PENAPISAN DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT DARI
TANAMAN BINAHONG DAN KETEPENG CINA PENGHASIL
SENYAWA ANTIBAKTERI PATOGEN
UKHRADIYA MAGHARANIQ SAFIRA PURWANTO
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Penapisan dan Identifikasi Bakteri Endofit dari Tanaman Binahong dan Ketepeng Cina Penghasil Senyawa Antibakteri Patogen adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Penelitian ini didanai menggunakan sumber dana DIPA LIPI atas nama Dr. Eng. Desriani, M.Si. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI).
ABSTRAK
UKHRADIYA MAGHARANIQ SAFIRA PURWANTO. Penapisan dan Identifikasi Bakteri Endofit dari Tanaman Binahong dan Ketepeng Cina Penghasil Senyawa Antibakteri Patogen. Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan DESRIANI.
Bakteri endofit merupakan mikroorganisme menguntungkan yang berinteraksi dengan tanaman inang tanpa menyebabkan gangguan atau kerusakan pada tanaman. Beberapa studi menunjukkan bahwa bakteri endofit tertentu dapat memproduksi senyawa kimia yang memiliki efek kesehatan bagi manusia, terutama bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman obat. Penelitian ini bertujuan mengisolasi bakteri endofit dari tanaman binahong dan ketepeng cina yang menghasilkan senyawa antibakteri penyebab penyakit infeksi sekaligus mengidentifikasi isolat potensial dengan marka 16S rRNA. Isolat bakteri endofit dari binahong dan ketepeng cina diuji terhadap 5 jenis bakteri patogen manusia, yaitu Escherichia coli dH5α, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, dan Enterobacter sakazakii. Isolat bakteri endofit dari tanaman binahong dengan kode BB5 dan BB14 menunjukkan kemampuan penghambatan terhadap kelima jenis bakteri tersebut (ditunjukkan dengan terbentuknya zona hambat). Identifikasi berdasarkan gen 16S rRNA menunjukkan bahwa kedua isolat tersebut kemungkinan adalah Pseudomonas sp. KR 1.13.
Kata kunci : antibakteri, bakteri endofit, binahong, ketepeng cina, 16S rRNA
ABSTRACT
UKHRADIYA MAGHARANIQ SAFIRA PURWANTO. Screening and Identification of Endophytic Bacteria from Binahong and Ketepeng Cina that Produced Antibacterial Pathogen Compound . Supervised by MARIA BINTANG and DESRIANI.
Endophytic bacteria is a beneficial microorganism that interacts with plant without causing any harm to the host. Most studies showed that certain endophytic bacteria can produce chemical compound which have medical effect for human, especially endophytic bacteria from medicinal plant. The objective of this research are to isolation endophytic bacteria from binahong and ketepeng cina that produce antibacterial compound and to identify the potencial isolate through 16S rRNA gene. Endophytic bacteria from both plants was tested to 5 human pathogenic bacteria, that are Escherichia coli dH5α, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, and Enterobacter sakazakii. Endophytic bacteria isolate from binahong code BB5 and BB14 have ability to inhibit 5 pathogenic bacteria growth (showed by inhibition zone). Identification based on 16S rRNA gene showed that both isolates possibly are Pseudomonas sp. KR 1.13. Keywords : antibacterial, endophytic bacteria, binahong, ketepeng cina, 16S
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
PENAPISAN DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT DARI
TANAMAN BINAHONG DAN KETEPENG CINA PENGHASIL
SENYAWA ANTIBAKTERI PATOGEN
UKHRADIYA MAGHARANIQ SAFIRA PURWANTO
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Skripsi : Penapisan dan Identifikasi Bakteri Endofit dari Tanaman Binahong dan Ketepeng Cina Penghasil Senyawa Antibakteri Patogen Nama : Ukhradiya Magharaniq Safira Purwanto
NIM : G84090078
Disetujui oleh
Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S. DR. Eng. Desriani, M.S.
Pembimbing I Pembimbing II
Diketahui
Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc Ketua Departemen
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Februari 2013 ini ialah bakteri endofit, dengan judul Penapisan dan Identifikasi Bakteri Endofit dari Tanaman Binahong dan Ketepeng Cina Penghasil Senyawa Antibakteri Patogen.
Melalui karya ilmiah ini penulis menyampaikan terima kasih kepada Prof. Dr. drh. Maria Bintang, MS dan DR. Eng. Desriani, MS selaku pembimbing atas arahan dan bimbingan dalam penyusunan tulisan ini. Penulis juga menyampaikan terima kasih untuk Ayah, Ibu, Endah, Staf Laboratorium Rekayasa Protein untuk Aplikasi Kesehatan Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI (Pak Rivai, Mba Neneng, Mba Wiwit, Mba Lita) serta rekan-rekan Biokimia 46 atas dukungan dan doa yang diberikan.
Penulis menyadari masih terdapat banyak kekurangan dalam karya ilmiah ini. Karena itu, kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi praktisi, akademisi, dan masyarakat luas.
