• Tidak ada hasil yang ditemukan

Verifikasi Potongan DNA Penyandi Protease Pada Plasmid pMTs1 dengan Hibridisasi Southern

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2017

Membagikan "Verifikasi Potongan DNA Penyandi Protease Pada Plasmid pMTs1 dengan Hibridisasi Southern"

Copied!
156
0
0

Teks penuh

(1)
(2)

T[T?4

1

Y ' j y

-

* s -

0oSY

VERlFlKASl POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE

BADA PLASMID pNlTsl DEWGAM HlBRlDISASl SOUTHERN

O!eh M A R D I

F

27. 0387

1 9 9 4

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(3)

Mardi

.

Protease Di bawah Antonius

F 27.0387. Verifikasi Potongan DNA Penyandi pada Plasmid pMTSl dengan Hibridisasi Southern. bimbingan Dr. Ir. Maggy T. Suhartono dan Dr. Ir. Suwanto

.

RINGKASAN

Fragmen- f ragmen DNA genom dari Bacillus stearo-

thermophilus DSM297, yang dipotong secara parsial dengan

EcoRI , telah diklonkan dalam Escheri chia col i DH5a dengan

menggunalcan plasmid pRK415 sebagai vektornya (Candra,

1993)

.

Namun E. coli rekombinan ini setelah ditumbuhkan

dalam media yang mengandung susu skim, menampakkan daerah

bening yang sangat sempit (kira-kira 1 mm) di sekitar

koloni. Begitu juga, ketika diukur aktivitas enzimnya

setelah ditumbuhkan dalam media kaldu Luria Bertani pada

suhu 37OC selama 22 jam, hanya menarnpaklcan aktivitas

0.0455 U/ml. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan

untuk membuktikan adanya potongan DNA B. stearotherrno-

philus DSM297 yang terklonkan dalam plasmid pMTSl serta

melacak apakah potongan DNA itu merupakan DNA penyandi

protease dengan menggunakan teknik hibridisasi Southern.

Sebagai pelacaknya digunakan DNA penyandi protease

subtilisin dari B. subtilis DB104.

Hasil elektroforesis gel agar mini pada tegangan 5

Volt/cm dan konsentrasi agarosa 1.2 % menunjukkan bahwa

terdapat potongan DNA B. stearothermophilus DSM297 yang

(4)

sekitar 1.7 kilo pasang basa (sebagai standar digunakan 1

kb ladder). Konsentrasi agarosa y a n g tinggi dan

penambahan l2NAse pada tahap digestion dapat memperjelas

visualisasi potongan DNA tersebut pada gel.

Pencucian membran setelah hibridisasi dilakukan pada

kondisi low stringency. Pencucian pertama dilakukan

selama 2 x 5 menit pada suhu ruang dengan larutan (1xSSPE

dan 0.1% SDS). Pencucian kedua dilakukan selama 2 x 15

menit pada suhu 37'~ (percobaan I) dan 30°c (percobaan 11)

dengan larutan ( 0 . 1 x SSPE dan 0 . 1 % SDS). Hasil

hibridisasi menunjukkan bahwa potongan DNA tersebut bulcan

merupakan gen penyandi protease subtilisin. Meskipun

demikian, masih ada kemungkinan potongan DNA tersebut

merupakan gen penyandi protease lainnya. Oleh karena itu,

perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan menggunakan DNA

penyandi protease netral atau protease lain sebagai

(5)

VERIFIKASI POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE

PADA PLASMID pMTSl DENGAN HIBRIDISASI SOUTHERN

Oleh :

M A R D I

F 27 0387

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN

pada JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZI

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

1 9 9 4

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(6)

INSTITLTT PERTAEJIAN BOGOR FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

VERIFIKASI POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE PADA PLASMID pMTSl DENGAN HIBRIDISASI SOUTHERN

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk rnernperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN

pada JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GI21 FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

Oleh :

M A R D I F 27 0387

Dilahirkan di Bagansiapiapi pada tanggal 25 Januari 1972

Tanggal lulus : 30 Agustus 1 9 9 4

Disetujui,

/

Dosen Pembimbing I

(7)

KATA PEWGANTAR

Penelitian ini merupakan bagian dari rangkaian

penelitian protease yang diadakan di laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia, Pusat Antar Universitas untuk Bioteknologi, IPB. Rangkaian penelitian ini bertujuan untuk menggali potensi Indonesia untuk berkiprah dalam produksi dan aplikasi protease, antara lain dengan mencari isolat mikroba asal Indonesia yang mempunyai potensi untuk memproduksi protease, memanfaatkan limbah untuk media fermentasi, dan meningkatkan produktivitas isolat tersebut dalam menghasilkan protease melalui rekayasa genetika.

