AKTIVITAS PROTEASE DAN UJI FISIOLOGI
ISOLAT BAKTERI PROTEOLITIK DARI LIMBAH CAIR NANAS
Oleh bromelin yang merupakan enzim protease sehingga dapat menjadi sumber nutrisi bagi pertumbuhan bakteri proteolitik. Setiap bakteri proteolitik memiliki aktivitas enzim dan sifat fisiologi yang berbeda. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas protease bakteri proteolitik dalam mendegredasi protein dan sifat fisiologinya. Penelitian ini telah dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung dari bulan Februari-April 2014. Penelitian ini disusun menggunakan metode Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 3 ulangan. Hasil pengamatan dianalisis ragam dilanjutkan dengan uji lanjut BNJ (Beda Nyata Jujur) 5%. Hasil yang diperoleh dari 4 isolat bakteri limbah cair nanas, semua isolat mampu menghasilkan enzim protease yang ditunjukkan dengan indeks proteolitik tertinggi,yaitu isolat Bp1 dengan nilai 2,60 dan isolat Bp2 dengan
nilai indeks terendah 1,39. Aktifitas protease sejalan dengan IP yaitu Bp1 0,0149
CFU/ml dan Bp2 0,0011 CFU/ml. Berdasarkan uji fisiologi, ke empat isolat memiliki
karakter yang diduga merupakan bakteri Bacillus yaitu bentuk basil, gram positif, berspora, katalase positif, mampu mencairkan gelatin dan bersifat motil.
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan pada tanggal 25 April 1992 di Bandarlampung, sebagai anak ketiga dari lima bersaudara dari pasangan Bapak Gerhat Situmorang dan Mama Rumiris br. Sihombing.
Penulis memulai jenjang pendidikan dari Taman Kanak-Kanak yang diselesaikan di TK Xaverius 1 Tanjungkarang pada tahun 1998, jenjang Sekolah Dasar diselesaikan di SD Fransiskus 1 Tanjungkarang pada tahun 2004, pada tahun 2007 penulis menyelesaikan pendididkan di SMP Fransiskus 1 Tanjungkarang, dan
selanjutnya menyelesaikan pendidikan di SMA Pangudi Luhur Bandarlampung pada tahun 2010. Pada tahun itu juga penulis terdaftar sebagai mahasiswa Universitas Lampung Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Jurusan Biologi melalui jalur Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negri ( SNMPTN).
Sejak awal perkuliahan mahasiswa baru, penulis bergabung dengan Unit Kegiatan
Mahasiswa Kristen (UKM-K) 2010-2014. Unit kegiatan mahasiswa tingkat universitas yang bergerak dibidang rohani kristen. Penulis juga aktif dalam Himpunan Mahasiswa Biologi ( Himbio) sebagai anggota bidang Keilmuan (2011) dan bidang Humas (2012), Persekutuan rohani kristen tingkat fakultas di MIPA 2011-2014.
Motto
Kuatkanlah dan teguhkanlah hatimu, hai semua orang
yang berharap kepada Tuhan!
(Mazmur 31:24).
Karena saat kita mengimani bahwa semua indah pada
waktunya, nothing is impossible
( Novaria Situmorang).
Sebab Tuhan itu baik, kasih setia-Nya untuk
selama-lamanya, dan kesetiaan-Nya tetap turun-temurun
PERSEMBAHAN
Teriring doa dan rasa syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa., penulis persembahkan skripsi
ini sebagai tanda bakti dan bukti cinta kasih yang tulus kepada :
Bapak,Mama, kakak, abang, dan adik-adik atas doa dan dukungan kepada
penulis hingga penulis dapat menyelesaikan pendidikan dengan baik.
Seluruh keluarga besar yang telah memberi doa, dukungan, dan semangat
dalam menempuh pendidikan.
Seseorang yang kelak menjadi pendamping hidupku.
SANWACANA
Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa, atas semua rahmat dan kasih karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Aktivitas Protease dan Uji Fisilogi Isolat Bakteri Proteolitik Dari Limbah Cair
Nanas” yang merupakan karya penulis selaku mahasiswi dan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains Biologi di Universitas Lampung.
Penulis menyadari bahwa dalam penulisan laporan kerja praktik ini tidak terlepas dari peranan dan bantuan berbagai pihak. Untuk itu penulis ingin menyampaikan rasa terimakasih kepada :
1. Ibu Dra. C. N. Ekowati, M.Si., selaku pembimbing pertama yang telah memberi kesempatan, kepercayaan, saran, dan kritik yang mecerdaskan dalam proses penyusunan skripsi ini.
2. Ibu Kusuma Handayani, M.Si., selaku pembimbing kedua yang telah memberi perhatian, arahan, bimbingan, kritik, dan saran dalam proses penyusunan skripsi ini.
3. Bapak Dr. Sumardi, M.Si., selaku pembahas yang telah dengan sabar
memberi saran, masukan, dan bimbingan dalam proses pembuatan skripsi ini. 4. Bapak Drs.Suratman Umar, M.Sc. selaku pembimbing akademik yang
5. Bapak Dr.Agus Sutanto dari Universitas Muhamadiah Metro, selaku pemilik proyek penelitian yang telah membantu penulis dalam pembiayaan penelitian. 6. Ibu Dra. Nuning Nurcahyani, M.Sc., selaku ketua jurusan Biologi MIPA
Universitas Lampung atas bimbingan dan semangat yang diberikan kepada penulis.
7. Bapak Prof. Suharso, Ph.D., selaku Dekan FMIPA Universitas Lampung. 8. Seluruh dosen dan Staff Biologi FMIPA Universitas Lampung.