Bogor, Agustus 2013
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR vi
DAFTAR LAMPIRAN vi
PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Rumusan Masalah 2
Tujuan Penelitian 2
Manfaat Penelitian 2
Ruang Lingkup Penelitian 2
METODE 3
Bahan 3
Alat 3
Prosedur Penelitian 3
HASIL DAN PEMBAHASAN 5
Hasil 5
Pembahasan 8
SIMPULAN DAN SARAN 10
Simpulan 10
Saran 10
DAFTAR PUSTAKA 10
LAMPIRAN 14
DAFTAR GAMBAR
1 Beberapa isolat bakteri endofit dari binahong (kiri) dan ketepeng cina (kanan) 5 2 Persentase isolat bakteri endofit dari tanaman binahong (a) dan
ketepeng cina (b) 6
3 Hasil uji antibakteri isolat bakteri endofit (kode BB 14) dari binahong
terhadap Staphylococcus aureus 6
4 Elektroforegram hasil ekstraksi DNA genom isolat BB5 dan BB14 7 5 Elektroforegram produk PCR isolat BB5 dan BB14 dengan primer 63F
dan 1387R 7
DAFTAR LAMPIRAN
1 Morfologi koloni isolat bakteri endofit dari tanaman binahong dan
interaksinya dengan bakteri patogen 14
2 Morfologi koloni isolat bakteri endofit dari tanaman ketepeng cina dan
interaksinya dengan bakteri patogen 15
3 Sekuens gen 16S rRNA isolat bakteri endoft BB5 dan BB14 hasil
amplifikasi dengan primer 63F dan 1387R 16
4 Hasil analisis homologi sekuens gen 16S rRNA isolat bakteri endofit
BB5 dan BB14 dengan program BLAST 17
5 Hasil pensejajaran sekuens gen 16S rRNA isolat bakteri endofit BB5
dan Pseudomonas sp. KR1.13 dengan program BLAST 18
6 Hasil pensejajaran sekuens gen 16S rRNA isolat bakteri endofit BB14
dan Pseudomonas sp. KR1.13 dengan program BLAST 19
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Bakteri endofit adalah bakteri yang hidup di dalam jaringan tanaman inang tanpa menyebabkan gejala-gejala penyakit (Bhore dan Sathisha 2010). Bakteri endofit masuk ke dalam jaringan tanaman umumnya melalui akar, namun bagian tanaman yang terpapar udara langsung seperti bunga, batang dan kotiledon, juga dapat menjadi jalur masuk bakteri endofit. Bakteri endofit yang telah masuk ke dalam tanaman dapat tumbuh hanya di satu titik tertentu atau menyebar ke seluruh tanaman. Mikroorganisme ini dapat hidup di dalam pembuluh vaskular atau di ruang intersel (Zinniel et al. 2002). Bakteri endofit pada satu tanaman inang umumnya terdiri atas beberapa genus dan spesies (Bhore dan Sathisha 2010).
Kajian mengenai manfaat bakteri endofit telah meluas ke bidang kesehatan manusia, yaitu dengan banyak ditemukannya bakteri endofit yang mampu menghasilkan senyawa berkhasiat sebagai obat. Salah satu sumber obat-obatan bagi manusia adalah tanaman obat (medicinal plants). Tanaman obat menghasilkan metabolit sekunder tertentu yang memiliki sifat sebagai zat penyembuh. Produksi metabolit sekunder tersebut diduga akibat adanya interaksi antara tanaman inang dan bakteri endofit. Bakteri endofit dari tanaman obat diketahui memiliki aktivitas sebagai antifungi (Jalgaonwala et al. 2010), antibiotik spektrum luas (Kumala dan Siswanto 2007), antikanker (Strobel et al. 2005), penghasil inhibitor alpha-glukosidase (Pujiyanto dan Ferniah 2010) dan penghasil senyawa antihiperlipidemia (Wirawan 2009).
Kemampuan bakteri endofit dalam menghasilkan metabolit sekunder yang serupa dengan tanaman inangnya merupakan keuntungan tersendiri. Kentungan tersebut dapat dilihat dari segi waktu dan biaya, mengingat diperlukan waktu yang lama dan biomassa tanaman yang tidak sedikit untuk menghasilkan satu jenis metabolit sekunder. Padahal, dengan adanya bakteri endofit yang potensial tersebut diharapkan produksi metabolit sekunder dapat berjalan dengan maksimal. Tanaman obat yang diketahui memiliki potensi di bidang kesehatan adalah binahong dan ketepeng cina.
Daun binahong (Anredera cordifolia Ten. Sternis) memiliki khasiat sebagai antihiperlipidemia, antipiretik, analgesik, antiinflamasi (Abou-Zeid et al 2007), antijamur, yaitu terhadap Candida albicans (Rochani 2009) dan sebagai hepatoprotektor dan antioksidan pada tikus putih induksi CCl4 (Orbayinah dan Kartyanto 2008). Selain daunnya, rizoma binahong juga memiliki kandungan alkaloid, saponin, flavonoid, dan polifenol, serta memiliki aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli (Setiaji 2009). Ketepeng cina (Cassia alata Lin.) diketahui memiliki efek imunomodulator terhadap aktivitas dan kapasitas fagositosis makrofag pada tikus yang diinjeksi S. aureus (Kusmardi dkk 2007). Ekstrak daun dan akar ketepeng cina mampu menghambat
pertumbuhan Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus dan Proteus
mirabilis secara in vitro (El-Mahmood dan Doughari 2008). Ekstrak kasar kulit kayu ketepeng cina berperan sebagai antifungi terhadap Trichophyton,
Microsporum dan Epidemophyton, yaitu fungi penyebab infeksi kulit (Sule et al
2
Penyakit infeksi pada manusia disebabkan oleh beberapa bakteri patogen, diantaranya Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, dan Enterobacter sakazakii. E. coli dapat menyebabkan diare yang ringan sampai sedang, bahkan dapat berakibat fatal (Veling et al 2002). P. aeruginosa dapat menyebabkan infeksi dan inflamasi pada mata akibat penggunaan lensa kontak yang tidak higienis (Willcox 2007). S.aureus dapat menyebabkan infeksi endokarditis (Nadji et al 2005) dan infeksi pada saluran pernafasan (Safdar dan Bradley 2008). Infeksi saluran pernafasan juga dapat disebabkan oleh B. cereus. Selain itu, B. cereus juga menyebabkan infeksi saluran pencernaan, terutama di usus halus (Bottone 2010). E. sakazakii merupakan patogen yang umumnya menyerang bayi baru lahir dan janin serta dapat menyebabkan meningitis dan bakterimia (Mittal et al 2009).
