• Tidak ada hasil yang ditemukan

Konstruksi Vektor Ekspresi Dan Ekspresi Protein Rekombinan Superoksida Dismutase (Cuznsod) Dari Melastoma Malabathricum L. Pada Escherichia Coli.

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2017

Membagikan "Konstruksi Vektor Ekspresi Dan Ekspresi Protein Rekombinan Superoksida Dismutase (Cuznsod) Dari Melastoma Malabathricum L. Pada Escherichia Coli."

Copied!
38
0
0

Teks penuh

(1)

KONSTRUKSI VEKTOR EKSPRESI DAN EKSPRESI

PROTEIN REKOMBINAN SUPEROKSIDA DISMUTASE

(CuZnSOD) DARI Melastoma malabathricum L.

PADA Escherichia coli

NURUL HOLIFAH

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(2)
(3)

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Konstruksi Vektor Ekspresi dan Ekspresi Protein Rekombinan Superoksida Dismutase (CuZnSOD) dari Melastoma malabathricum L. pada Escherichia coli adalah benar karya saya bersama komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

(4)

RINGKASAN

NURUL HOLIFAH. Konstruksi Vektor Ekspresi dan Ekspresi Protein Rekombinan Superoksida Dismutase (CuZnSOD) dari Melastoma malabathricum L. pada Escherichia coli. Dibimbing oleh SUHARSONO dan UTUT WIDYASTUTI

Gen CuZn-SOD penyandi superoksida dismutase yang diisolasi dari tanaman Melastoma malabathricum L. telah berhasil diintroduksikan ke dalam genom tanaman tembakau dan padi. Namun sampai saat ini analisis protein yang diekspresikan belum dilakukan karena belum adanya antibodi spesifik untuk MmCuZnSOD. Pembuatan Antibodi MmCuZnSOD dapat dilakukan dengan memasukkan protein MmCuZnSOD kedalam tubuh hewan. Namun, kandungan protein ini pada tanaman sangat rendah, sehingga protein ini sulit diisolasi dan dipurifikasi dari tanaman. Hal ini dapat diatasi dengan melakukan ekspresi protein MmCuZnSOD secara berlebih di dalam sel bakteri Escherichia coli. Tujuan penelitian ini adalah mengkonstruksi vektor ekspresi untuk gen MmCuZnSOD dan mengekspresikan secara berlebih untuk memproduksi protein antigen.

Penelitian dimulai dari konstruksi vektor ekspresi pET-14b-CuZnSOD yang membawa gen MmCuZnSOD dan vektor tersebut diintroduksi ke dalam E. coli strain Rosetta (DE3) sebagai sel inang. Optimasi ekspresi protein dilakukan dengan penentuan konsentrasi IPTG (0.1 mM, 0.3 mM, 0.5 mM dan 1 mM), lama waktu induksi (2 jam, 4 jam, 6 jam dan 8 jam) dan suhu (30 oC dan 37 oC)

optimum. Analisis protein dilakukan dengan fraksinasi protein untuk memisahkan fraksi insoluble dan soluble dengan enzim lisosim dan sonikasi. Protein MmCuZnSOD dipurifikasi menggunakan kromatografi afinitas Ni-NTA dan elektroelusi protein. Protein hasil pemurnian diendapkan menggunakan aseton.

Pada penelitian ini gen MmCuZnSOD berhasil disisipkan ke dalam vektor pET-14b. Verfikasi dilakukan dengan PCR koloni menggunakan primer T7 dan SOD-R menghasilkan amplikon yang berukuran 609 pb yang sesuai dengan ukuran dari daerah promoter sampai multiple cloning site (150 pb) dan gen MmCuZnSOD (459 pb). Pemotongan dengan enzim restriksi NdeI dan EcoRI menghasilkan dua pita DNA berukuran 4152 pb dan 978 pb. Pengurutan urutan DNA menunjukkan bahwa gen ini telah berfusi dengan penyandi His-tag pada ujung N-terminal. Berdasarkan hasil optimasi ekspresi, kondisi optimum untuk sintesis protein MmCuZnSOD adalah konsentrasi IPTG 0.5 mM dengan induksi selama enam jam pada suhu 37 oC. Analisis lebih lanjut menggunakan SDS-PAGE

