L A P O P ! PENELITIAN
HISAH BERSAING V1114 PERGURUAN TlNGGl TAHUN AF4GGARAN 2001
PRODUKSI, KRlOPRESERVAS1 DAN PENENTUAN JENIS KEtAMIN EMBRIO HASIL FERTILISASI IN WTRO MENGGUNAKAN SUMBER SEL TELUR ANAK SAP1
8. PENANGGUNGJAWAB PENELlTlAN
1. Nama lengkap : Drh. Bambang Purwadara, MSc. PhD. 2. Jenis Kelarnin : Pria
3. JabatanfGolongan : tektor Kepala Madydlllc
4. NIP : 131404216
5. Bidang Keahtian : Fisiologi dan Bioteknologi Reproduksi
6. FakultasfJurusan : Fakultas Kedokteran HewanlReproduksi dart Kebidanan 7. Perguruan Tinggi : lnstitut Pertanian Bogor
Nama
Bambang Purwantara tman Supriatna Tuty L. Yusuf
M. Agus Setiadi
Bidang Keahlian Fisiologi dan Bioteknologi
Reproduksi Fisiologi Reproduksi
dan Kriopreservasi Manipulasi Embrio
dan I0 Fertilisasi in wtro
Fa kultas' Jurusan KedoMeran Hewan
Kedoktetan Hewan Kedokteran Hewan
Kedokteran Hewan
l n st dlrsi IPB
IPB
IPB
IF8
8 . PENDANAN DAN JANGKA WAKTU PENELlTlAN :
1. Jangka waktu penelitian yang diusulkan : 4 tahun
2. Biaya tahun IV yang disetujui : Rp. 40.000.000
as Kedoktefan Hewan Peneliti Utama
5
WATA PENGANTAR
Laporan penelitian dengan judul "PRODUKSI, KRIGPRESERVASI DAN PENENTUAN JENIS KELAMIN EMBRIO HASIL FERTlLlSASl IN ViTRO MENGGUNAKAN SUMBER SEL TELUR ANAK SAPI" ini disampaikan kepada Pimpinan Proyek Peningkatan Penelitian dan Pengabdian Pada Masyarakat Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi melalui Fakultas Kedokteran Hewan lnstitut Pertanian Bogor.
Tujuan dari laporan ini adalah untuk memberikan gambaran tentang beberapa aspek stirnulasi hormonal melalui pemberian hormon gonadotropin (FSH) dan kombinasinya dengan
progesteron
implant (CIDR) temadap daya tanggap ovariurn anak sapi untuk menghasilkan folikel. Teknik panen sel telur melalui pembedahan (laparotomi) pada daerahlinea
alba
telah pula berhasil diidentifikasikelebihan
dan kekurangannya.Pada tahun ke empat kegiatan penelitian
ini
telah berhasil dilakukan identifikasi beberapa faktor yang mempenganrhi kemampuan individu anak sapi merespons stimulasi hormonal. Data yang diperoleh akan sangat bermanfaat bag! penelitian tahun ke terakhir yang akan dititikberatkan pada penyempumaan sistem stimulasi hormonal, pengembangan medium pematangan, fertilisasi dankultur embrio disamping pembekuan embrio
dan
penentuan gender.Bantuan dari berbagai pihak khususnya rekan-rekan staf pengajar dan pegawai di lingkungan Bagian Reproduksi dan Kebidanan FKH-IPB telah memungkinkan terselenggaranya rangkaian penelitian pada
tahun
pertama ini. Kepada semua pihak yang tela h banyak memban tu, khususnya kepada penyandang dana, penulis mengucapkan terimakasih.
Penghargaan dan ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Pimpinan Fakultas Kedokteran Hewan clan Lembaga Penelitian IPB yangtelah
memberikan fasititas dan mengijinkan terselenggaranya kegiatan penelitianini.
Bogor, 18 Oktober 2001
l n t e ~ a l antar
generasi
merupakan salah satu unsur penentu efisiensi program perbaikan mutu genetistemak. Dengan
mempendek interval antar generasi, mutu genetis induk dan pejantan dievaluasi dengan cepat. Dibandingkan dengan inseminasi buatan (161, program transfer embrio(TE)
pada program pernbibibn dianggap lebih efisien karena kemampuannya mernperpendek Interval antar generasi tersebut
Dengan
TE, evaluasi dapat dilakukan terhadap saudara seibu (sister sibling) dibandingkan1B
yang harus menunggu anaknya berproduksi (daughter). Dengan ET, bila dibandingkan denganIs,
waktu evaluasi dapat dihernat sekitar 4 tahun untuksetiap
generasi
(Lohuis, 1995). -Pemendekan
intenral generasi diharapkan dapat ditingkatkan dengan rnemanfaatkan anak sapi betina prapubefias, sebagai penghasil el telur. Sel telur tersebut kemudian ditumbuhkan secara in vitm untuk selanjutnya dapat rnenghasilkan embrio (Tervit, et al., 1994, Revel et at, 1995). Dengan pemanfaatan oosit atau embrio yang berasal dari anak sapi yang beiurn dewasa kelamin, interval antar generasi diharapkan dapat dikurangi secara nyata. Hal ini dapat menghemat waktudan
biaya, sehingga rnemiliki keunggulan ekonornis bag1 industri peternakan disamping sebagaipendukung
bagi pengembangan ilmu dan teknologi. Dengan teknologi inseminasi buatan
(In)
dan transfer ernbrio (TE) saja misalnya, laju perbaikan mutu genetisterhadap
efisiensi perturnbuhan diperkirakan meningkat dari 1.4 menjadi 2.6% per tahun. Laju perbaikan mutu temak diperkirakan meningkat sekltar 12% apablla cadangan bibit yang dihasilkan melatui MOET dapat digantikan dengan jantzn dan betina prapubertas (Lohuis, 1995).Teknik
rekayasa
garnet (spermatozoa dan sel telur)dan embrio
telah mernberikan kontribusinya bagi perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi di bidang ieproduksi. Teknologi tersebut diantaranya meiiputi produksi embrio invitro
(PIEV), kriopresewasi (sperma, msit dan ernbrio), rnikrornaniputasi dan penentuan jenis kelamin embrio (embryo sexing).6ue!unuau urelep nleq uejeyapuad ueyedruau (13flr/ja~sue~j ovquta
WJ!A u! al!uahn!,) ~des yeue Jnlal las Jaqwns ut36uap ouqlua !synpoJd (€661
'-je
ja e~eluemnd) yeAueq qlqq 6ueh o!Jqua l!seq uep yapuady!qa: 6ueA ueuauecuad ImJalu! u~6uap dnp!~ q!sew 6ueh 1n66un ynpu!
!nlelaur ~edep !delal '(966 1
'uezzsl
uep !1le3) Guolod!p 6ueA uemaq u ~ p Jnlal!as ueylepue6uatu dueq yep9 ~ 3 1 6 InqasJaJ y!uyal enpay uey6unqe66ua1.u
ue6uaa '(€66~
'wquemnd)
dnp!qu m a y
uep Jnlal las uauewauynlun ge~6ouose~~lri njucq 1eje
ueeun66uad
uep ( ~ q l d ] OJ!!A- u! ouqwaIsynpojd y~uya: yelepe Gunynpualu 6u!les Guuas 6ueA y!uya~
ens
-
qeund
~ue~ue~al6ueA ewes !sehlasuoy cue-16o~dynlun 'seyxpal
yelun!
welep euas'(juaura~elda~)
yue66uad ynpu! uedqliuad usp yq!q !synpo~de p ~ d
se)eq.ma u!sew oyqwa !6olouyal u~eejueuad dasuoyeyew '6ue)ew 6ueA
ueeumua~ad
ueynpaualu uep leqeut 6uolo6~al q!secu6ueL 16ojouyal !e6eqas -)nqasq I=J~LFJ
uals!s
luelEp (vuanhl) yeuelepnluueMay !se~oldsye nele
usleejueurad
t6eq rueq 6uenlad-6uenlad ~Au(n3unuuesuep lenyad!p uep Gunynp~p lnqas_ral leH -yapuadad!p p d s p yeural uee!lnluad ua)s!s Luelep !se~aua6 lemaau! 'pmy snapnu wajs!s !nleyalry -81
lue~6old
!nlelaul
uelue!ad
ueyleq!laluehueq
6ueh (iua6old !In) Iwo!suaAuoy ueee!lnwed ruals!s !6eq j!lguallB rilesyeles
1e6eqas eAul!s~queyyn[unuau
!elnu
Uqar
n!~w
e~e6au 1e6eqaq !p s!yuu~p 4elal6ueL 1 3 0 ~ wu60~d'(966
1 'seloq=r!~) ue]~ySu!uad !sua~od ueyyntunuawGuruapua:,
6u!paarqu!
ey6ue ,pa4 snq~nu,, nlensruetep
31
y!uyal
!nleyaw ouqua !synpo~d tua$s!s nlenswepp
EM~E~ l ~ i m pnvad 'ue!y!wap unlueN '(9661 "je
-Ja
uasallea)ehuueurunlay
gepq e ~
-eIwsnaua6
uendur~way uey)ey6u!uatu ueyEehu!yye
~ped 6ueA'!syalas
seysualu!
uey~ey6u!uatuuqe
Inqasdal wa~s!s's!laua6
EJW~S -Iwo!suanuoyueut~eylad uefiuap
uey6u!pueq!p
EI!~ )!y!pas q!qal qne!6ueh
enlel u~y np&p eheq ueurunlaq y slunias uey l!seqbau ynjun
'jnqas~al tuapoury!uyal ue6uaa 'I966 1 'seloyq~) yeulal !synwda~ !sua)od
ueypy6u1uau
y n w
qelepe!u!
