• Tidak ada hasil yang ditemukan

Perbandingan metode KIT komersial dan SDS untuk isolasi DNA babi dan DNA sapi pada simulasi cangkang kapsul keras untuk deteksi kehalalan menggunakan real-time PCR (polymerase chain reaction)

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2017

Membagikan "Perbandingan metode KIT komersial dan SDS untuk isolasi DNA babi dan DNA sapi pada simulasi cangkang kapsul keras untuk deteksi kehalalan menggunakan real-time PCR (polymerase chain reaction)"

Copied!
82
0
0

Teks penuh

(1)

PERBANDINGAN METODE KIT KOMERSIAL DAN

SDS UNTUK ISOLASI DNA BABI DAN DNA SAPI

PADA SIMULASI CANGKANG KAPSUL KERAS

UNTUK DETEKSI KEHALALAN MENGGUNAKAN

REAL-TIME

PCR (

POLYMERASE CHAIN REACTION

)

SKRIPSI

RIAN HIDAYAT

NIM: 1111102000096

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

(2)

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

PERBANDINGAN METODE KIT KOMERSIAL DAN

SDS UNTUK ISOLASI DNA BABI DAN DNA SAPI

PADA SIMULASI CANGKANG KAPSUL KERAS

UNTUK DETEKSI KEHALALAN MENGGUNAKAN

REAL-TIME

PCR (

POLYMERASE CHAIN REACTION

)

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

RIAN HIDAYAT

NIM: 1111102000096

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

(3)
(4)
(5)
(6)

v

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta ABSTRAK

Nama : Rian Hidayat Program Studi : 1111102000096

Judul : Perbandingan Metode Kit Komersial dan SDS untuk Isolasi DNA Babi dan DNA Sapi dari Simulasi Cangkang Kapsul Keras untuk Deteksi Kehalalan Menggunakan Real-Time PCR (Polymerase Chain reaction)

Status kehalalan pada cangkang kapsul keras masih diragukan statusnya. Dari tiga ribu jenis obat baru ada tiga produk yang memiliki sertifikat halal. Analisis cangkang kapsul keras gelatin simulasi telah berhasil dilakukan dengan metode Real Time PCR. DNA cangkang kapsul keras gelatin simulasi diekstrasi dan diisolasi menggunakan kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) dan cell lysis buffer SDS 1%. Hasil ekstraksi dan isolasi dengan kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) dihasilkan DNA genom simulasi cangkang kapsul keras gelatin sapi dan babi dan kemurnian berurut-turut adalah antara 8,70 – 19,01 ng/µl dengan kemurnian 1.169 – 1.851 dan 2.30 – 9.54 ng/µl dengan kemurnian 1.310 – 2.013 sementara dengan cell lysis buffer SDS 1% adalah 13.30 – 15.39 ng/µl dengan kemurnian 1.345 – 1.424 dan 20, 53 – 36.99 ng/µl dengan kemurnian 1.276 – 1.299. Nilai konsentrasi dan kemurnian DNA genom dianalis dengan statistik yaitu uji t dengan nilai p = 0.936 (konsentrasi) dan p = 0.003 (kemurnian) sehingga tidak ada perbedaan yang signifikan rata konsentrasi dan ada perbedaan yang signifikan rata-rata kemurnian DNA antara metode isolasi DNA dengan kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) dan cell lysis buffer SDS 1%. Berdasarkan hasil tersebut disimpulkan bahwa metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Praparation lebih unggul daripada metode cell lysis buffer SDS 1%.

(7)

vi

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Name : Rian Hidayat Major : Pharmacy

Title : Comparison of high Pure PCR Tamplate Preparation Kit and SDS Method for Pig and Cow DNA Isolation from Hard Capsule Shell of Gelatin for Halal Auntetication Use Real Time PCR (Polymerase Chain Reaction)

Halal status on hard capsule shell has been hesitated it. Three of three thousand have halal sertificate. Analysis of gelatin hard capsule shell was successfully done with Real Time PCR method. DNA from gelatin hard capsule shell were extracted and isolated by

High Pure PCR Template Preparation (Roche®) kit and cell lysis buffer SDS 1%. Result of extraction and isolation with High Pure PCR Template Preparation (Roche®) kit from pig and cow gelatin hard capsule shell are approximately 8.70 – 19.01 ng/µl (purity = 1.169 – 1.851) and 2.30 – 9.54 ng/µl (1.310 – 2.013) while with cell lysis buffer SDS 1% are 13.30 – 15.39 ng/µl ( purity = 1.345 – 1.424) and 20, 53 – 36.99 ng/µl (purity = 1.276 – 1.299). DNA consentrations and purities value tested with statistic were t test. P values concentration and purity are 0.936 and 0.003 so it is not significance concentrations mean different and significance purity means both of them methods. Based on result that High Pure PCR Template Preparation (Roche®) kit method is the most better than cell lysis buffer SDS 1% method.

(8)

vii

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang senantiasa memberikan jalan keluar bagi hamba Nya yang meminta jalan keluar. Atas rahmat Nya skripsi yang berjudul “Perbandingan Dua Metode Isolasi DNA Babi dan Sapi dari Cangkang Kapsul Keras Gelatin Simulasi untuk Deteksi Kehalalan Menggunakan Real-Time

PCR (Polymerase Chain Reaction)” ini berhasil penulis selesaikan. Sholawat beriring salam semoga selalu tercurah limpah kepada baginda Rasulullah SAW, manusia terbaik sepanjang zaman, teladan umat manusia menjalani kehidupan.

Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat ujian akhir guna mendapatkan gelar Sarjana Farmasi (S.Far) pada Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta. Rampungnya penelitian dan penulisan skripsi ini pastilah atas bantuan berbagai pihak, dalam kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih yang sedalam-dalamnya kepada :

1. Bapak Dr. Arif Sumantri, M.Kes selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan (FKIK) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. Ibu Zilhadia, M.Si., Apt. sebagai Pembimbing I dan Ibu Ofa Suzanthi Betha, M.Si., Apt. sebagai Pembimbing II yang sudah membimbing dan memberikan ilmu, tenaga, pikiran, materi dan dukungan selama penelitian dan penulisan skripsi ini.

3. Bapak Yardi, Ph.D., Apt. dan Ibu Nely Suryani, Ph.D. Apt. selaku Ketua Program Studi dan Sekretaris Program Studi Farmasi FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

4. Kedua orang tua tercinta, ayahanda Sayat Hidayat dan ibunda Umi Sumiati yang senantiasa ikhlas memberikan yang terbaik bagi putranya. Kakak-kakak dan Adik-adik tercinta yang selalu memberikan keceriaan dan semangat bagi penulis.

5. Bapak dan Ibu pengajar serta segenap staf dan karyawan yang telah memberikan ilmu pengetahuan, bimbingan dan atau bantuan selama penulis menempuh pendidikan farmasi di FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

6. Teman-teman Farmasi “Beng-beng” yang telah menjadi memori berkesan selama penulis menuntut ilmu.

7. Teman-teman Pendidikan Dokter, Kesehatan Masyarakat, dan Keperawatan yang sudah mengispirasi dan menghiasi suasana kampus FKIK.

8. Kakak-kakak laboran Farmasi (Kak Rachmadi, Kak Eris, Kak Lisna, Kak Tiwi, Kak Liken, Mbak Rani) yang telah membantu penulis dalam melakukan penelitian di Labolatorium.

(9)

viii

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

11.Keluarga 3L (Liqoku, Liqomu, Liqota) Kak Sule, Kak Iyus, Suparman, Azmi, Dendi dan Ali serta Sahabat-sahabat seperjuangan di jalan dakwah yang selalu

mendo’akan dimanapun dan kapanpun semoga Allah mempertemukan kita

dalam surga-Nya.

Semoga semua bantuan yang telah diberikan mendapat ganjaran terbaik di sisi Allah SWT. Sekali lagi mohon maaf jikalau penulis hanya bisa memberikan ucapan terima kasih yang sedalam-dalamnya. Semoga skripsi ini bisa bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan dan menjadi amal jariah bagi penulisnya. Amiin.

