T[T?4
1
Y ' j y
-
* s -
0oSY
VERlFlKASl POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE
BADA PLASMID pNlTsl DEWGAM HlBRlDISASl SOUTHERN
O!eh M A R D I
F
27. 03871 9 9 4
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Mardi
.
Protease Di bawah AntoniusF 27.0387. Verifikasi Potongan DNA Penyandi pada Plasmid pMTSl dengan Hibridisasi Southern. bimbingan Dr. Ir. Maggy T. Suhartono dan Dr. Ir. Suwanto
.
RINGKASAN
Fragmen- f ragmen DNA genom dari Bacillus stearo-
thermophilus DSM297, yang dipotong secara parsial dengan
EcoRI , telah diklonkan dalam Escheri chia col i DH5a dengan
menggunalcan plasmid pRK415 sebagai vektornya (Candra,
1993)
.
Namun E. coli rekombinan ini setelah ditumbuhkandalam media yang mengandung susu skim, menampakkan daerah
bening yang sangat sempit (kira-kira 1 mm) di sekitar
koloni. Begitu juga, ketika diukur aktivitas enzimnya
setelah ditumbuhkan dalam media kaldu Luria Bertani pada
suhu 37OC selama 22 jam, hanya menarnpaklcan aktivitas
0.0455 U/ml. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan
untuk membuktikan adanya potongan DNA B. stearotherrno-
philus DSM297 yang terklonkan dalam plasmid pMTSl serta
melacak apakah potongan DNA itu merupakan DNA penyandi
protease dengan menggunakan teknik hibridisasi Southern.
Sebagai pelacaknya digunakan DNA penyandi protease
subtilisin dari B. subtilis DB104.
Hasil elektroforesis gel agar mini pada tegangan 5
Volt/cm dan konsentrasi agarosa 1.2 % menunjukkan bahwa
terdapat potongan DNA B. stearothermophilus DSM297 yang
sekitar 1.7 kilo pasang basa (sebagai standar digunakan 1
kb ladder). Konsentrasi agarosa y a n g tinggi dan
penambahan l2NAse pada tahap digestion dapat memperjelas
visualisasi potongan DNA tersebut pada gel.
Pencucian membran setelah hibridisasi dilakukan pada
kondisi low stringency. Pencucian pertama dilakukan
selama 2 x 5 menit pada suhu ruang dengan larutan (1xSSPE
dan 0.1% SDS). Pencucian kedua dilakukan selama 2 x 15
menit pada suhu 37'~ (percobaan I) dan 30°c (percobaan 11)
dengan larutan ( 0 . 1 x SSPE dan 0 . 1 % SDS). Hasil
hibridisasi menunjukkan bahwa potongan DNA tersebut bulcan
merupakan gen penyandi protease subtilisin. Meskipun
demikian, masih ada kemungkinan potongan DNA tersebut
merupakan gen penyandi protease lainnya. Oleh karena itu,
perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan menggunakan DNA
penyandi protease netral atau protease lain sebagai
VERIFIKASI POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE
PADA PLASMID pMTSl DENGAN HIBRIDISASI SOUTHERN
Oleh :
M A R D I
F 27 0387
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN
pada JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZI
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
1 9 9 4
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
INSTITLTT PERTAEJIAN BOGOR FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
VERIFIKASI POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE PADA PLASMID pMTSl DENGAN HIBRIDISASI SOUTHERN
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk rnernperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN
pada JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GI21 FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Oleh :
M A R D I F 27 0387
Dilahirkan di Bagansiapiapi pada tanggal 25 Januari 1972
Tanggal lulus : 30 Agustus 1 9 9 4
Disetujui,
/
Dosen Pembimbing I
KATA PEWGANTAR
Penelitian ini merupakan bagian dari rangkaian
penelitian protease yang diadakan di laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia, Pusat Antar Universitas untuk Bioteknologi, IPB. Rangkaian penelitian ini bertujuan untuk menggali potensi Indonesia untuk berkiprah dalam produksi dan aplikasi protease, antara lain dengan mencari isolat mikroba asal Indonesia yang mempunyai potensi untuk memproduksi protease, memanfaatkan limbah untuk media fermentasi, dan meningkatkan produktivitas isolat tersebut dalam menghasilkan protease melalui rekayasa genetika.
Penelitian ini merupakan kelanjutan penelitian yang dilakukan Ir. K.P. Candra, M.S. mengenai usaha pengklonan gen protease dari Bacillus stearothermophilus ke dalam
Escherichia coli
.