!6olwyaj ueeun66uadcum
JeeJuEur
B~UIBSBP ~ p d'!des ehsnsnqy yewal ueqlnwad
uals!s
uep ue!6eq !ebeqes sen1 e~-s ueyeun6!puleye
eOnP?p
(3~1)
WWa
JnllWUeP
'(JAJ)!==!lW04
'(WAI~ Jnlallas ue6ue1ewad
uals!s
ynlun!se~auaf3
lehlalu! ue~apuaw~d u~p
uouuoy
ueeundbuad uqewaq6uadwedas
aAuu!el~nsun-~nsun
urqqeqluw!p
ey!! ~pue6 ~ed!paq ueye IU! ue6un~una)l .EseMap ynpu!ulebuap
uey 6u!pueq!pa~d!l
!ley
e6~owua
uey~sey6uaw nduew !desyeue qelu (~66~
"le
ja
6wsuv ) n66u!ur E uqep !Ieqas Bueln!paedsp
!desywe eped
mle)
tas !syaloy uep !selnnmadns w e q !surnse ue6ua~ti. TUJUAN DAN MANFAAT PENEUTIAN
2.1. Tujuan Penelitran
Tujuan umurn dari penelitian
ini
adalsh:1. Penyempurnaan teknik stimulasi hornon dan koleksi set telur anak sapi serta produksi ernbrb in vitro,
2. ldentifikasi faktor-faktor pznghambat perkembangan sel telur anak sapi dan pertumbuhan embrionya,
3. Perbaikan teknik kriopreservasi embrio hasil fertilisasi in vitro sel telur anak sapi,
4.
Penentuan
jenis kelamin embrio yang diproduksi dengan sumber sel telur anak sapi melalui teknik biopsi dan PCR.Tujuan khusus dari penelltian pada Tahun 1V adalah:
1 .
Mengoptimalkan
pernanfaatan bibitunggul
melalui eksploitasianak
sapi sebagai penghasil sel telur untuk program fertilisasi in vitro.2. ldentifikasi faktor-faktw
penyebab
rendahnya angka kebuntingan melalui kajian stnrktur ultra sel embrio.3. Modifikasi sistem kultur menggunakan alat inkubast sedet-hana.
4. Mengotimalkan potensi genetis sapi-sapi Indonesia melalui teknik
terbanr
kriopreservasi embrio.5. Penggunaan teknik biopsi dan PCR untuk penentuan
jenis kelamin embrio
pra
pem bekuan (kriopreservasi).Penelitiar! ini diharapkan dapat hemanfaat bagi:
1. Pengembangan sistem pemuliaan melalui pendekatan bioteknologi reprodu ksi modern, khususnya dalam rangka rnemperpendek interval generasi,
k ~ g r a m transfer embrio (TE) pada sapi,
khususnya
sapi perah betina dewasa (induk maupun dara), telah 'dimanfaatkan dalarnrangka
meningkatkan mutu bibit (Nicholas dan Smith, 1983). lnduk sapi yang dalam Proses reproduksi konvensknal hanya mampu rnenghasilkan seekor anak per hhun, dengan program TE mampu menghasilkan 30 embrio atau 15-20 ekoranak pertahun (Purwantara, 1991). Oengan
cara
ini,
induk
unggul dapat ditingkatkan potensinya untuk dapat rnemperpendekjarak
generasi dan mempercepat seleksi (Nicholas, 1 996).Pada
sistem
seteksi
konvensional (uji progeni) sesuaikonsep
Robertson-Rendel untukmenetapkan
tolok ukurproduksi
perfumenunggu
ana k(daughters)
meng hasiikansusu,
sedangkan dengan TE prcduksi dapat diukur melalui saudara betinanya (sisters/sibs). Dibanding kan cara konvensional,perbaikan
mutu genetisrnelalui
program TE dapat dtperpendek sampai dua kali lipat (Nicholas, 1996),Calksen et at. (1996) melaporkan bahwa program yang kini dikenal
sebagai
multiple
ovulation and embryo.tmnsfer
(MOET) tetah diterapkan secara sisternatis pada kelompok sapi betina elit sekurang-kurangnya dienam negara Eropa dan Amerika, melalui
konsep
"nucleus
h e d . PernerintahIndonesia telah rnengantisipasi perkembangan tekno-logi tersebut dengan introduksi TE pada tahun 1984 (Purwantara, 1990)
dan
diperkuat dengan pengoperasian Balai Embrio Temak (BET) di Cipeiang Bogor yang melibatkan tim JlCA Jepang dan perguman tinggi (Purwantara, 1995). Meskipun demikian, operasi~natisasi BET tersebut sejauh inimasih
jauhdari
konsep"nucleus
her#.Program MOET pada induk sapi masih dihadapkan pada berbagai kendata. Kendala utama yang dihadapi adalah
pembatasan panen
ernbrio hanya 6 kali koleksi per tahun atau dengan intervai koleksi2
bulan (Purwantara etat.,
1995). Oisarnping itu, betina induk sapi perah tidaksetalu
be
respon
secara konsi sten terhadap s~pero~~ulasi(Purwantara et
at,
1990),
meskipun ultrasonografi telah rnulai banya k digunakan sebagai alat bantu
ueurunlay ueyl!sey!p ueye !u!
me3
u~6uag -]euo!suanuoyurals!s ueeun66uad
S ~ J E !p OhZZ ~ehwps nsns
!synpo~d
depey~a~s!laua6
nlnu uey~ey6u!uau~j e d ~ p uslnq
s-c
Jnun !des y eue Jntal las Jaqulnsue6uap d 3 ~ 1
pep uqj!seq!p 6ueA eseMap Ides yep 1 3 0 ~ luals!sue6uap
6unqe6!p ey!!!~a60~d
!In
(566 C)S!n401 lrunuaW '(566
L
'K6L ''IF la He31086
L
"'le !a uasnW1WCl) W u O Pyeue eped
e6nI
uewod~(!pmlal
lasuaued
(~61 '~66~ "le la 6uo~lsuuy)! d ~ s yeue eped Guidwes!~ '(g6~& '~[Mal) c.J]!A u! oyqua !synpo~d ynlun Jnlel
1% 11seyBuad !ebqes (altuaAn0 uemq yeue ueeun66uad yelepe l e d a y!qa(
e~e3as ln66un
q!yauaB
uajeu ueleeluewad wqep ruecpal ueleyapuad-uollyala
d o y s t u y ! ~ue6uap
win Anlyruls !6olo~~oul ~pnls !nlelaw !nyelay!p npadueqenqurad
~r(ule6e6was
!sejnAo uep mlal ;as ure6uequayad!sualaduoy
ehuyepua 1eua6uau Jesepuau 6ueA !pnlS'!pebal
InqasJal !s!puoy ede6uaw dey6uruai wnlaq !u! lees !edweS , 1 3 0 ~ ue~6o>d u ~ p p~ouop
!pe[uau
yehq
yepn
!des yeue wqeq ueqyn!unuaw 6ueA (1~61 'le la lap!aS $961 'a~ooj uepewnuo) ehuurn~aqas
uenwqueysefiaueur
!u!
I!seH -!qenq!pyep9 6ueL Jnlal }as 9.0 ueyl!seqbuaw
ehueu
Q E L U ~ I
jnqaaal !selnno ey6~'(!selnno 1 'E)
sslewaJ~e6ues
!p&al 6ueh !sslnho !delal (lay!loj 6.0 1) yeAueq J!JelaJ erIuunlun ueyl!seq!p 6ueA lay!lol mqeq ueqodq!~- C L ~ M ~ )
jajsueJ1ohqua
~JJ!A u! al!ua~nL !eBeqas leuay!pInqasJal
y!uyal
' ( ~ ~ u 3 )
auoumq
6u!seqar v!dar)opeuo6 ue p (HS~ auouuo y 6uye/nws ap!llol '(~3a)
u!dw
-0peuo6quww3
au!nb'm13
ue6uap!ses!uoJqu!s!p/!se]nhoJadns!p
6ueA uelnqE
Jnun !d~s ywle uwl!sewaqayuey~odepu
(~661)
'ie )a yfclel'(~661
"le
la wquemnd) yerlueq 4!qq 6uerC ouqura l!seq uep yapued yqal6ue6 ueuawuad leiuaau! ueBuap (nb6un ynpu! uep Buqwaq wmas qalwad!p
jedep !dqq
'(966~
'uenq
uep
!lle3) Guolod!p 6ueh uehay yep Jnlat bas ueylepuebuaul @hey yepy! d q ~ InqaaaJ quyal snpay ueq6unqe66ueulueSuaa
'(~66b
'wquemnd) dnp!y uwquep
Jnlal lasuaueulaur
ynlun!#w6ouosqn wueq JelE ueeeun6Bued uep ( d 3 ~ 1 ) wgn
u!
ouqura!synpo~d
y!uyalqeppe
lnqaslajgeurallE
ywaw ynaun u~EuruapuemqGuc~opuaw
ue6ueqwaylad
!sualaduoy
6uelual qne! y!qa! 6ueh ue!!sy ueynpatuelu!u!
