Konstiuksi Pustaka cDNA Sengon (Paraserianthes falmtaria L. Nielsen ) Yang Terinduksi Oleh Serangan Hama Boktor (Xystrosera festiva)

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

(9)

(10)

(11)

(12)

(13)

(14)

(15)

(16)

(17)

(18)

(19)

(20)

(21)

(22)

(23)

(24)

(25)

(26)

(27)

(28)

(29)

(30)

(31)

(32)

(33)

(34)

(35)

(36)

(37)

(38)

(39)

(40)

(41)

(42)

(43)

(44)

(45)

(46)

(47)

(48)

(49)

(50)

(51)

(52)

(53)

(54)

(55)

(56)

(57)

(58)

(59)

(60)

(61)

(62)

(63)

(64)

(65)

(66)

(67)

(68)

(69)

(70)

(71)

(72)

a

KONSTRUKSI PUSTAKA cDNA SENGON

(Parmerianthes falcataria

L.

Nielsen) YANG

TERINDUKSI

OLEH

SERANGAN

HAMA

BOKTOR

(Xystrosera festiva)

OLEH

N.

SRI HARTATI

PROGRAM PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(73)

N. SRI HARTATI. Konstruksi Pwtaka cDNA Sengon (Parczserimthes

faleafaria L. Niefsen) Yang Terinduksi Oleh Semngan Hamrt B Q ~ X (Xystrmra festiva)). Dibrrwah bimbingan SUHARSONO sebagai ketua dm ENNY

SUDARMONOWATI sebagai anggota.

Penelitian ini bertujuan untuk mengklon gen-gen sengon yang terinduksi oleh swangim hama boktor melalui konstnrksi pustaka GDNA Vektor yang digunakan gdalah pSPORTl yang membawa gen penanda resistensi terhadap ampisilin (A& dan lacOPZ' penyandi P-galaktosidase. RNA total diisolasi dari kambium batang mngon yang terideksi dan yang tidak terideksi oleh hama boktor secara terpsah. Isolasi mRNA dari RNA total dilakukan Bengan metda fiaksinasi pada kolom oligo-dT seblosa. DNA komplementer @DNA) yang disintesis &%an menggunakan

mRNA

sebagai cetkan disisipkan pada situs

Notl- EcoRl yang terletak pada daerah 1acOPZ'. Plasmid rekombinan diintroduks'lkan ke daiaxn sel ~ c h e r i c h i a coli DH5a. Frelcuensi rekombinan yang diperdeh

adalah

31,91% dan 67,58% masing-masing

untuk

E wli yang

ditransformasi dengan plasmid rekombinan yang mengandung cDNA sengon yang terinfeksi dengan hama boktor dan yang tidak terinfeksi. A d i s i s pustaka cDNA dilakukan dengan mengamplifikasi sisipan cDNA pada mesin

PCR

menggunakan primer M13 (reverse dan forward) serta restriksi dengan Not1 dan

(74)

SURAT PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa t i i s yang bejudul

KONSTRUKSI PUSTAKA eDNA SENGON ( P ~ v ~ a n t h c ~ falcataria

L.

NSdscn)

YANG

TERIlWW#SI O m H SERANGAN HAMA BOK~@R (Xystmsetrz fdm)

Adalah

be=

merupakan hasil karya sendiri dan belum pentah dipubiikaikan. Semua sumbe?. data dan infonnasi yang digunakan telah dinyatakm jelas dan dapat diperiksa kebenarannya.

N.

Sri Hartati

(75)

Judul Tesis : Konstiuksi Pustaka cDNA Sengon (Paraserianthes falmtaria L. Nielsen ) Yang Terinduksi Oleh

Serangan Hama Boktor (Xystrosera festiva)

Nama : N. Sri Hartati

Nomor Pokok : 99637

Program Studi : Bioteknologi

Menyetujui

Ketua

2. Ketua Program Studi

u.

Muhammad Jusuf

C Dr. Ir. Ennv Sudarmonowati

Anggota

Mengetahui

ur Program Pasca

~ i ~Manuw d a

. Sarjana

,oto. MSc.

(76)

KONSTRUKSI PUSTAKA cDNA

SENGON

( P a r d a n t h a

falcataria L.

Nielsen)

YANG

TERINDUKSI

OLEH

SERANGAN

HAMA BOKTOR

(Xystrwera

f&a)

N.

SRI

HARTATI

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk rnernperoleh gelar Magister Sains pada

Program Studi Bioteknologi

PROGRAM

PASCASARJANA

(77)

RIWAYAT EUDUP

Penulis dilahirkan di Tasikmalaya, Jawa Barat pada fanggal 26 Desember

1969 sebagai anak pertma dari pasangan Bapak Maryoto

(ah)

dan Ibu Ati

Susilawati. Penulis rnenyelesaikan jenjang pendidikan formal di SD Negeri

Arjasari 1 pada tahun 1981, SMP Negeri 1 Singaparna pada tahun 1984 dm

SMA Negeri 1 Tasikmalaya pada tahun 1987. Pada tahun yang sama penulis

rnelanjutkan pendidikan di Institut Teknologi Sepuluh Nopember, Surabaya dan

memperoleh gelar Sarjana Kimia pada bufan Februari 1992.

Pada tahun 1999 penu1is diterima di Program studi Bioteknologi,

Program Pasmsarjana Institut Pertanian Bogor. Penulis bekeja sebagai staf

peneliti pada Pusat Penelitian Bioteknologi-Lembaga Ilmu Pengetahuan

(78)

PRAKATA

Puji syukur penulis p 8 t l . h ke hadirat Allah swt atas selesainya karya tulis i h i a h ini. Top& yang dipiff aeSalah Konstruksi Pustaka cDNA Sengon (Panwaianthes falcafmk

L.

Nielson ) Yang Tcriiaduksi

0 1 ~ B

Serangan Hama Boktor (xystrosm f k s t h ).

T g r i m m diucapkan

lrepada

Dr. Ir. Suharsono dm Dr. Ir: Emy Sudarmonmti

selaku

pembimbing, atas gagasan dan dorongan yang sangat berguna dalam memyelesaikan penelitian serta penulisan tesis; Ketua Program

Studi

be-

staf

atas kqemayaan

dan

kasediaannya mendidik penulis khususnya

ddam

bidang biologi nroleh1er;

Df

ektur

Program Pasea sajana IPB

beserta staf atas jdsymm

sel.83a

p d s menempuh pendidikan; Kepala Pusat Pmlitian Bideknologi UP1 begesta staf yang telah memberikan ijin belajar serta fasiritas penelitign; Dr. Made Sri Pram dm Dr. Titik

K.

Pransl,

atas segala dukmgmnya; Vivi Ang%raini, Elfawati dim Budi Saksono, atas semua saran yang berkaitan dengan teknis pditian; Pak Yitno, untuk dokumentasi hasil penelitian, Pak Nanang, atsrs bambmya dalam koleksi bahan penelitian; rekan- rekan di Labomtmium Biologi Wekuler 3 yaitu Retno, Santi, Tati, Upi, Soni, Bodhi, Tia, atas semua bantuan dan kebersamaan selama pemtlis melakukan penelitian; kepada orang tua

dan

adik-adik, keluarga (Anwar dan Harits), atas semua kasih sayang yang selalu menyertai perjalanan penulis; kepada semua teman Program Studi B i o t c h o ~ angkatan 99, Aryanti, Atmitri, Ragapadmi,

F

-

Lizawati

dan

b s u s kepada Enung Sri Mulyaningsih, atas kebemamaan yang sangat M.

Kegiatan penelitian

ini

didukung oleh proyek penelitian "Rekayisa

Genet& Sengon", kerjasama antam k t Penelitian Bioteknologi-LIP1 dengan Perum Perhutani, dibawah koordinator Dr. Ir. Emy Sudarmonowati. Dengan denikian, has3 penelitian yang diperoleh sepenuhnya milik kedua instansi tersebut. Kepda kedua fihak, pa&s mengucapkan terimakasih atas kesempatan yang dib- untuk d a k h&ah satu topik penelitian yang berkaitan

dengan kerjamma teastbut. Sdwgian studi penulis dibiayai oleh PPKT, Lembaga Ilmu Pen@ahn Indonesia, terinrakasih atas kesempatan yang dibePikan.