Jakarta, 29 Juni 2015

(10)
(11)

x

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ... viii

(12)

xi

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.2.1 Alat ... 22

3.2.2 Bahan ... 22

3.3. Prosedur Kerja ... 23

3.3.1 Pembuatan Lembar Cangkang Kapsul Simulasi ... 23

3.3.2 Pembuatan Larutan Stok ... 24

4.1. Pembuatan Lembaran Simulasi Cngkang Kapsul Keras Gela tin Sapi dan Babi ... 29

4.2. Isolasi DNA ... 30

4.2.1 Isolasi DNA dengan Kit Komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (PCR) ... 30

4.2.2 Isolasi DNA dengan Larutan Ekstraksi SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate) ... 31

4.2.3 Pengukuran Isolat DNA ... 33

4.2.4 Hasil Analisis Pengukuran Isolat DNA dengan Statistika ... 35

4.3. Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dan Lembaran Cangkang Kapsul Keras Gelatin dengan Real Time PCR ... 36

4.3.1 Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dan Lembaran Cangkang Kapsul Keras Gelatin Simulasi dengan Primer Sapi ... 37

4.3.2 Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dan Lembaran Cangkang Kapsul Keras Gelatin Simulasi dengan Primer Babi ... 39

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN ... 41

5.1. Kesimpulan ... 41

5.2. Saran ... 41

(13)

xii

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Konversi Kolagen Menjadi Gelatin ... 6

Gambar 2.2 Struktur Kimia Gelatin ... 7

Gambar 2.3 a. Ikatan 3’-5’ Fosfodiester ... 10

b. Rantai DNA yang Lebih Sedrhana ... 10

Gambar 2.4 Perbedaan struktur DNA dan RNA ... 11

Gambar 2.5 Struktur Mitokondria ... 13

Gambar 2.6 Struktur mtDNA ... 13

Gambar 2.7 Tahapan PCR ... 19

Gambar 2.8 Bentuk Kurva Real-Time PCR ... 20

Gambar 4.1 a. Lembaran Cangkang Kapsul Keras Gelatin Sapi Simulasi ... 29

b. Lembaran Cangkang Kapsul Keras Gelatin Babi Simulasi ... 29

Gambar 4.2 Kurva Amplifikasi DNA Gelatin dan Simulasi Cangkang Kapsul Keras Gelatin pada Primer Sapi ... 38

(14)

xiii

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR TABEL

Tabel 1 Urutan Basa Primer dan Probe ... 23 Tabel 2 Hasil Analisis Metode Kit Komersial dan SDS ... 33 Tabel 3 Hasil Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometer DNA (Biodrop®) .... 34 Tabel 4 Distribusi Rata-rata Konsentrasi DNA Gelatin dan Simulasi Menurut

Konsentrasi DNA ... 35 Tabel 5 Distribusi Rata-rata Kemurnian DNA Gelatin dan Simulasi Menurut

(15)

xiv

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Kerangka Penelitian ... 47

Lampiran 2. Perhitungan Pembuatan Larutan Stok Cell Lysis Buffer SDS ... 48

Lampiran 3. Pembuatan Larutan Stok Cell Lysis Buffer SDS ... 49

Lampiran 4. Perhitungan Pembuatan Larutan Primer dan Probe serta Tm (Mel Ting Temperature) Primer ... 51

Lampiran 5. Tabel Spesifikasi Komponen Kit Komersial High Pure Pcr Tem plate Preparation (Roche®) dan Campuran Reaksi Hydrolisis Probe Mastermix ... 52

Lampiran 6. Gambar Presipitasi Protein ... 53

Lampiran 7. Hasil Analisis Nilai Konsentrasi dengan SPSS ... 54

Lampiran 8. Hasil Analisis Nilai Kemurnian dengan SPSS ... 57

Lampiran 9. Bagan Metode Isolasi DNA ... 60

Lampiran 10. Gambar Bahan-bahan yang Digunkan dalam penelitian ... 64

(16)

xv

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR SINGKATAN

BHQ-1 : Black Hole Quencher-1

BLAST : Basic Logical Aligment Search Tool

bp : Base pair

CP : Crossing Point

cyt b : Cytochorme b

dATP : Deoxyadenosine Triphosphate

dCTP : Deoxycytidine Triphosphate

dGTP : Deoxyguanosine Triphosphate

dNTP : Deoxyribonuleaside Triphosphate

dTTP : Deoxythmidine Triphosphate

DNA : Deoxyribonucleic Acid

FAM : Fluorescein Amidite

mtDNA : mitochondrialDeoxyribonucleic Acid

NCBI : National Center for Biotechnology Information

NTC : No Template Control

PCR : Polymerase Chain Reaction

qPCR : Quantitative Polymerase Chain Reaction

RE : Retikulum Endoplasma RNA : Ribonucleic Acid

Tm : Temperature Melting

(17)

xvi

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISTILAH

BLAST ; Basic Logical Aligment Search Tool merupakan program untuk menganalisis kesejajaran urutan basa query (DNA atau protein) dengan urutan basa DNA atau protein dari database NCBI Blastn : Nucleotide Blast atau bisa disebut blastn merupakan salah satu

fasilitas dari program BLAST untuk menganalisis kesejajaran nukleotida yang dimasukan pada query dengan nukleotida pada

database NCBI

CP : Crossing Point merupakan angka siklus yang menunjukkan awal permulaan akumulasi amplikon telah memasuki peningkatan log-linear

Fit Point : Metode penentuan CP melalui pertemuan antara garis threshold

dengan kurva amplifikasi

Garis Theshold : Garis horizontal penanda siklus awal dari reaksi PCR yaitu saat sinyal Flourescent berada pada titik terendah

NCBI : National Ccenter for Biotechnology Information merupakan suatu institusi yang dimiliki United States National Library of Medicine yang berperan sebagai sumber informasi perkembangan biologi molekuler. Dari situs NCBI dapat diakses database bioteknologi meliputi genebank, urutan basa DNA atau protein juga publikasi-publikasi ilmiah

Second Derivative : Metode penentuan CP dalam instrument LightCycler 480

Maximum : Dimana CP diperoleh berdasarkan saat kurva amplifiaksi mengalami kenaikan yang tajam

Query : Urutan basa yang dimasukkan ke dalam program BLAST untuk diketahui kesejajarannya dengan data yang tersedia

(18)

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB I

PENDAHULUAN

1.1 LATAR BELAKANG

Islam mengatur umatnya dalam dua perkara, yaitu halal dan haram.

Halal adalah segala sesuatu yang diperbolehkan dalam syari’at Islam

sedangkan haram adalah kebalikan dari halal (Al-Qardhawi, 1997). Pada hadist keenam dalam hadist Arba’in dijelaskan “Sesungguhnya yang halal itu jelas dan yang haram itu jelas. Di antara keduanya terdapat perkara-perkara yang syubhat (samar-samar) yang tidak diketahui oleh orang banyak. Maka siapa yang takut terhadap syubhat berarti dia telah menyelamatkan agamanya dan kehormatannya. Dan siapa yang terjerumus dalam perkara syubhat maka akan terjerumus dalam perkara yang diharamkan…” Salah satu perkara syubhat saat ini adalah sumber bahan baku cangkang kapsul keras dengan alasan baru ada 3 produk kapsul yang bersertifikat halal dari 3 ribu jenis obat yang ada di Indonesia (LPPOM MUI). Angka tersebut masih kecil dibanding dengan jumlah penduduk muslim Indonesia yang mencapai 85% (BPS dalam Vivikananda, 2014)

Perkara syubhat dalam cangkang kapsul keras terletak pada sumber bahan bakunya, yaitu gelatin. Gelatin saat ini umumnya berasal dari kulit, tulang sapi dan babi (GMIA, 2012) karena gelatin yang dihasilkan memiliki kualitas yang lebih baik dibandingkan dengan sumber lainnya seperti ikan. Keragu-raguan dalam memilih produk cangkang kapsul keras bertambah dengan diketahuinya bahwa produsen gelatin dunia masih didominasi oleh negara-negara non muslim (Eropa Barat, Kanada, dan Meksiko) (Jamaludin,

et al., 2012). Oleh karena itu, analisis untuk membedakan cangkang kapsul keras yang bersumber dari gelatin perlu dilakukan.

(19)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Spectroscopy dan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) yang dikombinasikan dengan Principal Component Analysis (PCA), dan metode SDS-PHAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Poly Acrilamide Gel Elektrophoresis) yang mampu mengidentifikasi fragmen gelatin hidrosilatnya berdasarkan perbedaan bobot molekul (Saputra, 2014 & Syafiqoh, 2014). Namun, metode ini belum bisa memberikan hasil yang maksimal dikarenakan protein tidak stabil dalam suhu panas sehingga hasil yang didapatkan akan berbeda-beda.

Pendeteksian gelatin babi dan gelatin sapi telah berhasil dilakukan oleh Demirhan., et al (2011), Izzah (2014) dan Puspitaningrum (2015) dengan mengidentifikasi DNA pada standar gelatin sapi dan babi dan produk gelatin (marsmallows, gums drops, dan beberapa makanan orang turki) dengan Real-Time PCR (Polyemerase Chain Reaction ). Analisis menggunakan Real-Time PCR (Polyemerase Chain Reaction) membutuhkan DNA genom yang berkualitas baik secara jumlah maupun kemurnian. Gelatin merupakan bahan olahan begitu pula cangkang kapsul keras gelatin yang kemungkinan jumlah DNA relatif sedikit akibat adanya pengolahan sebelumnya (Demirham, et al., 2011) sehingga diperlukan metode isolasi DNA yang lebih unggul dari segi konsentrasi DNA genom yang didapat,

tingkat kemurnian yang tinggi, efisiensi waktu pengerjaan, keamanan dan ekonomis.