9. Kedua orang tua, kakak, Abang ipar, abang, dan adik-adikku yang selalu memberikan doa, dukungan semangat, kasih sayang, dan motivasi,
10.Ana Sulastri Sirait dan Aris Indriawan selaku sahabat terbaik, tempat berbagi cerita, canda tawa, untuk setiap warna kehidupan dalam kebersamaan dan kesetiaan baik disaat suka maupun duka yang tak terlupakan;
11.Sahabat Mikroholic (Aulia Murti Novita Sari, Shofia Rodiah, Nurul Maulida, Rizky Fajri Moro, Lestari) atas persaudaraan, kebersamaan, doa, dan motivasi yang telah diberikan selama penulis menyelesaikan skripsi. Semoga tali persaudaraan ini dapat terus terjalin.
12.Naposobulung HKBP Kedaton untuk setiap doa, dukungan dan motivasi yang diberikan sampai penulis mencapai gelar sarjana.
13.Kelompok Kecil SCAN (Kak Santi Nababan, Citra Oktrine Saragih dan Ana Sulastri Sirait) atas doa, kebersaman dan motivasi yang diberikan selama penulis menyelesaikan skripsi .
15.Teman-teman angkatan 2010 atas kebersamaan dukungan dan motivasi yang diberikan kepada penulis.
Akhir kata, penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan, namun semoga skripsi ini dapat bermanfaat dan berguna bagi kita semua. Amin.
Bandar Lampung, Juli 2013 Penulis
DAFTAR ISI
D. Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim ... 11
E. Karakter Fisiologi Bakteri Proteolitik ... 13
F. Limbah Cair Nanas (LCN)... 16
1. Peremajaan Stok Kultur Bakteri ... 20
2. Uji Proteolitik Secara Kualitatif dan Kuantitatif ... 20
3. Uji Fisiologi Isolat Bakteri Proteolitik ... 24
ii
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Aktivitas Protease SecaraKualitatif... 27
B. Uji Aktivitas Enzim Protease ... 29
C. Uji Peptonisasi ... 31
D. Uji Fisiologi Bakteri Proteolitik dan Pengecatan Spora ... 33
V. SIMPULAN DAN SARAN ... 38
DAFTAR PUSTAKA ... 39
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. Metode Pengujian Aktivitas Enzim Proteolitik ... 23
2. Indeks Proteolitik (IP) Berdasarkan Uji Lanjut BNJ (�= 5%) ... 27
3. Aktivitas Protease Berdasarkan Uji Lanjut BNJ (� = 5%) ... 29
4. Hasil Uji Peptonisasi Isolat Bakteri Proteolitik ... 31
iv
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Struktur sekunder beta-sheet dan alpha-helix protein ... 6
2. Reaksi uji katalase dengan bakteri yang mengandung enzim katalase ... 14
3. Reaksi yang terjadi pada uji motilitas ... 15
4. Penentuan indeks proteolitik ... 21
5. Uji katalase isolat bakteri proteolitik ... 48
6. Uji motilitas isolat bakteri proteolitik ... 48
7. Uji Peptonisasi isolat bakteri proteolitik ... 49
8. Uji gelatin isolat bakteri proteolitik ... 49
9. Uji fermentasi glukosa isolat bakteri proteolitik ... 50
10.Uji fermentasi laktosa isolat bakteri proteolitik ... 50
11.Uji fermentasi galaktosa isolat bakteri proteolitik ... 50
12.Uji fermentasi sukrosa isolat bakteri proteolitik ... 50
13.Pengecatan gram isolat bakteri proteolitik ... 51
1
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Indonesia merupakan salah satu pengekspor buah nanas yang menempati posisi ketiga dari negara-negara penghasil nanas olahan dan segar setelah negara Thailand dan Philippines. Berdasarkan data produksi nanas tahun 2011, sentra produksi nanas di Indonesia terdapat di 5 (lima) provinsi yang diantaranya yaitu Lampung dengan kontribusi 32,80% terhadap produksi nanas nasional.
Lampung Tengah mampu memproduksi lebih dari 500 ribu ton setiap tahunnya atau 11 ribu kontainer buah nanas per tahun sehingga dampak industri-industri pengolahan nanas ini berpotensi menghasilkan produk sampingan, yakni limbah sekitar 135 ribu ton setiap tahun atau 5000-7000 m3 per hari (Julius,2009) dan akan menimbulkan masalah jika dibiarkan begitu saja.
2
Menurut Kambey (2006), kandungan enzim bromelin pada tanaman nanas antara lain terdapat pada buah nanas dengan aktivitas spesifik tertinggi yaitu 62,5 U/mg; sedangkan pada batang nanas 27,3 U/mg dan pada kulit nanas 32,2 U/mg.
Kandungan protein pada limbah cair nanas merupakan salah satu komponen limbah organik yang dapat menjadi sumber nutrisi bakteri proteolitik. Bakteri proteolitik mendegradasi protein menjadi asam amino (Schlegel, 1984), yang kemudian didegradasi kembali menjadi CO2, H2O, dan amonia (NH3). Hasil
penelitian Prawesti (2009), adanya enzim bromelin (enzim proteolitik) amobil dengan konsentrasi subtrat kasein 80%, mampu mendegredasi protein dari ALPT sebesar 59,641% selama 9 jam dengan pH 6,5.