Akhir

kata, semoga

intbrm6 yang dfsajikan Mam karya tulis ini berguna bagi k e m a j w ilmu pengehhuan.

(79)

DAFTAR TABEL DATAR GAMBAR

TINJAUAN

PUSTAKA

Hama b o b (Xyslrwra fe 3 W ) Inter* h~ma-tammm

Konstruksi pustaka cDNA Isolasi RNA

Isolasi mRNA Sintesis cDNA

Perkifam jumlah Idon cDNA ymg ideal

BAHAN DAN METODE Bahan tawnan

Persiapon alat dan bahan untuk igolasi RNA Tahapan penelhian

Isolasi RNA total Isolasi mRNA Sintesis cDNA

Konstruksi plasmid rekomb'm

Introddcsi plasmid rekombinaa

kt

dalam baktei Analisis pustaka GDMA

HASIL DAN

PEMBAHASAN

Serangan X jestbm t e r U p sagon Isolasi RNA total

Isolasi mRNA Sintesis cDNA

Konstnrksi pustaka cDNA Analisis pustaka cDNA

KESIMPULAN SARAN

(80)

Tabel 1 Jurnlah koloni hail transformasi plasmid rekombinan dan fiekuensi rekombinan

Halaman

[image:80.555.73.478.0.783.2]

(81)

-bar 1 Mekanisme pertahanan yang terinduksi oleh serangan hama. 7

GIMbar 2 Peta pSPORTl dan multi situs pengklonan (MCS: Mulriple

Cloning Sites) 28

Cirnbar 3 Penampalcan sengon yang terserang hama boktor 3 1 G a m h 4 Hasil dektroforesis RNA total yang diperoleh dengan

[image:81.555.75.493.133.780.2]

metoda 1-3 33

Gambar 5 Hasil elektroforesis RNA total yang diperoleh dengan

metoda 4 34

Gambar 6 Isolasi mRNA melalui kolom oligo-dT selulosa 35

Gambar 7 Hasil elektroforesis mRNA 36

Gambar 8 Hasil elektroforesis cDNA 37

Gambar 9 Diagram sintesis cDNA dan penyambungan dengan

pSPORTl 39

Gambar 10 Koloni bakteri E colz DH5 yang mengalami transformasi

dengan plasmid rekominan 40

Gambar

1 1A Hasil elektroforesis pernotongan plasmid rekombinan

dan pSPORTl dengan EcoRl dan Not 1 42 Gambar 11B Hasil elektroforsis pernotongan plasmid rekombinan

dan pSPORT1 dengan b R l 43'

Gambar 12 Hasil elektroforesis produk amplifikasi DNA sisipan

(82)

Latar Belakang

Sengon (Paraseriunthes f a l c c ~ t ~ a L. Nielsen) merupakan &ah satu

jenis pohon yang dilrembangkan dalam program Hutan Tanaman Industri.

Tanaman ini mempunyai sifat-sifat unggul yaitu dapat tumbuh cepat pada tanah

miskin hara dan drainase yang kurang baik, batang lurus, dan muki guna sebagai

kayu pertukangan maupun bahan

baku

_{industri pulp. Sifatnya yang turnbuh cepat}

sangat sesuai digunakan dalam reboisasi dan penghijauan lahan-lahan kritis

sebagai penyubur tanah.

Masalah penting dalam tegakan sengon yang hampir selalu mengancam

program pembangunan hutan sengon adalah masalah hama dengan dampak

kerusakan yang cukup besar. Xystrosera festiw yang lebih dikenal sebagai

kumbang penggerek batang (uter, wowolan, boktor) merupakan hama utama

pohon sengon. Harna ini secara ekonomis sangat merugikan walaupun masih ada

hama-harna lain yang mengganggu tetapi merupakan hama sekunder (Suratmo,

Serangan X festiva dapat mengakibatkan turunnya kuditas kayu dan

kadang-kadang mematikan pohon inang. Pada serangan yang berat kulit pohon

akan mengering dan pecah-pecah, bahkan sebagian daunnya akan mengering dan

gugur (Nandika dan Wiseno, 1993). Penggerekan bathg mengakibatkan

msaknya bagian dalam kulit kayu sehingga kulit akan mati dan terkelupas. Bila

tidak terjadi serangan berulang-ulang, pertumbuhan pohon yang cepat akan

menyembuhkan luka-luka dengan cara pembentukan kalus. Akan tetapi

(83)

sthingga banyak pohon yang mati atau patah. Kerusakan tersebut

akan

m n u n k a n volume dan kualitas kayu pertukangan yang dihasilkan (Husaeni

dan Nandika, 1991).

Cara pengendalian yang benar-benar efektif hingga saat ini. belum

ditemukan. Berklcan ha1 tersebut peflu dilalnrkan usaha untuk mengatasi

m a d a h hama yang melibatlcan pendekatan biologi molekuler. DaIam rangka

mengatasi hama boktor yang lebih komprehensif dengan pendekatan biologi

molehler, dipandan8 perh untuk melakukan karakterisasi gen-gen yang

terinduksi oleh serangan hama boktor.

Respon yang dilakukan oleh tanaman saat terjadi interaksi dengan hama,

adalah melakukan sintesis berbagai molekul toksik baik molekul protein rnaupun

non pratein yang m g s i untuk perliiungan terhadap hama.

Perubahan

yang

terjadi pada tanaman sebagai akibat adanya kerusakan atau cekaman dise6ut

sebagai respon dari suatu induksi. Warn beberapa kasus, respon terjadi sebagai

sistem ketahanan suatu tanaman terhadap pelukaan oleh herbivora atau patogen.

Pelukaan jaringan tanaman dapat menginduksi sintesis senyawa fitokimia

tertentu sebagai bent& respon tamman. Respon ini bervariasi sesuai dengan

genotip tanaman, ontogmi, fenologi serta interaksi antara tanaman dengan

lingkungan abiotik dan biotik. Panda dan Kush (1995) mengemukakan bahwa

d a l m beberapa penelitian, respon tamman t d a p hama ditunjukkan oleh

adanya perubahan dalam kandungan tanin dan fen01 yang merupakan produk

jalur asam sikimat. Disamping itu aktifitas relatif fenil alanin ammonia liase

(84)

a k t i h PAL dapat menjadi indikator adanya tingkat ketahanan tanaman

twhadap suatu cekaman.

Pada

jenis tanaman tertentu seperti kentang, telah dike&& adanya

proddcsi senyawa fitoaleksin yang berbobot molekul rendah dan terakumulasi

wbagai respon tanaman terhadap m g g a (hama). Akumulasi fitoaleksin

sew respon tehadap kerusftkan oleh hama, mikroba atau pelukaan secara

mekanik telah diketahui terjadi pada beberapa famili tanaman meliputi

Legummoseae, &Ahnaceae, dan Compositae. Perkembangan lebih lanjut,

beberapa peneliti berhasil mengungkapkan adanya respon k e t a b n tanaman

terhadap hama yang melibatkan sekelompok inhibitor proteinase seperti pada

Salix viminalis (Saarikoski et al., 1996), kentang (Gruden et al., 1997), ubi jalar

(Yeh el

al.,

1997) dan buncis (Gin et al., 1998).

Penapisan gen-gen yang terlibat dalam sintesis senyawa-senyawa yan'g

berhubungan denga. pertahanan terhadap hama dapat dilakukan terhadap

pustaka cDNA yang disintesis dari mRNA. Penapisan suatu gen yang terinduksi

atau yang didEspresh pada jwingan tertentu dari pustaka cDNA, dapat

dilakukan melahi penapisan d i f m i a l atau plus minus screening maupun

hibridisasi asam nukIeat &ngan pelacak berupa gen tertentu. Penapisan

diferensial dilakulcan dengan melacak pustaka cDNA dengan dua jenis pelacak

berbeda baupa cDNA yang b r a d dari jaringan yang mengekspresikan gen

I

terinduksi dan yang tidak terinduksi atau jaringan cDNA dari dua jenis jaringan

yang berbeda.