Penanganan penyakit infeksi dengan antibiotik sintetik belakangan ini menjadi sorotan terutama dikaitkan dengan munculnya sifat resistensi bakteri patogen dan dampaknya bagi tubuh dan lingkungan. Sebagai contoh, ditemukan adanya strain Staphylococcus aureus yang resisten terhadap methicillin sehingga menyulitkan pengobatan pasien yang terinfeksi bakteri tersebut (Ruhe et al 2005). Resistensi Bacillus cereus terhadap erythromycin, tetracycline, dan carbapenem telah dilaporkan oleh Kiyomizu et al (2008) dan Savini et al (2009). Melalui penelitian ini diharapkan dapat diperoleh informasi potensi bakteri endofit hasil isolasi dari tanaman binahong dan ketepeng cina sebagai agen antibakteri khususnya terkait bakteri penyebab penyakit infeksi.
Rumusan Masalah
Tanaman binahong dan ketepeng cina merupakan tanaman yang digunakan sebagai tanaman obat di Indonesia. Sejauh ini belum ditemukan laporan potensi metabolit bakteri endofit sebagai agen antibakteri dari kedua tanaman tersebut. Dengan munculnya permasalahan resistensi bakteri penyebab infeksi terhadap antibiotika yang beredar di pasaran, penelusuran dan pencarian antibakteri baru menjadi penting dilakukan.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mengisolasi bakteri endofit dari tanaman binahong dan ketepeng cina yang menghasilkan senyawa antibakteri penyebab penyakit infeksi sekaligus mengidentifikasi isolat potensial dengan marka 16S rRNA.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah di bidang kimia, farmasi, dan kesehatan mengenai potensi bakteri endofit dari tanaman binahong dan ketepeng cina dalam menghasilkan senyawa antibakteri patogen.
Ruang Lingkup Penelitian
3
METODE
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah tanaman binahong dan ketepeng cina yang tumbuh liar dalam kondisi segar, isolat murni bakteri patogen (Escherichia coli dH5α, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, dan Enterobacter sakazakii), media NA, larutan Nistatin 100 mg/L, alkohol teknis, larutan Chlorox 5.25%, akuades, media LB (tripton, yeast exract, NaCl, dan agar), H2O steril, kit ekstraksi DNA genom (Genomic DNA Mini Kit Invitrogen, PureLinkTM. Cat number K1820, Lot number 753279), primer 63F: 5’CAGGCCTAACACATGCAAGTC3’ dan primer 1387R: 5’GGGCGGCGTGT ACAAGGC3’ (10 pmol/µL), DNA template, RNase pure water, Superscript III RT Platinum Taq mix (invitrogen), 2x reaction mix (invitrogen), serbuk agarose dan 1x buffer TAE.
Alat
Alat-alat yang digunakan antara lain cawan Petri steril, magnetic stirrer, laminar air flow, vorteks, inkubator shaker, mesin sentrifus (Hitachi), mesin Polymerase Chain Reaction (PCR), pipet mikro, seperangkat alat elektroforesis (Bio-Rad, USA) dan UV transluminator.
Prosedur Penelitian
Penapisan Bakteri Endofit
Isolasi bakteri endofit (Modifikasi Simarmata et al 2007). Tanaman obat yang akan digunakan sebagai sumber endofit merupakan tanaman obat yang sehat dan telah cukup matang secara fisiologis. Bagian tanaman yang digunakan adalah akar (ujung bawah, tengah, atas), batang (ujung, tengah, bawah), daun (bawah, tengah, pucuk), umbi akar dan umbi batang (untuk binahong). Sampel tanaman dalam keadaan segar dibersihkan dengan air mengalir kemudian dipotong-potong sepanjang 2-5 cm dan dipisahkan menurut bagian tanamannya. Potongan sampel tersebut direndam dalam alkohol teknis selama 1 menit, larutan Chlorox 5.25% selama 5 menit, dan alkohol teknis selama 2 menit. Potongan sampel dipotong-potong dan dicacah kemudian ditanam dalam media NA yang mengandung nistatin. Media yang sudah mengandung sampel tersebut diinkubasi pada suhu ruang dalam keadaan gelap dan diamati setiap hari sampai ada pertumbuhan koloni. Bakteri endofit yang tumbuh dimurnikan satu per satu dan dikultivasi dalam agar miring serta dikarakterisasi dari segi morfologi koloninya. Setiap koloni bakteri endofit diberi kode sesuai dengan bagian tanaman darimana bakteri tersebut diperoleh (Lampiran 1 dan 2).
4
Penapisan isolat bakteri endofit melalui uji aktivitas antibakteri metode cawan tuang (Modifikasi Simarmata et al 2007). Uji kualitatif aktivitas antibakteri metode cawan tuang dilakukan secara aseptik. Satu ose bakteri patogen yang berasal dari stok agar miring diambil kemudian ditumbuhkan di dalam 5 mL media LB cair steril. Selanjutnya dikocok dalam inkubator dengan suhu 37°C selama 24 jam. Sebanyak 2.5 mL kultur bakteri patogen yang berasal dari media LB cair dimasukkan ke dalam 50 mL media LB padat yang bersuhu 35-40°C kemudian dituang ke dalam cawan Petri sebanyak ±10 mL lalu didinginkan. Isolat bakteri endofit yang akan diuji diletakkan ke media yang telah mengandung bakteri patogen menggunakan ose. Kultur diinkubasi selama 1–2 hari. Isolat endofit dinyatakan berpotensi menghasilkan agen antibakteri dilihat dari kemampuannya menghasilkan zona hambat bakteri patogen.