menunjukkan bahwa protein MmCuZnSOD yang telah berfusi dengan 6x histidin memiliki ukuran 15 kDa dan terdapat pada kedua fraksi soluble dan insoluble. Analisis western blot dengan anti-histidin menunjukkan bahwa protein rekombinan MmCuZnSOD berhasil dipurifikasi dari fraksi insoluble dalam kondisi denaturasi dengan 8M urea menggunakan kromatografi afinitas Ni-NTA. Purifikasi dengan metode elektroelusi menghasilkan protein dengan kemurnian tinggi tetapi dalam konsentrasi rendah sehingga dilakukan pengendapan menggunakan aseton dengan konsentrasi aseton 50%. Protein murni yang dihasilkan adalah sebesar 3.75 mg dari 350 mL kultur sel.

(5)

SUMMARY

NURUL HOLIFAH. Construction of Expression Vector and Expression of Superoxide dismutase (CuZnSOD) Recombinant Protein from Melastoma malabathricum L. in Escherichia coli. Supervised by SUHARSONO and UTUT WIDYASTUTI

The cDNA CuZnSOD encoding superoxide dismutase successfully isolated from Melastoma malabathricum L was successfully introduced into the genom of Nicotiana tabacum and Rice. Development of antibody and antigen can be carried out to reveal the presence of protein or enzyme in complex biochemical reactions. Antibodies synthesis can be done by inserting the MmCuZnSOD antigen into the animal. This MmCuZnSOD enzyme is difficult to be purified from plants due to insufficient quantity for production of high quality antibodies. Molecular biology techniques are currently use to express the genes of interest in heterologous systems to produce high quantity and pure antigen for antibody production. The aim this research was to construct the expression vector for MmCuZnSOD and to over-express the MmCuZnSOD gene in Escherichia coli to prepare large quantities of antigen.

In this study, cDNA-MmCuZnSOD was successfully inserted into pET-14b expression vector and introduced into E. coli strain Rosetta (DE3) as host cells. Optimization of protein expression was done by determining the concentration of IPTG (0.1 mM, 0.3 mM, 0.5 mM dan 1 mM), induction time (2h, 4h, 6h, and 8h) and optimum temperature (30 oC and 37 oC). The proteins were extracted by

sonication and lysozime to separate the insoluble and soluble fractions. Pellet cells as an insoluble fraction and the supernatant containing soluble proteins were analyzed using SDS-PAGE. The MmCuZnSOD protein was purified by affinity chromatography column of Ni-NTA agarose under denaturing condition and electroelution. The purified protein was precipited by aceton.

The results showed that MmCuZnSOD gene was successfully inserted into pET-14b. Verification was done by colony PCR using T7P-F and SOD-R amplifying 609 bp composed of 150 bp of the region from promoter to multiple cloning site and 459 bp of MmCuZnSOD gene). The recombinant pET-14b-MmCuZnSOD was identified by double digestion analysis with NdeI and EcoRI enzymes. Two separated bands of 4152 bp and 978 bp were visualized. Sequencing analysis showed that the MmCuZnSOD gene was fused with His-tag at N-terminal. Optimum expression condition was achieved through induction by adding 0.5 mM IPTG for six hours at 37 oC. The cDNA encodes MmCuZnSOD protein of 154 amino acids was expressed at size 15 kDa and it was present in both soluble and insoluble fraction. Western blott analysis used anti-histidin antibody showed that fusion protein was purified from insoluble fraction under denaturing conditions with 8M urea using affinity chromatography. Purified protein from electroelution generated high purity but the concentration was low. Precipitation with 50 % of aceton can increase the concentration of protein yielding 3 mg protein per 350 mL.