Ukuran -men c ~ ~ ~ - u r n u m n ~ a lebih kecil dibandingkan dengan gen

(85)

sebagai vektor untuk mengklon cDNk Melalui konstmbi pustaka cDNA

sengoa mbngguItakan plasrnid pSPORTI diharaph dgpat diperoleh cDNA ymg

khubungan dengan g~n-gen ketahanan yang twinWsi oleh m g a n hama

Tujuan Penelitian

Penelitian ini M j u a n untuk mengkonstntksi pustaka cDNA tanaman

sengon Yang terinduksi oleh arangan hama bolctor, sehingga dapat digunahn

sebagai bahan penapisan untuk gen-gen yang berkaitm dengan ketahanan

terhadap serangan k a a dalarn m g k a perbailcan sifat tanaman sengon di masa

yang akan datang.

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Biologi Molelculer 3,

Pu&

Penelitian Bioteknologi LPI. Penelitian dilaksanakan sejak bulan Februari 2001

(86)

TINJAUAN PUSTAKA

Hama sengon yang secant ekommis sangat merugikan adalah penggerek

batang boktor (Xystrmera fern). Hama ini mempunyai nama daerah uter-uter,

boktor, wowolan, kumbang serendeng, dan engkes-engkes, yang tennasuk ke

dalam famili Cerambicidae clan ordo Coleoptera. Hama ini menyerang beberapa

spesies dari famili Leguminoceae sepwti Albizia falcatma

(P.

falcataria), A.

sumparm, A. strfilda, A. lebbeck, dan Pithecellobiurn lobdurn (Suratmo, 1982;

Nandika dan Wiseno, 1993).

Hama ini biasanya menyerang saat sengon berumur 3 tahun dan bila

serangan dibiarkan selama 2-5 tahun s e l w h tanaman &an rusak . Serangan

ditandai dengan warna merah kecokhtan pada batang. Serangan yang terjadi

pada kayu kadang sampai sekeliling batang dan bila demikian maka tajuk akan

menguning sehingga daun berguguran dan akhirnya pohon &an mati.

Derajat serangan hama pohon sengon dipengaruhi oleh umur pohon,

ketinggian, diameter batang serta p l a taaam. Derajat serangan kumbang

penggerek pada sengon cenderung semakin besar menghti pertumbuhan pohon

dan serangan terbesar terjadi pa& ketinggian batang 6,s

-

9 m (Hasan et al.,

1990). Hama boktor pada umumya menyerang batang-batang pohon yang besar

sehingga dapat diambil kesimpulan bahwa semakin tuai umur pohon maka

serangan hama ini pada sengon akan semakin besar. Berdaszukan pengamatan

dilapangan, besar kerusakan yang diakibatkan oleh serangan X festiva mencapai

(87)

Bebentpa peaelitian mengenai penggunaan insektisida tetah dilakukan

untuk mengatasi m&ah hama seperti insektisida kontak Sumithion SO EC dan

Sumialpha 25

EC

serta insek-tisida sistemik Suscon Blue yang disemprotkan

langsung. Insektisida ini dapat rnematikan imago maupun larva X' f e s t h .

Berbagai usaha yang dilakukan untuk mengatasi masalah hama baik dengan cars

men- pola tanam maupun penggunaan insektisida belum efektif untuk

mengendalikan serangan hama.

Interaksi hama-tanaman

Mekanisme perlindungan tanaman _terhadap_hama_dan_patogen_terdiri_dari

mekanisme konstitutif dan mekanisme terinduksi. Mekanisme konstitutif berupa

ciri-ciri yang dibentuk pada perhunbuhan vegetatif dan perkembangan tanaman,

seperti trikoma yang merupakan perlindungan daerah aerial pada berbagai

spesies tanaman. Pada mekanisme tefinduksi, hama atau patogen memicu

tanaman membentuk suatu sistem pertahanan. Mekanisme ini mungkin

melibatkan produk

gen

in situ yang telah siap, seperti induksi alrtivitas callme

synthase,

gluiranase,

kithast atclu inhibitor pfdeinase (Ayres, 1992). Infeksi

hama yang dilakukan pada daun melon ternyata meningkatkan aktivitas inhibitor

proteinase, sehingga diduga protein tersebut berperan dalam sistem pertahanan

tanaman melon terhadap hama (Hammersmidt dan Kuc', 1995). Mekanisme yang

lain adalah yang mengarah kepada pengaktifan gen-gen pertahanan.

Gen-gen yang terlibat didalam pertahanan mungkin menyandi sejumlah

produk yang b e h n g s i secara langsung seperti deterrents, anti feedtmts ataupun

(88)

ketahanan sejxrti fitodeksin (Ayres, 1992). Kecepatan serta i~ltmsitas biosintesis

senyawa yang terlibat ddam respon ketahatlan tanaman terhadap serangga

tergmtung pada jarak dari titik pelukaan, besarnya kerusakan, dan jenis elisitor

yang terlibat.

Fragmen tanaman dm dinding sel cendawan mengandung oligosakarida

dalam s t d c h r polisakaridanya. Oligosakarida yang dibebaskan ketika sel

mengalami kerusakan oleh hama atau mikroorganisme dapat befingsi sebagai

sinyd yang mengaktifkan gen-gen penyandi enzim untuk menghasilkan

senyawa-senyawa yang berkaitan dengan kelahanan tanaman (Gambar 1).

Fragmen poli dan oligosakarida yang dilepaskan akibat serangan hama dapat

distimulasi secara in viiro, yaitu meldui kontak antara dinding sel dengan

endopoligalalcturonase (ERhe) yang mempakan suatu enzim yang dilepaskan

oleh bagian tertentu di dalam sel akibat serangan hama.

avon no id Diterpen

Gambztr 1. Mekanisme pertahanan yang terinduksi oleh serangan hama (Panda

(89)

Penelitian-pelitim yang berkaitan dengan pengaktifan sistem

pertahanan tamman telah banyak dil-. Pemggeaek polong (Helicoverpa

armigera) yang diinfeks'lkan pada polong buncis 12 sampai 60 hari setelah

pemtwngaan, meng* inhibitor proteinase dengan aktivitas penghdmbatan

yang berbeda terhadap tripsin, kimotripsin, proteinase pencemaan ulat dan

proteinase bakteri (Giri et

d.,

1998). Aktivitas inhibitor tripsin pada kedelai yang

terinduksi oleh hama lebih tinggi d i b a n d i i a n dengan tanpa induksi (Zhao et

al., 1996). Pelukaan

secara

mekanik juga diketahui dapat menginduksi gen

penyandi inhibitor tripsin. Gen swin 1.1 penyandi inhibitor protease serin

d i t e m u h pada Salk viminalis yang dilukai secara mekanik, yang ditapis dari

pustaka genom dengan menggunakan pelacak win 3 dari populus (Saarikoski et

al., 1 996).

Penelitian lain menunjukkan adanya perbedaan respon

secara

rnolekulQ

antara pelukaan yang disebabkan oleh harna dan pelukaan secara rnekanik. Pada

kentang (So- tuberam), akumulasi transkrip mRNA untuk proteinase

inhibitor I1 @in 11)

dan

3-hydK,xy-3-methylalutsryI-coeayme akibat kerusakan

oleh harna lebih besar dibandihg dengan pernotongan daun (Korth

ctan

Dixon,

1 997).

Konstruksi Pustaka cDNA

Pengklonan gen melalui cara pemotongan DNA genom dengan suatu

enzim restriksi yang kemudian disisipkan dalam suatu vektor dan dipelihara

dalam suatu inang disebut dengan shot gun cloning. Setiap vektor yang

(90)

SekumpUtan klon DNA goaom mempakan pustaka genom. Fragmen DNA genom

yang dihorsilltan 58npt banyrrk, clan k e n a pemotmgm teajadi seam acak maka

hanya sedikit fiagmen saja yang mengandung gen. Cara lain untuk memperoleh

klon DNA ymg berupa gen dapat dilalrukan dengan memilih sekuen penyandi

saja. Enzim trankriptase balik dapat d i m a n f w untuk ntensintesis DNA

komplementer (cDNA) dengan menggunakan RNA sebagai cetakan (tRNA,

rIUUA, mRNA).

Gen-gen eukariot urnumnya terdiri dari sekuen-sekuen DNA yang

dipisahkm oleh sekuen bukan penyandi (intron). Intron ini

akan

dibuang pada

proses pasca transkripsi mRNA yang disebut dengan splicing. Klon cDNA

eukariot

yang diperoleh

dari

mRNq tidak mengandung intron-clan berguna

untuk

mempelajari ekspresinya di dalam sel bakteri misalnya Escheriichia coli. Pada

umumnya prokariot tidak &pat memproses intron (Old dan Primrose, 1985).