Ekstraksi DNA Genom dari Isolat Bakteri Endofit Potensial
Penyiapan kultur bakteri. Sebanyak satu ose koloni bakteri endofit potensial, yaitu isolat Batang Binahong (BB) 5 dan 14, dipindahkan ke dalam 5 mL LB cair steril kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C di dalam shaker inkubator. Kultur cair yang telah berumur 24 jam disentrifuse dengan kecepatan 10 000 rpm selama 10 menit dan diambil peletnya.
Pemecahan sel bakteri. Pelet hasil sentrifugasi ditambahkan 180 µL larutan lisozim kemudian divorteks, lalu diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Setelah itu, ditambahkan 20 µL Proteinase K dan divorteks. Kemudian ditambahkan lagi dengan 200 µL PureLink™ Genomic Lysis/Binding Buffer, divorteks, lalu diinkubasi pada suhu 55°C selama 30 menit. Sebanyak 200 µL etanol 96-100% ditambahkan ke dalam lisat dan divorteks sampai homogen.
Pemurnian DNA genom. Sebanyak 640 µL lisat dipindahkan ke dalam PureLink™ Spin Column lalu disentrifuse dengan kecepatan 12 000 rpm selama 3 menit pada suhu ruang. Spin column dipindahkan ke PureLink™ Collection Tube, lalu ditambahkan 500 µL Wash Buffer 1 (yang sudah ditambah etanol). Kemudian disentrifuse dengan kecepatan 12 000 rpm selama 1 menit pada suhu ruang. Spin column dipindahkan ke PureLink™ Collection Tube yang baru, lalu ditambahkan 500 µL Wash Buffer 2 (yang sudah ditambah etanol). Kemudian disentrifuse dengan kecepatan 12 000 rpm selama 3 menit pada suhu ruang. Spin column ditempatkan ke tabung mikrosentrifuse 1.5 mL, lalu ditambahkan 25-200 µL PureLink™ Genomic Elution Buffer (sesuai kebutuhan) dan diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Spin column disentrifuse selama 1 menit pada kecepatan 12 000 rpm, kemudian ditambahkan 50 µL RNase pure water. Larutan berisi DNA tersebut disimpan pada suhu -4°C.
Identifikasi Isolat Bakteri Endofit Potensial dengan Marka 16S rRNA
7
Ekstraksi DNA Genom dan Identifikasi Isolat Bakteri Endofit Potensial dengan Marka 16S rRNA
Genom total dari isolat BB5 dan BB14 telah diekstraksi dan dielektroforesis (Gambar 4). Pita yang terlihat merupakan pita tunggal yang berada di bagian atas dari pita marker berukuran 10000 pb. Hal ini mengindikasikan bahwa ekstraksi genom total dari kedua isolat telah berhasil dilakukan. Selanjutnya genom total dari masing-masing bakteri digunakan sebagai cetakan untuk isolasi gen 16S rRNA dengan teknik PCR. Hasil PCR menunjukkan dihasilkan satu pita tunggal dengan ukuran sekitar 1400 pb (Gambar 5) yang kemungkinan adalah pita gen 16S rRNA.
Gambar 4 Elektroforegram hasil ekstraksi DNA genom isolat BB5 dan BB14
Gambar 5 Elektroforegram produk PCR isolat BB5 dan BB14 dengan primer 63F dan 1387R
Hasil sekuensing gen 16S rRNA tersebut ternyata menunjukkan jumlah basa untuk isolat BB5 dan BB14 masing-masing sebanyak 1179 basa dan 1134 basa (Lampiran 3). Hasil ini dapat dikatakan kurang sesuai dengan yang diharapkan. Analisis hasil sekuensing dengan program BLASTN (NCBI)
BB14 BB5
10000 pb 6000 pb
1500 pb
1000 pb 10000 pb
6000 pb BB14 BB5 marker
marker
8
menunjukkan bahwa isolat BB5 dan BB14 memiliki kemiripan 99% dengan Pseudomonas sp. KR 1.13 berdasarkan sekuens 16S rRNA.
Pembahasan
Isolasi dan Pemurnian Bakteri Endofit
Morfologi isolat dari tanaman binahong dan ketepeng cina masing-masing memiliki kekhasan terutama dari warna dan bentuk. Isolat bakteri endofit dari tanaman ketepeng cina memiliki karakteristik morfologi yang lebih beragam dibandingkan isolat dari tanaman binahong. Keberagaman isolat tersebut mengindikasikan keragaman bakteri endofit di dalam tanaman (Bhore dan Sathisha 2010). Bakteri endofit dari kedua tanaman tersebut paling banyak diperoleh dari bagian akar dan batang. Akar merupakan bagian tanaman yang umumnya menjadi jalur masuk bakteri endofit ke dalam jaringan tanaman selain bunga, batang dan kotiledon (Zinniel et al. 2002). Setelah masuk ke dalam tanaman, bakteri endofit dapat tumbuh hanya di satu titik tertentu atau menyebar ke seluruh tanaman melalui batang.