~ipuoy -yo€ snslahyOm
!uyeA ep-aq qnel d n y m 6ueA ue6u!gunqeyey6ue ueylodyaiu ( ~ 6 6 1) ye
)a
lanat; '!des ywemlal
p s uep ynpu!\as
lese
oyqwa uebu!lunqay I!sey emue ueylelel!pq!r
'(~66 1 "iela
sedao)l)nyaq ouque yryun y,6 uep ~ebas ouquta ynwn ~hcp uep ( ~ 6 6 1 "le la sFa7
:
166~ '-pla
e~eq!?~)%EE
'(5665 "ie la I ! N ~ L ) %EZ '(~665 '-ie la 6~4s~)%EL
!edmuaw ehey yeue ue>r(!seybuaurynjun
I n q w @ES y ~ u e ouqwausr~dursuray e~yeq uewadal!p 't?Auu~fUl!~unqay IJSE~ uqey welea
y!p opqwa ue6uleqwaylad
uep
3oS1z
']!so0
leq6up eppddaln)as
s!s!leus. uey ~unSBuaw
ueBuap ueje)ad!p npad !u! s!so~sqq ey 5ueueumnuad ue6uwapua~y
b u e ~ u a ~
welepuaw 6ueA !pnls 'LaGeneap,)IEME
ueyepquad
deqel
!edues y!eq ue6uap Gueq~uay~aq ndureul yslalass!solselq !pejuaur 6ueqwayleq ysoo !sua~adwoy ueurunwd
uey~odelaur
e6nl
(~661)
+le
ja
lahau
'(ese~ap uwy) ynpylese
~ ~ s o oueduap
uey6u!pu~q!p s!so)sqq !edmacu~des
y8ue )!so0 Guequaylaq uendureway ehuqepuallele3uavJ 6ue4 (~61) Ruled U~P (~66~) ' I P ja e ~
't
166 1) 'YYP d e~ecl!!~*lo
Gunynp~p yepg
sep !plnqaslal
uel!seyraqay 'ue!q!wap
unueN'qq!q !syalas luals!s ynlun !se~aue6 Gualas ueyapuauad uep uowoq ueeun6Euad ueleuaqDuad
yadas
eLuu!el ~nsun-~nsun uey yequellpey!! epu~b ledjpaq ueye !u! ue6unlunay -eseMap ynpu! usduap uey6u!pueq!p
lady !ley e6!1 oywa ueyf!ssq6uaw
ndweur
!des yeue eyew (~61'ye ja 6uor~suuv ) n 6 6 u y g uepp !(eyas Gueln!p jedep !des yeue
eped
Jnla) (as !sya{oy uap !sejn~o~adnsmqeq !swnse
ue6ua~ - ~ d & j !p Guolod!p BwrCides
Jnlaa
las
Jaqwns
uduap
d 3 ~ 1 u~qeun66uau nwe (~61'e~~ue~nd)
HuopjuuqLua
L-P
eJelue lEs!yJaq 6ueA esemp ynpu! sped !seln~o~adns!nye]au opqua
!synpo~d ue6uap eJelas !u! I!seH's!solselqptmur
-22
leyyas
ueyl!seq6uaurn w
(936
c
'-/e
la
swe~o)o Japuejl yellel ouquJa I;-Suep a!soo 8-zz '(~661
'-la
Pswl)
slsolsetq
C-z
u~pst
uebuap'(~661
"lewall
~y!t~ 0s-obJewas uey1!seu6uaw ~edep
uetnq
c-
mwue mrun ule6uapIdes
y w edegas
' a r pu!
o!Jqlua !S~~POJ~ uep!sep~o~adns
uenyapaddegas uep ouqua 9-2 emue ueyl!seq6uaw pdep !des yew
'(~66
t 'l!~eL) uewund~y qqapuaulBuell
Je!l ewesuqetue(aAuad i6eq tapou uey!pel!p eBnf ~ e d e p
uqeqapued
-(qqe~eadar)eped ueysepuq!p sqe !p jnqawal u~leyapuad ueynrn1asa)l 'J!e sesueuad
nep ese!q Jo$Eqnqu! welep ay ueyynseu!p uep n,?laual
203
ue6unpuey ue6wpsa6
uwndwmue6uap
uzy6unqua61p 6ueA un!u!wnle Bun~ueyu~eun86uad
ueylodelaul(~s6~)
'IB la W!EA 'nl! Gu!dues!o '(266c
'aAaJ3UeP
h a ~ v ) !u!u loleqnyu!
ueeun66uad uep
203 u!)e!p 6ueA saldol ueeun66uad'!seqnyu!
6usm
uweyalluadwadas
!seqnyu! ue~s!s ueyl!qasualuuep
qjecpeduraur ynlunueynyel!p
yeAueqqep+ s k d n
!e6eqreg-oyqtua Jnltny ue6uny8u!l sq!leny
ytunqadwau
elnd ledep wngolemqel ulejep !p mepn uep
ue:eund!p
Bueh se6 uwndumeped ueu!weluoy ektq~d~p~a)
'ny
Gu!dlues~]-opqua
ueqnqunyaduen66ueB
u~qq~qartuaur
ledepQ3
ulebunpuey uep nynsule6uequr!asay usynwe6uau
~ ~ d e p dnlnl-eynq sasmd 1we(e6uaw 6uuas 6ueA JolPqnyu! nlu!d 'u!q!s!s -!66ug 6ueh ~euo!swado de!q ueyynlnqwau uep leyw 203 Joleqnyu! ehuunrun 'snsn yy
6ueh
ue!~ewaduey
y nlnquatu uep 6uguad 1eDues!seqnyu!
urals!s
sel!\!qe!laJ uep sg!l!qelS 'e!)etueur ouquauep
Jnlal [as WJ!A u! ue6uequawad !sue$aduoy !qru~Brraduau lelualsya JOJYEJ qeA~eg=ua9 203 p!oxo Jowgnyu!
ue6uap Jnj(nq
uraqs?~'ems
.uey leuaylad!p nuad !des yeue ep~d {eu!Bmsue4 u ~ p leu!uropqe
suw
!syaloy y!uyal
ynlun 1~~~6ouosea)n uqe~jueluad 'fiseAu!-Uau q!uyaa ~leweale !eSeqaS.uwodel!p
qetuad wnpqIdes
yeuo ynlun erluutllaelueluad!dlela~
(€661 'eJeluEmnd1~66~
'qe
jaas~ala!d)
y~~buosea~n
nlueque6uap
uwnyepp
yela1 Ides y npu!eped
qsoo !SR~!~SB und!ysan .y!lewal uey !lid ueyledruaur !luqoJ~delyyuyal e y w 'n66u!w
E
ny(eMfiuqas
ueBuap !syaloy u~6ueln6uadu!cuefuatu
eun3 '(566
c
" p
la lama)ue6uolouad
qelaaas
!syaloy uep ( ~ 6 6 1"le
la 1!Nal
!zm1
"le
la 6~orlsw) !doyso~adel'(~66~
"YYPs~al)
!uqo~edel
qelepe !des ywe eped uleyeun6!pw!mt
5uek Jn(al las !syaloy y ! u y ~ i'(~65~
"le
Ja
Aassts) eqln Jnlynrls !6olovo~u uep !sdo!q ueesyusurad uefi~~p Uey!SEUNUoy!P~edep
'(~66~ '266c
'WWU~M~~pngalifm mmpuran gas
ke
dalamruangan
(toples atau inkubator) untuk memenuhikebutuhsn
kandungan gas dansuhu
yang dikehendaki. Pada studiyang dilakukm
oleh S~izuki et al. (d999). COzdisediakan
secar in situ melalui penggunaan butiran effervescentyang
berisi asam tartarat, hidrogennatrium yang terkarbonasi dan
air.
Avery at
al.
(2000) menggunakan sistem kultur AnaeroJarrM , sebagai alternatif bagi penggunaan inkubator GO2 biasa. Kondisi optimum dapat dicapai dengan rnenernpatkan sachet CQGenTM dengan asam askorbat di dalam AnaeroJarTM. Setela h berkontak dengan udara, C02GenTM a kan bereaksi untuk menghasilkan kandunganudara
dengan komposisi 1 54002 dan 6% COz yang diangap wkup untuk rnengkultur ernbrio sapi. Penggunaan sachet ini diharapkan dapat mengurangi biaya produksi denganmenekan
pengadaan inkubat~r C02 , men yediakan udarayang
bebas toksik, terukur kandungannya, meskipun bertekanan O2yang
lebih rendah daritekanan
udara normal yang mencapai 20%. Studi tersebutmernbuktikan
kemampuan sistem ini untuk rnempertahankan kultur embrioyang
dapatberlangsung selarna satu mlnggu.
