumbuhan sel kanker paru-paru (Thomas et al.2010), kanker usus besar (Lin et al.2011), kanker pankreas (Nagaraju et al.2013) dan kanker ovarium (Rath et al.2013).
C
Claisen-Schmdt. Reaksi kondensasi juga dilakukan untuk proses sintesis senyawa turunan flavonoid menggunakan metode konvensional dengan katalis alkali yang aktif menghambat kanker payudara (Abu et al.2014).
Reaksi kondensasi aldol dapat dilakukan dengan menggunakan katalis basa
dengan syarat harus mempunyai atom Hα pada salah satu senyawa karbonil yang
digunakan sebagai reaktan. Mekanisme reaksi kondensasi aldol menggunakan katalis basa melibatkan pembentukan karbanion pada senyawa karbonil yang
mempunyai atom Hα dan kemudian terjadi adisi pada senyawa karbonil yang
Gambar 8 Mekanisme Reaksi kondensasi aldol (Carey et al.1990). Anion enolat dapat bertindak sebagai nukleofilik karbon, anion ini akan mengadisi secara reversibel pada gugus karbonil dari molekul aldehida atau keton lain dalam reaksi kondensasi aldol, yaitu reaksi pembentukan ikatan karbon-karbon (Morrison et al.1987). Ketika asetaldehid direaksikan dengan natrium hidroksida encer pada suhu ruang maka akan dihasilkan 3-hidroksibutanal berupa aldehida dan alkohol sehingga disebut aldol. Reaksinya terjadi dalam tiga tahap, yakni dimulai dengan basa (ion hidroksida) menghilangkan sebuah proton dari
karbon α pada sebuah molekul asetaldehid membentuk ion enolat. Ion enolat ini
tidak dapat mengisolasi produk aldol tetapi yang diperoleh turunan aldehid (Solomons 1990).
Aktivitas Sitotoksik Sel Kanker Payudara T47D
Kanker merupakan penyebab kematian paling umum kedua di dunia (do Amaral et al.2014) dan kanker payudara merupakan penyebab utama kematian pada wanita yang disebabkan metastasis dari kanker tersebut (DeMore et al. 2001). Morbiditas dan mortalitas dari kanker terus meningkat setiap tahun, sedangkan pengobatan kemoterapi kanker tetap mahal dan dikaitkan dengan banyak efek samping (Susidarti et al.2014). Kanker merupakan suatu penyakit sel yang ditandai dengan hilangnya fungsi kontrol sel terhadap regulasi daur sel maupun fungsi homeostatis sel pada organisme multiseluler. Dengan kegagalan tersebut, sel tidak dapat berproliferasi secara normal. Akibatnya, sel akan berproliferasi terus-menerus sehingga menimbulkan pertumbuhan jaringan yang abnormal.
Uji sitotoksik senyawa baru yang berpotensi sebagai antikanker melewati beberapa tahapan, baik itu uji praklinik maupun klinik. Uji farmakodinamika merupakan bagian dari uji praklinik untuk mengetahui apakah bahan obat menimbulkan efek farmakologi yang diharapkan atau tidak dan dapat dilakukan secara in vitro. Salah satu metode yang umum digunakan untuk menetapkan jumlah sel adalah metode MTT (Behbahani 2014). Prinsip dari metode MTT adalah terjadinya reduksi garam kuning tetrazolium MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid) oleh sistem reduktase. Suksinat tetrazolium yang termasuk dalam rantai respirasi dalam mitokondria sel-sel yang hidup membentuk kristal formazan berwarna ungu dan tidak larut air. Penambahan
reagen stopper (bersifat detergenik) akan melarutkan kristal berwarna ini yang
kemudian diukur absorbansinya menggunakan ELISA reader. Intensitas warna ungu yang terbentuk proporsional dengan jumlah sel hidup. Sehingga jika intensitas warna ungu semakin besar, maka jumlah sel hidup semakin banyak (Nugroho et al.2013).
Gambar 9 Sel kanker payudara T47D
Sel kanker payudara T47D (Gambar 9) merupakan continous cell line yang diisolasi dari jaringan tumor duktal payudara seorang wanita berusia 54 tahun.