Berdasarkan hasil isolasi bakteri proteolitik dari limbah cair nanas sebelumnya, diperoleh 4 isolat bakteri proteolitik yang masing-masing memiliki indeks proteolitik yang berbeda, yaitu B1 0,51; B2 0,6; B3 0,55; dan B4 0,36. Keempat
isolat tersebut belum diketahui besar aktivitas enzim protease serta sifat
3
B. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk :
1. Untuk mengetahui aktivitas protease bakteri proteolitik dalam mendegredasi protein.
2. Mengetahui karakter fisiologi isolat bakteri proteolitik yang meliputi sifat katalase, motilitas, uji gelatin, uji peptonisasi dan fermentasi gula.
C. Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai aktivitas bakteri proteolitik dalam mendegredasi protein dan karakter fisiologi dari limbah cair nanas, sehingga dapat membantu dalam pengolahan limbah cair nanas ke lingkungan.
D. Kerangka Pemikiran
Limbah cair nanas adalah limbah yang memiliki kandungan bahan organik yang diantaranya mengandung 4,41% protein (Sutanto, 2012). Komponen protein yang cukup banyak terdapat pada limbah cair nanas berupa bromelin yang merupakan enzim protease dan termasuk dalam protein kompleks. Kandungan protein yang ada pada limbah nanas dapat dimanfaatkan sebagai sumber nutrisi dan substrat untuk pertumbuhan bakteri proteolitik. Protein sebagaimana
4
yang mampu memproduksi enzim protease ekstraseluler. Bakteri penghasil enzim protease ekstraseluler disebut juga sebagai bakteri proteolitik.
Adanya aktivitas bakteri proteolitik dapat ditentukan dengan nilai Indeks
Proteolitik (IP) yang terlihat dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni bakteri pada media yang mengandung kasein. Terbentuknya zona bening
menandakan bahwa bakteri mampu menghidrolisis senyawa-senyawa protein menjadi oligopeptida, peptida rantai pendek dan asam amino.
Hasil isolasi bakteri proteolitik dari limbah cair nanas sebelumnya, diperoleh 4 isolat bakteri proteolitik yang masing-masing memiliki indeks proteolitik yang berbeda, yaitu B1 0,51; B2 0,6; B3 0,55; dan B4 0,36. Perbedaan hasil IP dari
masing-masing isolat dapat disebabkan karena luas zona bening dan luas koloni yang dihasilkan dari masing-masing isolat berbeda. Hal ini berkaitan dengan kemampuan enzim protease bakteri dalam menghidrolisis protein. Semakin banyak protein yang terhidrolisis maka luas zona bening yang terbentuk akan semakin besar dan menandakan aktivitas enzim yang terjadi juga besar.
Aktivitas enzim bakteri dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya
5
memiliki karakter fisiologi yang berbeda. Sifat fisiologi bakteri meliputi uji katalase, motilitas, uji gelatin, uji peptonisasi dan fermentasi gula.
E. Hipotesis
Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah
1. Adanya perbedaan aktivitas enzim protease isolat bakteri proteolitik yang berbeda dari limbah cair nanas.
6
II. TINJAUAN PUSTAKA
A. Protease
Protease disebut juga peptidase atau proteinase, merupakan enzim golongan hidrolase yang akan memecah protein menjadi molekul yang lebih sederhana, seperti menjadi oligopeptida pendek atau asam amino, dengan reaksi hidrolisis pada ikatan peptide. Enzim ini diperlukan oleh semua mahkluk hidup karena bersifat esensial dalam metabolism protein. Protein ini memiliki banyak struktur sekunder beta-sheet dan alpha-helix yang sangat pendek (Poliana, 2007).
Gambar 1. Struktur sekunder beta-sheet dan alpha-helix protein
Berdasarkan jenis residu asam amino dalam sisi aktifnya, protease dapat
7
Hartley (1960) membagi protease menjadi 4 golongan : 1. Protease serin,
a. Memiliki residu serin dalam lokasi aktifnya. b. Bersifat endopeptidase
c. Yang termasuk enzim ini: tripsin, kimotripsin, elastase dan subtilin 2. Protease sulfhidril
a. Memiliki residu sulfhidril pada lokasi aktif
b. Kerja enzim ini dapat dihambat oleh senyawa oksidator, alkilator dan logam berat
c. Yang termasuk enzimini : protease dari tanaman dan mikroba seperti papain, fisin dan bromelin
3. Protease metal
a. Keaktifannya tergantung pada adanya metal dengan hubungan stoikiometrik 1 mol metal/1 molenzim
b. Dapat dihambat oleh EDTA (Ethlene Diamine Tetra Acetic Acid) dimana dapat mengkelat metal sehingga keaktifan enzim hilang/berkurang. c. Yang termasuk enzim ini : karboksipeptidase untuk beberapa amino
peptidase 4. Protease asam
a. Enzim yang pada lokasi aktifnya terdapat dua gugus karboksil b. Aktif pada pH rendah,optimum 2,0-5,0
8
B.Penghasil Enzim Protease
Enzim protease dapat dihasilkan dari berbagai sumber, yaitu bakteri, jamur, virus, tumbuhan, hewan dan manusia. Protease yang dihasilkan dari berbagai bakteri kebanyakan bersifat basa dan netral, sedangkan protease yang dihasilkan oleh berbagai jamur dapat bersifat asam, netral, dan basa (Rao et al., 1998).
Salah satu sumber penghasil enzim protease yang banyak diteliti adalah bakteri. Pemilihan bakteri sebagai sumber enzim protease disebabkan beberapa alasan yaitu:
a. bakteri lebih mudah tumbuh dengan kecepatan yang lebih cepat dibandingkan makhluk hidup lainnya.
b. skala produksi enzim mudah ditingkatkan. c. biaya produksi enzim relatif rendah.
d. kondisi produksi tidak tergantung pada musim dan waktu proses produksi enzim lebih pendek (Poernomo, 2004).