Kedua penelitian ini dimaksudkansebagai langkah awal dalam usaha melakukan rekayasa genetika terhadap isolat mikroba penghasil protease asal Indonesia pada penelitian berikutnya. Dengan demikian, kedua penelitian ini lebih diarahlcan pada penguasaan teknik dalam rangka alih teknologi.
Sebagai langkah awal, banyak ditemui kesulitan- kesulitan karena keterbatasan Easilitas, bahan, dan informasi. Oleh karena itu, saran dan kritik yang membangun dari pembaca sangat diharapkan untuk menyempurnakan penelitian-penelitian berikutnya dalam rangkaian penelitian ini
Bogor, Agustus 1994
Puji syukur kepada Tuhan Yang Mahabaik, atas rahmat dan kasih-Nya telah memampukan penulis menyelesaikan skripsi ini.
Penghargaan dan terimakasih sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada fjr. Ir. Maggy T . Suhartono, atas bimbingan, nasehat dan perhatiannya terhadap penulis
selama mengerjakan penelitian dan menyelesaikan skripsi ini
.
Terimakasih secara khusus juga penulis sampaikan kepada Dr.Ir. Antonius Suwanto, atas segala bimbingan, pengarahan dan bantuannya selama ini. Beliaulah yang telah memperkenalkan betapa menariknya biologi molekuler kepada penulis. Terimakasih secara khusus juga penulis
sampaikan kepada Dr. Ir
.
Budiatman Satiawihardja, yangtelah bersedia menguji dan mernberikan koreksi dan masukan untuk penyempurnaan skripsi ini.
Penulis juga sangat berterimakasih kepada : Ir. Lili
Rosana atas segala bantuannya, fisik maupun moril; Drs. Yaya Rukayadi; Ir. Felix M. Mesak; Ir. Utut Widyastuti, MS.; Ir. Suzanna Ristiarini; Ir. Ricky Wijaya; Junaedi serta rekan-rekan dan teknisi Lab. Mikrobiologi dan Biokimia, PAU Bioteknologi, IPE atas segala bantuan dan masukannya.
Terimakasih juga penulis sampaikan kepada Han Cung dan Silvi yang telah membantu mengedit naskah ini, serta teman-teman yang telah banyak memberikan bantuan dan
dorongan moril : Agustina, Paul, Gunawan, Wandi, seluruh
DAFTAR IS1
Hal aman
. . .
KATA PENGANTAR i
UCAPAN TERIMAKASIH
. . .
iiDAFTAR IS1
. . .
iiiDAFTAR GAMBAR
. . .
vDAFTAR LAMPIRAN
.
. . .
viI
.
PENDAHULUAN. . .
1I1
.
TINJAUAN PUSTAKA. . .
3A
.
Gen Protease dari B.
stearothermophilus, B.
subtilis dan E.
coli. . .
3B
.
Plasmid. . .
6C
.
Pengklonan Gen Bacillus sp.ke Beberapa. . .
Inang 10 D.
Elektroforesis Gel Agarosa Mini. . .
12E
.
Hibridisasi Southern. . .
131
.
Teori Hibridisasi. . .
142
.
Hibridisasi Filter. . .
173
.
Deteksi. . .
18111
.
BAHAN DAN METODE PENELITIAN. . .
21A
.
Bahan dan Alat. . .
21B
.
Metode Penelitian. . .
221
.
Isolasi DNA Plasmid. . .
232
.
Isolasi DNA Kromosom.
243
.
Pemotongan DNA dengan Enzim Restriksi4
.
Elektroforesis Gel Agarosa Mini. . .
.
. . .
5 Southern Blots
6
.
Isolasi Fragmen yang Akan Dijadikan. . .
Pelacak
7
.
Pelabelan DNA Pelacak. . .
8
.
Pemurnian DNA Pelacak. . .
9.
Hibridisasi. . .
:
10.
Deteksi Hibridisasi. . .
IV
.
HASIL DAN PEMBAHASAN. . .
A.
Pertumbuhan Koloni pada Media SMMCA. . . .
B
.
Isolasi DNA. . .
C
.
Elektroforesis Gel Agarosa Mini. . .
. . .
D
.
Southern BlotsE
.
Isolasi, Pelabelan dan PemurnianDNA Pelacak . . .
F . Hibridisasi dan Deteksi
. . .
G
.
Analisis Hasil Pengklonan Gen B.
stearo-thermophilus DSM297 ke dalam E
.
coliDH5a
. . .
. . .
V
.
KESIMPULAN DAN SARAN. . .
A.
Kesimpulan. . .
B
.
Saran. . .