Jumlah bakteri endofit di dalam tanaman tidak dapat ditentukan secara pasti, namun bakteri ini dapat dideteksi dengan mengisolasi pada media agar (Bacon dan Hinton 2006). Media agar yang digunakan adalah media kaya, yaitu NA dan LB. Secara komposisi, kedua media tersebut serupa hanya dibedakan oleh jenis sumber nitrogennya. NA umumnya mengandung pepton, sedangkan LB umumnya mengandung tripton. Kedua media tesebut menunjukkan hasil yang baik untuk mengisolasi bakteri endofit dari binahong dan ketepeng cina. Untuk mengoptimalkan hasil isolasi, media ditambahkan dengan nistatin yang merupakan senyawa antifungi (Kumala dan Siswanto 2007). Penambahan nistatin tersebut terbukti mampu mengurangi laju pertumbuhan fungi.
Pertumbuhan bakteri endofit dari tanaman binahong dan ketepeng cina di dalam media agar umumnya mulai terlihat pada hari ke-2 masa inkubasi. Hal ini sesuai dengan Arunachalam dan Gayathri (2010), Simarmata (2007), Jalgaonwala et al (2010) dan Zinniel et al (2002) yang menyatakan bahwa waktu pemilihan inkubasi selama minimal 2 hari bertujuan untuk memastikan bahwa bakteri yang tumbuh merupakan bakteri endofit, bukan bakteri yang hidup di permukaan tanaman (filosfer) atau kontaminan. Proses isolasi dilakukan sampai diperoleh isolat bakteri endofit murni yang ditandai dengan mofologi koloni (warna, bentuk, elevasi) yang sama.
Penapisan isolat bakteri endofit melalui uji aktivitas antibakteri
9 2004), Streptomyces griseus dari tanaman Kandelia candel menghasilkan asam p-aminoasetofenonik sebagai antimikroba (Guan et al. 2005 dalam Ryan et al. 2008), Streptomyces NRRL 30562 dari tanaman Kennedia nigriscans menghasilkan munumbicin (antibiotik) dan munumbicin D (antimalaria) (Castillo et al. 2002 dalam Ryan et al. 2008).
Kemampuan isolat BB5 dan BB14 dalam menghambat 5 jenis bakteri uji (2 bakteri merupakan Gram positif dan 3 bakteri merupakan Gram negatif) mengindikasikan kemungkinan senyawa antibakteri yang dihasilkan dapat menjadi kandidat antibakteri berspektrum luas. Umumnya, bakteri endofit dari suatu tanaman mampu menghasilkan senyawa yang ada di dalam tanaman tersebut (Zinniel et al 2002). Kemungkinan isolat BB5 dan BB14 juga menghasilkan salah satu senyawa yang ada di dalam tanaman binahong. Hal ini diperkuat oleh Yu et al (2010) yang menyatakan bahwa terdapat beberapa senyawa antimikroba yang dihasilkan oleh endofit antara lain senyawa aromatik, flavonoid, alkaloid, peptida, fenol, kuinon, steroid, dan terpenoid.
Namun, kemungkinan lain seperti adanya quorum sensing juga bisa saja terjadi. Quorum sensing merupakan sistem pengaturan yang memungkinkan organisme untuk merespon sinyal-sinyal yang datang dari lingkungannya. Beberapa bakteri memiliki jalur pengaturan yang dikontrol oleh respon terhadap densitas sel dalam populasi bakteri itu sendiri (Madigan et al 2000). Zona hambat yang terbentuk berdasarkan uji antibakteri kemungkinan juga merupakan hasil adanya quorum sensing. Oleh sebab itu, hal ini masih perlu diteliti lebih lanjut.
Ekstraksi DNA Genom dan Identifikasi Isolat Bakteri Endofit Potensial dengan Marka 16S rRNA
Hasil ekstraksi DNA genom isolat BB 5 dan BB 14 menunjukkan satu pita dengan ukuran di atas 10000 pb. Hasil tersebut mengindikasikan bahwa keseluruhan genom telah terekstrak dan tidak adanya kontaminan dari bakteri lain. Ukuran pita lebih dari 10000 pb menunjukkan bahwa genom tersebut adalah genom bakteri karena umumnya genom total dari bakteri berukuran lebih besar dari 10000 pb (Madigan et al 2000). Genom total bakteri umumnya terdiri dari DNA inti, DNA mitokondria dan plasmid. Namun, pada penelitian ini genom tersebut tidak dipisahkan berdasarkan jenisnya karena akan dijadikan cetakan untuk PCR menggunakan primer yang spesifik.
Hasil PCR gen 16S rRNA dari isolat BB 5 dan BB 14 yang dilihat dengan elektroforesis menunjukkan satu pita dengan ukuran cukup tebal. Hal ini mengindikasikan konsentrasi DNA cetakan yang digunakan cukup dan banyaknya siklus yang digunakan, yaitu 35 siklus, dapat mengamplifikasi fragmen DNA dengan baik. Namun, terdapat ketidaksesuaian antara panjang amplikon gen 16S rRNA dengan primer yang digunakan. Kode 63 dan 1387 pada primer menunjukkan posisi basa berdasarkan sekuens gen E. coli (Wang dan Qian 2009). Jika primer tersebut digunakan pada PCR, panjang amplikon hasil PCR seharusnya berjumlah 1324 pb (diperoleh dari pengurangan 1387 terhadap 63). Namun, berdasarkan hasil sekuensing, isolat BB 5 dan BB 14 menunjukkan jumlah basa yang berbeda dengan panjang amplikon yang diharapkan, yaitu 1179 dan 1134 pb.