9
Untuk menguji suatu biakan bakteri menghasilkan enzim protease ekstraseluler, maka bakteri tersebut harus ditumbuhkan pada medium padat yang
mengandung kasein yaitu Skim Milk Agar (Fardiaz, 1993). Kasein adalah salah satu jenis protein. Hidrolisis kasein digunakan untuk memperlihatkan aktivitas hidrolitik protease yang memutuskan ikatan peptida CO-NH. Hidrolisis protein ditunjukkan dengan adanya zona bening di sekeliling pertumbuhan bakteri (Susanti, 2003). Pengujian secara kualitatif bakteri penghasil enzim protease ekstraseluler dilakukan dengan cara mengamati zona bening yang berada disekitar koloni bakteri, kemudian membagi diameter zona bening dengan diameter koloni bakteri. Hasil bagi diameter tersebut dinyatakan sebagai aktifitas protease secara relatif (Sastono, 2008). Besar-kecil diameter zona menunjukkan konsentrasi dan aktivitas enzim yang dihasilkan (Palmer, 1995). Bakteri penghasil enzim protease ekstraseluler disebut juga sebagai bakteri proteolitik.
C. Bakteri Proteolitik
10
Tingkat aktivitas proteolitik dapat dilihat dari keaktifan enzim dalam menghidrolisis protein. Aktivitas bakteri proteolitik dapat diketahui secara kuantitatif dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang ultra violet 280 nm. Panjang gelombang tersebut dapat ditangkap dan dipantulkan kembali oleh asam amino suatu protein berdasarkan gugus aromatik terutama asam amino tirosin, triptofan dan fenilalanin. Kelebihan metode ini yaitu sederhana, mudah serta tidak memerlukan penambahan reagen tertentu (Walker, 2002).
Semua bakteri umumnya mempunyai enzim protease di dalam sel, tetapi tidak semua mempunyai enzim protease ekstraseluler. Struktur protein yang lebih kompleks menyebabkan dekomposisi protein oleh mikroorganisme lebih
kompleks dibandingkan pemecahan karbohidrat dan produk akhirnya juga lebih bervariasi. Mikroorganisme melalui suatu sistem enzim yang kompleks,
memecah protein menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana. Senyawa-senyawa intermediet dan produk akhir hasil pemecahan asam amino sangat bervariasi (Rao, et al., 1998).
Bakteri proteolitik dapat digolongkan menjadi beberapa kelompok (Rao, et al., 1998):
1. Bakteri aerobik atau anaerobik fakultatif, tidak membentuk spora, misalnya Pseudomonas dan Proteus.
11
3. Bakteri anaerobik pembentuk spora, misalnya sebagian spesies Clostridium.
D. Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim
Aktivitas enzim dipengaruhi oleh konsentrasi enzim dan konsentrasi substrat. Pengaruh aktivator, inhibitor dan kofaktor dalam beberapa keadaan juga merupakan faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim.
1. Efek suhu terhadap aktivitas enzim
Aktivitas enzim akan bertambah dengan naiknya suhu sampai tercapainya aktivitas optimum. Kenaikan suhu lebih lanjut akan mengakibatkan menurunnya aktivitas enzim dan pada akhirnya merusak enzim (Pelczar, 1986).
2. Efek pH terhadap aktivitas enzim
Perubahan pH akan mempengaruhi kecepatan reaksi enzim, karena
berubahnya derajat ionisasi gugus asam dan basa dari enzim. Sebagian besar enzim, mempunyai rentang pH optimum aktivitas enzim dan mempunyai tingkat stabilitas yang tinggi. Sebagian besar enzim mempunyai pH optimum yang mendekati netral, sebagian kecil lainnya mempunyai pH optimum yang sangat rendah (sekitar 2,0) atau sangat tinggi (sekitar 9,0).
3. Efek konsentrasi enzim terhadap aktivitas enzim
12
dengan konsentrasi substrat. Saat konsentrasi enzim meningkat, maka aktivitas enzim juga bertambah (Pelczar, 1986).
4. Efek konsentrasi substrat terhadap aktivitas enzim
Kecepatan reaksi yang dikatalisis oleh enzim sangat dipengaruhi oleh
konsentrasi substrat. Pada konsentrasi substrat yang sangat rendah, kecepatan reaksi yang dikatalisis enzim juga sangat rendah. Sebaliknya, kecepatan reaksi akan meningkat dengan meningkatnya konsentrasi substrat sampai tercapai titik tertentu, yaitu titik batas kecepatan reaksi maksimum. Setelah titik batas, enzim menjadi jenuh oleh substratnya, sehingga tidak dapat berfungsi lebih cepat. Pembatas kecepatan enzimatis ini adalah kecepatan penguraian
kompleks enzim-substrat menjadi produk dan enzim bebas (Lehningher, 1995).
5. Efek aktivator, inhibitor dan kofaktor terhadap aktivitas enzim
Aktifitas katalitik enzim dapat dipengaruhi oleh aktivator (bahan-bahan yang meningkatkan aktivitas enzim) dan inhibitor (bahan-bahan yang menurunkan aktivitas enzim). Berdasarkan kinetikanya, inhibitor dapat dibedakan menjadi inhibitor ireversibel dan reversibel (Palmer, 1995).
13
garam klorida. Kation-kation lain yang telah diketahui dapat mengaktifkan enzim adalah Na+, K+, Rb+, Cs+, Mg2+, Zn2+, Cu2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, dan Al3+ (Palmer, 1995).