Pada penelitian Izzah (2014) dan Puspitaningrum (2015) metode ekstraksi gelatin yang digunakan adalah kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®). Konsentrasi DNA genom yang didapatkan masih sedikit dan dengan tingkat kemurniaan yang belum masuk dalam kemurnian ideal terbukti tidak terbentuknya pita pada gel agarose. Namun, DNA genom yang didapatkan dapat teramplifikasi pada Real-Time PCR (Polyemerase Chain Reaction).

(20)

3

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

mampu terdeteksi oleh gel agarose tetapi penggunaan metode ini masih terbatas dalam bentuk jaringan utuh (daging) dan olahannya (Rahmawati, 2012 & Mulyana, 2010). Oleh karena itu, penelitian selanjutnya akan dilakukan pendeteksian gelatin sapi dan babi pada simulasi cangkang kapsul keras dengan Real-Time PCR (Polyemerase Chain Reaction) dengan metode ekstraksi menggunakan kit (High Pure PCR Template Preparation (Roche®)) dan cell lysis buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate).

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui metode yang paling cocok untuk isolasi DNA antara kit (High Pure PCR Template Preparation

(Roche®)) dan cell lysis buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate) yang akan diamplifikasi menggunakan Real-Time PCR (Polyemerase Chain Reaction) dengan gen spesifik mitokondria sitokrom b Sapi dan Babi.

1.2 RUMUSAN MASALAH

1. Bagaimanakah perbandingan metode isolasi DNA dengan kit komersial

High Pure PCR Template Preparation (Roche®) dan cell lysis buffer SDS 1% dalam mengisolasi DNA genom dari simulasi cangkang kapsul keras berbahan gelatin babi dan gelatin sapi terhadap DNA genom yang dihasilkan?

2. Apakah DNA genom dari simulasi cangkang kapsul keras berbahan gelatin babi dan gelatin sapi yang diisolasi dengan kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) dan cell lysis buffer SDS 1% dapat teramplifikasi dengan RT-PCR?

1.3TUJUAN PENELITIAN

1. Mengetahui perbandingan DNA genom yang dihasilkan dari simulasi cangkang kapsul keras berbahan gelatin babi dan gelatin sapi dengan metode isolasi DNA menggunakan kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) dan cell lysis buffer SDS 1%

(21)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 1.4MANFAAT PENELITIAN

(22)

5 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Gelatin

Gelatin merupakan suatu biopolymer yang dihasilkan dari hidrolisis kolagen yang umumnya berasal dari kingdom hewan dan sebagian besar penyusunnya adalah protein. (Bailey dan Paul, 1998). Kata gelatin sendiri berasal dari Bahasa latin yaitu “gelare” yang artinya membuat beku dan merupakan senyawa yang tidak terjadi secara alamiah (Glicksman, 1969). Sifat gelatin yang dapat membeku (gelling agent) dan mengental (thickening agent) menjadi keberadaanya sangat luas terutama dalam produk makanan (Mariod dan Adam, 2013).

Kolagen merupakan bahan utama dalam pembentukan gelatin yang sumbernya bisa dari hewan mamalia seperti tulang sapi dan kulit babi maupun ikan dan serangga (Mariod dan Adam, 2013). Kolagen akan menjadi gelatin dengan bantuan asam atau basa dan pemanasan yang bertujuan untuk memutuskan ikatan hydrogen dari molekul tropokolagen sehingga rantai-rantainya terpisah dan strukturnya rusak (Setiawati, 2009).

Perubahan kolagen menjadi gelatin dan gelatin menjadi gel dipengaruhi oleh konsentrasi dan suhu seperti yang disajikan pada gambar 2.1. Menurut

Belitz dan Grosch (1999) gelatin akan terbentuk apabila kolagen dipanaskan dengan suhu di atas suhu pengerutnya (T>Ts) di mana suhu pengerut (Ts) untuk kolagen dari kulit mamalia berkisar antara 60-650 C sehingga ikatan silang dari rantai triple helix pada kolagen akan terputus dalam jumlah yang sangat besar dan struktur kolagen akan terpisah menjadi gulungan (coils) secara acak yang larut dalam air. Pada saat konsentrasi rendah (C1), struktur intramolekuler gelatin akan membentuk untaian/ikatan-ikatan tunggal ( single-strands). Namun, untuk kembali ke kondisi semula (pada kolagen) pada saat

konsentrasi tinggi (C2) dan proses pendinginan berjalan lambat (ΔT1), apabila

(23)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Gambar 2.1 Konversi kolagen menjadi gelatin (sumber : Belitz dan Grosch, 1999 dalam

Hasan, 2007)

Berdasarkan perlakuan pada saat pembuatan, gelatin dibedakan menjadi dua perlakuan yaitu dengan asam atau basa. Gelatin dengan asam disebut gelatin tipe A dan dengan basa disebut gelatin tipe B. Gelatin tipe A memiliki titik isoelektrik pada pH 7-9 dan umumnya diperoleh dari kulit babi. Sedangkan gelatin tipe B memiliki titik isoelektrik pada pH 4.8 – 5.2 dan

biasanya diperuntukan untuk bahan yang keras dan liat seperti kulit sapi (Poppe, 1992).

2.1.1 Sifat Fisika dan Kimia Gelatin

(24)

7

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

lebih cepat pada suhu 650 C dan kekuatan gel dapat berkurang setengah kali semula ketika dipanaskan pada suhu 800 C selama 1 jam (Rowe,

Sheskey dan Owen, 2006).

Protein merupakan kandungan tertinggi pada gelatin, tetapi kadar lemaknya rendah. Gelatin kering dengan kadar air 8-12% mengandung protein sekitar 84% - 86%, lemak dan vitamin hampir tidak ada (Carr et al, 1995). Bobot molekul gelatin termasuk tinggi sekitar 20.000 g/mol sampai 250.000 g/mol (Fatimah, 2012). Adanya perbedaan bobot molekul tersebut ini memberikan dampak pada kekuatan gel yang dihasilkan. Semakin tinggi bobot molekul gelatin semakin tinggi bloom

(kekuatan gel) yang dihasilkan (Rabadiya, 2013). Kekuatan gel dapat ditentukan dengan menggunakan metode Gomez-Guillen et al (2010) dengan menggunakan analisis Tekstur Model TA-TX2 (Balti et al.,

2010).

2.1.2 Struktur dan Komposisi Kimia Gelatin

Sebagian besar kandungan gelatin adalah protein yang disusun dari beberapa asam amino. Komposisi asam amino gelatin bervariasi tergantung dari sumber kolagen, spesies hewan penghasil, dan jenis kolagen (Setiawati, 2009). Menurut Grobben et al., (2004) dalam Fatimah, (2009) gelatin terdiri dari 18 asam amino yang saling terikat oleh ikatan peptida dan sebagian besar penyusunnya adalah glisin dan prolin berturut-turut mencapai 30,5% dan 14,8% - 18%.

Glisin Prolin Y Glisin X Hidroksiprolin

(25)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Senyawa gelatin merupakan suatu polimer linier yang tersusun oleh satuan terulang asam amino yaitu prolin-glisin dan

glisin-prolin-hidroksiprolin yang bergabung membentuk rangkaian polipeptida. Seperti yang tunjukkan pada gambar 2.2 bahwa susunan asam amino gelatin merupakan triplet peptide, yaitu glisin-X-Y, dimana X umumnya adalah asam amino prolin dan Y umumnya adalah asam amino hidroksiprolin. (Viro, 1992).

2.1.3 Aplikasi dan Pemanfaatan Gelatin

Dalam produk pangan, gelatin menjadi bahan tambahan yang sering digunakan baik sebagai pengental, penstabil, pengikat, dan pengemulsi. Gelatin yang dicampurkan bervariasi mulai dari 0.015% - 9% tergantung fungsi keberadaannya dalam bahan campuran. Adapun produk pangan berbahan gelatin adalah jelly, marshmallows, gummy, wafer, dan cokelat. Selain digunakan dalam industri pangan, gelatin juga sering digunakan dalam industri fotografi, industri farmasi, dan produk kedokteran seperti cangkang kapsul keras dan lunak, pengikat pada tablet, suppositoria, gelatin sponge, dan pengganti plasma (GMIA, 2012).