10
dengan spesifik pada gen 16S rRNA. Kemungkinan primer justru menempel di bagian lain gen atau justru menempel di gen lain selain 16S rRNA. Jika hal ini terjadi, kemungkinan gen lain yang teramplifikasi. Umumnya, suhu annealing yang digunakan pada proses amplifikasi gen dari bakteri endofit adalah 50°C-60°C, tergantung primer yang digunakan (Zinniel et al 2002; Wang et al 2010; Yogiara et al 2012). Kedua, suhu saat fase pemanjangan, yaitu 68°C, kurang optimum untuk kerja enzim Taq polymerase sehingga proses sintesis amplikon kurang maksimal yang menyebabkan ada beberapa bagian dari gen yang tidak teramplifikasi.
Hasil analisis sekuens isolat BB 5 dan BB 14 dengan program BLASTN memang menunjukkan bahwa kedua isolat memiliki kemiripan 99% dengan Pseudomonas sp. KR 1.13. Namun, berdasarkan hasil perbandingan panjang amplikon seperti yang disebutkan sebelumnya, belum dapat dikatakan dengan pasti bahwa kedua isolat tersebut adalah Pseudomonas sp. KR 1.13. Selain itu, pada proses sekuensing, primer yang digunakan hanya primer 63F sehingga hasil sekuensing tidak dapat dipercaya sepenuhnya. Umumnya, dalam proses sekuensing, kedua primer, yaitu primer forward dan reverse, digunakan sehingga hasil sekuensing bisa dikonfirmasi dengan kedua primer tersebut, yaitu dengan menentukan fragmen yang saling overlapping (tumpang tindih).
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Isolasi bakteri endofit dari tanaman binahong dan ketepeng cina telah berhasil dilakukan dengan total isolat bakteri endofit berjumlah 73 isolat yang sebagian besar berasal dari bagian batang tanaman. Berdasarkan uji antibakteri, diperoleh dua isolat bakteri endofit potensial yaitu BB5 dan BB14. Identifikasi berdasarkan gen 16S rRNA menunjukkan bahwa kedua isolat tersebut kemungkinan adalah Pseudomonas sp. KR 1.13.
Saran
Perlu dilakukan isolasi dan identifikasi lebih lanjut untuk mengetahui jenis senyawa yang dihasilkan oleh isolat BB5 dan BB14 terkait kemampuannya membentuk zona hambat. Selain itu, perlu dilakukan optimasi kondisi PCR untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA, serta perlunya menggunakan kedua primer (forward dan reverse) dalam proses sekuensing agar hasil identifikasi lebih dapat dipercaya.
DAFTAR PUSTAKA
Abou-Zeid AHS, Soliman FM, Sleem A, Mitry MNR. 2007. Phytochemical and bioactivity investigations of the aerial parts of Anredera cordifolia (Ten.) Steenis. Bulletin of the National Research Centre Cairo 32 (1) : 31-33.
11 antimicrobial activity and antibiotic susceptibility pattern. Int J of Curr Pharm. Res. 2 (4) : 63-68.
Bacon CW, Hinton DM. 2006. Bacterial endophytes : the endophytic niche, its occupants, and its utility. Di dalam : Gnanamanickam SS, editor. Plant-Associated Bacteria. Netherland : Springer.
Bhore SJ, Sathisha G. 2010. Screening of endophytic colonizing bacteria for cytokinin-like compounds: crude cell-free broth of endophytic colonizing bacteria is unsuitable in cucumber cotyledon bioassay. World J. Agric. Sci. 6 (4): 345-352.
Bottone EJ. 2010. Bacillus cereus, a volatile human pathogen. Clin. Microbiol. Rev. 23(2):382-398.
Cornelis P. 2008. Pseudomonas Genomics and Molecular Biology. Norfolk : Caister Academic Press.
El-Mahmood AM, Doughari JH. 2008. Phytochemical screening and antibacterial evaluation of the leaf and root extracts of Cassia alata Linn. Afr. J. of. Pharm. and Pharmacol. 2 (7) : 124-129.
Jalgaonwala RE, Mohite BV, Mahajan RT. 2010. Evaluation of endophytes for their antimicrobial activity from indigenous medicinal plants belonging to north maharashtra region india . Int. J. on Pharm and Biomed Res. 1 (5) : 136-141.
Kiyomizu K, Yagi T, Yoshida H, Minami R, Tanimura A, Karasuno T, Hiraoka A. 2008. Fuliminant septicemia of Bacillus cereus resistant to carbapenem in a patient with biphenotypic acute leukemia. J. Infect. Chemother. 14: 361–367. Kumala S, Siswanto EB. 2007. Isolation and screening of endophytic microbes
from Morinda citrifolia and their ability to produce anti-microbial Substances. Microbiology Indonesia 1 (3) : 145-148.
Kusmardi, Kumala S, Triana EE. 2007. Efek imunomodulator ekstrak daun ketepeng cina (Cassia alata L.) terhadap aktivitas dan kapasitas fagositosis makrofag. MAKARA 11 (2) : 50-53.
Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biology of Microorganisms Ninth Edition. New Jersey : Prentice-Hall Inc.
Miller CM, Miller RV, Garton-Kenny D, Redgrave B, Sears J, Condron MM, Teplow DB, Strobel GA. 1998. Ecomycins, unique antimycotics from Pseudomonas viridiflava. J Appl Microbiol 84: 937–944 dalam Ryan RP, Germaine K, Franks A, Ryan DJ , Dowling DN. 2008. Mini Review : Bacterial endophytes: recent developments and applications. FEMS Microbiol Lett 278:1–9.