DAFTAR PUSTAKAT[T?4
1
Y ' j y
-
* s -
0oSY
VERlFlKASl POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE
BADA PLASMID pNlTsl DEWGAM HlBRlDISASl SOUTHERN
O!eh M A R D I
F
27. 03871 9 9 4
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Mardi
.
Protease Di bawah AntoniusF 27.0387. Verifikasi Potongan DNA Penyandi pada Plasmid pMTSl dengan Hibridisasi Southern. bimbingan Dr. Ir. Maggy T. Suhartono dan Dr. Ir. Suwanto
.
RINGKASAN
Fragmen- f ragmen DNA genom dari Bacillus stearo-
thermophilus DSM297, yang dipotong secara parsial dengan
EcoRI , telah diklonkan dalam Escheri chia col i DH5a dengan
menggunalcan plasmid pRK415 sebagai vektornya (Candra,
1993)
.
Namun E. coli rekombinan ini setelah ditumbuhkandalam media yang mengandung susu skim, menampakkan daerah
bening yang sangat sempit (kira-kira 1 mm) di sekitar
koloni. Begitu juga, ketika diukur aktivitas enzimnya
setelah ditumbuhkan dalam media kaldu Luria Bertani pada
suhu 37OC selama 22 jam, hanya menarnpaklcan aktivitas
0.0455 U/ml. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan
untuk membuktikan adanya potongan DNA B. stearotherrno-
philus DSM297 yang terklonkan dalam plasmid pMTSl serta
melacak apakah potongan DNA itu merupakan DNA penyandi
protease dengan menggunakan teknik hibridisasi Southern.
Sebagai pelacaknya digunakan DNA penyandi protease
subtilisin dari B. subtilis DB104.
Hasil elektroforesis gel agar mini pada tegangan 5
Volt/cm dan konsentrasi agarosa 1.2 % menunjukkan bahwa
terdapat potongan DNA B. stearothermophilus DSM297 yang
sekitar 1.7 kilo pasang basa (sebagai standar digunakan 1
kb ladder). Konsentrasi agarosa y a n g tinggi dan
penambahan l2NAse pada tahap digestion dapat memperjelas
visualisasi potongan DNA tersebut pada gel.
Pencucian membran setelah hibridisasi dilakukan pada
kondisi low stringency. Pencucian pertama dilakukan
selama 2 x 5 menit pada suhu ruang dengan larutan (1xSSPE
dan 0.1% SDS). Pencucian kedua dilakukan selama 2 x 15
menit pada suhu 37'~ (percobaan I) dan 30°c (percobaan 11)
dengan larutan ( 0 . 1 x SSPE dan 0 . 1 % SDS). Hasil
hibridisasi menunjukkan bahwa potongan DNA tersebut bulcan
merupakan gen penyandi protease subtilisin. Meskipun
demikian, masih ada kemungkinan potongan DNA tersebut
merupakan gen penyandi protease lainnya. Oleh karena itu,
perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan menggunakan DNA
penyandi protease netral atau protease lain sebagai
VERIFIKASI POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE
PADA PLASMID pMTSl DENGAN HIBRIDISASI SOUTHERN
Oleh :
M A R D I
F 27 0387
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN
pada JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZI
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
1 9 9 4
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
INSTITLTT PERTAEJIAN BOGOR FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
VERIFIKASI POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE PADA PLASMID pMTSl DENGAN HIBRIDISASI SOUTHERN
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk rnernperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN
pada JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GI21 FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Oleh :
M A R D I F 27 0387
Dilahirkan di Bagansiapiapi pada tanggal 25 Januari 1972
Tanggal lulus : 30 Agustus 1 9 9 4
Disetujui,
/
Dosen Pembimbing I
KATA PEWGANTAR
Penelitian ini merupakan bagian dari rangkaian
penelitian protease yang diadakan di laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia, Pusat Antar Universitas untuk Bioteknologi, IPB. Rangkaian penelitian ini bertujuan untuk menggali potensi Indonesia untuk berkiprah dalam produksi dan aplikasi protease, antara lain dengan mencari isolat mikroba asal Indonesia yang mempunyai potensi untuk memproduksi protease, memanfaatkan limbah untuk media fermentasi, dan meningkatkan produktivitas isolat tersebut dalam menghasilkan protease melalui rekayasa genetika.
Penelitian ini merupakan kelanjutan penelitian yang dilakukan Ir. K.P. Candra, M.S. mengenai usaha pengklonan gen protease dari Bacillus stearothermophilus ke dalam
Escherichia coli
.