Beberapa tahun terakhir fungsi penting gelatin lainnya telah diidentifikasi dan dikembangkan. Kemampuan gelatin yang mirip dengan lemak terutama teksturnya, menempatkan gelatin sebagai pengganti lemak pada beberapa aplikasi. Salah satu kelompok produk

utama dimana sifat ini digunakan adalah margarin makan rendah lemak (Tahmid, 2005).

2.2 Kapsul

(26)

9

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

menjadi dua kategori, yaitu kapsul keras (dua cangang) dan kapsul lunak (satu cangkang) (Ansel, 2005 & Rabadiya, 2013).

Cangkang kapsul umumnya tidak berbau dan tidak berasa. Cangkang kapsul gelatin dapat dibuat dengan berbagai ukuran dengan panjang dan diameter yang bervariasi. Pemilihan ukuran tergantung pada berapa banyak isi bahan yang akan dimasukkan ke dalam kapsul dan dibandingkan dengan kapasitas isi dari cangkang kapsul. Karena kepadatan dan penekanan dari serbuk atau campuran serbuk akan menentukan berapa jumlah yang dapat ditampung dalam kapsul dan karena tiap bahan mempunyai sifat tersendiri, maka tidak ada pengaturan yang ketat untuk menentukan ukuran kapsul yang tepat. Untuk diberikan kepada manusia, cangkang kapsul kosong berkisar dari 000 yang terbesar sampai no. 5 yang terkecil (Ansel, 2005)

2.2.1 Cangkang Kapsul Keras

Cangkang kapsul keras gelatin harus dibuat dalam dua bagian, yaitu badan kapsul dan penutupnya yang biasanya lebih pendek. Biasanya kapsul dikategorikan sebagai kapsul keras atau lembut dipengaruhi oleh keberadaan plasticizer seperti gliserol yang dapat membuat kapsul lembut dan elastis. Kapsul keras dikatakan ideal jika memiliki kekuatan elastisitas permukaan 200-300 bloom; viskositas (600 C / 6-23%b/b dalam air) 44-60 MP; pH 4,5-6.5 (Rabadiya, 2013).

2.3 Deoxyribonucleat Acid (DNA)

(27)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 2.3.1 Struktur Kimia DNA

Setiap nukleotida tersusun oleh tiga komponen, yaitu molekul gula

pentosa (deoxyribose untuk DNA dan ribose untuk RNA), gugus fosfat, dan basa nitrogen. Semua nukleotida memiliki gula pentose dan gugus fosfat dengan susunan dan bentuk yang identik, sedangkan untuk penyusun basa nitrogen mempunyai susunan dan bentuk yang berbeda dari satu nukleotida dengan satu nukleotida yang lainnya. Menurut molekulnya, basa nitrogen dibagi dua, yaitu basa purin (Adenin dan

guanin) dan basa pirimidin (cytosin, uracyl, dan thimin). Pada DNA penyusun basa pirimidin adalah sitosin dan timin, sedangkan pada RNA, yaitu sitosin dan urasil. Basa-basa tersebut berpasangan satu sama lain, yaitu pada DNA basa guanine berpasangan dengan basa sitosin membentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan basa adenine berpasangan dengan basa timin (pada RNA dengan urasil) membentuk dua ikatan hidrogen. Sehingga jumlah dari masing-masing basa baik purin maupun pirimidin akan selalu sama dalam molekul DNA (Muladno, 2010 dan Purves et al., 2004).

a b

Gambar 2.3 a. Ikatan 3’ –5’ fosfodiester,

b. Rantai DNA yang lebih sederhana (sumber: Champe, et al., 2011)

DNA merupakan poli-deoksiribonukleat yang mengandung

banyak mono-deoksiribonukleat yang dihubungkan secara kovalen

(28)

11

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta gugus 5’-hidroksil deoksipentosa pada satu nukleotida dengan gugus 3’ -hidroksil deoksipentosa yang berdekatan melalui gugus fosfat (gambar

2.3).

Rantai panjang ini dengan ujung -5’ (ujung dengan fosfat bebas) dan ujung -3’ (ujung dengan hidroksil bebas) yang tidak melekat pada nukleotida lain. Urutan basa DNA yang diperlihatkan pada gambar 2.3

dibaca “timin, adenine, sitosin, guanin” (5’-TACG-3’). Ikatan fosfodiester antara nukleotida (di DNA atau RNA) dapat diuraikan secara hidrolisis oleh bahan kimia, atau dihidrolisis secara enzimatik oleh famili nuklease: deoksiribonuklease untuk DNA dan ribonuklease untuk RNA (Champe, et al., 2011). Selain dari basa pirimidin (timin pada DNA dan urasil pada RNA) perbedaan antara DNA dan RNA lainnya adalah pada DNA untaiannya berbentuk double helix (untai ganda) sedangkan pada RNA single helix (untai tunggal) seperti pada gambar 2.4.

Gambar 2.4 Perbedaan struktur DNA dan RNA

(29)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Satuan panjang molekul DNA adalah pasang basa (pb). Satuan ini adalah unit ukuran panjang terkecil. Apabila molekul DNA hanya

berbentuk serangkaian nukleotida tunggal (tidak berpasangan ), maka unit satuannya basa (b) dan bukan pasang basa (pb) (Muladno, 2010).

2.3.2 Sifat Fisika DNA

Struktur untai ganda DNA dapat dipisahkan (dicairkan) menjadi dua untai komponen dalam larutan dengan cara meningkatkan suhu (>900 C) atau menurunkan konsentrasi garam. Akibatnya kedua tumpukan basa tidak saling menjauh, tetapi tumpukan basa-basa itu sendiri terurai meskipun masih berada dalam bentuk polimer karena adanya jembatan fosfodiester. Karena penumpukan basa dan ikatan hidrogen antar tumpukan, molekul DNA untai-ganda bersifat seperti batang yang kaku dan dalam larutan, DNA berbentuk seperti material kental yang akan kehilangan kekentalannya jika mengalami denaturasi. (Murray, et al., 2012). Denaturasi DNA bersifat reversible dimana proses renaturasi (pembentukan kembali struktur untai ganda dari keadaan terdenaturasi) dapat berjalan apabila suhu mendekati 600 C (Yuwono, 2009).

2.3.3 DNA Mitokondria

DNA mitokondria (mtDNA) adalah molekul DNA rantai ganda yang berbentuk sirkuler yang ditransmisikan secara maternal dan ukurannya relative sangat kecil dibandingkan dengan ukuran genom

(30)

13

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Gambar 2.5 Struktur Mitokondria (sumber : Susmiarsih, 2010)

Struktur organisasi mtDNA bersifat stabil, sehingga mtDNA hewan memiliki jumlah gen dan ukuran yang sama (gambar 2.6), yakni terdiri atas 13 gen yang menyandikan protein yaitu URF1, URF2, URF3, URF4, URF5, URF6, URFA6L, URF4L, Cytochrom Oxidase unit I,

Cytochrom Oxidase unit II, Cytochrom Oxidase unit III, Cytochrom b

dan ATPase 6 (terlibat dalam respirasi sel), 2 gen menyandikan rRNA (12S dan 16S), 22 gen menyandikan tRNA dan beberapa daerah lain

yang tidak menyandikan protein D-loop (Control Region) dan daerah

intergenic (Moritz et al, 1987 dan Solihin, 1994).

(31)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DNA mitokondria memiliki karakteristik yang mendukung dalam keperluan analisis biologi dan keragaman genetik, yaitu mtDNA mampu

meng-copy diri dalam jumlah yang tinggi (menjadikannya mudah diisolasi dan dipurifikasi), ukuran yang relative kecil sekitar 14 kb sampai 34 kb sehingga dapat dipelajari sebagai satu kesatuan yang utuh, dan memiliki laju evolusi yang tinggi sekitar 5-10 kali lebih cepat dari DNA inti (Hartati et al.,2004 dan Solihin, 1994).

2.4 Isolasi DNA

Analisis molekular merupakan suatu metode analisis yang lingkup pengerjaanya sampai ke tahap molekul seperti analisis asam nukleat dan protein. Salah satu analisis molekular adalah metode PCR (Polymerase Chain Reaction) yang dalam tahapannya ada proses isolasi DNA. Isolasi DNA adalah proses pemisahan DNA dari komponen-komponen penyusun sel lainnya. Proses ini melibatkan penghancuran membran sel (lisis), pemisahan DNA dari protein, dan pemurnian (purifikasi) DNA (Muladno, 2010).

Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan awal dari isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel (Holme dan Hazel, 1998). Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia seperti lisozim dan dikombinasikan dengan EDTA (Etilendiamin tetraasetat), SDS (Sodium Dodecyl Sulphate), sarkosil dan CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) (Muladno, 2010 dan Subandiyah, 2006).

(32)

15

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

darah (Khosravinia et al., 2007) serta mendegradasi protein globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel (Surzycki, 2000).