Continous cell line sering dipakai dalam penelitian kanker secara in vitro karena
doxorubicin (Zampieri et al.2002). Metode MTT untuk sel T47D telah diujikan untuk senyawa sintesis baru maupun kombinasi dengan obat kanker doxorubicin (Anindyajati et al.2010; Nurrochmad et al.2013).
Response Surface Methodology, RSM
RSM merupakan metode gabungan teknik statistika dan matematika yang digunakan untuk mengoptimalkan variabel bebas (Lee et al.2013; Ho et al.2014). RSM terdiri dari penyesuaian model empiris untuk data yang diperoleh secara eksperimental (Amdoun et al.2010) dan merupakan teknik statistik yang efektif karena dapat mengoptimalkan prosedur yang kompleks dengan menyelidiki variabel dan interaksi dari variabel secara bersamaan (Zhao et al.2012; Wang et al.2013).
Penggunaan RSM telah banyak digunakan untuk mencari kondisi optimum untuk beberapa proses, baik itu proses ekstraksi bahan alam (Zou et al.2011; Wang et al.2014; Gomez et al.2014), proses biologi (Huo et al.2014), proses kimia (Ebshish et al.2014; Kalantari et al.2014) dan lingkungan (Dawood et al.2013). Teknik analisa respons surface yang perlu diperhatikan adalah bentuk persamaan, apakah fungsi berorde satu atau berorde dua. Fungsi berorde dua persamaan polinomial digunakan sebagai berikut :
∑ ∑ ∑
di mana berbagai nilai Xi adalah variabel bebas yang mempengaruhi respon Y.
Nilai β0, βi, βiidan βij adalah koefisien regresi (Vuong et al.2014).
Untuk fungsi berorde dua dengan tiga variabel bebas maka terdapat dua rancangan percobaan yang dapat digunakan yaitu central composite design (CCD) (Lai et al.2013) atau box-behnken design yang memerlukan unit percobaan yang lebih sedikit (Goldsmith et al.2014). Salah satu perbedaan box-behken design
dengan central composite design adalah pada box behnken tidak ada axial/star run
sehingga lebih efisien karena lebih sedikit unit percobaan (Amdoun et al.2010)
3
METODOLOGI
Kerangka Pemikiran
Piperonal
Tahap 4. Uji aktivitas sitotoksik produk metode in vitro terhadap biakan sel kanker payudara T47D
Produk yang paling aktif
Tahap 5. Optimasi proses sintesis Optimasi proses menggunakan metode RSM,
Rancangan percobaan Box-bahnken Design dengan 3 variabel bebas Model dan kondisi proses terbaik
Validasi Selesai
Gambar 10 Diagram alir tahapan penelitian Tahap 1. Sintesis piperonal dari minyak lawang
Minyak Lawang A. Isolasi safrol Safrol B. Isomerisasi
Piperonal C. Oksidasi Isosafrol
Tahap 2. Sintesis produk AKS Piperonal
Reaksi kondensasi 1 tahap
Metode Metode konvensional gelombang mikro
AKS-k AKS-m
Tahap 3. Sintesis produk AKAS Piperonal
Reaksi kondensasi 2 tahap
Metode Metode konvensional gelombang mikro
Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain: minyak lawang hasil destilasi uap kulit kayu tanaman lawang (Cinnamomum cullilawan Blume) di Maluku, silica gel biru, kalium hidroksida, natrium hidroksida, asetaldehid, asetofenon, aseton, metanol, dietil eter, petroleum eter, asam asetat glasial, asam sulfat, diklorometana, natrium sulfat anhidrat, kalium permanganat yang semuanya p.a (e.merck), polyoxyethylene sorbitan monooleate (Tween 80) (brataco), kertas saring whatman 42, indikator universal, aquades, PBS, MK (RPMI), DMSO, tetrazolium MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid), SDS, alumunium foil, HCl, sel T47D.
Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain alat refluks, pemanas listrik dilengkapi pengaduk magnet, termometer, pendingin bola, penangas es, evaporator Buchi, penyaring Buchner, electrothermal, spektrofotometer inframerah (FTIR, IR Prestige-21, Shimadzu), kromatografi gas spektrometri massa (GCMS, QP-2010 Plus, Shimadzu), kromatografi gas (GC, Shimadzu 2010), HPLC (Shimadzu), Kromatografi cair spektrofotometer massa (LC-ESI-MS, L6200, Hitachi), microwave oven LG 700 watt, mikropipet, 96-well
plate, vortex, ELISA reader (SLT 240 ATC) dan alat-alat gelas.
Prosedur Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dalam lima tahap. Penelitian tahap pertama bertujuan untuk memperoleh produk sintetik piperonal dari minyak lawang. Produk piperonal hasil tahap pertama tersebut digunakan untuk penelitian tahap kedua dan ketiga. Penelitian tahap kedua bertujuan untuk memperoleh produk AKS menggunakan metode gelombang mikro dan metode konvensional. Tahap ketiga bertujuan untuk memperoleh produk AKAS menggunakan metode gelombang mikro dan metode konvensional. Produk hasil tahap kedua dan ketiga digunakan untuk penelitian tahap keempat. Tahap keempat bertujuan untuk mengetahui aktivitas sitotoksik produk sintetik analog kurkumin menggunakan metode in vitro terhadap biakan sel kanker payudara T47D. Produk yang memiliki nilai sitotoksik (IC50) rendah dipilih untuk di optimasi prosesnya pada tahapan kelima. Tahap kelima bertujuan untuk mengoptimasi kondisi proses sintesis AKAS metode gelombang mikro menggunakan RSM serta menentukan model terbaik untuk memperoleh kondisi proses optimum.
Penelitian Tahap I : Sintesis piperonal sebagai prekursor antikanker dari minyak lawang
Karakterisasi bahan baku
menggunakan corong pisah. Minyak kemudian dianalisis kadar safrol dan eugenol menggunakan GCMS.
Proses isolasi safrol dari minyak lawang (Kapelle et al.2010)
Proses isolasi safrol dilakukan dengan cara mencampurkan 614,76 g (600 mL) minyak lawang, 240 g NaOH dan 1250 mL aquades dalam erlenmeyer ukuran 1 L. Campuran diaduk dengan kecepatan 2500 RPM selama 6 jam sampai terbentuk dua lapisan, kemudian lapisan atas dipisahkan. Lapisan bawah diekstraksi dua kali dengan 100 mL petroleum eter dan ditambahkan pada lapisan atas, selanjutnya dicuci dengan aquades hingga netral dan dikeringkan dengan Na2SO4 anhidrat. Petroleum eter dipisahkan menggunakan evaporator dan dilakukan destilasi dengan pengurangan tekanan. Kemurnian diuji dengan GC dan struktur ditentukan dengan 1H-NMR dan FTIR. Proses isolasi safrol dari minyak lawang dapat dilihat pada Gambar 11.
Gambar 11 Diagram alir proses isolasi safrol dari minyak lawang.
614,76 g Minyak lawang
ditambahkan 240 g NaOH dalam 1250 mL aquades. diaduk 2500 RPM 6 jam sampai terbentuk dua lapisan, dipisahkan
Lapisan atas
Lapisan atas dicuci dengan aquades hingga netral, dikeringkan dengan Na2SO4 anhidrat, disaring
Lapisan bawah diekstraksi 2x dengan 200 mL petroleum eter, pisahkan
Lapisan bawah
Dimurnikan dengan destilasi pengurangan tekanan pengurangan tekanan
Proses isomerisasi safrol (modifikasi Gimeno et al.2005)
Proses isomerisasi safrol menghasilkan isosafrol dilakukan dengan cara mencampurkan 71,56 g (0,44 mol) safrol dan 50 g (0,89 mol) KOH ke dalam labu leher tiga ukuran 500 mL yang telah dilengkapi dengan pengaduk magnet, termometer, pendingin bola dan tabung yang berisi gel biru. Campuran kemudian direfluks pada suhu 120º C dan diaduk pada kecepatan 750 RPM selama 6 jam. Hasil di dinginkan dan ditambahkan 250 mL aquades, kemudian diekstraksi dengan dietil eter. Hasil dikeringkan dengan Na2SO4 anhidrat dan dietil eter dipisahkan menggunakan evaporator. Produk dimurnikan menggunakan destilasi pengurangan tekanan. Kemurnian diuji dengan GC dan struktur ditentukan dengan FTIR dan 1H-NMR. Diagram alir proses isomerisasi safrol menjadi isosafrol dapat dilihat pada Gambar 12.