(6)

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB

(7)

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains

pada

Program Studi Bioteknologi

KONSTRUKSI VEKTOR EKSPRESI DAN EKSPRESI

PROTEIN REKOMBINAN SUPEROKSIDA DISMUTASE

(CuZnSOD) DARI Melastoma malabathricum L.

PADA Escherichia coli

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2015

(8)
(9)
(10)

PRAKATA

Puji syukur kepada Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan rangkaian penelitian dan penulisan tesis yang berjudul Konstruksi Vektor Ekspresi dan Ekspresi Protein Rekombinan Superoksida Dismutase (CuZnSOD) dari Melastoma malabathricum L. pada Escherichia coli. Penelitian ini di biayai oleh Program Riset Pengembangan IPTEK Tahun Anggaran 2015 Nomor: 064/SP2H/PL/Dit.Litabmas/V/2015 Tanggal 28 Mei 2015 atas nama Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium BIORIN (Biotechnology Research Indonesia-The Netherlands), Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Genetik Universitas Kassel, Jerman.

Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada bapak Prof. Dr. Suharsono, DEA dan Ibu Dr. Utut Widyastuti, M.Si selaku pembimbing penelitian atas segala perhatian dan bimbingannya selama penelitian dan penulisan naskah tesis ini. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Prof. Wolfgang Nellen yang telah membimbing selama penulis mengikuti program Exchange Student Indonesian Germany Network (IGN ttrc) dan Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si selaku penguji yang telah memberikan masukan sehingga memperkaya tulisan ini. Penulis mengucapkan terimakasih kepada ayah, ibu, Zainollah, serta seluruh keluarga atas segala doa dan kasih sayangnya. Terima kasih kepada teknisi laboratorium yang telah banyak membantu dalam penelitian ini. Ungkapan terima kasih juga kepada keluarga besar Laboratorium Biorin, Laboratorium Genetik Uni-Kassel, Bioteknologi 2013 dan Himawipa IPB yang telah banyak membantu penulis.

Penyusunan karya ilmiah ini tentunya tidak terlepas dari kekurangan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan adanya saran dan kritik yang membangun untuk menyempurnakan penulisan karya ilmiah ini. Penulis berharap semoga penelitian ini dicatat sebagai amal ibadah dan bermanfaat bagi masyarakat.

Bogor, November 2015

(11)

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL vi

DAFTAR GAMBAR vi

DAFTAR LAMPIRAN vi

1 PENDAHULUAN 1

Latar Belakang 1

Perumusan Masalah 2

Tujuan Penelitian 2

Manfaat Penelitian 2

3 METODE 3

Waktu dan Tempat Penelitian 3

Bahan 3

Prosedur 3

4 HASIL DAN PEMBAHASAN 8

Konstruksi Vektor Rekombinan 8

Optimasi Ekspresi Protein Rekombinan MmCuZnSOD 10

Purifikasi Protein Rekombinan MmCuZnSOD 14

5 SIMPULAN DAN SARAN 16

Simpulan 16

Saran 16

DAFTAR PUSTAKA 17

LAMPIRAN 20

(12)

DAFTAR TABEL

1 Hasil pengukuran protein rekombinan MmCuZnSOD 13

DAFTAR GAMBAR

1 Peta plasmid pGEM-MmCuZnSOD 3

2 Konstruksi vektor rekombinan 9

3 Hasil transformasi E. coli DH5α dengan pET-14b-MmCuZnSOD 9 4 Verifikasi konstruksi cDNA-MmCuZnSOD pada plasmid pET-14b

dalam Escherichiacoli.