3.4. Aspek selulo-molekuler dan tekni k-teknik kriopreservasi
Dalam
proses
pembekuan atau kriopreservasi, embrio menghadapi beberapa resiko kerusakan sel-selnya oleh beberapa faktor diantaranya : I ) toksisitas krioprotektan, 2) cedera akibat "chilling", 3) cedera fisik akibat es ekstraseluler, 4) toksisitas akibat elektrolit yang mengenial,5)
pembentukan
dan perkembangan es intraseluler,6)
kerusakan beiupa "fraktur" dan 7 ) pembeng-kakan osmotis (Kasai, 1996). Oengan mengunakanteknik
pembekuan lambat yang diperkenatkan oteh Whittingham et a/. (1972) embrio hams dibekukart secara lambat sehinggaisi
selulemya terkonsentrasi dengan dehidrasi bertahap karena pem bentukan ese
kstraseluler (Kasai,1996).
kiitis
ternperatur
secara -pat (Kasai, 1996j. Namun demikian embrio masih berpeluanguntuk
menghadapi Crentsakanakibat
toksisitas, pemkntukan es intraseluter, frakturdan ekses osmosis. Studi yang rnendalam tenfang kondisi seluler embrio dengan sumber sei telur anak sapi terhadap berbagai teknik pembekuan belum banyak dilaporkan.3.5. Penentuan jenis kelamin embrio
Terdapat
2 tujuan penting dari peditian mengenai penentuan jeniskelarnin
embrio yakni : 1) viabilitas sel embrio yang rnenjalani biopsi yang dilakukandengan
card mikroaspirasi Mastome r dan mikroseksisel
embrio, 2 )efisiensi
teknik PCRdalam
menentukan jenis
kelaminernbrio
(Peippo dan Bredbacka, 1 997).Oleh
karen itu perlu dicatat beberapa parameter penting seperti: 1 )perkembangan
embrio setelah menplani proses mikromanipulasi,IV. MATERt DAN METOOE PENELITIAN
4.1. Materi Penelitian 4.j.f.
Hewan P e r m b a n
Enam ekor anak sapi betina Frisian Holstein
(FH)
berurnur sekitar 3-4bulan
denganberat
badan antara60-70
kg dan tinggi badan antara7C75
ern
direncanakan akan digunakan dalam penelitian ini. Pada saatkedatangan
(sekitarsatu
Wan
sebetum percobaan dirnulai) hewantersebut
baru bemmur
2-3 bulandengan
berat badan antara50-60
kg. Hewan dipeljhara dalarn kandang bersamadengan
masing-masingkelompok
terdiri atas3
ekor.4.1.2. Ovarilrm sapi dewasa
Ovarium diperoleh dari jenis sapi
potong
PO dan Brahman cross yangdipotong
pada Rumah Potong Hewan (RPH) dilingkungan FakultasPetemakan
IPB, Kecamatan CibinongKabupaten
Bogor dan Kabupaten Cianjur.Ovarium
dilepaskan dari penggantung ovariumsegera
setelah pernotongan dan dimasukkanke
dalamtemos
dengan suhu37°C
dan sesegera mungkin dibawa ke laboratorium.4.2.
Bahan
dan Feralatan 4.2.7. BahanHonnon untuk stimulasi folikef: FSH (Anttin@, Japan) dan progesteron dalarn bentuk
Controlled
Intravaginal Drug Release (CIDRm, New Zealand); bahan untuk bedah: xylazin (Xylaza-2m), atropin sulfat, desinfektan dan antibiotika; medium pembilasan dan pematangan oosit: PBS, TCM 199,fetal
calf serum
(FCS), Penisilin-Streptomisin; mediumfertilisasi:
Medium Brackett-Oiiphan(BO),
kafein,
BSA; dan medium kultur perkernbangan embrio:CR
I aa, BSA.4.2.2. Peralatan
(bu!quewq~op yn~un) 1 1 % ~ 8 ~ 1 3 9 yod~otay eped 'ma3 las !sya(oy ujnlaqas gw P !elnu!? 111 dew1 ynwn
nv
SZwol
nelen~
z
'c
'v
'p '9 '9 uep 'I dew1y w u n
nv
02 lelwnele nv
z
' Z'c
'E
' S '5) leybuwaq umnl s!sopue6uap
Irun)-lrunveq ueyE
ewelas (a~os-!6ed) uqas !leyenp
ueynyelip#sj
ueygunAuad -(II uep 1 d e q e l ynjunmya
~u!selu-bu!seul 'g yodwolay) HS~nt,
sz
nqeoz
uep
dq13
!seu!quay uep '(11uep
I deyel
ynqun
JoyaE
6u1selu
-6u!sleu'v
'yoduolax) F:SJ(ny)
6u
sz
n q e 02u!darlopeuo6
ueqqunhadqalaaduraur 6u!seu-6u!sau~ uekqm~ad
umaH
-11uep
I unqel ueplauaduep
y!eqal
y!uy
a1 !e8eqas uey lndw!s!p euelu!~beqas H~JD-HSJ !seu!qcuoyuep
HSJueyeun66uau
uebuap ueynyel!p jeuouuoq !sejnurgS'u~ylq6u!i!p ~ndurru
!s!sodu~oy uep !6us~ny!p !lue6Euad nsns 'dleue~aq
wmas
'uelnq I etuelas( ~ o y a
lad
6 y9 s
~~!yas) ellunpedas ~nduru uepmya
ad 6y yeAueqas(mpaa#opul) JeJluasuoy ueyed uep Oa~elda y~w) gue66uad nsns ial!l
s-P
qa]o~aduIaw ue6u~epay
lees eped
uqnq
c-z
Jnluruaq q!seur 6u eh ueeqmad uemH -(@xo~ng) ~!swedo~a d~peyaa !=sewueqe6a~uad
ju~eqo6uadU E ~
(wjweleso!g
uepwedojerua~)
u!w eyA!l]nlu u~vaquad'(~uazeqle~)
6upm u~eqo6uad u ~ ~ o J ~ ~ L I ~ u ueeqmadumaq 'Buapuey
!p !~duresqelales 'uelnq riles y!qq Buwny ewelas !sqdepe uep uedquad epopad -e[uaw uwaq 6u!seurdu!s~lu 'ueeqmad
ueeuesyelad
eAu!qnu!p wnlaqas -yeualad l e y 6 u ~ !p ue~~ey!geulad eseu euelas nsns ueuequad ynseutlaly!eq 6ueA !s!puay !y!l!urau uq~e~~As~ad!p
znqawal
ue~qmad ue~aq-ue~a~-qeJaep
lenl
uep uey6u~~p!p nele ~obq~e$!yes!p
E~E 6ueA IEQEJ qe~ad Idesue6uep m y n a p sny!l!qcun uep
fiu~qwe
eAelue u~luopq~ue!paw
ue!6eq
epednlna -ynqnj 6ueyepq ue16eq uesuap ueyEu!pueq~p y~puar q!qal yelauaj 4nqnl usdap ue!6q
uep
epday !s!sod ue6wp ~qluop/6u!quey uemyn
,,ajpen,,
ssle
!p ueyledwayp uwpnuay uenzaH -iuncun w e m s !salseueJal nele Jnpwal e~a6as uEye uma4 'ue!pnuray I!ualu edwaqaa'(ee6hmm)
mya
Buelnl ewevad seru uep uruyas Buqnl ejque elas -elas sped%z
u!lEueJpeu!ayop!(
m 2 ueyaqurdueBuap
ueynyel!p pnp!daIsalseue 'unueho
u ~ p sruqn !selnd!uelu yspnuadwaw s(nlun .lw 5 . Jelqas eluuauaw Joya degas '61$L+L
w y a s uspeq I E J ~ ue~~lyrad ue6utq~q~adueBuaa
'wnwn
uesnlqurad
saso~d ynlunueyguns!p
uepeq lmaq
6916~ 0 ~ - Q 51-0
yeheqas (mz-j(zelAx)%OZ
eu!ze!Ax .urnLun!salseue
Wqge !ebeqasqelunw suodsa~ qebmuad uep !sey!paufa~d !e6eqas
-u'!
emas
ueyy!$unstpIUI 0 18
yehueqas
%plejlns
u!doqe u~jrue( 'urny!lajseue uey!gunAuadulnlaqas
I!uaur
01
JEl!yaS '$w$uasuoy uep uenef!y ueyed ueyuayp eduel we! 81 emetas ueyesend!p eAwrrlal {as!sya/oy!p
ueyeB u d
!des yeuvwnurn eJe9as !sa)seuwal uep
6ueual ynlun
uey!s!puoy!p
u~wq '!ulojo~edel ueynyel!p lunlaqas '(m61 uep€166 1 ' e ~ q u ~ l ~ n d ) 111
uap
11
'Iunyel uemde7
eped urey!wn!p euew!eBeqas(eqp
eau!]) uauopqe ue!paw
y waep ~ p e dutr~epaqluad
!nje)alu !wo$aredel y!uy a) ueyeun66uaw ue6uap uey nyeyp mjal jas uaued'(666i "te 13 e~auewnd) W w
E uep y!qal Jalaurs!p ue6uap
~ay!loj
yelunlas u~qnqlunyad(€1
'(eAuu!el eu!gaq qeue qalo !y!eu!puep)
pay5upuejs
uep (~Auu!ei eu!yeq yeue !y!eua~u)m!junour 'Bueua~ yepg elejaS edruaq nye~uad ueueqruad (2) '~!pual !sayas
lueyn~uaqulad uep
e!ua~ad!v 'Enlnn ueyeybuaqurad edruaq y!sy ueyeqruad( 1) :ywuaq uqep !n~untu ~ e d e p
lay!loj ueqnqurnvad depewal ~!do~lopeuoB
uowoy u~y eun66uaul ue6uap.
leuouuoq
!selnulns
depewal suodsaa-uepAes
ueeynwad
ey nmueuyum!p uqpnway y!W81 wdep B u ~ h ulnyeno -eu!&n tuelep ay ueyynseup
6ueA Jelaley !nlelaLu
eAu!ses~leyo!