Bakteri yang digunakan untuk membuat klon cDNA umumnya adalah E. coli.

Secara umum pembuatan pustaka cDNA dilakulcan melalui tahap-tahap

sebagai befilnrt ( Huang et al., 1982):

I . Isolasi RNA total

bahaa

untuk

_{isolasi mRNA}

2. Sintesis utas pertama dan utas kedua cDNA

3. Konstruksi vektor rekombinan. Jika vektor ystng digunakan berupa plasmid,

selanjutnya plasmid rekombinan diintmduksikan ke dalam sel inang.

4. Seleksi vektor r e k o m b i i berdasarkan gen penanda yang terdapat pada

vektor.

Plasmid merupakan salah satu vektor yang &pat digunakan untuk

(91)

untuk klon cDNA Br&m napus (Kim et al., 1998), pGEX-2T untuk klon

cDNA ubi jalar (Yeh et al., 1997) dan pSPORTl untuk mengkIon gen-gen

kedelai yang terinduksi oleh alumunium (Miftahudin et al., 1995; Yuniati, 1999;

ARWar, 2000). Pembuatan pustaka cDNA dapat pula dilakukan dengan

menggunakan vektor lain seperti cosmid dan vektor h. Vektor h banyak

digunakan untuk mengkonstruksi cDNA seperti ZAPXR untuk konstruksi cDNA

Cicer arietinum (Munoz et al, 1998), h gtl 1 untuk kentang (Gruden et al.,

1997),

A

Zap 1 1 untuk Brassim campestris L. ssp. pekinensis dan Arabidopsis

(Lim et al., 1996 ; Park et al., 1 998).

Masing-masing klon dari suatu pustaka cDNA dapat dimanfaatkan untuk

berbagai tujuan seperti peningkatan produksi protein yang disandikan oleh klon

cDNA tertentu dalam sel inang, karakterisasi gen maupun transfer cDNA kepada

sel lain. Gen mustard tripsin PI2 (mti-2) yang diperoleh dari klon cDNA telah

dimasukkan ke dalam Nicotiana tabacum L. cv Xanthi dan Arabidopsis L.

(Heynh.)

dan

digunakm untuk mempelajari pengaruh tingkat ekspresi inhibitor

proteinase terhadap larva S ' t e r a lifforalis (Leo et al., 1998).

Klon cDNA juga dapat d i d - dalarn upaya mengurutkan DNA

genom. Pada eukariot tingkat tinggi urutan DNA keseluruhan genom masih sulit

dilakukan karena ukurannya besar dan kompleks, sehingga analisis genom

dimulai dengan mengenali wutan DNA yang diekspresikan saja atau yang

dikenal dengan analisis EST (Expremed Sequence Tags). Dalam analisis EST,

cDNA diklon ke dalarn suatu vektor dan selanjutnya dilakukan pengurutan DNA

(92)

pasang basa cukup untuk mengidentifikasi gen dengan cara membandingkannsa

dengan database publik.

Menurut data per September 2000 sudah lebih dari 26000 sekuen EST

l,o/ri.s japot~ictrs yang telah tercatat dalam database publik. Sekuen vang

ditemukan tersebut dibagi menjadi beberapa grup dengan berbagai fungsi seperti

respon terhadap lingkungan, sintesis protein, proses seluler, respon terhadap

patogen dan metabolit sekunder (Asamizu el al., 2000). Beberapz- famili gen

pinus seperti chaperonin 60, thiolase, elongnizon.fact)r i a, acid phoshatase, actin

Jeplymerizing factor, heat shock polypeptide HSP 90 dan alcohol

dehidrogenase telah diidentifikasi dengan cara mensekuen cDNA (Kinlaw dan

Neale, 1997). Gen penyandi Notch dari Drosophila juga telah diteliti urutan

basanya dari cDNA (Caballero, 1992).

Isolasi

RNA

RNA merupakan polimer linier yang terdiri dari monomer ribonukleosida

monofosfat yang dihubungkan oleh ikatan fosfodiester (Farrell, 1993). RNA

terdiri dari dua jenis yaitu RNA yang berhubungan dengan ekspresi gen serta

yang tidak berhubungan dengan ekspresi gen, yaitu RNA primer dalam repiikasi

DNA dan RNA dalam struktur kromosom bakteri.

Terdapat tiga jenis RNA yang berhubungan dengan ekspresi gen yaitu

rRNA (ribosomal RNA), tRNA (trmfer RNA) dan m w A (messenger RNA).

rRNA merupakan komponen utama penyusun ribosom yang berperan dalam

sintesis rantai protein, yaitu sebagai tempat pertemuan antara mRNA dengan

(93)

paling banyak y a h 80-85% dari RNA total. Pada eukariot terdapat 4 jenis rRNA

yaitu rRNA 18s (17s pada khamir), 28s (25s pada khamir), 5,8S, dan 5s

(Sambrook et al., 1989).

Jumlah tRNA lebih sedikit dibanding rIWA yaitu 15-20%. RNA transfer

b b n g s i mentejemahkan kodon yang terdapat pada mRNA menjadi satu jenis

asam amino pada proses translasi. mRNA merupakan model cetakan dalam

proses penyusunan asam-asam amino pada rantai polipeptida dan disandi oleh

mas khas. Proporsi mRNA adalah yang paling sedikit yaitu 1-2% dari RNA total

dan hanya ada sehtna protein yang disandikan masih diproduksi. Kebanyakan

rnRNA prokariot sangat tidak stabil clan mempunyai waktu paruh sekitar 3 menit

sedangkan mRNA eukariot lebih stabil dengan waktu paruh >10 jam

(P-

globin)

dan ada pula yang hanya 30 menit atau h a n g (Albert et al., 1989).

Populasi mRNA dalam sel mamalia terbagi menjadi tiga jenis yaitu tipe

mRNA beriimpah (12000 kopi per sel), tipe intermediet (300 kopi per sel) dan

tipe jarang (15 kopi per sel) (Farrel, 1993). Sambrook et al. (1989) membagi

mRNA menjadi dua jenis yaitu abuncht mRNA dan low abumhce mRNA

( 4 4 kopi per sel). Fro@ low abtnsdance mRNA adalah. 30% dari jumlah

mRNA.

Secara kimiawi maupun biologi, RNA lebih labil dibanding DNA

terutama pada suhu tinggi (%S°C) dan terhadap alkali. RNA juga sangat mudah

terdegradasi oleh RNase, yang merupakan enzim yang sangat stabil. Pada saat

mengisolasi

RNA,

aktivitas RNase h a s dihambat, yang dapat dilakukan dengan

menambahkan inhibitor RNase misalnya 8-hydroxyquinolin, memanaskan

(94)

Air yang digunakan untuk melarutkan bahan untuk isolasi RNA juga harus bebas

RNase.

Sifat RNA yang tidalc stabil memerlukan cara-cara yang tepat u~ltuk

mengisolasinya. Beberapa ha1 yang perlu diperhatikan dalam isolasi RNA dari

jaringan tanaman yaitu:

1. Penghancuran dinding sel tamman

Se1 tanaman dilcelilingi oleh dinding sei yang terdiri dari selulosa, pektin dan

xyloglucan. Pada prinsipnya isolasi RNA dilakukan dengan rrierusak dinding

sel untuk mengeluarkan sitoplasma dan RNA. Penggunaan nitrogen cair ketika

penggerusan jaringan tanaman sangat penting untuk menjaga jaringan tanaman

tetap beku karena suhu sangat rendah (- 196°C) sehingga ribonuklease tidak

aktif (Wilkins dan Smart, 1996).

2. Pdisakarida dan metabolit sekunder

Kandungan polisakarida dan metabolit sekunder pada sel tanaman sering

menyulitkan dalam isolasi RNA. Banyak jaringan tanaman yang mengandung

polisakarida

cukup

tinggi yang sifirtnya mirip dengan

asam

nuWestt sehingga

dapat mengendap bersama RNA Polisakarida dapat menghalangi atau

menghambat pengendapan

RNA,

mengganggu kuantifikasi RNA yang

berdasarkan absorbansi, menghsmbat aktivitas enzirnatik pada percobaan

selanjutnya seperti terhadap enzim restriksi, ligase dan polimerase,

menghambat seleksi poly(~)'-RNA (mRNA) dan mengg- migrasi RNA

saat elektroforesis (Wilkins clan Smart, 1996). Karena sifatnya yang mirip

dengan asam nukleat, pemisahan polisakarida dari RNA sangat sulit.