10 5 Optimasi konsentrasi IPTG dan waktu induksi ekspresi protein

rekombinan MmCuZnSOD. 11

6 Optimasi suhu induksi ekspresi protein rekombinan MmCuZnSOD 12 7 Analisis SDS-PAGE fraksinasi protein rekombinan MmCuZnSOD 13 8 Purifikasi protein rekombinan MmCuZnSOD menggunakan kolom

afinitas Ni-NTA 14

9 Analisis SDS-PAGE protein rekombinan MmCuZnSOD hasil

elektroelusi dan pengendapan dengan aseton 15

DAFTAR LAMPIRAN

1 Urutan basa nitrogen plasmid rekombinan pET-14b-MmCuZnSOD 19 2 Komposisi media pertumbuhan bakteri Luria-Bertani (LB) 20

3 Komposisi reagen lowry 21

4 Komposisi gel SDS-PAGE 15% 22

5 Komposisi larutan western blot 23

(13)

1

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Reactive oxygen species (ROS) merupakan molekul tidak stabil karena mengalami reduksi oleh elektron sehingga bersifat sangat reaktif. Radikal superoksida (O2-), hidrogen peroksida (H2O2) dan radikal hidroksil (OH-) adalah

bentuk molekul ROS (Qu et al. 2010). Produksi ROS dalam sel terjadi pada metabolisme secara normal dalam kondisis aerob. Peningkatan produksi ROS terjadi saat tanaman mengalami cekaman lingkungan (Shaban et al. 2013) yang dapat menyebabkan sel menuju kearah kematian (Verma dan Dubey 2003). Tanaman memiliki mekanisme pertahanan terhadap efek cekaman oksidatif secara enzimatik dengan produksi enzim-enzim antioksidan, salah satunya adalah superoksida dismutase (SOD) (Aydin et al. 2014).

Superoksida dismutase (SOD) merupakan enzim antioksidan yang berperan sebagai barisan pertahanan pertama dalam menetralkan radikal bebas dengan mengkatalisis perubahan O2- menjadi molekul O2dan H2O2 (Rueda et al. 2013). Enzim ini diklasifikasikan kedalam tiga tipe berdasarkan kofaktor logam pada sisi aktif enzim dan distribusinya dalam sel yaitu: enzim copper/zinc (CuZn-SOD) di sitosol, kloroplas, dan peroksisom, besi (Fe-(CuZn-SOD) di kloroplas, dan mangan (Mn-SOD) di mitokondria dan peroksisom (Alscher 2002). Ekspresi SOD pada tanaman menjadi sangat penting terkait akumulasi ROS yang disebabkan oleh cekaman lingkungan seperti seperti ozon, kekeringan, suhu rendah, salinitas dan logam berat. Pengetahuan enzim SOD pada tanaman untuk mekanisme pertahanan menjadi dasar dalam meningkatkan resistensi tanaman terhadap cekaman lingkungan.

Saat ini banyak penelitian mengarah ke peningkatan toleransi tanaman terhadap cekaman lingkungan melalui rekayasa genetika dengan melakukan ekspresi enzim SOD secara berlebih (overexpression). Pada beberapa tanaman transgenik, contohnya Festuca arundinacea (Lee et al. 2007), kapas (Luo et al. (2013) dan sawi (Basu et al. 2001). Ekspresi gen CuZn-SOD secara berlebih dapat meningkatkan toleransi tanaman tersebut terhadap cekaman lingkungan akibat meningkatnya aktivitas enzim SOD.

Gen CuZn-SOD penyandi superoksida dismutase berhasil diisolasi dari tanaman Melastoma malabathricum L. (Hannum 2012). Gen ini telah digunakan dalam perakitan beberapa tanaman yang toleran teradap cekaman Al3+ melalui

(14)

2

melakukan isolasi dan purifikasi secara langsung dari sel tanaman. Hal ini dapat diatasi dengan melakukan ekspresi protein MmCuZnSOD secara berlebih pada sel bakteri Escherichia coli untuk produksi protein dalam jumlah banyak.