nlueqlp ue6uap ungeho yqal umuauue!pnuay
~ole~adg
'(eqle ew!!) ueBuuel eped ueyln!uel!p uaeAeAuad 'I!lnq leAehuau qelalas -6u1qwe ~eiualay uep ~esnd wye !p uauopqeler,uah ~ie!Beq !p
m
0
1-8 JEl!yas Gule[uadas ueqnyeltp uepA~Auad -uelshesywaep
.~q!yase p ~ d
eqnqJal 6ueA u!ey ue6uap dnlnyp !swado m!yasywaea '~leyed lnlyu!a lun!poA uebuap
!sa]o!p uep
loqoyle us6uap sq!q!p du-1nfuelas
ynaun unqes us6uap ueyq!sJaq!p uep Jnyntr!p !swado qeJesg'q!e~!p ~ e d e p
urnymo weLClapas
~selnd!uetu
ue6uap~66u!qas yapuad
qqal
fielaJua~hes
ay ulnpeho ywa! !u! y!uyal u~6uaa- u ~ q e ~ e p ~ a d usylnqu!uau !leyas I!y!pas ehuueyepaqaluad saso~d eBBu!qas qaep qnlnqluad 6unpue6uau
yy!pas
wwe uep s!dg ne(a @q/e eauq ~ ~ y y a s ! pley! ue6uuel uep #lny
uebuue!
eweq yelepe !u! y!uqal ueln66uney -unueno!s!sod u~y qe~e6uau aedep ~66u1qas !seu!uasu! un6 neie Jalaley uq6ussed!p
xya3 uep eu!6e~ sped
'!swuauo
ueyqepnwaur ynlun .!selnd!u~wue!ey6uaas
mynpad!p
'snleq snsn y!lsq!p !hunquaslal ~Auese!q BueAwnueno y!wau ynwn
'nu
euaxy qalO -Jesaq snsn uepsnjeq
snsn!se~nOguoy
y!pq !p epwaq !synpoda~ uwnles uap unyeno '6uquqal ysod
urelea
'!66u!g
q!qal 6ueA !s!sod eped ueyyelal!p 6ueyetaq uq6eq ynqnl euas 6ue~uapal
ueepeal WeP ueMay !s!sod ueyqnlnquau !u!
y!uyal
+6u!qu~~~ruatay
uepsny!l!Wn WQue !s!sd e~ed uep
(Wje eau!l)
ugnd sue6 eped yduruaqynqnl
Gue[ueuaur nqwns ue6uap ~e!~[as y eMeq u@eqmad
6u!pu!p ue~eA~Auad!nl&rn
ueynyel!pue!pew
ueqepaqwad lua)s!sue8uap
Jnlal lasuaued
'!se~ado
u~erles
lel!yas
Gunpu!lad u!eyue6uap
dn~n~!p u~pam-
urn!p@
uebuap!salo!p anqaaal
wpau
qwaep uleyBuuay!p qqaps 'palyleq ! l u ~ !pueLu15
4.3.2. Aspirasi folikel dan koleksi sel telur 4.3.2.1. Ovarium
anak
sapiFolikel yang
terse
bar di permukaan ovarium diaspirasi dengan meng-gunakan
jarumukuran
21 G yang dihubungka&dengan alat suntikplastik
ukuran
20cc
yang berisi2-3
cc
larutanphosphate
buffer saline (PBS). Untuk menghindari pembekuan cairan medium akibat teraspirasinyadarah
bersama dengan cairan folikel pada medium ditambahkan 10 1U heparinlrnl larutan PBS. Teknik aspirasidilakukan
dengan pendekatan aspirasi funggai yakni penyedotan cairan folikel satupersatu
melalui permukaan masing-masing folikei (teknik terbaik sesuai Purwantara etal.,
1 999). Cairanhasil
aspirasi yang berisi sel telur ditempatkan pada filter ernbrio dan dibilas dengan PBS guna mengurangi campuran darah di dalarn medium koleksi. Caimnyang
telah tersaringtersebut
kemudian dipindahkanke
dalam cawan petri besar.Sel
telur yang ditemukan di daIam cawan petri besar kemudian dipindahkanke
daJam cawan pew kecil (ukuran 3 cm) yang berisilarutan
TCMI 99. Sel telur yangtelah
terkumpul kernodian dicuci duasampai
tiga kali dengan menggunakan larutan TCM199yang
diperkaya dengan5%
fetal
calf4.3.2.2. Ovarium
sap;
dewasa dari RPUKompleks oosit-kumulus (COC) dikoleksi dari folikel berdiameter 2-8 milimeter yang terdapat di ovarium dengan menggunakan jarum ukuran 18 G dengan
sisj
miring (bevel) yang pendekyang
dihubungkan dengan spuit plastik steril. Dengan rnenggunakanconical
t u k ,
seluruhcairan
folikelyang
teraspirasi dishpan dan disatukan untuk beberapa ovarium yang tersedia. Se! telur yang dikoleksi kemudian dibilas dengan medium pembilas TCMt99.4.3.3. Evaluasi
dan
penentuan. kualitas sel telur ...Sel
telur
yang terkdeksi -dievaluasi terhadap kualitasnya metaluidua
indikator yanglazirn
digunakan yakni jurnlah lapisandan
integritas set-sel6ueA
(le~au!ur
yellu!u! dnlnyp uep InOOL
uesalal
edruaq) !ses!l!gral lunlpauuepp ay uewynssup ue!pnulay Jnlal
las
'~u~eozo~ewads ,OL x S ' Z ~qqepe u~yeun6!p 6ueh eoto~eltlleds iseJluasuoy 'uuedaq uep u!ajey
'u!s!u
-ojda)s-u!l!s!uad
')ehn~~d urnlposw6uap
!squalualdns!p6u~h
~a
urn
!paw uegp fseqny u!!p eozojewads '!se)!sedey saso~d ynlun
-!ley
edwaqaquepnmad
!n(e(aw
erCrua~uaBuad uP$nJe( yep uey!wnw!p qalo~ad!p 6ueLeozo~euads -eAusel!l!ua4 !ny etay !p 6ueA ny aq uauias ue~eun6Busu
ue6uep
uqnytyp OJ~A u! !seu!cuasu! nwe !ses!(!yad -VS~ uehap !se~uauraidns!p
6ueh Og un!pau !uyeA
pimuad
wn!pauJ ue6uap !3n3!p Jnlaa las 'y!6ologoureJezes uEynyel!p 6u~h Jnlal !as ue6uepway !sen(ena qelalas
'yrunlasluaw
exgas
ehuralnlas seluSalu!
uepeLueluseldoo
sw!leny
'snlnuny las-las !susdsyaednraq
eueln ~ol~ypu! epednae6uacu
ua6uap
!senle ha!p IISOO ue6uslewad - UE! JQMas nayam ey 6uejLuelep
s~e !p InqasJal ~s~puoyurelep
6unsbuepaq JnlaJlas
ue6ue~euradJnlln)(
'r;lua!3z03
pox0 Joleqnyu! uey~un66uau nep 2 0 3 %S ue6unpueyuep (0/o~6) leur~syeur ueqequratay '30~.0f: nqns
uehap
Jojeqnyu!w q e p !p
u~yl~dural!p
l!soo
!suaq
6uehuln!pan
.we!z
lel!yas euelas
ueyiseq-ny u!!p nlnqep y!qal~al
4qa~
6uehue6ueleuad
urn!paur
uesala]
deyas epedAnla1 las 0z-01 uey~edwauau u~6uap ueynyel!p Jnlat !as us6u~s~ued
-!s=!lvals!p
uelaj
6ueA leJau!luyehu!ur
ueyeun6tSuaw
ue6uap
ehuueqnuuad uednlnuad ueynye(!p usden6uadueputy 6uaw
ynlun
-(tu:, g~alau~~p)
6uepas
uemyn !qadumm
sme!p In00
1ysheqas S3-J %S
uefjuap !selualualdns!p
6ueA 661~31 wn!paw ueselalqenq
p
IEnquraur ue6uap u e y d ~ ! a a d ! p mlaj jas u~6ue)euad urnjpapy.uw!se)wlunyoD!p uep )wer>!p
a
uep
3sw!leny
u ~ 6 u a p
303
'!sya(oycai 6ueA Jnfal las 1~101 ueliun~!qBuad FURS-eAqnyuaq
ue!!n6uad
evasue6ueqwaylad deqea-deqe] wp ue6uqecuad saso~d wslep ue@un@p ynlun
yeAq u~yqehu!p 6ueA eles
a
u~pv
sel!(sny.lsq 6ueA303
eXue~40 ~ r t 02 ueyequeuad uep
vsg
ue6uap !squaualdns!p 6ueA 661~31uqruel
ep~d uede!s~ad ue6uap au!p!Jn !seqnyu! (e) :uede!s~ed deqelA ede~aqaq
ue6uap jn~ymas'ell\n ueesy!~awad
ynlun
u~yd~!aad!p !syaloylal 6uerC )!so0-ese!q 203 Jolpqnyu!