Gambar 12 Diagram alir proses isomerisasi safrol menjadi isosafrol.
Proses sintesis piperonal (modifikasi Kapelle et al.2010)
Proses sintesis piperonal dari isosafrol dilakukan dengan cara mencampurkan 14,85 g isosafrol (0,1 mol), 500 mL aquades, 10 mL asam asetat, 75 mL asam sulfat 50%, 0,5 g tween 80 dan 500 mL diklorometan ke dalam labu leher tiga ukuran 500 mL yang telah dilengkapi dengan pengaduk magnet, termometer, pendingin bola dan tabung yang berisi gel biru. Selanjutnya 48,95 g (0,31 mol) padatan KMnO4 ditambahkan sekitar 500 mg setiap menit dan diaduk pada kecepatan 750 RPM, suhu dipertahankan di bawah 30oC dengan menempatkan labu leher tiga dalam penangas es. Setelah KMnO4 ditambahkan, labu dipanaskan perlahan-lahan pada suhu 40oC sampai warna ungu KMnO4
Ditambahkan 50 g (0,89 mol) KOH, di refluks pada suhu 120oC, diaduk 750 RPM selama 6 jam
Ditambahkan 250 ml aquades, diekstraksi dengan dietil eter
Dikeringkan dengan Na2SO4 anhidrat
Diuapkan pelarut dan dimurnikan dengan destilasi 71,56 g Safrol
hilang (15 menit). Campuran kemudian di dinginkan selama beberapa menit sampai terbentuk endapan MnO2. Endapan MnO2 disaring menggunakan silica gel dengan ketebalan 10 cm pada penyaring Buchner, larutan hasil pemisahan kemudian dituangkan ke dalam corong pisah dan kedua lapisan dipisahkan. Lapisan air (lapisan atas) di ekstraksi dengan diklorometan (2 x 30 mL). Semua lapisan organik digabung, kemudian dicuci dengan 2 x 30 mL aquades. Lapisan organik dikeringkan dengan Na2SO4 anhidrat, disaring dan dievaporasi dengan evaporator. Ke dalam residu hasil evaporasi ditambahkan larutan NaOH 20% dan campuran diaduk dengan kecepatan 750 RPM selama 30 menit. Selanjutnya campuran diekstraksi dengan diklorometan, dicuci dengan aquades, dikeringkan dengan Na2SO4 anhidrat dan dievaporasi kembali. Rekristalisasi dilakukan dengan menggunakan pelarut metanol, hasil yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan GCMS dan 1H-NMR. Diagram alir sintesis piperonal dapat dilihat pada Gambar 13.
Gambar 13 Diagram alir proses sintesis piperonal dari isosafrol.
Ditambahkan 500 mL aquades, 10 mL asam asetat glacial, 75 mL asam sulfat 50%, 0,5 g tween 80 dan 500 mL diklorometan
Dimasukkan dalam penangas es suhu < 30 0C, aduk 750 RPM
Dipanaskan pada suhu 40oC sampai warna ungu KMnO4 hilang Ditambahkan 48,95 g (0,31 mol) padatan KMnO4
Saring endapan MnO2 menggunakan silica gel, pisahkan
Lapisan bawah (organik) Lapisan atas (air) diekstraksi 2x
dengan 30 mL diklorometan
Lapisan
air Lapisan organik dicuci dengan aquades hingga netral, dikeringkan dengan Na2SO4 anhidrat, disaring, diuapkan pelarut
Ditambahkan NaOH, diektraksi dengan diklorometan, dikeringkan, uapkan pelarut dan direkristalisasi dengan metanol
Dianalisis dengan menggunakan GCMS dan 1H-NMR
Penelitian Tahap II : Sintesis produk analog kurkumin simetris menggunakan metode gelombang mikro dan konvensional
Proses sintesis analog kurkumin simetris metode gelombang mikro
(modifikasi Elavarasan et al. 2013)
Sintesis dengan menggunakan metode gelombang mikro dilakukan dengan cara mencampurkan 45 g (0,3 mol)piperonal, 8,93 g (0,15 mol) aseton dan 30 mL metanol. Campuran diaduk dengan kecepatan 1000 RPM selama 1 menit dan ditambahkan 15 mL NaOH 10%. Campuran dimasukkan ke dalam oven microwave pada tingkat daya 140 watt dengan waktu pemanasan 2 menit. Hasil kemudian didinginkan, dicuci dengan metanol, disaring dan dianalisis menggunakan LCMS dan FTIR. Diagram alir proses sintesis analog kurkumin simetris menggunakan metode gelombang mikro dapat dilihat pada Gambar 14.