Teknik ekspresi protein secara berlebih dalam sel Escherichia coli telah digunakan untuk produksi protein mantel Pelargonium zonate spot virus (Shakuja et al. 2009), protein Interferon-gamma manusia (HIFN-gamma) (Babaeipour et al. 2007) dan protein Malaysian Highly Virulent Infectious Bursal Disease Virus (hvIBDV) pada tanaman tembakau (Mohtar et al. 2013). Escherichia coli sering digunakan dalam produksi protein rekombinan karena memiliki pertumbuhan yang cepat, ekonomis dalam jumlah yang besar (Donahue dan Bebee 1999) dan sedikit modifikasi pasca translasi (Shakuja et al. 2009).

Pada penelitian ini, cDNA MmCuZn-SOD digunakan sebagai materi genetik untuk produksi protein rekombinan superoksida dismutase dan dikonstruksi ke dalam vektor ekspresi pET-14b yang mengandung 6x-His•Tag sebagai penanda dalam purifikasi. Plasmid ini di introduksikan kedalam E. coli strain Rosetta (DE3) dibawah promotor kuat T7. Protein rekombinan MmCuZnSOD yang diperoleh, selanjutnya digunakan sebagai antigen untuk pembuatan antibodi MmCuZnSOD.

Perumusan Masalah

Pembuatan antibodi spesifik MmCuZnSOD membutuhkan protein MmCuZnSOD sebagai antigen. Namun, kandungan protein ini pada tanaman sangat rendah menyebabkan sulitnya melakukan isolasi dan purifikasi secara langsung dari sel tanaman sehingga perlu dilakukan ekspresi protein rekombinan melalui cDNA-MmCuZnSOD pada sel bakteri Escherichia coli untuk produksi protein dalam jumlah banyak.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi vektor ekspresi rekombinan, mengekspresikan protein rekombinan MmCuZnSOD melalui ekspresi cDNA-MmCuZnSOD secara berlebih pada sel bakteri Escherichia coli dan mempurifikasi protein rekombinan untuk mendapatkan protein murni yang akan digunakan sebagai antigen.

Manfaat Penelitian

(15)

3

2

METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan pada bulan April 2014 sampai Juli 2015 di Laboratorium BIORIN (Biotechnology Research Indonesia - The Netherlands), PPSHB (Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi) Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Genetik Universitas Kassel, Jerman.

Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri E. coli strain DH5α yang mengandung plasmid rekombinan pGEM-MmCuZn-SOD sebagai sumber gen (Gambar 1.). Fragmen gen di isolasi dengan teknik polymerase chain reaction (PCR) menggunakan pasangan primer spesifik dengan penambahan situs restriksi yaitu SOD-XhoI-F: 5’-TTCTCGAGATGGTGAAGGCTGTGG-3’ dan SOD-BamHI-R 5’-GCGGATCCAGAGGTAGCTTAACCCT-3’. Fragmen gen SOD dan pET-14b sebagai vektor ekspresi dipotong menggunakan enzim restriksi BamHI dan XhoI yang kemudian diligasikan dengan T4 ligase. Bakteri DH5α sebagai sel inang untuk konstruksi vektor rekombinan dengan penanda seleksi antibiotik ampisilin. Bakteri E. coli strain Rosetta (DE3) digunakan sebagai sel inang untuk ekspresi protein MmCuZnSOD dengan penanda seleksi antibiotik kloramfenikol.