Penelitian ini merupakan kelanjutan penelitian yang dilakukan Ir. K.P. Candra, M.S. mengenai usaha pengklonan gen protease dari Bacillus stearothermophilus ke dalam

Escherichia coli

.

Kedua penelitian ini dimaksudkan

sebagai langkah awal dalam usaha melakukan rekayasa genetika terhadap isolat mikroba penghasil protease asal Indonesia pada penelitian berikutnya. Dengan demikian, kedua penelitian ini lebih diarahlcan pada penguasaan teknik dalam rangka alih teknologi.

Sebagai langkah awal, banyak ditemui kesulitan- kesulitan karena keterbatasan Easilitas, bahan, dan informasi. Oleh karena itu, saran dan kritik yang membangun dari pembaca sangat diharapkan untuk menyempurnakan penelitian-penelitian berikutnya dalam rangkaian penelitian ini

Bogor, Agustus 1994

(8)

Puji syukur kepada Tuhan Yang Mahabaik, atas rahmat dan kasih-Nya telah memampukan penulis menyelesaikan skripsi ini.

Penghargaan dan terimakasih sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada fjr. Ir. Maggy T . Suhartono, atas bimbingan, nasehat dan perhatiannya terhadap penulis

selama mengerjakan penelitian dan menyelesaikan skripsi ini

.

Terimakasih secara khusus juga penulis sampaikan kepada Dr.Ir. Antonius Suwanto, atas segala bimbingan, pengarahan dan bantuannya selama ini. Beliaulah yang telah memperkenalkan betapa menariknya biologi molekuler kepada penulis. Terimakasih secara khusus juga penulis

sampaikan kepada Dr. Ir

.

Budiatman Satiawihardja, yang

telah bersedia menguji dan mernberikan koreksi dan masukan untuk penyempurnaan skripsi ini.

Penulis juga sangat berterimakasih kepada : Ir. Lili

Rosana atas segala bantuannya, fisik maupun moril; Drs. Yaya Rukayadi; Ir. Felix M. Mesak; Ir. Utut Widyastuti, MS.; Ir. Suzanna Ristiarini; Ir. Ricky Wijaya; Junaedi serta rekan-rekan dan teknisi Lab. Mikrobiologi dan Biokimia, PAU Bioteknologi, IPE atas segala bantuan dan masukannya.

Terimakasih juga penulis sampaikan kepada Han Cung dan Silvi yang telah membantu mengedit naskah ini, serta teman-teman yang telah banyak memberikan bantuan dan

dorongan moril : Agustina, Paul, Gunawan, Wandi, seluruh

(9)

DAFTAR IS1

Hal aman

. . .

KATA PENGANTAR i

UCAPAN TERIMAKASIH

. . .

ii

DAFTAR IS1

. . .

iii

DAFTAR GAMBAR

. . .

v

DAFTAR LAMPIRAN

.

. . .

vi

I

.

PENDAHULUAN

. . .

1

I1

.

TINJAUAN PUSTAKA

. . .

3

A

.

Gen Protease dari B

.

stearothermophilus, B

.

subtilis dan E

.

coli

. . .

3

B

.

Plasmid

. . .

6

C

.

Pengklonan Gen Bacillus sp.ke Beberapa

. . .

Inang 10 D

.

Elektroforesis Gel Agarosa Mini

. . .

12

E

.

Hibridisasi Southern

. . .

13

1

.

Teori Hibridisasi

. . .

14

2

.

Hibridisasi Filter

. . .

17

3

.

Deteksi

. . .

18

111

.

BAHAN DAN METODE PENELITIAN

. . .

21

A

.

Bahan dan Alat

. . .

21

B

.

Metode Penelitian

. . .

22

1

.

Isolasi DNA Plasmid

. . .

23

2

.

Isolasi DNA Kromosom

.

24
(10)

3

.

Pemotongan DNA dengan Enzim Restriksi

4

.

Elektroforesis Gel Agarosa Mini

. . .

.

. . .

5 Southern Blots

6

.

Isolasi Fragmen yang Akan Dijadikan

. . .

Pelacak

7

.