SDS merupakan deterjen kationik yang mampu melarutkan komponen lipid dan merusak struktur sekunder dan tersier protein yang terdapat pada membran sel sehingga merusak struktur membran sel (Kesmen et al., 2009; Maftuchah & Zainudin, 2006; Malisa et al., 2006). Metode isolasi dengan SDS lebih dikenal dengan metode fenol-kloroform. Buffer lisis metode ini biasanya terdiri atas EDTA, Tris HCL, NACL, dan SDS (Utami, et al., 2012). Setelah struktur sel rusak, komponen-komponen yang ada di dalamnya, yaitu RNA, DNA, lipid, dan karbohidrat akan keluar (Dale & Malcom, 2002).

Penggunaan EDTA dalam proses lisis berfungsi untuk melindungi DNA dari aktivitas endogenous nucleases karena EDTA ini merupakan agen pengkelat ion yang dibutuhkan sebagai kofaktor sebagian besar nucleases

(33)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Tahapan isolasi DNA yang kedua adalah pemisahan DNA dengan protein dengan cara penambahan fenol (mengikat protein dan sebagian kecil

RNA), kloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan) dan RNAse (Muladno, 2010 & Utami, 2012). Selain ketiga bahan kimia tersebut ada pula dalam proses ini menambahkan isoamil alkohol (kloroform:isoamil alkohol 24:1). Adanya isoamil alkohol bertujuan untuk mengurangi pembentukan busa (anti foaming agent) (Marmur, 1961 & Restu et al., 2012). Pada tahapan selanjutnya adalah purifikasi yang sebelumnya dilakukan proses presipitasi DNA dengan penambahan garam (NaCl) dengan konsentrasi tinggi sehingga dapat mengendapkan protein dikarenakan adanya proses salting out

(Kurniati, 2009). Pada salting out terjadi kompetisi antara protein dan garam dalam menghidrasi dalam proses solvasi, sehingga protein dapat mengendap (Plummer, 1971).

Seiring berkembangnya ilmu pengetahuan dan teknologi, metode isolasi DNA dapat dilakukan dengan waktu pengerjaan yang lebih efisien. Hal ini dikarenakan kegiatan preparasi larutan yang mendukung kerja isolasi dapat diminimalkan atau tidak dilakukan. Salah satu pengembangan teknik isolasi DNA, yaitu dengan penggunaan kit komersial yang semua larutannya sudah tersedia dalam satu paket dengan pertimbangan untuk penggunaan beberapa kali reaksi.

(34)

17

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 2.5 Polymerase Chain Reaction PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida melalui bantuan enzim dalam suatu thermocycler (Gaffar, S., 2007; Muladno, 2010; & Sulistyaningsih, 2007). Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum daerah target disebut primer forward dan yang berada setelah daerah target disebut primer reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA yang baru dikenal disebut enzim polimerase. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR, diperlukan juga dNTPs yang mencakup dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP (Muladno, 2010).

Menurut Gaffar (2007), PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis oleh DNA polymerase.

Keunggulan metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan basa nukleotida ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap n siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utama

pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target (Fatchiyah, 2008 dalam widiastika).

2.5.1 Komponen PCR

Ada 5 komponen penting dalam reaksi PCR, yaitu DNA target/tamplate, sepasang primer, enzim Taq Polymerase,

deoxynucleoside triphosphate (dNTP), dan larutan buffer PCR (Gaffar, 2007 dan Muladno, 2010).

(35)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Dalam proses PCR, DNA template berfungsi sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama atau molekul

DNA yang menjadi sekuen target yang akan diamplifikasi dan biasanya berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA yang mengandung fragmen DNA target yang dituju. Keberhasilan PCR tergantung dari ada atau tidaknya sekuen yang sama dengan primer.

2. Primer

Di dalam proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Pasangan primer terdiri dari 2 oligonukleotida yang mengandung 16 – 30 nukleotida dan mempunyai 40 – 60 % basa G-C content. Sekuen primer kurang dari 16 basa dapat memicu amplifikasi produk PCR non spesifik. Untuk ukuran primer yang pendek kemungkinan terjadinya mispriming

(penempelan primer pada situs non-target) tinggi, ini akan menyebabkan berkurangnya spesifisitas dari primer tersebut yang nantinya akan berpengaruh pada efektifitas dan efisiensi proses PCR. 3. dNTPs (Deoxynucleotide Triphosphates)

Dalam proses PCR dNTPs bertindak sebagai building block

DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA. dNTP akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA template. dNTPs merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat), dCTP (deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosintrifosfat).

4. Buffer PCR dan MgCl2

(36)

19

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase. Adanya MgCl2 akan meningkatkan interaksi primer dengan template DNA.

5. Enzim DNA Polimerase

Enzim DNA polymerase berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA. Pada proses PCR enzim ini diperlukan untuk tahap ekstensi DNA. Enzim polimerase DNA yang digunakan pada proses PCR diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik oleh karena itu enzim ini bersifat termostabil sampai temperatur 950 C. Aktivitas polymerase DNA bergantung dari jenisnya dan dari mana bakteri tersebut diisolasi. Sebagai contoh adalah enzim Pfu polimerase (diisolasi dari bakteri Pyrococcus furiosus) mempunyai aktivitas spesifik 10x lebih kuat dibandingkan aktivitas spesifik enzim Taq polymerase (diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus). Penggunaan jenis polymerase DNA berkaitan erat dengan buffer PCR yang dipakai.

2.5.2 Tahapan PCR

Adapun beberapa tahapan dalam proses PCR (gambar 2.7) adalah denaturasi (pemutusan untai ganda menjadi untai tunggal melalui pemanasan pada suhu 900 C 950 C).

Gambar 2.7 Tahapan PCR (Sumber. www. faculty.unlv.edu)

(37)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

berikatan dengan ikatan hydrogen pada suhu melting dimana separuh jumlah primer menempel pada template), dan extension (pemanjangan DNA dengan katalis enzim polymerase) (Gaffar, 2007; Muladno, 2010).

2.6 Real-time PCR

Real-time Polymerase Chain Reaction (RTPCR)merupakan salah satu teknik analisis yang paling banyak digunakan dalam biologi molekuler modern (Vaerman, 2004). Dibanding dengan teknik PCR konvensional ( end-point PCR), Real-time PCR memiliki berbagai keunggulan, yaitu amplifikasi atau perbanyakan fragmen DNA yang dapat diamati seketika (secara realtime) dan juga dapat menentukan konsentrasi target molekul DNA hasil amplifikasi.

Real-time PCR mendeteksi amplikon dengan mengukur adanya peningkatan

fluoroscent yang berpendar ketika terikat dengan doubled stranded DNA. Fluoresensi yang dihasilkan sebanding dengan jumlah DNA template yang teramplifikasi (Dooley et al., 2004). Dalam kurva amplifikasi ditunjukkan adanya 3 fasa yaitu fasa awal, fasa eksponensial dan fasa plateau seperti pada gambar 2.8 (Vaerman, 2004).

Gambar 2.8 Bentuk Kurva Real-time PCR (Sumber. Bio-rad.com)

(38)

21

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

probe menempel pada situs target pada saat annealing. Apabila probe

menempel pada produk PCR selama langkah elongasi, aktivitas 5’ -exonuclease dari enzim polimerase akan memotong probe. Pemotongan probe tersebut mengakibatkan terpisahnya reporter dari quencher yang menyebabkan sinyal reporter tidak lagi diredam sehingga fluoresensi

(39)

22 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

3.1.1 Tempat

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Analisis Pangan dan Obat Halal, Laboratorium Teknologi Sediaan Steril, dan Laboratorium Penelitian II, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan-Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.1.2 Waktu

Waktu pelaksanaan penelitian dilaksanakan dari bulan Maret 2015 hingga Juni 2015.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Real-Time PCR (LightCycler® 480.0-Roche), Sterofoam, tabung mikrosentrifus volume 1.5 ml (Biogenix), High Pure Filter Tube dan

Collection Tubes (Kit High Pure PCR Tamplate Preparation-Roche®), Plastic Wrap, Multiwell Plate 96 (Roche®), Sealing Foil (Roche®), Mikropipet 0.5 10 µl (Biorad), Mikropipet 2 20 µl (Biorad), Mikropipet 20 - 200 µl (Biorad), Mikropipet 100 1000 µl (Biorad), Mikrotips volume 10 µl, 200 µl, dan 1000 µl (Genfollower), Spatula,

Sentrifugator (5417R - Eppendorf), Vortex, Freezer, Digital Waterbath

(SB-100 Eyela), Autoklaf, batang pengaduk, gelas ukur, gelas beaker, cawan penguap, kertas perkamen, plastik tahan panas, timbangan analitik, kaca arloji, benang kasur, pipet tetes, Moisture Balance Analyzer, dan Spektrofotometer UV DNA (BioDrop®).