Gambar 14 Diagram alir proses sintesis analog kurkumin simetris menggunakan metode gelombang mikro.
Proses sintesis analog kurkumin simetris metode konvensional (modifikasi
Chen et al.2011)
Sintesis dengan menggunakan metode konvensional dilakukan dengan cara mencampurkan 45 g (0,3 mol) piperonal, 8,93 g (0,15 mol) aseton dan 30 mL metanol. Campuran diaduk dengan kecepatan 1000 RPM selama 1 menit dan ditambahkan 15 mL NaOH 10%. Campuran diaduk dengan kecepatan 1000 RPM selama 3 jam residu dicuci dengan metanol, disaring dan hasil yang diperoleh dianalisis menggunakan LCMS dan FTIR. Diagram alir proses sintesis analog kurkumin simetris menggunakan metode konvensional dapat dilihat pada Gambar 15.
Dicuci dengan metanol dan disaring
Dianalisis menggunakan LCMS dan FTIR
Ditambahkan 8,93 g (0,15 mol) aseton, 30 ml methanol, aduk selama 1 menit
Ditambahkan 15 ml NaOH 10%, dimasukkan dalam microwave pada 140 watt selama 2 menit
Gambar 15 Diagram alir proses sintesis analog kurkumin simetris menggunakan metode konvensional.
Penelitian Tahap III : Sintesis produk analog kurkumin simetris menggunakan metode gelombang mikro dan konvensional
Pembuatan produk intermediate (3-benzo[1,3]dioxol-5-yl-propenal)
(modifikasi Tran et al.2012)
Produk intermediate diperoleh dengan cara mencampurkan 16 g (0,4 mol) NaOH, 100 mL aquades dan 150 mL metanol. Campuran diaduk, selanjutnya 8,8 g (0,2 mol) asetaldehid dituangkan kedalam campuran. Sebanyak 30 g (0,2 mol) piperonal ditambahkan kedalam campuran dan diaduk dengan kecepatan 1000 RPM selama 3 jam Hasil kemudian didinginkan dan dimasukkan dalam lemari pendingin selama 12 jam. Padatan hasil disaring dengan penyaring Buchner dan dicuci dengan aquades sampai pH netral. Kristal yang terbentuk direkristalisasi dan dianalisis menggunakan GCMS. Diagram alir proses pembuatan produk
intermediate dapat dilihat pada Gambar 16.
Proses sintesis analog kurkumin tidak simetris metode konvensional
(modifikasi Tran et al.2012)
Sintesis dengan menggunakan metode konvensional dilakukan dengan cara mencampurkan 3,2 g (0,08 mol) NaOH, 20 mL aquades dan 30 mL metanol. Campuran diaduk, selanjutnya 4,8 g (0,04 mol) asetofenon dituangkan kedalam campuran dan segera diaduk. Sebanyak 7,04 g (0,04 mol) produk intermediate
dituangkan kedalam campuran dan diaduk dengan kecepatan 1000 RPM selama 3 jam. Hasil kemudian didinginkan dan dimasukkan dalam lemari pendingin selama 12 jam. Padatan hasil disaring dengan penyaring Buchner dan dicuci dengan aquades sampai pH netral. Kristal yang terbentuk direkristalisasi dan dianalisis menggunakan LCMS, HPLC dan FTIR. Diagram alir proses sintesis analog kurkumin tidak simetris menggunakan metode konvensional dapat dilihat pada Gambar 17.