Pelabelan DNA Pelacak

. . .

8

.

Pemurnian DNA Pelacak

. . .

9

.

Hibridisasi

. . .

:

10

.

Deteksi Hibridisasi

. . .

IV

.

HASIL DAN PEMBAHASAN

. . .

A

.

Pertumbuhan Koloni pada Media SMMCA

. . . .

B

.

Isolasi DNA

. . .

C

.

Elektroforesis Gel Agarosa Mini

. . .

. . .

D

.

Southern Blots

E

.

Isolasi, Pelabelan dan Pemurnian

DNA Pelacak . . .

F . Hibridisasi dan Deteksi

. . .

G

.

Analisis Hasil Pengklonan Gen B

.

stearo-

thermophilus DSM297 ke dalam E

.

coli

DH5a

. . .

. . .

V

.

KESIMPULAN DAN SARAN

. . .

A

.

Kesimpulan

. . .

B

.

Saran

. . .

DAFTAR PUSTAKA
(11)
(12)
(13)
(14)
(15)
(16)
(17)
(18)
(19)
(20)
(21)
(22)
(23)
(24)
(25)
(26)
(27)
(28)
(29)
(30)
(31)
(32)
(33)
(34)
(35)
(36)
(37)
(38)
(39)
(40)
(41)
(42)
(43)
(44)
(45)
(46)
(47)
(48)
(49)
(50)
(51)
(52)
(53)
(54)
(55)
(56)
(57)
(58)
(59)
(60)
(61)
(62)
(63)
(64)
(65)
(66)
(67)
(68)
(69)
(70)
(71)
(72)
(73)
(74)
(75)

T[T?4

1

Y ' j y

-

* s -

0oSY

VERlFlKASl POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE

BADA PLASMID pNlTsl DEWGAM HlBRlDISASl SOUTHERN

O!eh M A R D I

F

27. 0387

1 9 9 4

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(76)

Mardi

.

Protease Di bawah Antonius

F 27.0387. Verifikasi Potongan DNA Penyandi pada Plasmid pMTSl dengan Hibridisasi Southern. bimbingan Dr. Ir. Maggy T. Suhartono dan Dr. Ir. Suwanto

.

RINGKASAN

Fragmen- f ragmen DNA genom dari Bacillus stearo-

thermophilus DSM297, yang dipotong secara parsial dengan

EcoRI , telah diklonkan dalam Escheri chia col i DH5a dengan

menggunalcan plasmid pRK415 sebagai vektornya (Candra,

1993)

.

Namun E. coli rekombinan ini setelah ditumbuhkan

dalam media yang mengandung susu skim, menampakkan daerah

bening yang sangat sempit (kira-kira 1 mm) di sekitar

koloni. Begitu juga, ketika diukur aktivitas enzimnya

setelah ditumbuhkan dalam media kaldu Luria Bertani pada

suhu 37OC selama 22 jam, hanya menarnpaklcan aktivitas

0.0455 U/ml. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan

untuk membuktikan adanya potongan DNA B. stearotherrno-

philus DSM297 yang terklonkan dalam plasmid pMTSl serta

melacak apakah potongan DNA itu merupakan DNA penyandi

protease dengan menggunakan teknik hibridisasi Southern.

Sebagai pelacaknya digunakan DNA penyandi protease

subtilisin dari B. subtilis DB104.

Hasil elektroforesis gel agar mini pada tegangan 5

Volt/cm dan konsentrasi agarosa 1.2 % menunjukkan bahwa

terdapat potongan DNA B. stearothermophilus DSM297 yang

(77)

sekitar 1.7 kilo pasang basa (sebagai standar digunakan 1

kb ladder). Konsentrasi agarosa y a n g tinggi dan

penambahan l2NAse pada tahap digestion dapat memperjelas

visualisasi potongan DNA tersebut pada gel.