3.2.2 Bahan

Gelatin babi [Sigma-Aldrich], gelatin sapi [Sigma-Aldrich], satu set kit komersial High Pure PCR Template Preparation Roche® (meliputi:

(40)

23

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Wash Buffer, dan Elution Buffer), Tris Base, NaOH, NaCl, Sodium Dodecyl Sulphat (SDS), Na2EDTA, Kloroform, Aquabidest [Roche], Etanol Absolut [Merck], Etanol 70%, Isopropanol [Merck], LC TaqMan Probe Master (terdiri dari: Fast Start Taq DNA Polymerase, dNTP mix, MgCl2 6.4 mM) [Roche], dan Primer-probe (tabel 1).

Tabel 1. Urutan basa primer dan probe (Tanabe, et al., 2007 dengan modifikasi) Nama Primer Runutan Basa

Babi Forward 5'-ATCTTGCAAATCCTAACAGGCCTG-3'

Reverse 5'-CGTTTGCATGTAGATAGCGAATAAC-3'

Probe 5'-(FAM)-CACAACAACAGCTTTCTCATCAGTTACBHQ_1-3'

Sapi Forward 5'-CCCGATTCTTCGCTTTCCAT-3'

Reverse 5'-CTACGTCTGAGGAAATTCCTGTTG-3'

Probe 5'-(FAM)-CATCATAGCAATTGCC-BHQ_1-3'

3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Pembuatan lembar cangkang kapsul simulasi

a. Formulasi

Gelatin 30%

Sorbitol 5%

Pewarna 0.05%

Aquadest ad 100%

b. Cara Pembuatan

(41)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Selanjutnya, lembaran simulasi cangkang kapsul keras disimpan dalam wadah berisi silika gel.

3.3.2 Pembuatan Larutan Stok

Tahap pembuatan larutan stok cell lysis buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate) terdapat di lampiran 2.

3.3.3 Preparasi Sampel

a. Gelatin

Sebanyak 100 mg standar gelatin sapi dan gelatin babi ditimbang. Selanjutnya, masing-masing dimasukkan ke dalam

Microsentrifuge tube dan ditambahkan 200 μl aquabidest panas lalu diinkubasi pada suhu 750 C selama 30menit. Selanjutnya ditambahkan 250 μl Tissue Lysis Buffer (metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation Roche®) dan 400 μl Cell Lysis Buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate)] untuk melisiskan sel

dan 50 μl (metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation Roche®) dan 20 μl (metode cell lysis buffer SDS 1%) larutan Proteinase K. Untuk menghomogenkan larutan tersebut maka campuran di vortex selama 1 menit dan diinkubasi pada suhu 57 0 C selama 21 jam (metode kit komersial High Pure PCR

Tamplate Preparation Roche®) dan 3 jam (metode cell lysis buffer SDS 1%) dalam waterbath. Larutan gelatin yang dihasilkan selanjutnya digunakan untuk tahap isolasi DNA.

b. Cangkang Kapsul Keras Gelatin Simulasi

Sebanyak 50 mg cangkang kapsul keras gelatin sapi dan gelatin babi ditimbang. Selanjutnya, masing-masing dimasukkan ke dalam Microsentrifuge tube dan ditambahkan 100 μl aquabidest,

250 μl Tissue Lysis Buffer (Roche®) dan 400 μl Cell Lysis Buffer

(42)

25

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

jam (metode cell lysis buffer SDS 1%) dalam waterbath. Larutan gelatin yang dihasilkan selanjutnya digunakan untuk tahap isolasi

DNA.

3.3.4 Isolasi DNA

Metode 1 [Isolasi DNA dengan Kit Komersial High Pure PCR

Tamplate Preparation (Roche®)]

Meode isolasi DNA mengikuti metode Izzah (2014) dengan modifikasi. Larutan (gelatin sapi, gelatin babi, simulasi cangkang kapsul keras gelatin babi, dan simulasi cangkang kapsul keras gelatin sapi) hasil inkubasi ditambahkan 230 μl larutan Binding Buffer.

Campuran tersebut divortex selama 20 detik untuk menghomogenkan dan diinkubasi pada suhu ± 70oC selama 10 menit pada waterbath.

Penambahan 150 μl isopropanol pada masing-masing tube dan dihomogenkan dengan vortex selama 20 detik. Selanjutnya campuran tersebut dipipet dan dimasukkan ke filter tube yang sebelumnya telah terpasang pada collection tube, kemudian tube

ditutup dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit.

Proses selanjutnya, filter tube dilepaskan dari collection tube

dan cairan yang melewati filter dibuang bersamaan dengan collection tube. Filter tube dipasangkan kembali dengan collection tube yang

baru. Kemudian, ditambahkan 500 μl Inhibitor Removal Buffer ke dalam filter tube dan disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Sama seperti sebelumnya setelah disentrifugasi filter tube

dilepaskan dari collection tube dan cairan yang melewati filter dibuang bersamaan dengan collection tube. Filter tube dipasangkan kembali dengan collection tube yang baru. Masing-masing tube ditambahkan

500 μl Wash Buffer kemudian sentrifugasi kembali dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Pencucian dilakukan sekali lagi dengan

(43)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

setrifugasi kembali selama 10 detik dengan kecepatan 12000 rpm diasumsikan agar tidak ada lagi wash buffer yang tertinggal pada filter.

Tahapan selanjutnya yaitu mengelusi DNA yang terdapat pada filter tube dengan cara pisahkan collection tube dari filter tube

dan pasangkan dengan microsentrifuge tube yang bersih dan steril.

Kemudian ditambahkan 200 μl Elution Buffer yang sebelumnya telah dihangantkan pada suhu 70oC selama 3 menit lalu disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 8000 rpm. Pada microsentrifuge tube

telah mengandung DNA terpurifikasi dan disimpan pada suhu 4oC untuk dianalisa selanjutnya.

Metode 2 [Isolasi DNA dengan menggunakan Cell Lysis Buffer

SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate)]

Metode yang digunakan mengikuti metode isolasi Zheng, et al.,

(1995) dalam Utami (2012) dengan modifikasi. Larutan (gelatin sapi, gelatin babi, simulasi cangkang kapsul keras gelatin babi, dan simulasi cangkang kapsul keras gelatin sapi) hasil inkubasi disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit pada suhu 40 C. Supernatan dipisahkan pada microtube baru dan ditambahkan 400 μL kloroform dan divortex selama 20 detik. Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 13.000 rpm selama 20 detik pada suhu 40 C. Lapisan atas yang terbentuk dipisahkan pada microtube baru dan ditambahkan 800

μL etanol absolut dan diinkubasi pada suhu -350 C selama 1 jam. Sentrifugasi dilakukan 13.000 rpm selama 20 detik . Endapan berupa pellet DNA ditambahkan 500 μL Etanol 70% dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13.000 rpm selama 20 detik. Pellet yang telah kering diresuspensi dengan 50 μL TE dan disimpan pada suhu -350 C.

3.3.5 Pengukuran Kemurnian dan Kuantitas DNA

(44)

27

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DNA (Biodrop®) dipilih Nucleac Acid. Selanjutnya, sample port dibersihkan dengan tisu steril. Elution Buffer (metode kit Komersial

High Pure PCR Template Preparation (Roche®)) dan Trish-EDTA (metode cell lysis buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate) bertindak sebagai blangko. Sebanyak 2 µl sampel isolat dari masing-masing metode diteteskan ke bagian sample port untuk diukur kemurnian dan kuantitas DNA dengan menekan tombol measure. Tunggu beberapa detik akan muncul data kemurnian dan kuantitas DNA.

3.3.6 Amplifikasi DNA dengan metode Real-Time PCR

Larutan induk primer dan probe dengan konsentrasi 100 μM dibuat dan dimasukkan ke dalam tube. Kemudian kedua larutan

tersebut dibuat menjadi primer dan probe konsentrasi 10 μM dan

disimpan ke dalam tube yang lain. Master Mix dibuat dengan volume

total 20 μL yang terdiri dari 5 μL template DNA, 1.4 μL Aquabidest, 1.6 μL primer forward konsentrasi 0.8 μM, 1.6 μL primer reverse konsentrasi 0.8 μM, 0.4 μL probe konsentrasi 0.2 μM, dan 10 μL

LightCycler® 480 probe master (enzim FastStart Taq DNA Polymerase,

dNTP mix, dan 6.4 mM MgCl2).