Gambar 1. Peta plasmid pGEM-MmCuZn SOD (3839 bp) yang terdiri dari vektor pGEM-T Easy (3015 pb) dan full length cDNA- MmCuZn-SOD (824 pb)

Prosedur

Konstruksi cDNA- MmCuZn-SOD pada

(16)

4

melalui amplifikasi dari plasmid rekombinan pGEM-MmCuZn-SOD dengan pasangan primer spesifik SOD-XhoI-F dan SOD-BamHI-R yang telah didesain dengan penambahan situs restriksi XhoI dan BamHI pada ujungnya. Kondisi PCR untuk mengamplifikasi gen MmCuZnSOD adalah pra-denaturasi 94 oC selama 10 menit, denaturasi 94 oC selama 1 menit, annealing 55 oC selama 45 detik, ekstensi 72 oC selama 1 menit dan final ekstensi 72 oC selama 10 menit dengan jumlah

siklus 35. Produk PCR dan vektor pET-14b dipotong dengan enzim restriksi XhoI dan BamHI pada suhu 37 oC selama semalam. Hasil pemotongan DNA sisipan dan vektor, masing-masing dipurifikasi dari gel agarosa menggunakan kit (Geneaid) dan diligasi menggunakan enzim T4 DNA ligase selama semalam pada suhu 4 oC (Sambrook et al. 1989). Hasil ligasi diintroduksikan ke dalam bakteri E. coli strain DH5α dengan metode heat shock . Enam koloni E. coli yang tumbuh pada media seleksi antibiotik ampisilin dikonfirmasi dengan PCR koloni menggunakan pasangan primer spesifik promoter T7-P dan SOD-BamHI-R. E. coli transforman yang mengandung gen target ditumbuhkan pada media LB cair untuk isolasi plasmid menggunakan Gene JET Plasmid Miniprep KIT (Thermo Scientific), kemudian dipotong dengan enzim restriksi NdeI dan EcoRI. Plasmid rekombinan yang diperoleh diintroduksi ke dalam E. coli Rosetta (DE3) untuk ekspresi protein rekombinan MmCuZnSOD. Bakteri yang mengandung plasmid rekombinan kemudian dianalisis dengan PCR koloni dan dilanjutkan dengan analisis sekuensing.

Transformasi Escherichia coli

Transformasi E. coli dilakukan dengan metode heat shock (Sambrook et al. 2001). Pembuatan sel kompeten dilakukan dengan menumbuhkan E. coli strain DH5α dalam 2 mL LB (Luria-Bertani broth) dan diinkubasi pada suhu 37 oC

dalam inkubator goyang pada kecepatan 150 rpm selama semalam. Selanjutnya 200 µL kultur E. coli di subkultur dalam 5 mL LB dan diinkubasi kembali pada suhu 37 oC sampai OD

600 ~ 0.4. Pemanenan dilakukan dengan sentrifugasi pada

kecepatan 5000 rpm, suhu 4 oC selama 10 menit. Supernatan hasil sentrifugasi dipisahkan dari pellet sel, sebanyak 495 µL larutan buffer CaCl2 ditambahkan

kedalam pellet kemudian diinkubasi dalam es selama 10 menit. Suspensi sel disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm, suhu 4 oC selama 10 menit. Pellet sel yang diperoleh dilarutkan dalam 125 µL buffer CaCl2 dan 8.8 µL DMSO. Sel

kompeten yang diperoleh selanjutnya digunakan dalam proses transformasi. Proses transformasi dilakukan dengan mencampur 50 µL sel kompeten dan 20 µL hasil ligasi, kemudian diinkubasi di dalam es selama 30 menit. Proses heat shock dilakukan pada suhu 42 oC selama 45 detik, dengan segera dipindahkan ke dalam

es selama lima menit. Sel diberi 100 µL LB dan diinkubasi pada suhu 37 oC

selama satu jam. Setelah proses recovery selesai, sel bakteri ditumbuhkan ke dalam media LB agar yang mengandung 50 mg L−1 ampisilin sebagai penanda

seleksi. Sel kompeten juga ditumbuhkan di media LB agar yang mengandung antibiotik dan tanpa antibiotik sebagai kontrol.