E.Karakter Fisiologi Bakteri Proteolitik
Karakterisasi fisiologis dilakukan untuk mengelompokkan taksonomi
mikroorganisme termasuk taksonomi bakteri. Pengujian fisiologis terdiri dari uji motilitas, uji katalase, uji gelatin, dan uji fermentatif/oksidatif (Hadioetomo 1993) 1. Uji Katalase
Uji katalase merupakan suatu pengujian terhadap bakteri tertentu untuk
mengetahui bakteri tersebut merupakan bakteri aerob, anaerob fakultatif, atau anaerob obligat. Bakteri aerob menghasilkan hidrogen peroksida (H2O2) yang
sebenarnya beracun bagi bakteri sendiri. Namun untuk menjaga kelangsungan hidupnya, bakteri tersebut menghasilkan enzim katalase yang dapat mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen sehingga sifat toksiknya hilang (Pelczar 1986). Pada umumnya bakteri aerobik dan anaerobik fakultatif akan memproduksi hidrogen peroksida yang bersifat toksik terhadap bakteri yang masih hidup. Bakteri anerobik obligat akan mengalami kematian bila ada oksigen, disebabkan karena tidak adanya pembentukan enzim katalase sehingga H2O2 meracuni bakteri itu sendiri. Ada tidaknya pembentukan enzim katalase
14
Persamaan reaksi yang yang terjadi pada uji katalase dapat dilihat pada gambar 2.
2 H2O2 katalase 2 H2O
+
O 2Gambar 2. Reaksi uji katalase dengan bakteri yang mengandung enzim katalase (Hadioetomo 1993)
2. Uji Motilitas
Motilitas adalah salah satu dari ciri mikroorganisme yang memiliki alat gerak sederhana berupa flagella atau cilia. Sebagai petunjuk adanya aktivitas motilitas, dapat diamati pada daerah bekas tusukan medium yang telah
diinokulasikan oleh biakan dan diinkubasikan. Medium yang digunakan pada uji motilitas ialah sulfide indol motility (SIM). Pada medium ini ditambahkan senyawa anorganik yang mengandung sulfur, yaitu natrium tiosulfat. Natrium tiosulfat akan bereaksi dengan ion hidrogen dari air dan dengan adanya enzim tiosulfat reduktase, maka akan dihasilkan ion sulfit dan gas H2S. Gas ini akan bereaksi dengan feri ammonium sulfat yang ditambahkan (sebagai indicator untuk H2S) ke dalam media sehingga terbentuk FeS yang berwarna hitam. Pembentukan FeS inilah yang diamati sebagai penunjuk adanya aktivitas motil dari bakteri uji pada tabung yang berisi medium motilitas setelah
15
Berikut ini adalah mekanisme reaksi yang terjadi pada uji motilitas :
Gambar 3. Reaksi yang terjaadi pada uji motilitas
3. Uji Gelatin
Uji gelatin digunakan untuk mengetahui keberadaan enzim gelatinase yang dimiliki oleh bakteri. Media yang digunakan ialah gelatin. Gelatin merupakan protein yang diperoleh dari hidrolisis kolagen yaitu zat pada jaringan
penghubung dan tendon dari hewan. Gelatin akan terurai oleh jasad renik yang mempunyai enzim gelatinase. Larutan gelatin bersifat cair pada suhu ruang atau suhu kamar dan padat apabila berada di dalam refrigerator. Jika gelatin telah dihidrolisis oleh jasad renik maka akan tetap bersifat cair meskipun berada di dalam suhu dingin yang menunjukkkan reaksi positif (Hadioetomo, 1993).
4. Uji Fermentasi
16
Fermentasi terbagi atas dua jenis, yakni homofermentatif dan
heterofermentatif. Homofermentatif adalah fermentasi yang produk akhirnya hanya berupa asam laktat. Contoh homofermentatif adalah proses fermentasi yang terjadi dalam pembutan yoghurt. Heterofermentatif adalah fermentasi yang produk akhirnya berupa asam laktat dan etanol sama banyak. Contoh heterofermentatif adalah proses fermentasi yang terjadi dalam pembuatan tape (Belitz, et al, 2009).
F. Limbah Cair Nanas (LCN)
Limbah Cair Nanas (LCN) memiliki karakteristik keasaman dan kandungan bahan organik yang tinggi dicirikan oleh parameter derajat keasaman (pH), BOD (Biological Oxygen Demand) 338 mg/L, COD (Chemical Oxygen Demand) 4200 mg/L, dan TSS (Total Suspended Solid) 390 mg/L (Julius,2009) belum
memenuhi baku mutu yang dipersyaratkan. Pengolahan di Instalasi Pengolahan Limbah (IPAL) dengan sistem kolam (Lagoon) memerlukan tempat yang luas dan waktu tinggal lama sehingga kurang efisien. Berdasarkan masalah ini perlu teknologi pengolahan limbah yang berwawasan lingkungan dengan teknologi bioproses yang memanfaatkan kemampuan bakteri indigen pendegradasi polutan organik salah satunya dengan bioremediasi (Sutanto,2010).
17
organik adalah protein yang dapat menjadi sumber nutrisi bakteri proteolitik. Protein akan didegregdasi oleh mikroba menjadi asam amino (Schlegel, 1984), kemudian didegredasi lagi menjadi CO2, H2O, dan Amonia (NH3) yang di
18
III. METODE PERCOBAAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari sampai April 2014 di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.