Pencucian membran setelah hibridisasi dilakukan pada

kondisi low stringency. Pencucian pertama dilakukan

selama 2 x 5 menit pada suhu ruang dengan larutan (1xSSPE

dan 0.1% SDS). Pencucian kedua dilakukan selama 2 x 15

menit pada suhu 37'~ (percobaan I) dan 30°c (percobaan 11)

dengan larutan ( 0 . 1 x SSPE dan 0 . 1 % SDS). Hasil

hibridisasi menunjukkan bahwa potongan DNA tersebut bulcan

merupakan gen penyandi protease subtilisin. Meskipun

demikian, masih ada kemungkinan potongan DNA tersebut

merupakan gen penyandi protease lainnya. Oleh karena itu,

perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan menggunakan DNA

penyandi protease netral atau protease lain sebagai

(78)

VERIFIKASI POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE

PADA PLASMID pMTSl DENGAN HIBRIDISASI SOUTHERN

Oleh :

M A R D I

F 27 0387

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN

pada JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZI

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

1 9 9 4

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(79)

INSTITLTT PERTAEJIAN BOGOR FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

VERIFIKASI POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE PADA PLASMID pMTSl DENGAN HIBRIDISASI SOUTHERN

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk rnernperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN

pada JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GI21 FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

Oleh :

M A R D I F 27 0387

Dilahirkan di Bagansiapiapi pada tanggal 25 Januari 1972

Tanggal lulus : 30 Agustus 1 9 9 4

Disetujui,

/

Dosen Pembimbing I

(80)

KATA PEWGANTAR

Penelitian ini merupakan bagian dari rangkaian

penelitian protease yang diadakan di laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia, Pusat Antar Universitas untuk Bioteknologi, IPB. Rangkaian penelitian ini bertujuan untuk menggali potensi Indonesia untuk berkiprah dalam produksi dan aplikasi protease, antara lain dengan mencari isolat mikroba asal Indonesia yang mempunyai potensi untuk memproduksi protease, memanfaatkan limbah untuk media fermentasi, dan meningkatkan produktivitas isolat tersebut dalam menghasilkan protease melalui rekayasa genetika.

Penelitian ini merupakan kelanjutan penelitian yang dilakukan Ir. K.P. Candra, M.S. mengenai usaha pengklonan gen protease dari Bacillus stearothermophilus ke dalam

Escherichia coli

.

Kedua penelitian ini dimaksudkan

sebagai langkah awal dalam usaha melakukan rekayasa genetika terhadap isolat mikroba penghasil protease asal Indonesia pada penelitian berikutnya. Dengan demikian, kedua penelitian ini lebih diarahlcan pada penguasaan teknik dalam rangka alih teknologi.

Sebagai langkah awal, banyak ditemui kesulitan- kesulitan karena keterbatasan Easilitas, bahan, dan informasi. Oleh karena itu, saran dan kritik yang membangun dari pembaca sangat diharapkan untuk menyempurnakan penelitian-penelitian berikutnya dalam rangkaian penelitian ini

Bogor, Agustus 1994

(81)

Puji syukur kepada Tuhan Yang Mahabaik, atas rahmat dan kasih-Nya telah memampukan penulis menyelesaikan skripsi ini.

Penghargaan dan terimakasih sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada fjr. Ir. Maggy T . Suhartono, atas bimbingan, nasehat dan perhatiannya terhadap penulis

selama mengerjakan penelitian dan menyelesaikan skripsi ini

.

Terimakasih secara khusus juga penulis sampaikan kepada Dr.Ir. Antonius Suwanto, atas segala bimbingan, pengarahan dan bantuannya selama ini. Beliaulah yang telah memperkenalkan betapa menariknya biologi molekuler kepada penulis. Terimakasih secara khusus juga penulis

sampaikan kepada Dr. Ir

.

Budiatman Satiawihardja, yang

telah bersedia menguji dan mernberikan koreksi dan masukan untuk penyempurnaan skripsi ini.

Penulis juga sangat berterimakasih kepada : Ir. Lili

Rosana atas segala bantuannya, fisik maupun moril; Drs. Yaya Rukayadi; Ir. Felix M. Mesak; Ir. Utut Widyastuti, MS.; Ir. Suzanna Ristiarini; Ir. Ricky Wijaya; Junaedi serta rekan-rekan dan teknisi Lab. Mikrobiologi dan Biokimia, PAU Bioteknologi, IPE atas segala bantuan dan masukannya.

Terimakasih juga penulis sampaikan kepada Han Cung dan Silvi yang telah membantu mengedit naskah ini, serta teman-teman yang telah banyak memberikan bantuan dan

dorongan moril : Agustina, Paul, Gunawan, Wandi, seluruh

(82)

DAFTAR IS1

Hal aman

. . .

KATA PENGANTAR i

UCAPAN TERIMAKASIH

. . .

ii

DAFTAR IS1

. . .

iii

DAFTAR GAMBAR

. . .

v

DAFTAR LAMPIRAN

.

. . .

vi

I

.