(95)

tanaman seperti Geranium, poinsetia, pinus putih dan k h o dapat

menghasilkan RNA yang ba& (Schultz et al., 1994 dan Santoso, 1996).

Senyawa fenolik dm metabolit sehnder lain seperti antosianin, lateks dan

asam anacardic dapat mempengaruhi proses isolasi RNA dan percobaan

selanjutnyo yang menggunakan

RNA.

Terdapat beberapa cara untuk mengatasi

ha1 ini antam lain penggunam polivinilpirolidon (PVP) yang bekerja melalui

ikatm

hidrogen

dm

mengendapkan senyawa fenolik serta metabolit sekunder.

Senyawa pereduksi seperti $-mercaptoethanol dan dithithreitol

(Dm)

&pat

me@ oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambat aktifitas radial

bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fen01 terhadap asam nukleat. Bufer alkalin

dapat menghambat reduksi senyawa fenolik oleh difenol oksidase. Penggunaan

proteinase

K

dapat mendegradasi enzim pengoksidasi senyawa fenolik dan

metabolit sekunder.

3. Aktivitas nuklease

Dalam kondisi senescens, pelukaaq serangan patogen atau kekwangan fosfat,

produksi r i b o d e a s e endogen bisa meningkat. Hal ini dapat diiasi dengan

penambahan peredulrsi kuat seperti $-merkaptoe&mol atau

DTT,

proteinase K,

guanidin isotiosianat, beberrrpa jenis inhibitor nuWease seperti

VDR

(vanadyl

ribonuclease complexes), RNasin

dan

RNAguard. Beberapa bahan lain yang

dapat menghambat aktivitas nuklease adalah guanidine hydrochloride, SDS,

sarcosyl, phenol : chloroform : isoamylalcohol, 8-hydroxyquinoline, cesium

chloride d m cesium tri fluoroacetate (Farrell, 1993; Wilkins dan Smart, 1996)

Larutan untuk isolasi RNA yang siap pakai telah tersedia , seperti T R I z o L ~ ~

(96)

varia) dm sel HeLa dengan kualitas RNA yang dihasilkan baik (Kapros

dm

Weterborg, 1995; Braccete et al., 1 999)

Isolasi

mRNA

Pada sel eukafiot mRNA matang dibentuk dari prekursor hnRNA

(heterogenw nuclear RNA) meldui proses pasca transkripsi

RNA.

Sekitar 1-

4% RNA total yang terdapat ddam sitoplasma merupakan mRNA matang. Pasca

transkripsi RNA terdiri dari pemasangan tudung ( 5 ' q ) yang krupa

pemunbahan nukleotida 7-methyl guanosine (m7G) pada ujung 5', met3asi pada

posisi

N-7

dari nukleotida panin, pembuangan intron (intron splicing) dan

penambahan ekor (3'-end processing) yaitu penambahan 50-300 nukleotida

adenin pada ujung 3 ' (Farrel, 1993).

Ketmadaan poly-A+ yang baperan menjaga kestabilan stmktuf mRNA

dapat dimanfbtkan untuk memisahkan mRNA dari rRNA dan tRNA. Isolasi

mRNA dapat dilakukan dengan melalui beberapa cara yaitu hksinasi mRNA

daIam kolom digo-dT penggunaan partikel magnetik, biotinilasi secara

kimia maupun enzimatik atrurpvn metoda kombinasi seperti fraksinasi oligo dT

berlapis &el magnet

dan

strep avidin berlapis partikel magnet (Jones et al.,

1994). Seluruh metoda isolasi RNA berdwrkan pada perpasangan basa antara

* _{residu adenilat dari}_mRNA_{dengsn residu timidilat (oligo-dT) 'Mau residu urasilat}

(97)

Sintesis eDNA

Prinsip sintesis cDNA addab membentuk DNA kornplementer meialui

proses enzimatik dengan RNA sebagai cetakan. Sintesis cDNA dari mRNA

terdiri dari dua tahap yaitu sintesis utas perkma yang memanfhtkan ekor plyA+

pada ujung 3' yang @at berpasangan dengan primer oligo dT untuk memulai

sintesis utas pertama

dm

sintesis utas kedua dengan cetakan utas pertama dari

cDNA yang terbentuk. Pada sintesis utas pertama diperlukan molekul mRNA

sebagai mtakan, suatu primer sebagai umpan untuk memulai sintesis, cmpat

macam nukleotida yaitu d A Z , dCTP, dGTP dan dTTP, enzim transkriptase

terbalik dan larutan penyangga reaksi.

Sintesis utas kedua cDNA dapat dilakukan dengan metode seypriming

yang memanfatkan 'simpul jepit rambut' yang terbentuk pada ujung 3' sebagai

primer. Sintesis utas kedua diitalisis oleh fiagmen Klenow dari DNA

polimerase I E cob dan selanjutnya simpul ini dipotong dengan S1 nuklease.

Metoda ini mempunyai kelemahan, yaitu penggunaan S1 nuklease untuk

memotong simpul jepit nunbut mmpakan reaksi yang sulit dikontrol.

Cara lain untuk rhensintesisutas

kedua

cIlNA addah metoda replacement

synthesis yang dikembangkan oleh Okayama dan Berg (1982) dan dimojifikasi

oleh Gubler dan

Hoffman

(1983). Metoda ini menggunakan

mRNA

yang

berpasangan dengan utas pertama cDNA sebagai bahan r@csi nick translasi

RNaseH. Hasil pernotongan RNaseW pada rnRNA digunakan sebagai primer

(98)

* Perkiraan jumlah klon cDNA yang ideal

Pengklonan cDNA untuk memperoleh jenis kopi mRNA berlimpah

seperti penyandi globin, imunoglobulin dan ovalbumin yang proporsinya

mencapai 50-90% dari M A sitoplasma, tidak memerlukan tahap purifikasi

lebih lanjut sebelum disintesis menjadi cDNA utas ganda.

Konstruksi pustaka cDNA yang lengkap, yaitu yang mengandung seluruh

jenis mRNA yang berbeda Mam sel membutuhkan jumlah klon cDNA yang

tinggi. Menurut Kamalay dan Goldberg (1980) yang disitir oleh Slightom dan

Quemada (1988), diperkirakan dalam sel tembakau terdapat 25.000 jenis

mRNA

dan sekitar 6000 diantaranya unik

untuk

_{setiap organ seperti daun,}_akar,_cabang,

petal, anter atau ovari.

Jumlah klon cDNA yang diperlukan agar jenis mRNA jenis low.

abundance tercakup dalam pustaka, dapat diperkirakan dengan rumus sebagai

berikut (Sambrook et al., 1989):

N = ln (1 - P) 1 l(1

-

lln)

N : jumiah Mon yang d h t d b q P : probabilitas ,bhany-a: 0,99, n: fraksi populasi

mRNA total yang dinpesewasilcan oleh satu jenis low abundcmce mRNk

Sebagai contoh, dalam sel fibroblast manusia yang mengandung 30% RNA jenis

low abundance dengan 1 1.000 jenis sekuen yang berbeda, dibutuhkan 170.000

klon cDNA untuk menyusun pustaka cDNA yang lengkap.

Penapisan klon cDNA untuk mengidentifikasi sekuen yang diinginkan

dari sejumlah klon cDNA yang sangat banyak merupakan pekerjaan yang sulit

dan membutuhkan biaya yang ti@. Untuk memudahkan penapisan, jumlah

klon cDNA bisa dibatasi dengan cara melakukan fraksinasi mRNA atau

(99)

Fraksinasi mRNA kdasarkan ukuran merupakan cara paling sederhana

untuk mendapatkan populasi mRNA yang mengandung h n yang diinginkan.