Mittal R, Wang Y, Hunter CJ, Gonzalez-Gomez I, Prasadarao NV. Brain damage in newborn rat model of meningitis by Enterobacter sakazakii: a role for outer membrane protein A. Laboratory Investigation 89 : 263–277.
Mohapatra H, Singh SK, Ekka R. 2012. Molecular mechanism of resistance in multiple antibiotic resistant isolates from aqueous environment. NISER, forthcoming.
Nadji G et al. 2005. Comparison of clinical and morphological characteristics of Staphylococcus aureus endocarditis with endocarditis caused by other pathogens. Heart 91 : 932-937.
12
Pujiyanto S, Ferniah RS. 2010. Aktifitas inhibitor alpha-glukosidase bakteri endofit PR-3 yang diisolasi dari tanaman pare (Momordica charantia).
BIOMA 12 (1) : 1-5.
Ruhe JJ, Monson T, Bradsher, RW, Menon A. 2005. Use of Long-Acting
Tetracyclines for Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infections: Case Series and Review of the Literature. Clin. Inf. Dis. 40:1429–1434.
Rochani N. 2009. Uji aktivitas antijamur ekstrak daun binahong (Anredera cordifolia) terhadap Candida albicans serta skrining fitokimianya. [Skripsi]. Solo : Universitas Muhammadiyah Surakarta.
Ryan RP, Germaine K, Franks A, Ryan DJ , Dowling DN. 2008. Mini Review : Bacterial endophytes: recent developments and applications. FEMS Microbiol Lett 278:1–9.
Safdar N, Bradley EA. 2008. The risk of infections after nasal colonization with Staphylococcus aureus. The American Journal of Medicine 121 : 310-315. Savini V, Favaro M, Fontana C, Catavitello C, Balbinot A, Talia M, Febbo F,
D’Antonio D. 2009. Bacillus cereus heteroresistant to carbapenems in a cancer patient. J. Hosp. Infect. 71:288–290.
Setiaji, A. 2009. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Petroleum Eter, Etil Asetat Dan Etanol 70% Rhizoma Binahong (Anredera Cordifolia (Tenore) Steen) Terhadap Staphylococcus aureus Atcc 25923 Dan Escherichia Coli Atcc 11229 Serta Skrining Fitokimianya. [Skripsi]. Solo : Universitas Muhammadiyah Surakarta.
Simanjuntak P, Bustanussalam, Otovina DM, Rahayuningsih M, Said EG. 2004. Isolasi dan identifikasi artemisinin dari hasil kultivasi mikroba endofit dari tanaman Artemisia annua. [studi mikroba endofitik tanaman Artemisia spp.]. Majalah Farmasi Indonesia 15 (2) : 68-74.
Simarmata R, Lekatompessy S, Sukiman H. 2007. Isolasi mikroba endofitik dati tanaman obat sambung nyawa (Gymura procumbens) dan analisis potensinya sebagai antimikroba. Berk Penel Hayati 13 : 85-90.
Strobel G, Daisy B, Castillo U. 2005. Novel natural products from rainforest endophytes. Dalam: Natural Products: Drug Discovery and Therapeutic Medicine (Zhang L. and Demain A., eds.). Humana Press. Totowa : NJ.
Sule WF, et al. 2011. Phytochemical properties and in-vitro antifungal activity of Senna alata Linn. crude stem bark extract. J.of.Med. Plants. Res. 5 (2) : 176-183.
Veling J, H.W Barkema, J. van der Schans, F. van Zijderverld, J. Verhoeff. 2002. Herdlevel diagnosis for Salmonella enterica subsp. enterica serovar Dublin infection in bovine dairy herds. Prev. Vet. Med. 14: 31-42.
Wang Y, Zeng Q, Zhang Z, Yan R, Zhu D. 2010. Antagonistic bioactivity of an endophytic bacterium H-6. Afr. J. Biotechnol. 9 (37) : 6140-6145
Willcox MDP. 2007. Pseudomonas aeruginosa Infection and Inflammation During Contact Lens Wear : A Review. Optometry and Vision Science 84 (4) : 273-278.
13 Yogiara SS, Magdalena S, Rachelia D. 2012. The genetic diversity of endophytic
and phyllosphere bacteria from several indonesian herbal plants. Makara J. Sci. 16 (1) : 39-45.
Yu H, Zhang L, Li L, Zheng C, Guo L, Li W, Sun P, Qin L. 2010. Recent developments and future prospects of antimicrobial metabolites produced by endophytes. Microbiol. Res. 165 : 437- 449.