PENDAHULUAN

. . .

1

I1

.

TINJAUAN PUSTAKA

. . .

3

A

.

Gen Protease dari B

.

stearothermophilus,

B

.

subtilis dan E

.

coli

. . .

3

B

.

Plasmid

. . .

6

C

.

Pengklonan Gen Bacillus sp.ke Beberapa

. . .

Inang 10

D

.

Elektroforesis Gel Agarosa Mini

. . .

12

E

.

Hibridisasi Southern

. . .

13

1

.

Teori Hibridisasi

. . .

14

2

.

Hibridisasi Filter

. . .

17

3

.

Deteksi

. . .

18

111

.

BAHAN DAN METODE PENELITIAN

. . .

21

A

.

Bahan dan Alat

. . .

21

B

.

Metode Penelitian

. . .

22

1

.

Isolasi DNA Plasmid

. . .

23

2

.

Isolasi DNA Kromosom

.

24
(83)

3

.

Pemotongan DNA dengan Enzim Restriksi

4

.

Elektroforesis Gel Agarosa Mini

. . .

.

. . .

5 Southern Blots

6

.

Isolasi Fragmen yang Akan Dijadikan

. . .

Pelacak

7

.

Pelabelan DNA Pelacak

. . .

8

.

Pemurnian DNA Pelacak

. . .

9

.

Hibridisasi

. . .

:

10

.

Deteksi Hibridisasi

. . .

IV

.

HASIL DAN PEMBAHASAN

. . .

A

.

Pertumbuhan Koloni pada Media SMMCA

. . . .

B

.

Isolasi DNA

. . .

C

.

Elektroforesis Gel Agarosa Mini

. . .

. . .

D

.

Southern Blots

E

.

Isolasi, Pelabelan dan Pemurnian

DNA Pelacak . . .

F . Hibridisasi dan Deteksi

. . .

G

.

Analisis Hasil Pengklonan Gen B

.

stearo-

thermophilus DSM297 ke dalam E

.

coli

DH5a

. . .

. . .

V

.

KESIMPULAN DAN SARAN

. . .

A

.

Kesimpulan

. . .

B

.

Saran

. . .

DAFTAR PUSTAKA
(84)
(85)
(86)
(87)
(88)
(89)
(90)
(91)
(92)
(93)
(94)
(95)
(96)
(97)
(98)
(99)
(100)
(101)
(102)
(103)
(104)
(105)
(106)
(107)
(108)
(109)
(110)
(111)
(112)
(113)
(114)
(115)
(116)
(117)
(118)
(119)
(120)
(121)
(122)
(123)
(124)
(125)
(126)
(127)
(128)
(129)
(130)
(131)
(132)
(133)
(134)
(135)
(136)
(137)
(138)
(139)
(140)
(141)
(142)
(143)
(144)
(145)
(146)
(147)
(148)
(149)
(150)
(151)
(152)
(153)
(154)
(155)
(156)

Referensi

Dokumen terkait

PROGR,{M STIDI TEKNIK LISfRtr<. JURUSAN TIKNTX

Jika Widodo (2007) meneliti tentang hubungan beban kerja dengan waktu tanggap darurat menurut persepsi pasien, sedangkan peneliti akan melakukan faktor-faktor yang

Dalam perencanaan sudah tertulis kompetensi dasar dari beberapa mata pelajaran Sudah tertu!is indikator dari beberapa mata pelajaran dan sudah diintegrasik an dcngan mata pelajaran

Sebanyak 22 subjek pernah mengalami diare pada rentang satu tahun sejak terdiagnosa HIV/AIDS dengan kejadian diare sebagian besar berada dalam rentang waktu tiga bulan sejak

Mas Ahmad Santosa, dalam Malik, perspektif fungsi pengawasan Komisi Yudisial Pasca Putusan Mahkamah Konstitusi (MK) Nomor 005/PUU-IV/2006 Jurnal Hukum Vol. Mochtar

[r]

ANALISIS PENGARUH INDEPENDENSI, INTEGRITAS , KOMPETENSI , OBJEKTIVITAS DAN PENGALAMAN KERJA TERHADAP KUALITAS HASIL PEMERIKSAAN SATUAN PENGAWASAN INTERN DENGAN GOOD

lingkungan sekolah dan masyarakat.” 7 Sehingga apabila pendidikan dalam lingkungan keluarganya dapat berjalan dengan baik, maka akan mempengaruhi kegiatan belajar yang