B. Alat dan Bahan
1. Alat
19
2. Bahan
Adapun bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah aquadest, Phenol Red, Skim Milk Agar (SMA), Sucrose Broth, Lactose Broth, Dextrose Broth, bufer borat, TCA (Trichloroacetic Acid), CaCl2, cat kristal protein (Coomassie
Brilliant Blue), etanol, aseton, spirtus, Na2CO3, Nutrient Broth (NB), Natrium
Agar (NA), folin Ciocalteau, alkohol 70%, Hidrogen Peroksida (H2O2), Sulfit
Indol Motility (SIM), dan Kasein Hammerstein, Brom Cresol Purple Milk (BCPM), Gelatin Agar, .
C. Metode Penelitian
20
D. Analisis Data
Data aktivitas enzim protease yang diperoleh dilakukan analisis ragam dilanjutkan dengan menggunakan uji lanjut BNJ (Beda Nyata Jujur) 5%.
E. Prosedur Kerja
1. Peremajaan Stok Kultur Koleksi Bakteri
Isolat koleksi bakteri proteolitik( B1, B2, B3, dan B4) yang sudah murni,
diremajakan pada NA miring dengan cara menggoreskan satu ose dari tiap isolat bakteri dan di inkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Bakteri ini harus diremajakan 1 kali dalam sebulan, agar tetap mendapat nutrisi dan tidak mati.
2. Uji Proteolitik Secara Kualitatif dan Kuantitatif 2.1. Aktivitas Protease Secara Kualitatif
Uji proteolitik secara kualitatif isolat bakteri proteolitik dilakukan dengan menggunakan media Skim Milk Agar (SMA). Suspensi isolat Bakteri proteolitikyang telah diremajakan diambil sebanyak 1 ose dan di point plate ke dalam cawan petri yang berisi media Skim Milk Agar (SMA), lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0C. Aktivitas proteolitik dari bakteri proteolitik yang ditumbuhkan pada media SMA ditunjukan dengan terlihatnya zona bening yang muncul di sekitar koloni yang terbentuk (Putri, 2012). Indeks proteolitik dihitung dengan cara
21
proteolitik adalah perbandingan luas areal bening dengan luas koloni bakteri (Baehaki, 2011).
Rumus indeks proteolitik: a b Keterangan:
a = diameter zona bening
b = diameter koloni (Setyaningsih,2013)
Gambar 4. Penentuan indeks proteolitik.
2.2. Aktivitas Enzim Protease Secara Kuantitatif
2.2.1. Pembuatan Starter Isolat Bakteri Proteolitik
22
2.2.2. Produksi Enzim Protease
Starter bakteri proteolitik sebanyak 10% diinokulasikan ke dalam 50 ml media Nutrient Broth + Skim Milk, kemudian diinkubasi selama 24 jam di atas shaker incubator dengan kecepatan 120 rpm. Setelah 24 jam, kultur dimasukkan ke dalam tabung dan dipanen dengan cara disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh digunakan untuk uji aktivitas protease (Baehaki, 2011).
2.2.3. Penentuan Aktivitas Enzim Protease
Aktivitas protease diukur dengan metode Bergmeyer dan Grassl (1983), dengan menggunakan substrat Kasein Hammerstein 2% (w/v). Prosedur pengujian aktivitas protease adalah mereaksikan 0,2 ml enzim dengan 1 ml substrat Kasein Hammerstein dan 1 ml bufer borat. Campuran reaksi diinkubasi pada suhu 370C selama 10 menit, lalu ditambahkan 0,1 M TCA (Trichloroacetic Acid). Larutan diinkubasi kembali pada suhu 37 0C selama 10 menit, dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm 10 menit. Dari campuran hasil sentrifugasi diambil 1,5 ml supernatan dan ditambahkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 5 ml Na2CO3
23
inkubasi diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 578 nm.
Tabel 1. Metode Pengujian Aktivitas Enzim Protease Blanko
Substrat kasein (20 mmol, pH 8) Enzim dalam CaCl2(2mM)
Tirosin standard Inkubasi pada 370C selama 10 menit
TCA (0,1 M) Inkubasi pada 370C selama 10 menit
Sentrifugasi 4000 rpm selama 10 menit pada suhu 40C Filtrat Diamkan selama 20 menit pada suhu 370C
Baca absorbansinya pada panjang gelombang 578 nm
Aktivitas ptotease dihitung dalam satuan PU (Protease Unit) per ml ekstrak enzim (Djajasukma, 1993).
PU = � � −��� Asb : Nilai Absorbansi Sampel
24
3. Uji Fisiologi Isolat Bakteri Proteolitik
3.1. Uji Peptonisasi
Isolat bakteri proteolitik diremajakan pada media NA miring dan di inkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Kemudian diambil 1 ose isolat dan dimasukkan ke dalam media skim milk yang telah diberi indikator Bromocresol Purple. Perubahan warna media menjadi ungu muda menunjukkan terjadi fermentasi dan adanya endapan pada media menunjukkan terjadi peptonisasi(Nurhayati,2011).
3.2. Uji Fermentasi Gula
25
3.3. Uji Gelatin
Sebanyak 1 ose isolat bakteri proteolitik diinokulasikan pada media gelatin dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC. Kemudian kultur dimasukkan pada lemari pendingin dengan suhu 4oC selama 30 menit. Indikator pengamatan reaksi positif jika medium gelatin menjadi cair, dan negatif jika medium gelatin menjadi padat (Lay, 1994).
3.4. Uji Motilitas
Uji Motilitas dilakukan dengan cara menginokulasikan isolat bakteri dengan cara menusukkan jarum ose secara tegak lurus hingga setengah tinggi media Sulfit Indol Motility pada tabung reaksi. Media diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC, setelah itu diperhatikan ada tidaknya motilitas koloni bakteri. Terbentuknya warna hitam pada media SIM dan kekeruhan yang menyebar sepenjang bekas tusukan menandakan hasil sulfur positif.