Fraksinasi mRNA dapat cEilakukan dengan cara sentrifugsi dalam gradien

sukrosa yang mengandung bahan yang dapat mendenaturasi struktur sekunder

RNA. Fraksinasi cDNA lebih menguntungkan dibandingkan fiaksinasi mRNA

karena DNA lebih tahan terhadap degradasi oleh rmklease, dapat dilakukan

fiaksinasi secara lebih akurat melalui elektrof~esis pada gel agarose, dan karena

fidcsinasi cDNA dilakukan pada tahap yang lebih lanjut maka kemungkinan

(100)

BAHAN

DAN

METODE

Bahan tanaman

Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini berupa kambium

batang sengon yang terinfeksi hama boktor dan tidak terinfeksi yang diperoleh

dari kebun koleksi plasma nu- Puslit Bioteknologi LIPI.

Persiapan alat dan bahan untuk isolasi RNA

Semua tahapan ekstraksi

RNA

dilakukan pada kondisi dingin dengan

menggunakan peralatan dan air yang bebas RNase. Peralatan dibebaskan dari

RNase dengan merendamnya dalam 0,l % DEPC (dietil pirokarbonat) dan

diautoklaf. Air yang digunakan ditambah dengan 0,l % DEPC, diaduk beberapa

jam dan diautoklaf.

Tahapan penelitian

Penelitian ini dilakukan melalui beberapa tahap yang dirangkum pada

Lampiran 1.

Proses

pengendapan dengan sentrifbgasi pada seluruh percobaan

dilakukan dengan menggunakan dua jenis sentrifbs. Sentrihgasi yang

menggunakan tabung sentrihs 50 ml dilakukan dengan Bioftse 28RSLHeraeus

(No. rotor: 3746), sedangkan sentrifbgasi yang menggunakan tabung mikro 1,5

ml dilakukan dengan Biofbse fresco.

Isolasi

RNA

total.

I d a s i RNA total dilakukan segera setelah bahan tanaman dikoleksi.

(101)

metoda isolasi RNA yang paling sesuai. Analisis kualitatif RNA total dilalcukan

dengan cara elektroforesis pda 1% gel agarose menggunakan bufer 0,5X

TBE

(0,05M Tris-HCl, pH 8,3; 0,0415 M asam borat; 0,SmM EDTA).

Met& 1

Sebanyak 0,s g kambium sengon digenrs bersama nitrogen cair dan 0,3 g

polivinilpirolidon

(PW)

hingga halus. Selanjutnya dimaddcan pada tabung

wntrifus 50 ml yang berisi 5 ml bufer pengekstrak CTAB (100mM Tris-HC1 pH

8,O; 1,4

M

NaCI; 20rnM EDTA, 0,02% B-merkaptoetmol; 2% CTAB), kemudian

dicampur perlahan-lahan dan diinkubasi pada 65°C selama 1 jam. Setelah

inkubasi campuran didinginkan pada

suhu

ruang selama 6 menit dan kemudian

ditambahkan 6 ml k l o r o f o d l - oktanol (24:l). Selanjutnya disentrifbgasi pada

10.000 rpm, 4OC selama 20 menit. Cairan bagian atas diambil dan diekstraksi

dengan klorofodl-oktanol (24: 1) yang dilakukan sebanyak 3 kali. Supernatan

yang diperdeh pada tahap ekstraksi ditambahkan dengan 112 volume 5M NaCl,

dicampur pertahan dan ditambah dengan 2 volume 95% etanol clan disimpan

pada -20°C se1ama beberap8 jam. Selanjutnya disentrifugasigasi pada 10.000 rpm,

4°C selama 20 menit. Endapan dicuci dengan lamtan etanol 70% dingin dan .

dikeringkan pada suhu ruang. Endapan yang telah dikeringkan ditambah dengan

1 ml air bebas nuklease dan 114 volume 10M LiCl dan disimpan selama 1

malam pada suhu ruang. Selanjutnya disentrihgasi pada 10.000 rpm selama 20

menit. Endapan dilarutkan dalam air bebas nuklease, ditambah dengan 1/10

volume 3M sodium asetat pH 5,2 dan 2,5 volume 95% etano1 dan dibiarkan

(102)

selama 20 menit. Endapan yang dihasilkan dicuci dengan 70?4 etml,

dikeringha pada suhu m g

dan

dilamtkan dengan 40 pl air.

Tahapan isolasi RNA pada metoda 2, hingga tahapgn presipitasi asam

nukleat setelah ekstraksi dmgan Morofodl-oktanol(24: 1) sama dengan met&

I. Enciapan yang dihasilkan selanjutnya dilmtkan dalam bufer resuspensi (25

m M

baric acid; 50 mM Tris-HCl pH 7,6; 1,25

mM

EDTA (pH 8,O); 0,l M NaCI)

serta 0,4 vohune 2-Butil Eter (2-BE). Campuran dihomogenkan menggunakan

vorteks

dan

diinkubasi di es selama 30 menit. Selanjutnya disentrifbgasi pada

10.000 rpm, 4OC selama 20 menit. Selanjutnya supernatan ditambah dengan 1

volume 2-BE untuk mengendapkan asam nukleat. Campuran dihomogenkan

menggunakan vorteks selama 2 menit, diinkubasi di es selama 30 menit dan '

dilanjutkan dengm sentrifugasi pa& 10.000 rpm, 4°C selama 20 menit. Endapan

dicuci dengan 70% etanol untuk xnenghdangkan 2-BE dan selanjutnya

dilarutkan dalam lml air bebas rmklease. Pengendapan RNA dilakukan dengan

8M LiCl (Irowntrasi

aWrir

WII) dan disimpan pada 4°C selama 1 malam.

Endapan yang diperoleh melalui sentrifbgasi pacia 10.000 rpm, 4°C selama 20

menit dicuci dengan 70% etanol dim dikeringkan pa& suhu ruang.

Met& 3

Sebanyak 0,s g jaringan digerus bersarna 0,3 g

PVP

dan nitrogen cair

hingga halus dan segera dipindahkirn ke dalam tabung sentrifbs 50 mi yang

(103)

100 mM LiCl, 5mM

EDTA,

100 m M NaCl dan 1% SDS (Wilkins dan Smart,

1996). Setanjutnya ditapnbah dengan 5 ml fenol yang dipanaskan pa& 60°C dan

dihomogedcan dengan vorteks selarna 2 menit. Ke ddam campuran ditambahkan

5 ml klorofbnn/isoamilalkohol(24: 1) dan dihomogenkan dengan vorteks selama

2 menit, kemudian dilanjutkan dengan sentrifbgasi pada 3500 rpm, 4°C selama

10 menit. Bagian atas larutan dipindahkan dan ditambah dengan 10 ml fenol-

klorofonn-isoamilalkohol

(25:24:1), dihomogenkan dengan vorteks selama 2

menit dan disentrifbgasi pada 3500 rpm, 4°C selarna 10 menit. Tahapan ini

dilaktdm sebanyak 2 kali. Selanjutnya pada bagian atas larutan ditambahkan

kloroform/isoamilalkohol

(24:l) dengan volume yang sama dan disentrifugasi

pada 3500 rpm, 4°C selama 10 menit. Bagian atas larutan ditambah dengan 113

volume 8M LiCl dan disimpan pada 4°C selama semalam. Endapan yang

diperoleh meldui sentrifbgasi pada 10.000 rpm, 4OC selama 20 menit, dicuci

dengm 2M LiCl dingin sebanyak 2 ml. Selanjutnya disentrifbgasi pada 10.000

rpm, 4°C selama 20 menit. E n m a n dikeringkan pada suhu ruang, dilarutkan

dalam 250 pl air bebas mklease

dm

ditambah dengan 1/10 volume 3 M sodium

asetat dan 2,s volume etano1 absolut wrta disimpan pada -20°C selama semalam.

Selanjutnya disentrihgasi pada 13.000 rpm , 4°C selama 20 menit. Endapan

dicuci dmgan 70% etanol, dikeringkan pada suhu ruang dan dilarutkan dalam 40

pl air bebas nukIease.

Metode 4.

Jaringan tanaman sebanyak 1,O gram digerus bersama dengan 0,4 gram

(104)

sentrifbs 50 ml yang berisi 10 ml bufer

HB,

dicampur perlahan-lahan dan

dihomogenkm den- slbakier pada kecepatan rendah (100 rpm) s e b a 10 menit.

Selanjutnya 10

d

fenol ditambahkan ke dalam larutan tersebut dm

dihomogenkan dengan vorteks selama 2 menit. Ke dalam campuran ditambahkan

.