uals!s
nae6uaw ue6tiap
ueynyellp
Jnljny S~SOJ~qrunlas -rueq ~,uaD
qaq3Esueynpawau 6ueh 3~1 uep 3~1 'WAI ueynyelalu lees !uyeA nlyeM uau6as
epe
eAui(ep!gas
ny
eualey
Val0 'qnq!p YEP!$ said01 6ue[uedss 6unsSuel.laq eAuu!el se0 uep203
uePunpuc3y
ueyu!y6unwaw wa~s!s ueeun66uad.lede~ qequleuaq u ~ p ley 6ue~al
ye6e dnln] e66u!yas 'sa~do~ uJe)ep !p j!l!sod ueucyal eAu6uequaylaq
~tqu!y6unwau ueye
punfiuad
d~ly 'pun6uad dyyy ~ n q
pue6uap !sesyy
6ueheAudnln1 GuesecuaLu
ue6uap
)edw dnj~q!p ue!pnluaysaldol
'saldol ulelepay ueyyelat!p uep eynq!p
awes
' s a l d o ~ welep ay ueyyejal!p o!~quran!soo!suaq ue~er, yelalas
'3&9
UBP 41qal ye)la~pes
~nl~ladura]us6uap
y!wajosya Iej!smq
yerepe
expn ue8uap qeqmyse wese !syeaa wepnue6uap ye~uoylaq
qe]aJas
NYE ueqepwes
'~Aul~nqurad yqed us6uap !ensas *o!lquran!soo myny ureiep ueyeunE!p JewoysE uesa !suaq wlua3 203lau3es
uep ,,jeraJaeuv ]at!/ S'Z awn run ~euoqey!lad
sqdoj qenqas,,uagz03 p ! o x ~ JoJeqnyu! uey euri66uaw mqny
'S-E-P
I
.s!soJsejq
ueBusqcuayrad
deqe]eped
lew!syeu ueynqurnuad eped!edtues Fey
de!las
geue!p
ekuln!uelas ue6ueqluayad 'uayenqurad elIu!pepal!sq!pu! !e6eqas (a6e~eap)
ueqelaquad
erluepe ley!lacu ynaun qnyehu!elnul!p yqalas WE! gp
~ped
!1Eure!p ouqura ueSueqluaylad - 2 0 3%s
u~6unpu~y uep wnlulsyeluueqeclulalay
ue6usp'305'QE
nyns
eped ele CU=)uln!palu
uesaial
sped uley~~duraualu us6uap uqnysl!p ~06!z JnIlny -QS~uebuap !squauraldns!p 6ueK 0q wn!paw ue6uap !ley edwqaq pm!p
uep
snlnluny ]as-las y~p ueqy !s~aq!p lnlal 1%'!ses!lwaj
sasosd qqa$as-I.uE~~
leuelas
203
ue6unpuq u~purnlw!syeur
ueqeqlualaq5-1. PElV anak
sapi
Produksi ernbrio in vitro dengan rnenggunakan sumber sel telur anak sapi barn akan dilaksanakan (dimulai) pada awal November 2001 oleh karena adanya kesulitan sinkronisasi waktu pindah dari fasilitas lama di Bogor ke
karnpus baru
di Darmaga. Olehkarena
itupada
tahap
ini
belumdapat
ditaporkan produksi ernbrio anak sapi yang dijadwalkan berlangsung selama2 bulan (sampai dengan
akhir
Desember 20Ollawal Januari 2002)5.2. PEIV sapi dewasa
Produksi embrio sapi dewasa dengan sumber ovariurn dari RPH diperoleh dengan tujuan untuk dapat memenuhi jumlah embrio
yang
dapat dibekukan. Dan pengajaman peneiitian tahap atau tahun sebelumnya, jumlah embrioyang
dihasilkanoleh
PlEVpada
anak sapi sangat tidak mernungkinkan untuk dapat dilakukannya percobaan pembekuan embrio dan penentuan jenis kelamin embrio. Olehkarena
itu atas kesepakatan timpembahas pada evaluasi Tahun ke 111, percobaan pernbekuan dan penentuan jenis kelamin
ernbrio
dapat nenggunakan embrio hasil PEIV pada sapidewasa.
5.2. I. Kondisi ovan'um dari RPH
' 1
law1
eped!leurqp ledep ~nqasml oyqlua ue6uequawad dew !edmuaw
ueI!sswaqay
ey6~
-s!sqselq
uep elmou '13s9)
!edues '8 Uep opqwa ueywuaquadyelepe
!u!
ueg8uad yep geue!p 6ueAopqtua
ule6uequaylad
ouqura uetjuequtaqmd -pmz-s
'%S8 s W ! P U e W W nele
%SL
!edmaw
ajw
a6eneq~ iwmueiu 6ueA(0002)
'le la
haw
yap ueynysl!p6ueA !pnls yep lq~p
Bueh
l!seq
qeMeq!p u~p % g ~ ' g p~'p~-wel
a6meapE ~ B U B
u~qodelaui6ueh
(~661)upuaH
uep y!eq wqa( I!y!pas!u!
~!ss~ - 0 h p q ~ s qe)epe ju! u~!g!lauad Luelep (las lenp ay riles yeplas
ueyelaquradey6ue) a)w a6eneap uesuap m y y n[unl!p 6ueA !ses!gyaj ey 6uv
.!des
srulsa
luntpejs !e6eq~aq pep
ullruas
ueyleq!(aw 6ueL myny wa~s!s !e6ecpaq ynjun~80.1~ e)e~-qw !ede~au
6 u d
(~661)FpuaH
qajo ueyysey!p 6ueAue6uap
wwos JnqesJal ue6u~1ewad ley6w~,OC'ZL
ae-1-e)~~ !edmuaur sntnuny 13s-]as !suedsyau ~ 6 u a p
!epuq)p 6ueA Anla1 \asue6ueleurad
ey6uv!s~s!l!~aj
ely6ua uep
mlaa
las ue6uer wad -&-~g'wnueno
lad
qsoo 8-b mque uep ~ t ' p 6u!seru-Bu!seur 8
uep
tls q l e n y
)!soopsey
JwmuauJ6ueh (586
1) 'le la a6pallna -pauJq!al u~p (~661) UpuaH Yale ue+l!seq!p6ueh
ue6uap welesu n w w
(~86~ "te la ~1) wnyeno Jad $!so0 6.9 !uyd sy66ul !p qalojad!p
6ush
l!seq ue6uap uey6u!puleq!p ey!! qepua~ JgelaJ!u!
!s!puo)(
.a
uep 3l!soo
sel!leny ueyedruaujerlues!s
uzy6uepasa
uepv
ysoo sEl!leny!y!l!uraur
0 p . l T 6 9 ' ~elel-qw InqasJa) l-lelunr
pea
'cunuEnofi!soo08-1
T ~5.5 WEJ-~EJ uebuapLungeho ad qenq 01 ledrues 1 eJmue Jes!waq !sw!ds~~al 6ueA ]!so0
ey6uv .s!solselq ueynluaqurad uel!seWaqay ey6ue uEyunJnuau eind ledep
ualyeq uep (wnyole~oqel uep ~opqnyu!) ue6uny6u!l eJepn !seu!lusluoy elnd
ue!y(urag 'u!syolopua uedeura yep seqaq 6ueA ecue)ma) J!e se)!jeny ye]epE
usy!ae~ad!p ynjun 6u1luad le6ues 6ue.rl
~olye4
rilles qeles .!epetuaul Gue~nyj!le!aJ 6ueh Jnllny
uals!s
qelepes!so$salq ueynluaqwad
ey6ue ehuyepua~qeqahuad
!~6eqasde66ue!p
ledsp e6np!p 6ueh eAuu!eljolyej
'ua6au Jenl uep !des-!des ueySu!pueq!p yrunq y!qal ~hcunwn
e!sauopul
!d~s-!des 4alo !y!t!u!p 6ueA !s!llnu snlws qel !s!s!a
'qspua~ 4iqal qe~-eje~ ~lmas eAu!synpojda~utlndueuray
e6np!pe6Eu!yas
en)
Jnun epedGuo$od!p eAulunun Eyuatuv uep ed0~3 !des-!des ue6uap epaqaq
'e!sauopul
!p Guolod!p 6u~h !des-!des '(~66~
"le
)a poll!w~afl) !des np!n!pu! !se!JehUEp ( 166
L
' ' 1 ~ la I!I~[OQ-E!~E~) !S!JflU '(~66 1 'UO~JO~) !~ES ES~UE~ '(166 L "lela 6 u e y ~ ) !des
Jnwn
qelepe u!et ejelue Inqawal !yrue6uaduaw 6ueh Jo3ye-J-epaqJaq 6ueL !synpo~da~ 6ueyelaq me1
!seueh
eKuepe
ue6uap uqeylaq elnd ledep 6uns6uel yep1 n e p 6uns6uel eJwasInqasw
ueepaqJad.uey eun6!p
6uerC
ueMaqsel!leny
~Auqepua~ 4ap ueyleq!y e!p qepuadlje(ad
6ueA ]!SOD ss)!lBny ue6uap uei!ayraq e6np!p !u! lees epE 6ueA
uals!s
u~6uap!depeq!p BueA ueqewalay
'ueyl!seq!p
ledep s!so~sqqeduel
uep %26+~1lesaqas
elmow
ey6ue aeae3uau 6ueh (~661)upuaH
yep y ! ~ q ylqaj q ~ s ~ u rInqasJal
eybue ue!y!uap unlueN-%OE
sele!p s!solselq ey6ue le~e~uau~6ueA
(000~)
'le
la
&any
qalb !edeg!p 6ueh I!sey us6uap uey6u!pueq!p el!qeds qepuaj 1~6~s qsew)!lelaj
s~s~~sslq deqeleped
!@dues)!so0 jsynpo~d uendueuay m q p q leq!~!p ~edep se$e !p 1 laqel peg
s!so~selq
deqw
!edues ouqwa uep (ysoo)Jnlaj
ps ue6uequlayrad .1lwei
I
( % z E - ~ )
o!JWa
11(%~6'91) o!Jqwa 02
(%SO'S€)
o!JWa
6E(%PS'ZS)
otlqwa29
(UJn~eho~!soo
69.~18
L 1SISO~S el8
elruolrJ
I
las 9 1-8
a6e~~a(3
0
'JeP
Vsel!l@ny
Us00-qepuad nuns
uep u!6u!p
usweya9 ueu1y6unwayIeEeqaq
depeualueyel l~!qal jge(aA s!solselq
deqqwed
ouqlua mqequey!sey!pu!Buacu
!u! I!seH .uey 2-1 Jnllny ~uele6uaw qelalas ewes 6uel; un!pels eped d e w
ynluawa4
6ueA s!soase]q ~ $ 1 Jeyyas nl! eleluautag -1se~a6ap1ueye6uaur
6ud 546
ekueyue6uap
(%EL)!66u!1
J!IE~~J ,,6u!~e41, uepuenyaqwad
e ~ s e d
lnllny!p6ueh
ouqua ueheqwaylad ey Bus ueyynfunuaul s!solselq uln!pels epsd ouqura uenyaqurad nt!eleluauras