26
Peremajaan Stok Kultur Koleksi F. Diagram Alir
Terbentuk Zona Bening
Pembuatan Stater Isolat
Bakteri Proteolitik
Produksi Enzim Protease Penentuan Aktivitas Enzim Dengan Spektrofotometer pada = 578 nm
Uji Fisiologi
Isolat Bakteri Proteolitik
Uji Proteolitik Kualitatif
Kuantitatif
Identifikasi jenis bakteri dengan pengecatan gram dan spora
Uji Katalase Uji Motilitas
Uji Fermentasi Gula
V. SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa :
1. Keempat isolat Bp tergolong sebagai bakteri dengan aktivitas protease sedang dengan aktivitas protease isolat Bp1 sebesar 0,0149 U/ml, isolat Bp3 sebesar
0,0037 U/ml, isolat Bp4 sebesar 0.0022 U/ml dan Bp4 sebesar 0.0011 U/ml.
2. Berdasarkan hasil pengamatan fisiologis keempat isolat digolongkan dalam bakteri Bacillus dengan bentuk basil, bersifat motil, positif terhadap uji katalase, sifat Gram positif, menghasilkan spora, bakteri homofermentatif, mampu mencairkan gelatin dan positif dalam uji petonisasi.
B. Saran
Dari hasil penelitian, isolat Bp1 dengan aktivitas proteolitik tertinggi dapat
39
DAFTAR PUSTAKA
Abraham et al. (1992). Understandings And Misunderstandings of Eight Grades of Five Chemistry Concepts Found in Textbooks. J. Research In Science Teaching 29(2); 105-120.
A. H. Akmal, dan Romita, A. 1996. Isolasi Mikroba Tanah Penghasil Antibiotika dan Sampel Tanah pada Lokasi Penumpukan Sampah. Cermin Dunia Kedokteran, No. 108,199645.
Arwiyanto,T., Maryudani, YMS. Azizah,N.N.2007. Sifat-Sifat Fenotipik
Pseudomonas fluoresen, AgensiaPengendalian Hayati Penyakit Lincat pada Tembakau Temanggung. J.Berk. Penel. Hayati 12; (93–98).
Bachdar, Saviq.2014. Puas di Pasar Ekspor Nanas GGP Akan Masuk Pasar Domestik .http://www.the-marketeers.com/archives/puas-di-pasar-ekspor-nanas-ggp-akan-masuk-pasar-domestik.Posting 30 Mei 2014.
Baehaki, A., Rinti, dan A. Budiman. 2011. Isolasi Dan Karakterisasi Protease Dari Bakteri Tanah Rawa Indralaya, Sumatera Selatan. J. Teknol. dan Industri Pangan, 22(1); 10-16.
Badriyah, Baital Izzatul dan Ardyati, Tri. 2013. Deteksi Aktivitas Proteolitik Isolat Bakteri Asal Ampas Tahu Pada Substrat Bekatul. J. Biotropika. Vol. 1( 3). Universitas Brawijaya.
Barrow, G.I., and R. K. A. Feltham. 1993. Cowan and Steel’s Manual for the
Identification of Medical Bacteria Third Edition. Syndicate of the University of Cambridge: United Kingdom.
Belitz, H.D. and Grosch W. 2009. Food Chemistry. Springer Verlag. Germany. Bergmeyer H.V., M. Grassl, dan H.E. Walter, 1983. Methods of Enzymatic.
Biro Pusat Statistik. 1994. Statistik Perdagangan Luar Negri Indonesia: Impor. BPS, Jakarta.
Cappuccino, J. G. 1983. Microbiology: A Laboratory Manual. Addison-Wesley: USA.
Coffman, Melodie Anne.2014. How Much Protein in a Serving of Skim Milk?. http://healthyeating.sfgate.com/much-protein-serving-skim-milk-4862.html. Demand Media.
Creighton, H. 1986. Law Every Nurse Should Know. Philadelphia:W.B. Saunders Fardiaz, Srikandi.1993.Analisis Mikrobiologi Pangan.Jakarta : PT.Raja Grafindo
Persada.
Hadioetomo RS. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek: Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. Jakarta: PT Gramedia Pustaka.
Harley and Prescott. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology. Fifth Edition. The McGraw−Hill Companies
H.G Schlegel, Mikrobiologi Umum, Yogyakarta: Gadjah Mada. University Press. Yogyakarta (1984).
H.M. Aksoy and S.K. Ozman-Sullivan. 2008.Isolation of Bacillus megaterium from Aphis pomi (Homoptera: Aphididae) and assessment of its pathogenicity. Journal of Plant Pathology 90; 449-452.
Indranada, Henry. 1994. Pengelolahan Kesuburan Tanah. Semarang . Bumi Aksara. I.Ruiz, M. C. Veiga, P. de Santiago and R. Blázquez. 1997. Treatment of
slaughterhouse wastewater in a UASB reactor and ananaerobic filter. Bioresource Technology. 60: 251-258.
Julius S. 2009. Kualitas Fisik Kimia IPAL PT .Great Green Pineapple Lampung. (Julius@ggpc.co.id). 21 Pebruari 2009. e-mail kepada Agus Sutanto (sutanto11@gmail.com).
Jutono, J. Soedarsono, S. Hartadi, S. Kabirun, S. Suhadi, D. dan Soesanto.
41
Kambey, N. 2006. Pengolahan Minyak Kelapa dengan Penambahan Enzim Bromelin dari kulit Nanas (Ananas comosus L). (Skripsi). FMIPA UNSRAT, Manado. Lay, Bibiana W. 1994. Analisis Mikrobiologi Di Laboratorium.Raja Grafindo
Persada.Jakarta.