Dicuci dengan metanol dan disaring
Dianalisis menggunakan LCMS dan FTIR
Ditambahkan 8,93 g (0,15 mol) aseton, 30 ml methanol, aduk selama 1 menit
Ditambahkan 15 ml NaOH 10%, diaduk dengan kecepatan 1000 RPM selama 3 jam
Gambar 16 Diagram alir proses pembuatan produk intermediate
Gambar 17 Diagram alir proses sintesis analog kurkumin simetris menggunakan metode konvensional.
Disaring, dicuci sampai pH netral
Direkristalisasi menggunakan metanol Ditambahkan 16 g (0,4 mol) NaOH, 100 mL air, 150 mL methanol dan 8,8 g (0,2 mol) asetaldehid
Diaduk dengan kecepatan 1000 RPM selama 3
jam, didinginkan selama 12 jam 30 g Piperonal
Dianalisis menggunakan GCMS
Disaring, dicuci sampai pH netral
Direkristalisasi menggunakan metanol Ditambahkan 3,2 g (0,08 mol) NaOH, 20 mL air,
30 mL metanol dan 4,8 g (0,04 mol) asetofenon
Diaduk dengan kecepatan 1000 RPM selama 3
jam, didinginkan selama 12 jam. 7,04 g intermediate
Proses sintesis analog kurkumin tidak simetris metode gelombang mikro
(modifikasi Azarifar et al.2003)
Sintesis dengan menggunakan metode gelombang mikro dilakukan dengan cara mencampurkan 3,2 g (0,08 mol) NaOH, 20 mL aquades dan 30 mL metanol. Campuran diaduk, selanjutnya 4,8 g (0,04 mol) asetofenon dituangkan kedalam campuran dan segera diaduk. Sebanyak 7,04 g (0,04 mol) produk intermediate
dituangkan kedalam campuran dan diaduk dengan kecepatan 1000 RPM selama 1 menit. Campuran dimasukkan ke dalam oven microwave pada tingkat daya 140 watt dengan waktu pemanasan 2 menit. Hasil kemudian didinginkan dan dimasukkan dalam lemari pendingin selama 12 jam. Padatan hasil disaring dengan penyaring Buchner dan dicuci dengan aquades sampai pH netral. Kristal yang terbentuk direkristalisasi dan dianalisis menggunakan LCMS, HPLC dan FTIR. Diagram alir proses sintesis analog kurkumin tidak simetris menggunakan metode gelombang mikro dapat dilihat pada Gambar 18.
Gambar 18 Diagram alir proses sintesis analog kurkumin tidak simetris menggunakan metode gelombang mikro.
Penelitian Tahap IV : Uji sitotoksisitas senyawa analog kurkumin
menggunakan metode in vitro terhadap biakan sel kanker payudara T47D
Uji Sitotoksik metode MTT (Susidarti et al.2014)
Untuk menentukan toksisitas sampel, sel dimasukkan ke dalam 96-well
plate dengan kepadatan 2x104sel/sumuran, masing-masing 100 μl sel dan diamati
keadaan sel di mikroskop. Sel diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam,
selanjutnya pada tiap sumuran ditambahkan 100 μl MK yang mengandung sampel
dengan variasi kadar (400; 100; 50; 25; 12,5 µg/ml) dan diinkubasi kembali
Disaring, dicuci sampai pH netral
Direkristalisasi menggunakan metanol Ditambahkan 3,2 g (0,08 mol) NaOH, 20 mL air,
30 mL metanol dan 4,8 g (0,04 mol) asetofenon
Dimasukkan dalam mikrowave daya 140 selama 2 menit, didinginkan selama 12 jam.