14
Lampiran 1 Morfologi koloni isolat bakteri endofit dari binahong dan interaksinya terhadap bakteri patogen
Kode isolat Warna Koloni Tepian Elevasi Interaksi*
Bin DT 1 Putih susu Berlendir Bergerigi Rata -
Bin DT 2 Putih susu Berlendir Bergerigi Rata -
Bin BUB 1 Kuning cerah Tidak berlendir Rata Rata - Bin BUB 2 Putih kekuningan Tidak berlendir Rata Rata -
BBU Kuning pucat Berlendir Bergelombang Rata -
BBT Kuning pucat Berlendir Bergelombang Rata -
Akar 1 Putih Berlendir Bergerigi Rata +
Akar 1.2 Bening Berlendir Rata Rata +
Akar 2.1 Putih kekuningan Berlendir Bergelombang Rata -
Akar 2.2 Bening Berlendir Bergerigi Rata -
Akar 3 Putih mengkilat Tidak berlendir Bergerigi Rata - Akar 3.1 Putih kekuningan Berlendir Rata Cembung -
Akar 4 Bening Tidak berlendir Bergerigi Rata +
Akar 4.1 Bening Berlendir Rata Rata -
Akar 5.1 Kuning pucat Berlendir Bergerigi Rata +
Akar 5.2 Putih susu Berlendir Bergerigi Rata +
BB 1 Kuning Tidak berlendir Bergerigi Rata -
BB 2 Kuning Tidak berlendir Bergerigi Rata -
BB 3 Putih susu Tidak berlendir Bergelombang Rata +
BB 4 Coklat (tengah) Berlendir Rata Rata +
BB 5 Coklat (tengah) Berlendir Rata Rata +
BB 13 Kuning pucat Berlendir Bergerigi Rata -
BB 14 Coklat (tengah) Berlendir Rata Rata +
BB 15 Bening Berlendir Rata Rata +
BB 16 Putih kecoklatan Berlendir Rata Rata +
Daun 1 Kuning Berlendir Rata Rata -
Daun 2 Putih kecoklatan Berlendir Bergelombang Rata +
Daun 2.1 Putih Berlendir Bergelombang Cembung +
Umbi Tengah 6 Kuning Berlendir Bergerigi Rata + Umbi Tengah 7 Kuning Berlendir Bergerigi Rata - Umbi Tengah 8 Kuning pucat Tidak berlendir Bergerigi Rata - Umbi Tengah 9 Kuning pucat Tidak berlendir Bergerigi Rata - Umbi Tengah 10 Kuning pucat Tidak berlendir Bergerigi Rata - Umbi Tengah 11 Kuning Berlendir Bergerigi Rata - Umbi Tengah 12 Kuning pucat Tidak berlendir Bergerigi Rata - Umbi Akar 1 Putih susu Tidak berlendir Rata Rata + Umbi Akar 3 Putih kecoklatan Berlendir Bergerigi Rata -
15 Lampiran 2 Morfologi koloni isolat bakteri endofit dari tanaman ketepeng cina
dan interaksinya denga bakteri patogen
Kode isolat Warna Koloni Tepian Elevasi Interaksi*
AT Putih Tidak berlendir Bergerigi Rata -
AT 1 Putih Berlendir Rata Rata -
AT 2 Jingga Berlendir Rata Rata -
AU 1 Kuning Berlendir Bergerigi Rata -
BT 1 Putih Tidak berlendir Bergerigi Rata -
BT 2 Kuning Berlendir Rata Rata -
BT 5 Putih kekuningan Berlendir Bergerigi Rata - BT 6 Putih kekuningan Berlendir Bergerigi Rata -
BT 7 Bening Tidak berlendir Rata Rata -
BT 8 Bening Tidak berlendir Rata Rata -
BT 9 Kuning keemasan Tidak berlendir Rata Rata -
BDT 1 Merah muda Berlendir Bergerigi Rata -
BDT 2 Merah muda Berlendir Bergerigi Rata -
BDT 3 Putih kecoklatan Berlendir Bergelombang Rata -
BDT 4 Coklat muda Berlendir Rata Rata -
BDT 5 Putih Berlendir Rata Rata -
BDT 6 Merah muda Berlendir Rata Cembung -
BDT 8 Merah muda Berlendir Rata Rata -
BDT 9 Bening Tidak berlendir Rata Rata -
B 30 1 Bening kekuningan Tidak berlendir Rata Rata -
B 30 2 Bening Tidak berlendir Rata Rata -
B 30 3 Kuning Tidak berlendir Bergelombang Rata -
B 30 4 Kuning Tidak berlendir Rata Rata -
B 30 5 Jingga muda Berlendir Bergelombang Rata -
B 30 6 Kuning Berlendir Bergelombang Rata -
D bin 1 Putih susu Berlendir Bergelombang Cembung -
D bin 2 Putih susu Berlendir Rata Cembung -
D bin 3 Putih susu Berlendir Bergelombang Cembung -
D bin 4 Putih Berlendir Rata Rata -
D bin 5 Putih susu Berlendir Bergerigi Cembung -
DB Putih Berlendir Bergerigi Cembung -
P1 Kuning Berlendir Bergelombang Rata -
P2 Kuning Berlendir Bergelombang Rata -
P3 Kuning Tidak berlendir Rata Rata -
P4 Putih susu Berlendir Bergelombang Cembung +
P5 Jingga Berlendir Rata Rata -
16
Lampiran 3 Sekuens gen 16S rRNA isolat bakteri endofit BB5 dan BB14 hasil amplifikasi dengan primer 63F dan 1387R
>1234653_BB5
CTGCTCCTGATTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGG ATAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGTGGGGGATCT TCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCC CACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGAC ACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTG ATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGA GGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCAACAGAATAAGCACCGGCT AACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGG CGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCAGCAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGG AATTGCATCCAAAACTACTGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAG CGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGAT ACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC GCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGC GATAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGG GCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGG CCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGACACAGG TGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCG CAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACCTCGGGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGA CAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGGCCCTTACGGGCCAGGGCTA CCACCATGGCTACAATGGGCCGGGACAAAGGGTTGCCAA
>1234652_BB14
17 Lampiran 4 Hasil analisis homologi sekuens gen 16S rRNA isolat bakteri endofit
BB5 dan BB14 dengan program BLAST Isolat BB5
18
19 Lampiran 6 Hasil pensejajaran sekuens gen 16S rRNA isolat bakteri endofit BB14
20
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Tegal pada tanggal 24 April 1991 dari pasangan Heri Purwanto dan Abdjad Asih Nawangsih. Penulis merupakan anak pertama dari tiga bersaudara. Tahun 2009 penulis lulus dari SMAN 1 Bogor dan pada tahun yang sama diterima di Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB melalui jalur SNMPTN.