5 ml klorofonn-isoamildkohol (24:l) dan dicampur perlahan. Selanjutnya

disentrihgasi pada 7000 rpm, 4°C selama 10 menit. Bagian atas diambil dan

dilakukan kembali ekstraksi dengan 10 ml fen01 dan 5 ml klorofoxm-

isoamilzlkohol (24:l) serta disentrihgasi dengan kecepatan 7000 rpm, 4°C

selama 10 menit. Selanjutnya pada fase atas ditambahkan 5 ml kloroforml

isoamilalkohoI(24: 1) dan disentrifiigasi pada 7000 rpm selama 10 menit. Tahap

ini dilakukan sebanyak 2 Mi. Setelah dilakukan ekstraksi dengan kloroform-

olctanol dan disentrifbgasi, pada fase atas ditambahkan 113 volume 8M LiCl dan

dibiarkan pada 4°C selarna semalam (pekerjaan dilakukan dalam tabung 1,5 mi).

.

Endapan

yang diperoleh setelah dilakukan sentrifbgasi pada dengan kecepatan

12.000 rpm, 4°C selama 20 menit, dicuci dengan 200 pl larutan 2M LiCl dingin.

Selanjutnya larutan d i i h g a s i pada 12.000 rpm, 4°C selama 20 menit.

Endapan dikeringhm pa& whu ntaag

dan

kemudian dilarutkan dalam 300 pl air

bebas rmklease dan ditambahkan 1/10 volume 3M sodium asetat dan 2 volume

etanol absolut serta disimpan pada -20°C selama semalam. Selanjutnya lamtan

disentrifbgasi pada 13.000

rpm,

4°C selama 20 menit. Endapan dicuci dengan

I

70% etanol, dieringkan pada suhu ruang dan dilarutkan dalam 40 p1 air bebas

(105)

IsoIrsi

d m A

I& mRWA dilakukan dengan metoda fhtksinasi pttda kolom oligo-dT

selulosst. Tibp-tabap isolasi mRNA terdii dari preparasi RNA total, isolasi

mRNA ~eleksi pertama dan isolasi mRNA seleksi kedua yang dilalrukan menurut

pro& yang t&pat pada panduan kit ME;SSAGEMK&X mRNA isolation

system (OBCO

BRL).

Sinttsia cDNA

Tahapan sintesis cDNA terdiri dari (1) sintesis utas pertama dan (2) sintesis

utas kedua.

1. S i e s i s utas pertama. Sintesis utas pertama dilakukan dengan memhat

campuran lop1 mRNA (1,375 pg untuk sengon terinfeksi dan 2,s pg untuk

sengon tidak terinfeksi), 2 pl (0,s pglpl) primer adaptor Not1 (5'-

dAAATTWGGCCGC C(T)15 3') dan 3 pl air bebas nuklease. Campuran

diinkubasi pada 6S°C selama 5 rnenit. Selanjutnya pada campuran tersebut

ditambilhkan 10 pl 5X

bufk

reaksi utas pertama (50 ,nM Tris-HC1 pH 8,3;

75

m M

KCI; 3mEul MgCh), 5 p l DTT (0,1M), 2,s pl

dNlT

(10 mM), 15 p1

air bebas nuklease. Campuran ini diinlnrbasi pada 42°C selama 5 menit.

Sehjutnya ditambahkan 2,s pl M-MLV Reverse Transkriptuse (20U/@)

dan diinkubasi pada 37°C selama 1 jam, kemudian di simpan di es selama

30 menit. Realcsi dihentikan dengan menambahkan 0,25M EDTA sebanyak

(106)

2. Reaksi utas kedua. Utas kdua cDNA dibuat dengan mencampurkan 50 pl

reaksi utas pertama, 7,s pl dNTP (I-, 40 pl 1OX bufer utas kedua (25

m M

Tfis-fK:l pH 8,3; 100 mM KCl; lOmM 0$304; 5mM MgCI2, 0,15

mM $-NAD), 10 pl DNA polimerase I (lOUlj~l), 1,25 pI E coli DNA

ligase (lOUIpl), 1,75 pl

RN&

(2U/fl), 289,s pl air bebas nuklease.

Campuran diinkubasi pada 15°C selama semalam. Selanjutnya reaksi

dihentikan dengan menambalkan 0,25 M EDTA pH 7,5 sebanyak 4 pl.

3. Ekstraksi clan presipitasi. Hasil pada reaksi utas kedua diekstraksi dengan

fen01 shnyak l x

,

kemudian disentrifbgasi pada 4"C, 12.000 rpm selama

20 menit. Kemudian diekstraksi dengan kloroform I isoamilalkohol (24:l)

sebanyak Ix dan disentrifbgasi dengm kecepatan 5000 rpm, 4OC selama 5

menit. Fase bagian atas dipresipitasi dengan 2 volume etano1 absolut dan 0,l

volume 3M sodium asetat pH 5,2 kemudian diinkubasi pada -20°C selama

semalam. Untuk memperoleh endapan cDNA, larutan disentrifbgasi pada

12.000 rpm, 4°C selama 30 menit. Selanjutnya endapan dibilas dengan etanol

70% dan akhirnya diresuspensi dengan 30 pl air bebas nuklease. Analisis

kualitatif cDNA dilakukan melalui elektroforesis pada 1,596 agarose

menggunakan bufer Ix TAE (0,04M Tris-HCI, pH 8,3; 0,0198M asam asetat

(107)

Konstruksi plasmid rekambinan

Plasmid yang digunakan sebagai vektor untuk mengMon cDNA adalah

pSPORTl yang membawa gen penanda resistensi terhadap ampisitin (Ap3 dan

JacOPZ' penyandi $-galaktosidase. Konstruksi plasmid rekombinan terdiri dari,

(1) penyambungan cDNA dengan adaptor EcoR1, (2) pemotongan fbsi cDNA-

adaptor dengan enzim restriksi Notl, dan (3) penyisipan cDNA yang berujung

EcoRl dan Notl

ke

dalam pSPORTl yang telah dipotong dengan EcoRl dan

Not 1

.

1. Penyambungun cDNA dengan adaptor EcoRlt

Reaksi dilakukan dengan mencampurkan 5 pl cDNA (5Ong/pl),6 pl

5X

bufer

ligasi, 1 pl BSA (10 mglml), 1 pl adaptor EcoRI, 2,s U T4 DNA ligase dan.

Air bebas nuklease pada volume akhir reaksi 30 p1. Campuran diinkubasi

pada 15°C selama 4 jam. Inaktivasi enzim dilakukan pada 70°C selama 10

menit dan selsnjutnya disimpan di es.

2 . Pemotongan cDNA

-

a&ptot dengan

NoJl

Fusi cDNA dan adaptor dipotong dengan Notl yaitu dilakukan dengan cara

mengirhbasi campuran yang terdiri dari 30 pl reaksi ligasi, 4 p1 10X bufer

restriksi NotI, 45 U NotI dan air bebas nuklease pada volume akhir reaksi 40

p1, pada 37°C selama semalarn. Inaktivasi enzim dilakukan pada 65°C

selama 10 menit dan diencerkan d e n p

dH20

sebanyak 500 p1. Tahap

(108)

isoamilalkohol (25:24:1) dan disentrifigasi pada suhu ruang dengan

kecepatan 5000 rpm selama 3 menit. Presipitasi dilakukan dengan

mensunbahkan 0,1 vdume 3M sodium asetat pH 5,2 dan 2 volume etanol

absolut serta diinkubasi pada -20

"C

selama semalam. Selanjutnya campuran

disentrifbgasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 30 menit. Endapan

dicuci dengan 70% etanol absolut, dikeringudarakan dan diresuspensi

dengan I 0 pl air bebas nuklease.

3. Pemotongun vektor pSPORTI (GIBCO, BRL) dengar, enzim Not1 dan

EcoRI

Pemotongan pSPORTl dengan enzim EcoRl dan Nor1 dilakukan bersamaan

karena kedua enzim restriksi yang digunakan membutuhkan suhu inkubasi

d m komposisi bufer restriksi yang sama. Setiap pg vektor dipotong dengan

6 unit enzim restriksi. Peta pSPORTl dan multi situs pengklonan disajikan

pada Garnbar 2.