Master mix dimasukkan ke dalam multiwell plate pada well yang diinginkan dan ditutup dengan sealing foil. Dilakukan proses

pengaturan program LightCycler® 480 Real-Time PCR yang akan digunakan untuk proses amplifikasi. Setelah campuran reaksi total PCR dan program amplifikasi telah siap, campuran reaksi total PCR diletakkan pada multiwell plate yang ditutup menggunakan sealing foil, kemudian diletakkan pada mesin real-time PCR. Instrumen real-time PCR akan mengamplifikasi DNA secara otomatis dan langsung memberikan hasil amplifikasi melalui monitor dalam bentuk kurva.

3.3.7 Analisis Statistik

(45)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

IBM SPSS Statistics 20 dengan taraf kepercayaan 95% dengan Uji t sehingga dapat diketahui apakah perbedaan rata-rata yang diperoleh

(46)

29 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada penelitian ini dilakukan pengujian terhadap DNA simulasi cangkang kapsul keras dengan Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction). DNA didapatkan dari proses ekstraksi dan isolasi simulasi cangkang kapsul keras dengan menggunakan kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) dan larutan ekstraksi SDS 1% (Sodium Dodecyl

Sulphate).

4.1. Pembuatan Lembaran Simulasi Cangkang Kapsul Keras

Lembaran simulasi cangkang kapsul keras dibuat dari standar gelatin sapi dan babi, sorbitol, aquadest, dan pewarna tartrazin. Penggunaan gelatin sebagai bahan utama didasarkan atas pemanfaatan sifatnya yang sebagai

gelling agent (GMIA, 2012).

a b

Gambar 4.1 a. Lembaran simulasi cangkang kapsul keras gelatin sapi b. Lembaran simulasi cangkang kapsul keras gelatin babi

Lembaran simulasi cangkang kapsul keras gelatin sapi dan babi yang dihasilkan berupa lembaran tipis, sedikit transparan, dapat digulung, berwarna kuning terang (asal gelatin babi) dan kuning cokelat (asal gelatin sapi). Perbedaan warna yang dihasilkan tersebut akibat dari warna asal serbuk gelatin (serbuk gelatin babi putih dan serbuk gelatin sapi kuning-cokelat).

Hasil simulasi cangkang kapsul keras ditunjukkan pada gambar 4.1.

(47)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 4.2. Isolasi DNA

Isolasi DNA dilakukan dari gelatin sapi, babi, dan simulasi sapi dan

babi dengan cara mengekstraksinya. Metode ekstraksi yang digunakan ada dua cara, yaitu menggunakan kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) dan larutan ekstraksi SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate). Prinsip metode tersebut intinya sama yaitu penghancuran membran sel (cell lysis), pemurnian dari sel debris dan protein (purifikasi), dan presipitasi DNA (Muladno, 2010 dan Rochec, 2007).

4.2.1. Isolasi DNA dengan Kit Komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®)

Kit Komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) terdiri dari lima larutan yang terpisah dan memiliki spesifikasi masing-masing seperti yang terperinci dalam lampiran 4 Prinsip dari kit ini adalah DNA sampel diabsorpsi oleh Silikon Dioksida (SiO2) yang terdapat dalam filter tube dan selama pencucian dan pemusingan DNA tetap terikat dengan fiber glass sehingga ini dapat meminimalisir kehilangan DNA pada saat isolasi DNA (Izzah, 2014 dan Rochec, 2007).

Metode isolasi dengan kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) mengikuti metode Izzah (2014) dengan mengalami modifikasi pada jumlah volume penggunaan Tissue Lysis Buffer, Binding Buffer, dan Proteinase K. Peningkatan jumlah volume penggunaan bahan tersebut berdasarkan arahan dari protokol Kit Roche® apabila dalam penggunaan prosedur isolasi tidak memberikan hasil yang memuaskan. Modifikasi pada penggunaan bahan tersebut didasarkan pada peran masing-masing, yaitu Tissue Lysis Buffer

(48)

31

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

banyak DNA yang terikat kuat, dan Proteinase K yang mempunyai peran untuk menghilangkan protein sehingga dengan begitu ketika

jumlah Proteinase K ditingkatkan maka jumlah kontaminan protein dalam isolat DNA semakin kecil.

Keunggulan dari metode kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) adalah sederhana dan ekonomis. Dikatakan sederhana karena dalam pengerjaannya tidak rumit (proses presipitasi dihilangkan) dan aman (risiko terpapar bahan toksik dapat dihindari seperti tidak adanya penggunaan kloroform dan deterjen). Metode ini juga relatif ekonomis karena tidak membutuhkan banyak pelarut namun kandungannya lengkap seperti diperlihatkan pada lampiran 4. Dalam penelitian yang menjadi kelemahan dari metode kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) adalah relatif lama dalam pengerjaannya karena waktu proses lisis sel yang dilakukan overnight dan hanya dapat digunakan untuk beberapa reaksi saja.

4.2.2. Isolasi DNA dengan larutan ekstraksi SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate)

Salah satu metode konvensional untuk isolasi DNA adalah dengan penggunaan deterjen dan agen pengkhelat dalam proses

lisisnya (Muladno, 2010). Deterjen yang digunakan dalam penelitian adalah SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate) yang merupakan deterjen kationik yang memiliki kemampuan dapat melarutkan komponen lipid dan merusak struktur sekunder dan tersier protein yang terdapat pada membran sel sehingga struktur membran sel menjadi rusak (Kesmen,

(49)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

proteinase K. Sampel isolasi dalam penelitian ini adalah gelatin sapi dan babi dan simulasi sapi dan babi. Penambahan proteinase K

bertujuan untuk menghilangkan kontaminan protein dalam isolat DNA dan memberikan aktivitas dari SDS 1% menjadi lebih optimal (Hilz, et al., 1975 dan Muladno, 2010).

Larutan yang digunakan dalam metode konvensional ini adalah kloroform, etanol absolut, dan etanol 70%. Fungsi dari kloroform adalah untuk presipitasi protein, sedangkan etanol absolut dan etanol 70% berturut-turut berperan sebagai presipitasi DNA dan purifikasi DNA (Utami, et al., 2012). Pada saat presipitasi DNA terbentuk 3 lapisan seperti yang diperlihatkan pada lampiran 5 yaitu lapisan atas adalah fase air, lapisan tengah adalah protein, dan lapisan bawah adalah fase organik (kloroform). Kejadian ini terjadi karena adanya perbedaan masa jenis. Masa jenis air lebih kecil (1 g/mL) dari masa jenis kloroform (1.4474 g/mL) shingga air berada di lapisan atas dan kloroform berada di lapisan bawah. Lapisan atas merupakan fase air yang mengandung DNA terlarut akibat dari sifat keduanya yang sama-sama polar. Sifat DNA yang polar dikarenakan adanya muatan negatif pada rantai fosfat sedangkan protein berada pada pelarut organik (kloroform) akibat sifatnya yang nonpolar (Rahmawati,

2002).

Proses presipitasi dilakukan dua kali yang bertujuan untuk memperkecil DNA dari kontaminan protein. Adanya DNA pada fase air maka lapisan ini diambil dan dipisahkan untuk proses presipitasi DNA. Presipitasi DNA menggunakan etanol absolut dengan cara membuat DNA menjadi kurang hidrofil sehingga DNA mengendap. Pemisahan endapan (pellet) dan supernatan perlu kehati-hatian karena akan menentukan pada kemurnian isolat yang dihasilkan.

(50)

33

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

yang hanya diperlukan 3 jam dalam penelitian sehingga total pengerjaan kurang lebih 5 jam (lihat tabel 4.1).

Tabel 4.1 Hasil Analisis Metode Kit Komersial dan SDS

Nama Metode Waktu kemungkinan kehilangan isolat lebih tinggi akibat dari pengulangan tahapan tersebut dan tingkat keamanan yang harus diperhatikan karena kontak dengan bahan-bahan yang toksik (serbuk SDS, kloroform, etanol absolut) dalam jumlah yang cukup banyak serta membutuhkan biaya yang mahal.

4.2.3. Pengukuran Isolat DNA

Isolat DNA yang dihasilkan diukur menggunakan alat Spektrofotometer DNA (Biodrop®) pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Hasil analisis diinterpretasikan pada tabel 4.1.

Analisis isolat DNA didapatkan nilai konsentrasi (jumlah DNA) dan kemurnian. Pengukuran nilai konsentrasi didasarkan pada prinsip

iradiasi sinar ultra violet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam isolat. Secara maksimal penyerapan iradiasi oleh DNA dicapai

(51)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

dengan metode cell lysis buffer SDS 1% berkisar 16.73 – 20.83 ng/ µl, 4.55 – 11.97 ng/ µl, 13.30 – 15.39 ng/ µl, dan 20.53 – 36.99 ng/ µl. Hasil konsentrasi gelatin sapi dan babi dengan metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) yang didapatkan lebih besar dari penelitian sebelumnya yang hanya sekitar 19.38 ng/ µl untuk gelatin sapi dan 13.63 ng/ µl untuk gelatin babi (Izzah, 2014). Secara garis besar isolasi dengan metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) memperoleh konsentrasi DNA yang lebih tinggi dibandingkan metode isolasi dengan cell lysis buffer SDS 1% karena pada metode kit tidak terjadi proses presipitasi dan kandungan reagennya lebih banyak seperti adanya Urea dan Triton X namun pada simulasi babi sebaliknya metode SDS yang lebih tinggi.