*!swaBap
nbuau
nele jas ue!leway!ulel~6ue~
elnd
yela1
Epe Gulerl ainralu qeyedeuelepualu
q!qa(u e ! l ~ y
nuad -ewes 6ueA wn!pejs eped ue6ueqwayrad !seu6~~s ueyyn!unuaur
%0~
Je)!yas uey6uepas '!se~aua6ap !ueleBuaru 6ud %OZ ehueq uea -jsA30js~~q
papuedxa
uep s~solsqq
!pe!uau 6uequaylaqn d u w
uqnyaq!p 6u~Aelruow
%OL
uep 4!qal -,,6u!ME#,, uepuenyaquad
!welebuauryqalas
IU! uau~!~adsya eped ueypseylp 6usAs!sopelq
uep slruout eAu6uequaylaq uap ynqulnluendweuray ueyyniunualu
z
-uenyaqluad leq!ye ueueya:, !depeu6ualu n d u w usp ledep smey -JM ww0o~d !nielau uayl!seq!p 6 u ~ h ouqur3utrnqaq
w
ad
e~s~dopqwa
segl!q~!~ -5 -2-s.(a6eneap) ueqejaqwad
w6ue
ehuqepua~qalo
ueyu!uuaqp he4!ses!l!yaJ
eAuyepua~
ueyqwqahuaw qnd ~~dep luoso~ys uwqwacu ueyesruayAnalisis stnrktur
uttra
sel telur dan embriob
Analisis
struktur
ultraguna
me!inat perkernbangan dan hambatan yang dihadapi oleh sel telurdan
embrio dalam upayanya tumbuh dan berkembangI
merupakan unsur penting y a y dikerjakan dalarn penelitian ini. Penge jaan(
preparat dan analisis menggunakan mikroskop elektron transmisi, akan dike jakan di Jurusan Anatorni dan Fisiologi, Royal Veterinary and Agricultural University (RVAU), KopenhagenDenmark.
Para peneliti a kan mengoleksi seiI
telur danembrio
sebegaimana protukol yang dijelaskan secara garis besar didepan
dan sebagaimana secara rinci dijelaskan pada Lampiran.Kesepakatan dengan pihak RVAU Denmark memungkinkan sampel baik berasal
dari
set telur anak sap; dan sapi dewasa dapatdike
jakanpada
bulan
Februari 2002. Gambaran dari analisis struktur ultra diharapkan dapatKESIMPULAN OAN SARAN
Kesimpulan
Dari hasit sernentara yang dapat diperoleh
dari
penelitian ini dapat disimpulkan bahwa :1. Produksi embrio dengan sumber set telur sap1 dewasa dapat beqalan
pada
kondisi laboratoriurnyang
terbatas, rneskipun masih relatif rendah dibandingkan dengan yang dicapai di negara maju.2. Dengan berbagai upaya perbaikan sistem kultur angka keberhasiian berupa produksi embrio yang layak transfer dapat dicapai.
3. Embria hasil PEW dapat dibekukan dengan kemampuan berkembang pasca pernebekuan yang relatif tinggi.
Saran
I. Perlu improvisasi penggunaan
alaf kultur yang
lebih murahdan
sederhana
agar
hasilyang
dicapai reta tif memadai rneskipun dikerjakan pada labaratorium yang serba terbatas.DAFTAR PUSTAKA
Armstrong, D.T., Holm P., lmine B., Petersen, B.A., Stubbing, R.8., Mclean, B., Stevens, G., and Seamark, R.F.,
1992.
Pregnancies and livebirth
from in vitro fertilization of calf oocytes collected by laparoscopic follicular aspiration. Theriogenotogy, 38: 667-678.Armstrong, D.T., lrvine
B.,
Earl, C.R.,
McLead, D. and Seamark, R.F., 1994. Gonadotropin stimulation regimen for follicular aspiration and in vitro embryo production from calf oocytes. Theriogenology, 42: 1227-1 236. Armstrong, D. T., Kotaras, P. J., and €ad,C.
R . 1997. Advances inproduction of embryos in vitro from juvenile and prepubertal oocytes from the calf and tamb. Reproduction, Fertility and Development. 9 :
333 339.
Assey , R.J. Hyttel, P.: Greve, T., Purwantara, B. 1994. Oocyte morphology in dominant and subordinate follicles. Molecular Rerproduction and Development 37, 335-344.
Avery, B., Melsted, J.K., Greve, T. 2000. A novel approach for in vitro production
of
bovine embryos; use of the oxoid atmosphere generatingsystem.
Theriogenology 54: 1259-1 268.Bedirian,
K.N.,
and
Baker, R.D. 1975. Follicular development , oocytematuration and ovulation in gonadotropin treated prepuberal calves. Canadian Journal of Animal Science 55, 1 93-1 99.
Betteridge, K.J. 1977. Embryo transfer in farm animals : A review of techniques and applicaltion. Monograph No 16. Agriculture Canada. pp 34-41 .
Brackett. I?. B., Bousquet, D., Boice, M. L.. Donawick, W. J., Evans, J. F., and Dressel, M. A. 1982. Normal devetopment following in vitro fertilization in the cow. Biol. Reprod. 27 : 147 - 158.
Brogliatti G.M. and Adarns, G. P. 1 996. Ultrasound-guided transvaginal oocyte
co:lection in prepubertal calves. Theriogenotogy 45, 1 163-1 1 76
Callesen,
H.
Libohussen, T., Greve, T., 1996. Practical aspects of multiple ovulation-
transef in cattle. Animal Reproduction Science 42: 21 5- 226.Dahlhausen,
R.
D.,Dresser, B. L.,and Ludwick,T.
M. 1980.In
vitroEarl, C. R., Armstrong, D. T.,and !wine, 8. J. 1994b. Juvenile
in
vitro fertilization-emixyo transfer(3
WET): the in vitro production of viable embryos from m y t e s obtainfrom
gonadotropin-s timulatct
juve n i k calves and Lambs. Proc. Aust. Assoc. Anim. Artif. Breeders.7:2527.
Earl,C.
R., Irvine,0.
J.,Kely, J. M., Rowe, J. +,,and Amstrong, D. T. 1995.Ovarian stimulation protocols for oocyte collection and
in
vitro embryo production from 8 to 9 week old lambs. Theriogenology.
43: 203.Galli, C., and
G.
Lazrari. 1996. Practical .4spects oi IVMAVF in cattle. Animal Reproduction Science. 42; 371 -379.Garcia,
M.
1988. An abbattoit survey of reproductive organ abnormalities from female zebu cattle. ACTA Vet. Scandinavian (Suppl. 83). 3 4 4 5 . Garcia-Bojalil, C. M., C. R.Staples.,
J. D. Savio.,M.
Drost., and W. W.Tatcher. 1991. Effect of
dietary
protein on follicle growth and embryo development of superovula ted non-laming Holstein cows. J. Dairy Sci. 74 (suppl. 1) : 95.Gardner, D.K., Lane, M, and Batt, P.A. 1994. 1994. Numefit uptake and enzime activity of the preattachment goat embryo developed in
vivo.
Theriogenology 41 : 204.Gordon, 1. 1994.
Laboratory
production of cattle embryos. CAB International. Wallingford.640 p.
Greve, T. and
8.
Punvantara. 1992.Ultrasonography
in embryo transferpractice.
A Review. Proceeding8th
Scientifk Meeting,European
Embryo Transfer Association,Lyon
France.Greue, T.
and
8.
Purwantara. 1993. Ultrasonography in embryo transferpractl~e..
A Review. Proceeding gth Scientific Meeting, European Embryo Transfer Association, Lyon France. 137-1 47.Hendri. 1997. Efektifitas penambahan berbagai jenis dan konsentrasi serum serta kokultur sel-sel epitel tuba fallopii dan kumulus pada TCM-199
dalam
produksi embrio sapi in vitm. D1se;tasi. Program Pascasaqanalflstitut pertanian
Bogor.
Bogor. 140 p.Kajihara, Y., Blakewood, E. G., Myers,
M.
?rV., Kometani, N., Goto, K., and Godke, I?. A. 1991. In vitro maturation and vertilization off~llic~lar
oocytesobtained
from calves. Theriogenology.35: 220.
Kotaras. P. J., Earl, C. R., Kelly, J.