Kedua penelitian ini dimaksudkansebagai langkah awal dalam usaha melakukan rekayasa genetika terhadap isolat mikroba penghasil protease asal Indonesia pada penelitian berikutnya. Dengan demikian, kedua penelitian ini lebih diarahlcan pada penguasaan teknik dalam rangka alih teknologi.
Sebagai langkah awal, banyak ditemui kesulitan- kesulitan karena keterbatasan Easilitas, bahan, dan informasi. Oleh karena itu, saran dan kritik yang membangun dari pembaca sangat diharapkan untuk menyempurnakan penelitian-penelitian berikutnya dalam rangkaian penelitian ini
Bogor, Agustus 1994
Puji syukur kepada Tuhan Yang Mahabaik, atas rahmat dan kasih-Nya telah memampukan penulis menyelesaikan skripsi ini.
Penghargaan dan terimakasih sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada fjr. Ir. Maggy T . Suhartono, atas bimbingan, nasehat dan perhatiannya terhadap penulis
selama mengerjakan penelitian dan menyelesaikan skripsi ini
.
Terimakasih secara khusus juga penulis sampaikan kepada Dr.Ir. Antonius Suwanto, atas segala bimbingan, pengarahan dan bantuannya selama ini. Beliaulah yang telah memperkenalkan betapa menariknya biologi molekuler kepada penulis. Terimakasih secara khusus juga penulis
sampaikan kepada Dr. Ir
.
Budiatman Satiawihardja, yangtelah bersedia menguji dan mernberikan koreksi dan masukan untuk penyempurnaan skripsi ini.
Penulis juga sangat berterimakasih kepada : Ir. Lili
Rosana atas segala bantuannya, fisik maupun moril; Drs. Yaya Rukayadi; Ir. Felix M. Mesak; Ir. Utut Widyastuti, MS.; Ir. Suzanna Ristiarini; Ir. Ricky Wijaya; Junaedi serta rekan-rekan dan teknisi Lab. Mikrobiologi dan Biokimia, PAU Bioteknologi, IPE atas segala bantuan dan masukannya.
Terimakasih juga penulis sampaikan kepada Han Cung dan Silvi yang telah membantu mengedit naskah ini, serta teman-teman yang telah banyak memberikan bantuan dan
dorongan moril : Agustina, Paul, Gunawan, Wandi, seluruh
DAFTAR IS1
Hal aman
. . .
KATA PENGANTAR i
UCAPAN TERIMAKASIH
. . .
iiDAFTAR IS1
. . .
iiiDAFTAR GAMBAR
. . .
vDAFTAR LAMPIRAN
.
. . .
viI
.
PENDAHULUAN. . .
1I1
.
TINJAUAN PUSTAKA. . .
3A
.
Gen Protease dari B.
stearothermophilus,B
.
subtilis dan E.
coli. . .
3B
.
Plasmid. . .
6C
.
Pengklonan Gen Bacillus sp.ke Beberapa. . .
Inang 10
D
.
Elektroforesis Gel Agarosa Mini. . .
12E
.
Hibridisasi Southern. . .
131
.
Teori Hibridisasi. . .
142
.
Hibridisasi Filter. . .
173
.
Deteksi. . .
18111
.
BAHAN DAN METODE PENELITIAN. . .
21A
.
Bahan dan Alat. . .
21B
.
Metode Penelitian. . .
221
.
Isolasi DNA Plasmid. . .
232
.
Isolasi DNA Kromosom.
243
.
Pemotongan DNA dengan Enzim Restriksi4
.
Elektroforesis Gel Agarosa Mini. . .
.
. . .
5 Southern Blots
6
.
Isolasi Fragmen yang Akan Dijadikan. . .
Pelacak
7
.
Pelabelan DNA Pelacak. . .
8
.
Pemurnian DNA Pelacak. . .
9.
Hibridisasi. . .
:
10.
Deteksi Hibridisasi. . .
IV
.
HASIL DAN PEMBAHASAN. . .
A.
Pertumbuhan Koloni pada Media SMMCA. . . .
B
.
Isolasi DNA. . .
C
.
Elektroforesis Gel Agarosa Mini. . .
. . .
D
.
Southern BlotsE
.
Isolasi, Pelabelan dan PemurnianDNA Pelacak . . .
F . Hibridisasi dan Deteksi
. . .
G
.
Analisis Hasil Pengklonan Gen B.
stearo-thermophilus DSM297 ke dalam E
.
coliDH5a
. . .
. . .
V
.
KESIMPULAN DAN SARAN. . .
A.
Kesimpulan. . .
B
.
Saran. . .
DAFTAR PUSTAKA