7,04 g intermediate
selama 48 jam. Pada akhir inkubasi, media kultur yang mengandung sampel
dibuang dan dicuci dengan 100 μl PBS. Kemudian ke dalam masing-masing
sumuran ditambahkan 100 μl media kultur yang mengandung 5 mg/ml garam tetrazolium MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid) dan diinkubasi kembali selama 4 jam pada suhu 37°C. Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk formazan yang berwarna ungu. Setelah 4 jam, pada tiap sumuran ditambahkan reagen stopper 100μL SDS 10% dalam HCl 0,1N untuk membunuh sel dan melarutkan kristal formazan. Plate dibungkus dengan alumunium foil kemudian diinkubasi pada suhu kamar dalam ruang gelap selama semalam. Selanjutnya, absorbansi tiap sumuran dibaca dengan ELISA reader
pada panjang gelombang 595 nm. Diagram alir tahapan uji sitotoksik metode MTT dapat dilihat pada Gambar 19.
Gambar 19 Diagram alir tahapan uji sitotoksik metode MTT
Sel kanker payudara T47D
Dimasukkan dalam microplate 96 lubang dengan jumlah sel 2 x 104 sel/mL dalam media RPMI
Dikultivasi dalam inkubator CO2 selama 24 jam
100 μl MK dengan konsentrasi 400; 200; 100; 50; 25; 12,5 µg/ml Dikocok dengan microplate mixer
dan disimpan kembali dalam inkubator CO2 selama 48 jam
Ditambahkan 100 μl media kultur yang mengandung 5 mg/ml garam tetrazolium MTT dan diinkubasi kembali selama 4 jam pada suhu 37°C.
Ditambahkan reagen stopper 100μL SDS 10% dalam HCl 0,1N untuk membunuh sel dan melarutkan kristal formazan.
Penelitian Tahap V : Optimasi proses sintesis analog kurkumin tidak simetris metode gelombang mikro menggunakan RSM
Optimasi proses
Penelitian menggunakan rancangan percobaan Box-Behnken Design, dengan nilai batas minimum dan maksimum untuk variabel bebas seperti Tabel 2. Variabel tetap pada tahapan proses reaksi kondensasi adalah konsentrasi NaOH 3,2 g (80 mmol), konsentrasi produk intermediate (3-benzo[1,3]dioxol-5-yl-propenal) 7,04 g (40 mmol), 20 mL aquades dan 30 mL metanol.
Tabel 2 Kisaran nilai variabel bebas
Faktor Nilai
Minimum Maksimum
Daya (watt), X1 140 420
Waktu (menit), X2 1 3
Konsentrasi prekursor (mmol), X3 20 60
Nilai batas minimum dan maksimum dimasukkan ke dalam program
Desing-Expert.7 RSM untuk diacak dan diperoleh 17 formula perlakuan yang akan
dilakukan seperti pada Tabel 3. Prosedur sintesis dilakukan sesuai dengan formula yang ada, hasil yang diperoleh didinginkan dan dimasukkan dalam lemari pendingin selama 12 jam. Padatan hasil disaring dengan penyaring Buchner dan dicuci dengan aquades sampai pH netral. Kristal yang terbentuk direkristalisasi dengan 50 mL metanol. Parameter yang dilihat adalah kemurnian dengan HPLC, titik leleh dan rendemen. Diagram alir optimasi proses sintesis analog kurkumin tidak simetris menggunakan metode gelombang mikro dapat dilihat pada Gambar 20.
Tabel 3 Rancangan percobaan optimasi
Gambar 20 Diagram alir optimasi proses sintesis analog kurkumin tidak simetris menggunakan metode gelombang mikro.
Parameter Pengamatan
Pengamatan pada tahap pertama, kedua dan ketiga dilihat dari sifat fisik-kimia, rendemen hasil, kemurnian berdasarkan data spektrum (GC, GCMS, HPLC, LCMS),
dan penentuan struktur berdasarkan data spektrum (FTIR, 1H-NMR). Tahap keempat
mengamati konsentrasi penghambatan pertumbuhan 50% sel kanker payudara T47D
menggunakan metode MTT. Tahap kelima mengamati yield hasil reaksi optimasi
proses berdasarkan data HPLC.
Analisis Data
Data yang diperoleh untuk tahap keempat dianalisis menggunakan software SPSS 18 menggunakan analisis probit. Data hasil tahap kelima menggunakan software Desing-Expert.7 dan analisis kearagaman (ANOVA) untuk melihat pengaruh perlakuan.