Tabel 4.2 Hasil Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometer DNA (Biodrop®)

(52)

35

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Hasil pengukuran kemurnian yang didapatkan belum dikatakan murni. Menurut Muladno, (2010) bahwa DNA yang dikategorikan

murni berkisar 1.8 – 2. Dalam penelitian, nilai kemurnian gelatin sapi, gelatin babi, simulasi sapi, dan simulasi babi pada metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) berturut-turut berkisar 1.561 – 1.698, 1.369 – 1.707, 1.169 – 1.851, dan 1.310

– 2.013 sedangkan metode cell lysis buffer SDS 1% berturut-turut 1.351 – 1.401, 1.092 – 1.284, 1.345 – 1.424, dan 1.276 – 1.299. Berdasarkan nilai-nilai tersebut dapat disimpulkan bahwa isolasi dengan metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation

(Roche®) memberikan hasil kemurnian yang lebih bagus dikarenakan adanya pengikatan DNA pada fiber glass (silikon dioksida) sehingga pencampuran dengan bahan lain dapat diminimalisir.

4.2.4. Hasil Analisis Pengukuran Isolat DNA dengan Statistika

Analisis pengukuran isolat DNA dilakukan dengan bantuan program statistik, yaitu software IBM SPSS Statistics 20 bertujuan agar lebih mudah dan cepat. Adapun hasilnya disajikan dalam tabel 4.2.

Tabel 3. Distribusi Rata-rata Konsentrasi DNA Gelatin dan simulasi menurut konsentrasi DNA Keterangan : a. Kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®)

(53)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

data konsentrasi ini memenuhinya. Dari tabel 3. rata-rata konsentrasi DNA metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation konsentrasi DNA antara metode isolasi DNA dengan kit komersial

High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) dan metode isolasi DNA dengan cell lysis buffer SDS 1%.

Tabel 4. Distribusi Rata-rata Kemurnian DNA Gelatin dan simulasi menurut kemurnian DNA Keterangan : a. Kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®)

b. Cell Lysis Buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate)

c. Standar Deviasi d. Standar Error

Dari tabel 4.3 rata-rata kemurnian DNA metode kit komersial

High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) adalah 1.60325 dengan standar deviasi 0.084976 , sedangkan untuk metode cell lysis buffer SDS 1% rata-rata kemurnian DNA-nya adalah 1.31025 dengan standar deviasi 0.092500 . Hasil uji t didapatkan nilai p=0.003, berarti pada alpha 5% terlihat ada perbedaan yang signifikan rata-rata kemurnian DNA antara metode isolasi DNA dengan kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) dan metode isolasi DNA dengan cell lysis buffer SDS 1%.

4.3. Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dan Lembaran Simulasi Cangkang Kapsul

Keras Gelatin dengan Real Time PCR

Amplifikasi DNA dengan Real Time PCR menggunakan metode

(54)

37

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

sapi dan 60 siklus menjadi 65 siklus untuk primer babi. Persiapan metode

Hydrolisis Probe adalah menentukan sepasang primer target spesifik dengan cara mendesain primer. Dalam penelitian, primer yang digunakan mengacu pada Tanabe, et al., (2007) dalam Izzah (2014) dengan modifikasi.

4.3.1 Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dan Lembaran Simulasi Cangkang

Kapsul Keras Gelatin dengan Primer Sapi

Proses amplifikasi dilakukan dalam 3 tahap, yaitu tahap denaturasi, anealing, dan ekstensi. Denaturasi adalah tahap dimana DNA tamplate membelah menjadi untai DNA tunggal pada suhu 950 C. Suhu tersebut merupakan waktu optimal DNA terdenaturasi (Muladno, 2010). Tahap penempelan (anealing) antara primer dan DNA tamplate

pada suhu 610 C sesuai optimasi yang dilakukan oleh Izzah (2014). Salah satu keberhasilan dalam amplifikasi PCR adalah tergantung pada suhu annealing primer. Jika suhu annealing terlalu tinggi, oligonukleotida primer tidak akan menempel dengan baik, sehingga hasil produk akan sangat sedikit. Namun, apabila suhu annealing terlalu rendah, primer dapat menempel pada bukan situs target (non-spesific), sehingga dihasilkan produk PCR yang tidak diinginkan bahkan bisa jadi tidak ada produk yang dihasilkan (Dale & Malcom, 2002; Bartlet & Stirling, 2003).

Format deteksi dari Hydrolisis Probe adalah FAM ( 6-carboxyl-flourescein) sebagai reporter dan BHQ1 (Block Hole Quencher) sebagai

(55)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Gambar 4.2 Kurva Amplifikasi DNA Gelatin dan simulasi cangkang kapsul keras gelatin pada primer sapi

Keterangan : DS (Daging sapi), DB(daging babi), GS (Gelatin Sapi metode kit), GS2 (Gelatin sapi metode SDS), GB (Gelatin babi metode kit), GB2 (gelatin babi metode SDS), SS (simulasi cangkang kapsul keras gelatin sapi metode kit), SS2(simulasi cangkang kapsul gelatin sapi metode SDS), SB (simulasi cangkang kapsul keras gelatin babi metode kit), SB2 (simulasi cangkang kapsul keras gelatin babi metode SDS), dan NTC (No Tamplate Control)

Data kualitatif yang diperoleh dari hasil analisis berupa Crossing point (Cp). Cp adalah nilai dimana flouresens pada sampel meningkat di atas fase lag (background) dan ini menjadi tanda pada siklus keberapa sampel mulai teramplifikasi seperti diperlihatkan pada gambar

4.2.

Dari hasil kurva amplifikasi terlihat kenaikan kurva (membentuk fase log) pertama kali dari daging sapi sesuai gambar 4.2 dengan Cp 13,92; selanjutnya diikuti berturut-turut gelatin sapi metode SDS (26.47), simulasi sapi metode SDS (27.77), simulasi sapi metode kit (27.85), gelatin sapi (29.78), dan daging babi (33.49). Kenaikan tersebut menandakan primer yang dipakai spesifik dikarenakan semua sampel yang sebagai kontrol positif dapat teramplifikasi dan NTC tidak mengalami kenaikan. Naiknya daging babi kemungkinan pada saat pengerjaan reaksi RT-PCR terkontaminasi. Real time PCR ini dapat

Gambar

Gambar 2.1 Konversi Kolagen Menjadi Gelatin  ............................................
Tabel 1 Urutan Basa Primer dan Probe  ..............................................................
Tabel Spesifikasi Komponen Kit Komersial High Pure Pcr Tem
Gambar 2.1 Konversi kolagen menjadi gelatin (sumber : Belitz dan Grosch, 1999 dalam
+7

Referensi

Dokumen terkait

gel ekstrak dan fraksi metanol daun kesum dengan metode Simplex Lattice Design (SLD) sehingga dapat diperoleh sediaan gel.. yang bersifat hidrofilik

Hasil penelitian menunjukkan: Minat studi lanjut siswa SMA/SMK Kota Bogor setelah lulus sekolah berada pada level sangat kuat, Mayoritas siswa SMA/SMK Kota Bogor

Dalam Tugas Akhir ini, beberapa hal yang akan dijadikan objek penelitian adalah unsur-unsur yang diperlukan untuk membuat game bertemakan Sawunggaling seperti Cerita

Dalam kegiatan penelitian aktivitas antioksidan ini, perubahan nilai absorbansi DPPH kontrol awal yang terjadi setelah pereaksian dengan infusa daun kelor memberikan data

Departemen sebagaiman telah delapan kali diubah terakhir dengan Peraturan Presiden Nomor 4 Tahun 2OL3 (Lembaran Negara Republik Indonesia Tahun 2OI3 Nomor

Pembangunan jalan alternatif kota Idi bertujuan untuk menghindari masalah kemacetan di sekitar kota idi, pembangunan jalan tersebut telah dimulai sejak tahun 2010 dengan

IAIN Syekh Nurjati Cirebon menerapkan Kurikulum Berbasis Kompetensi (KBK) dengan tujuan agar lulusan memiliki kompetensi yang menjadi tujuan dan sasaran jurusan/ prodi.. Mata

Dari hasil uji lanjut, aktivitas terbaik antibakteri Escherichia coli sediaan granul instan ekstrak sirih dan jahe terdapat pada formula I dengan potensi yang