4. Penyisipun cDNA Re &lam vektor

Reaksi ligasi yang terdii dari 2 p1 vektor ( 0,5 pglpl), 3 p1 cDNA (1 0 ng/pl),

1 pl 10X bufer T4 DNA ligase, 3U T4 DNA ligase dan air bebas nuklease

(109)

SP6 promoter

,\

A /

-

T7 promoter

11 lntergenlc region

[image:109.564.93.430.52.415.2]

IacOPZ'

Gambar 2. Peta pSPORT 1 dan multi situs pengklonan (MCS : Multiple Cloning

Sites).

Introduksi plasmid rekombinan ke dalam bakteri

Pembuatan sel bakteri kompeten

Sebelum plasmid rekombinan diintroduksi ke dalam sel E. coli DHSa,

bakteri hams dalam keadaan kompeten. Pembuatan sel kompeten dilakukan

dengan menggunakan kalsium klorida (Tomley, 1996). Stok kultur E. coli DHSa

sebanyak 0,l ml dikultur dalam media LB (10 g/l tripton, 5 g/i yeast extract, 4,8

I

g/l NaC1, pH 7,O) selama semalam dalam inkubator shaker pada 37 "C dengan

kecepatan 150 rpm. Selanjutnya 0,5 ml kultur ini dimasukkan dalam 10 ml LB

(110)

Sebany* 1 ml kultur ditransfer ke dalam tabung mikro steril dan disentrifugasi

pada 5000 rpm, 4 OCselama 2 rnenit.

Endapan yang diperoleh ditambah dengan lml larutan 0,lM CaClz dingin

dan disuspemikan. Suspensi kemudian disentrifugasi dengan kondisi yang sama

dan se:lanjutnya endapan disuspensikan kembali dalam 250 pl larutan 0,lM

CaC12 dingin. Selanjutnya diinkubasi di e.s selama 10 menit. Bakteri siap untuk

ditransfmnasi

.

Transf-i baRieri

Plasmid rekombinan hasil ligasi pSPORTl dengan cDNA sebanyak 10

dimasukkan dalam tabung mikro yang berisi 250 pl set E. coli DHSa kompeten.

Selanjutnya campran tersebut diinkubasi pada 42°C selama 45 detik ( heat

shock), kemudian disimpan di es selama 1 jam dan setiap 30 menit digoyang.

Heat shock dilakukan kembali 1 kali, selanjutnya dimasukkan ke dalam 2 ml

media LB. Suspensi bakteri dikultur pada inkubator shaker dengan kecepatan

150 rpm pada 37°C selama 1 jam. Selanjutnya disebar pada media seleksi.

Media seieksi yang digunakan adalah media LB padat yang mengandung 1,5%

bakto agar, 100 pglrnl ampisilin, 2 mg

IPTG

per cawan dan 1 mg X-gal per

cawan.

Anatisis putaka eDNA

Analisis terhadap pustaka cDNA yang diperoleh dilakukan terhadap

beberapa koloni yang berwarna putih yang diarnbil secara acak. Sisipan cDNA

(111)

dan pemotongan plasmid rekombinan dengan kombinasi enzim restriksi EcoRl

d m

Not1

serta k o R 1 saja. PCR dilakukan s e b y a k 30 siklus den* kondisi

sebagai berikut: 95OC, 9 menit (pra- PCR); 95OC, 1 menit (denaturasi); 60°C, 1

menit (pelelcatan); 72OC, 3 menit (pemanjangan); 72OC, 5 menit (pasca PCR).

Selain dengan

PCR,

pada beberapa kdoni yang lain, sisipan yang ada didalam

vektor dianalisis dengan pemotongan menggunakan enzim restriksi yang sesuai.

Plasmid dipotong dengan enzim restriksi pada perbandingan 1 pg plasmid dan 6

(112)

HASIL DAN PEMBAHASAPJ

k q a s X fath terhttdap sagan

EWmg S ~ ~ O P I yang temmmg X fed'w k a d m g - u dop;rt h a t i

dqgm mmperhatikan kulit ksyu yang atma tetapi

8da

@a

ymg h2i.t

kayunya

tidak

_maam _yrtag_jetas_-_f _3A).

Kambium

mngon y a q tidak terinfiksj hama War tamp& sle@lar d e w

k a b g a f t

air

ymg tin& serta w m a q a putih. Berbda dagan kambiurn

y u q -hat, k d i u m sengcm y q terserang hma b o b bienvgna

coklrtt dm seratnya ada yang Icehitaman serta kandungan airnya sadikit atau

[image:112.555.13.543.16.765.2]

mengering ( G m k 3B).

Gambar 3. Penam* sengon yang terserang hama bktw: A. Kvlit kayu

terserarrg hama tetapi ti& mermmpdckm Ismsakan yang jefas, Qyu = w n ylng *..'@&L*<g?5$y!n~=ang. . .

I - . i . I .

(113)

Kambium yang digunakan untuk isolasi RNA total sebagai bahan untuk

membuat pustaka cDNA sengon yang terinduksi oleh sermgan harna boktor

berasal dari pohon yang masih terserang ulat, dengan tujuan untuk mendapatkan

mRNA yang ditfmskripsikan dari gen-gen yang terinduksi. Isolasi RNA total

dilakukan segera setelah kayu sengon dikoleksi untuk mencegah degradasi RNA.

lsolasi RNA total

RNA total diisolasi dari kambium batang sengon yang terinfeksi hama

boktor d m yang tidak terinfeksi. Kualitas RNA total tanaman yang baik

ditunjukkan dengan integritas RNA ribosom yaitu rRNA 28s dan rRNA 18s

serta tebal kedua pita tersebut yang seimbang. Intensitas pita rRNA 28s yang

lemah m e n u n j u b terjadinya degradasi RNA yang berukuran besar. Degradasi

RNA total ditandai dengan ketidak-tampakan kedua pita tersebut dan munculnya

pita tebal dibagian bawah lajur migrasi RNA yang merupakan pdongan-

potongan RNA total yang berukuran kecil akibat terdegradasi oleh nuklease (Lin

et al., 1996).

RNA yang diperoleh dengan menggunakan metoda 1-3 tidak

menghgsilkan RNA total yang baik (Gambar 4A-C). Pada gambar tersebut tidak

tampak Pita rRNA 28s dan rRNA 18s yang utuh. Penggunaan metoda I

disamping menghasilkan RNA total yang tidak utuh, juga larutan RNA totalnya

kental. Larutan RNA total yang kental mungkin disebabkan oleh kandungan

polisakarida yang tinggi. Pengendapan diferensial untuk memisahkan

(114)

total yang tidak kental tetapi mengalami degradasi. RNA total yang diperoleh

dengan metoda 3 juga masih mengalami degradasi.

[image:114.555.65.472.48.783.2]

A B C

Gambar 4. Hasil elektroforesis RNA total pada gel agarose 1% menggunakan bufer 0,5X

TBE

yang diperoleh dengan metoda 1 (A), 2 (3) dan 3

(C).

Hasil pengujian secara kualitat if terhadap RN A total yang dii solasi

dengan menggunakan metoda 4 (Gambar 5) menghasilkan RNA total yang

mengandung rRNA 28s dan rRNA 18s utuh. Dengan demikian metoda 4 sesuai

untuk mengisolasi RNA total sengon dan dapat digunakan sebagai bahan untuk

mengisolasi rnRNA. Bufer pengekstrak yang digunakan pada metoda 4

komposisinya sama dengan bufer pengekstrak pada metoda 3 yaitu bufer

HB,

demikian juga tahapan isolasinya secara umum harnpir sarna dengan metoda 3.

Tahap yang berbeda adalah homogenisasi ekstrak pada shaker dengan kondisi

dingin serta fen01 yang digunakan tidak dipanaskan terlebih dahulu.

Homogenisasi ekstrak dengan shaker pada isolasi RNA telah dilakukan pada

isolasi RNA dari daun Arabidopsis thaliana dengan hasil, yang sangat baik

(Eggkrmont et al., 1996). Berdasarkan pengukuran jumlah RNA dengan

menggunakan "Gene Quant", RNA total yang dihasilkan adalah 0,895 mg-1,438

(115)

Garnbar 5. Hasil elektroforesis RNA total pada gel agarose 1% menggunakan bufer 0,5X TBE. 1-4 : sengon terinfeksi; 5-7: sengon tidak terinfeksi. .