Lehningher A.L.1995.Dasar-Dasar Biokimia.Thenawidjaja M, penerjemah. Jakarta: Erlangga.Terjemahan dari: Principles of Biochemistry.
Lehninger, A. L. 2005. Dasar-Dasar Biokimia Jiid 1. Erlanggga. Jakarta. Hal : 100- 105.
Nurhayati.2011. Isolasi dan Karakterisasi Bacillus sp. Penghasil Antimikroba Dari Saluran pencernaan Ayam Kampung (Gallus domesticus).(Skripsi). FMIPA UNILA.Lampung.
Nurhayati, Iis. 2001. Isolasi Bakteri Proteolitik dari Limbah Lateks Dan
Pemanfaatnya Untuk Penurunan Kadar Protein Karet Alam. (Skripsi). FMIPA IPB,Bogor.
Pakpahan, R. 2009. Isolasi Bakteri dan Uji Aktivitas Bakteri Protease Termofilik Dari Sumber Air Panas Sipoholon Tapanuli Utara Sumatera Utara. (Thesis). Universitas Sumatera Utara.
Palmer, T., 1995. Understanding Enzymes 4thedition. Prentice Hall, London. Pelczar, Michael J. ECS. Chan. 2008. Dasar-dasar mikrobiologi. Jakarta. UI Press. Pelczar MJ, ECS Chan.1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Imas T, penerjemah; Jakarta: UI Press. Terjemahan dari: Elements of Microbiology.
Poernomo, A. T., dan Purwanto, D.A., 2003. Uji Aktifitas Crude Enzim Proteolitik Bacillus subtilis FNCC 0059 Hasil Fermentasi Curah. Majalah Farmasi Airlangga, 3: 103–107.
Poliana J dan Mac CAP. 2007. Industrial enzymes: structure, function, and applications. Dordrecht: Springer Hal: 24.
Putri, Yunita Silvia. 2012. Skrining Dan Uji Aktivitas Enzim Protease Bakteri Dari Limbah Rumah Pemotongan Hewan. (Skripsi).Universitas Airlangga. Raihana, Nadia.2011. Profil Kultur Dan Uji Sensitivitas Bakteri Aerob Dari Infeksi
Luka Operasi Laparatomi Di Bangsal Bedah RSUP DR. M. Djamil Padang. (Artikel).Universitas Andalas. Padang. Posting September 2011.
Rao MB et al .1998. Molecular and Biotechnologi Aspect of Microbial Proteases. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63 (3): 597−635.
Risris, N.S., Sastro,Y., Bakrie,B.2011. Karakteristik Fisik, Kimia Dan Biologi Dari Tepung Limbah Rumah Potong Ayam Sebagai Bahan Baku Untuk Pakan Ternak (Jurnal Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2011). Balai Pengkajian Teknologi Pertanian Jakarta.
S. Julius. 2009. Department Waste Water Treatment PT.GGP Lampung, Indonesia.Private Communication.
Said I.M. dan Ningrum E.M. 2009. Karakterisasi dan purifikasi protease bakteri Bacillus sp. dan jamur Aspergillus sp. serta aplikasinya sebagai soaking agent pada proses penyamakan kulit kambing (Abstrak). Hibah Penelitian
Kerjasama (Hibah Pekerti) : LP2M, UNHAS. Makasar.
Sastono,U., Sutardi., Verdial,O.F.2008. Opimasi Pemecahan Emulsi Kanil Dengan Cara Pendinginan Dan Pengadukan Pada Virgin Coconut Oil (VCO): (Abstrak) Prosiding Seminar . Institut Pertanian Bogor .
Saputera, Firmansyah. 2014. Kandungan Gizi Bekatul. http://www.scribd.com/ doc/60250251/kandungan-gizi-bekatul. Akses 30 Juni pukul 8.17 wib Schlegel Hans G,. 1994. Mikrobiologi Umum. Penterjemah Tedjo Baskoro. Edisi
keenam. Gajah Mada University Press. Yogyakarta
Sekarrini, Arum dan D, Happy Athikah. 2014. Diversifikasi Pembuatan Tauco Dengan Penggantian Fungsi Kedelai Menggunakan Campuran Jagung Dan Tepung Ikan. Jurusan Teknik Kimia, Fakultas Teknik, Universitas
Diponegoro. Akses 17 Juni 2014.
Setyanigsih, I., Nurhayati,T., Aremhas, U. 2013. Pengaruh Media Kultivasi Chaetoceros gracilis Terhadap Kandungan Kimiawi dan Potensi Inhibitor Protease. J.Teknol. dan Industri Pangan 24(2). Institut Pertanian Bogor. Bogor.
43
Sutanto, A. 2011. Degradasi Bahan Organik Limbah Cair Nanas Oleh Bakteri Indigen. Jurnal Pendidikan Biologi Universitas Muhammadiyah Metro Lampung.1(4);151-159.
Susanti, Elfi. 2003. Penentuan Aktivitas Dan Jenis Protease Dari Bacillus sp. BAC4¹.Sainmat,1: 56-57.
Walker, John, M.2002. Protein Protocols Handbook. Humana Press Inc, Totowa Winarno,F.G.1980. Enzim Pangan. Pusat Pengembangan Teknologi Pangan. IPB,
Bogor.
Wanenoor. 2011. Sentral Dogma Biologi, Pengertian Gen, DNA, RNA, Ekspresi Gen, serta Transkripsi DNA.
http://wanenoor.blogspot.com/2011/11/sentral-dogma-biologi-pengertian-gen.html. Diakses tanggal 29 Agustus 2013.