Disaring, dicuci sampai pH netral
Direkristalisasi menggunakan metanol Ditambahkan 3,2 g (0,08 mol) NaOH, 20 mL air,
30 mL metanol dan 4,8 g (0,04 mol) asetofenon
Dimasukkan dalam mikrowave daya (140-420 watt)
selama 1-3 menit, didinginkan selama 12 jam.
7,04 g intermediate
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian Tahap I : Sintesis piperonal sebagai prekursor antikanker dari minyak lawang
Hasil identifikasi minyak lawang (Gambar 21a) menggunakan GCMS (Lampiran 1) diperoleh data seperti Tabel 4 berikut ini.
Tabel 4 Data GCMS minyak lawang
No Waktu retensi Persentasi Nama senyawa
1 8,312 1,55 Sineol
2 11,514 1,79 4-terpineol
3 13,590 13,96 Safrol
4 14,736 67,53 Eugenol
5 15,339 12,61 Metil eugenol
(a) (b) (c) (d) Gambar 21 Produk a) Minyak lawang. b) Safrol. c) Isosafrol. d) Piperonal.
Produk mayor dalam proses isolasi menggunakan pereaksi basa NaOH adalah eugenol. Safrol merupakan hasil samping dari proses isolasi eugenol, namun masih mengandung komponen lain dalam campuran sehingga perlu dilakukan pemurnian. Safrol dapat dipisahkan dari campuran dengan menggunakan pereaksi basa NaOH, dimana eugenol dan komponen fenolik yang lain akan bereaksi dengan NaOH membentuk garam yang larut dalam air. Terbentuk dua lapisan yang dapat dipisahkan, lapisan safrol yang tidak larut dalam air berada pada bagian atas campuran. Jumlah mol pereaksi basa (NaOH) yang ditambahkan haruslah sebanding ataupun berlebih dengan jumlah mol eugenol yang terkandung dalam minyak. Safrol hasil pemisahan dengan ekstraksi basa dianalisis menggunakan GC diperoleh 7 produk campuran. Safrol pada puncak ketiga dengan waktu retensi 15,133 menit, kemurnian 80,082 % (Gambar 22) dan rendemen tanpa pemurnian 23,82% (Lampiran 2).
Gambar 22 Spektrum GC safrol hasil pemisahan dengan metode kimia Penurunan tekanan dari 760 mmHg menjadi 1 mmHg menghasilkan safrol pada suhu destilasi 90-123 oC dengan rendemen 17,21% (Lampiran 2). Safrol yang dihasilkan berbentuk cairan bening kekuningan, berbau harum, tidak larut dalam air tetapi larut dalam etanol, kloroform dan eter (Gambar 21b). Analisis safrol dengan menggunakan kromatografi gas diperoleh safrol dengan kemurnian 89,18% (Lampiran 3), sehingga terjadi kenaikan kemurnian sebesar 9,09% dari safrol hasil isolasi tanpa pemurnian.
Gambar 23 Rendemen hasil isolasi safrol dari minyak lawang
Rendemen safrol hasil isolasi dari minyak lawang berbeda dengan yang dilakukan Sastrohamidjojo (2004) dan Kapelle et al (2010), hal tersebut dikarenakan komponen senyawa kimia dalam minyak lawang yang digunakan berbeda (Gambar 23). Safrol dan komponen lain yang terdapat dalam minyak lawang merupakan senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan dari tanaman lawang yang terdapat pada bagian kulit pohon tanaman lawang (Cinnamomum
cullilawan Blume). Senyawa aromatik yang terdapat dalam minyak lawang
merupakan kelompok fenilpropanoid, yang terbentuk dari reaksi biosintesis yang dipengaruhi oleh faktor lingkungan dan genetik tanaman.
Analisis safrol dengan spektrofotometer FTIR (Lampiran 4) menunjukkan bahwa senyawa tersebut adalah safrol yaitu adanya rentangan C=C stretching aromatik pada daerah serapan 1608 cm-1. Juga adanya gugus C=C stretching
17,21%
21%
10,33%
0% 5% 10% 15% 20% 25%
Hasil Sastrohamidjojo, 2004