M.,
Rowe, J. P., de Barro, T. M., and Amstrong. 1995. Pregnancies from in vitromatured
and fertilised prepubertal catf oocytes. Serono Int. Symp. on Superovulation andLeibfried-Rutledge, M. L., E. S. Critser., and N.
i.
First. 1985. Fertilization potential of follicular owytes classified by stage of cydsand
size
of follicle. Theriogenology.23
:753-759.
Lewis, I., Owens, J.,
and
Prime, P. 1995. The commercial production of offspringfrom
two to fivemor?ths
ddheifers and
the effectson
later
fertility. Proc. Aust. Soc. Reprod. Biol. 27: 29.Lohuis, M. M. 1995. Potential benefits of bovine embryo-manipulation technologies to genetic improvement programmes.
fheri~~enology.
43: 51-60.Looney,
C.
R., Oamiani, P., Lindsey, B. R., Long, C. R., Gonseth,C.
L.,
Johnson, D.
t..,
and Duby R, T. 1995. Use of prepubertal heifers as OoCyte donors for 1VF: effect of age and gonadotrop~n treatment. Therbgenology. 43 : 269 (abstra~t),Loos
de,
F.A.M., van Wiet ,C,
van
Maurick, P and Kruip, T.A.M. 1989. Morpho!ogy ~f immature bovine oocytes. Garnet Research 24: 797- 204.Metmillod.
P.,C.
Baccart.,C.
Wils., A massip., and F. Dessy. 1992. Effectof
oviduct-condition
medium
and of cumuluscelb
on bovineembryo
developmentin
viiro. Theriogenology. 37 : 256.Moreno, J. F., C. J. Turczynski., G. Flores-Foxworth., and 13. C. Craemer. 1992. Influence of parity of donor and presence of a C t on quality of bovine oocytes from
ovarian
follicles aspirated post-mortem. Biol. Reprod. 46(suppl.
I). 65 (Abs.60).
hicholas, F. W., and Smith, C. 1983, Increased retes of
genetic change
in dairy cattle by embryo transfer and splitting. Anim. Prod. 36: 341-353.Nicholas, F. W. Genetic irnprovem~nt through reproductive technology. I T . Animal Reproduction Science. 42: 205-214.
Onuma, H., and Foote,
R. H.
1969. In vitro development of ova from pubertal cattle. .I. Dairy Sci. 52: 1065-1087.Palma,
G.
A.,Uernent-Sengevald
., andKrem, H.
1993. Invitro
production of cattle embryos from calf oocytes. f heriogenology. 39: 278.Palma, G. A. 1994. Effects of FSH
and Estradiol-17p
for maturation of calf mcytes on the in vilro development to blastocyst. Theriogenolog y. 41. 267.Pieterse, M.C. 1990. Clinical
use
of ultrasoundin
bovine reproduction. Thesis.'
'0002
'Atnr
9-Z UaPaMS 'W!OYY~OIS'uoqmpo~da~ ~euj~uv uo ssa~6uo3 leuo!leualul 1
.al!uannr
auinoq u! asuodsa~ hol~lnw!ls ue!Jeno uo uo!leAls!ulupe auouuoq pue abe40
pag3
-0002 -!zo~wv pus 1!6v 'fl ' jnsnA'1
'1
'euiel~dns .I 'g 'e~elusnzlndW
l l A 6u!es~a€I Wq!H
ue!g!gauadue~odel
*!des yeus JnlaJ Jas laquns ueyeun66uaw olyn UI !ses!g!yadpseH
oyqu13 u!luelay quay uenluauad uep '!se~asa~douy ,!synpoJd -0~02 A ! z o ~ ~ y uep 4nsnA '7 '1 'euleudns '1 '8 'meluewnd'~11111 Bu!es~aa 4~14
ue!g!lauad u~~odq '!des ysue m(al (as Jaqurns ueyeun66uau oq!~ u! !ses!y!yD;t ~!se~ o~qu13 u!urelay sluar uenluauad uep 'Isshlasa~douy
'!synpold ,6661 ':!6~ 'VI) uep
InsnA
'7 '1'euleydns
.I '8 '~~e~uewnd' 26-68 'EE 'puex PA ~ 1slaj!aH 3 ~u! suo!~~afu!
HSJ 8 snsJan E 6u!~o1lo~
ha~o5aa
ohqua pue luacudop~ap ~eln3!lloj '~66~ 'aha3'1
'uasalpg'H
'~p!luy~s'a
'a
me$uemnd- ' 126% t 6:o~ A6oloua6opayl sjaj!aH
u!
uo!geln~o~adns 6uun~pue
01~ o u d w!weuAa
~elnD!llod -6661.
'uasa(le3
'H Pueaha~9
'1
'lp!uq~S 'W'8
'e~~~uenund
'nn
'a6puque3 'uo!ye!~oss~ Jajsuejl ohqur3ueadoing
'6u!gaaly ~~ygua~s yl~ du!paa3o~d*slue:,
u!
1uau~!6w
uo!leyn~o~adns IuaJagp oy u! aleJ 1Cta~o~a~ohqua
pue
sa6ueq3ueuelza
erlu(
,166~ 'ahad3'1
'1pturr(3~-w
"8
'e~que~fld' z g ~ '11 'OA
~1t)v
'sJaj!aqu!
asuodsaho)ejn~o~dns
aq1
uo
st-q~sueueno
qu! 40 wfi3 '~661 'aha19-1
pue-a
'E~quewnd'OFL
'11 {onviay
'sJaJ!ayu!
uogeln~o~adns 6uunp pue 01 ~ouduo!lelndod JEI~!HGJ
ueueno
40 s!weuAg 1661 -aAaJg -1 pue -8 'e~muwund'z6E
- 98E : 'uo!g~npcxlday 40 A6010!8'sanlerr ;waqndaJd
u!
s!saua60hqtua
JO;a=>ualaduo=,
ehoo40 uog!s!nboa 40 auapuadap leuouuoq pus a6v ' ~ 6 6 1 'X '6u~~ Dus
Revel, F.,Mermillod, P., Peynot, N., Benard, J.
P.
and Heyman. 1995. Low developmental capacity of in vitro matured and fertilised omytes from calves compared to that of cows. J. Reprod. Fertil. 103 : 115120.Seidel,
G , E., Larson,C.
H.,
SpiIman, C. H, Hahn, J., and Foote, R.H.
1971.Culture and transfer of calf ova. J. Dairy Sci. 54: 923-926.
Supriatna, I., T.L. Yusuf, 8. Purwantara, D. G. Moekti, L.P. Hemomoadi. A study on the purification of anti-PMSG and its neutralization dose against PMSG on superovulation in dairy cattle. Proceeding 13th International Congress on Animal Reproduction. Vol 3. P19-27 (1 996). Tervit, R. , Mc Millan, W., Mc Gowan, L., Smith, J., Voges,
H.,
Lynch, P.,Larsen, J., and Hall, D. 1995. Follicle development, superovulation and in vitro embryo producytion from calves. Proc. Aust. Soc. Reprod.
Biol.
27:1Tervit. H. I?. 1996. Laparoscopyllaparotomy oocyte recovery and juvenile breeding. Animal Reproduction Science. 42: 227-238.
Thompson, J.
G.
1997. Comparison between in vivo-derived and in vitro- produced pre-elongation embryosfrom
domestic rumunants. Reprod. Fertil. Dev. 9: 341-354Lampiran 1.
Tabel I.
Kualitas sel
felur
sesuaidengan
parameter rnorfdogisKategori Kualitas
A
0
C
D
Kondisi cumulus oocyfe complex (COC)
1
LSel-sel
~ U ~ U ~ U Stersusun
kornpak terdiri atas beberapa lapis, 1 \ooplasma nampak homagen dan
kornpleks
kumulus-#sit
,
(COC) nampak wrah
dan
transparan.i
I Sel-sel kumulus tersusun kompak terdiri atas 2-4 lapis,1
ooplasma narnpak hornogen tetapi terdapatdaerah
gelap pada1
permukaan oosit,COC
nampak lebih gelap dan kurang!
transparan.
Sel-sel kumulus hanya 1 lapis danlatau tidak terlalu kompak, I
i
ooplasma kurang beraturan dengan "clustet' yang gelsp, COC Inampak tidak beraiuran dan gelap. i
Setsel kumulus mengalami e kspansi (pernekaran) atau
,
1
I
terserak dalam matriks bertendir yang beraspek gelap atau !
sama sekali tidak ditemukan adanya $el-sel kurnulus (gundul),
i
COC nampak gelap dan takberaturan.
i
Y P ' I Q @ ) U ~ ~ :I!eu-3
LPSZ
8ZSE
SP+
:xEzl IPS2 8ZGE SP+:auoqdalai
weuuaa3 GJaqsy uapa~j OLQ
L-ya
' L !~AS~JE~~~UU~OJ~h!wa~!un
lwnllngu6v
pueAsuuals~
K60lo!sA&j pu~
Luo~euv
40
~uawedaa DSAa '04d'Ma
'I~U~H lnod ~ossawd101 wa42 I!ecll pue Jaynq
aleqdsoqd-e~
fl 1-0 41!~ pallU Alapldwo3 SMEJJS o~u! so~qwa]sa~o8~z ayl peal'Jagnq
aleydsoqd-e~
1 ,Ou!
sohqwajs3~o6Az ayl sols'3,P 1E '4 1
Jagnq aleydsoyd-BN
w
1'0 u! aplIqeple~e~nj6%E
u!sa106hz
aqi x!d