(17)

5

Ekspresi Protein Rekombinan CuZnSOD di Escherichia coli

Ekspresi protein rekombinan dilakukan dengan menumbuhkan klon terpilih bakteri E. coli strain Rosetta (DE3) yang telah membawa konstruk plasmid rekombinan ke dalam 2 ml media LB mengandung 50 mg L−1 ampisilin selama 16 jam dalam inkubator shaker pada suhu 37 oC dengan kecepatan 220 rpm sebagai kultur starter. Sebanyak 10 mL medium di inokulasi dengan 1 mL kultur starter lalu di tumbuhkan pada 37 oC sampai mencapai OD600 = 0.5. Optimasi ekspresi protein diinduksi dengan dengan perlakuan berupa perbedaan penambahan konsetrasi IPTG yaitu 0 mM (tanpa IPTG), 0. 1 mM, 0.3 mM, 0.5 mM dan 1 mM selama 4 jam. Analisis ekspresi dilakukan dengan mengambil 1.5 mL dari kultur bakteri kemudian sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Endapan diresuspensi dalam buffer Laemmli untuk analisis SDS-PAGE. Konsentrasi IPTG yang optimum digunakan untuk menentukan lama waktu induksi optimum. Periode waktu induksi yang digunakan adalah 2, 4, 6 dan 8 jam. Kombinasi konsentrasi IPTG dan lama waktu diinduksi digunakan untuk menentukan suhu ekspresi protein yang optimum. Delapan klon bakteri E. coli rekombinan terpilih ditumbuhkan pada dua suhu yang berbeda yaitu suhu 30oC dan 37oC dan diinduksi dengan 0.5 mM IPTG selama 6 jam pada suhu tersebut.

Sebanyak 1.5 mL dari kultur bakteri kemudian sentrifugasi pada 10.000 rpm selama 10 menit. Endapan sel diresuspensi dalam buffer Laemmli untuk western blot menggunakan anti-histidin sebagai antibodi primer dan Goat anti-mouse IgG sebagai antibodi sekunder.

Analisis selanjutnya fraksinasi protein dilakukan dengan memisahkan fraksi insoluble dan soluble. Protein diekstraksi dari endapan sel yang diresuspensi dalam buffer lisis mengandung (50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl,

lisosim) dan disonikasi sampai larut. Fraksi insoluble dan soluble dipisahkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm, 4oC selama 30 menit. Endapan sel sebagai fraksi insoluble dan supernatan mengandung protein soluble dianalisis menggunakan sodium dodecyl sulphete-polyacrilamide gel (SDS-PAGE).

Purifikasi Protein menggunakan Kolom Afinitas Kromatografi Ni-NTA resin

Purifikasi protein menggunakan kolom afinitas kromatografi Ni-NTA resin (Jena Bioscience). Protein kasar diekstrak dari fraksi intraseluler (pellet sel). Ekstraksi protein dilakukan dengan penambahan buffer NPI-10 pH 8.0 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl dan 10 mM imidazol) dan 1 mg mL-1 lisosim pada pellet

sel bakteri. Suspensi sel disonikasi selama tiga menit dan disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm, suhu 4 oC selama 20 menit. Endapan yang merupakan

fraksi insoluble disolubelisasi dengan menambahkan buffer DNP1-10 pH 8.0 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl dan 10 mM imidazol dan 8 M Urea) dan disonikasi

sampai endapan terlarut sempurna. Suspensi disentrifiugasi dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 20 oC selama 20 menit. Cairan yang diperoleh digunakan

untuk analisis SDS-PAGE dan purifikasi.

(18)

6

dilakukan pencucian dengan menambahkan buffer DNPI-20 pH 8.0 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole dan 8 M urea). Protein di elusi

dengan buffer DNPI-250 pH 8.0 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM

imidazole dan 8 M urea). Protein rekombinan MmCuZnSOD murni kemudian dianalisis secara kuantitatif dengan metode Lowry (Lowry et al. 1951) dan secara kualitatif menggunakan SDS-PAGE (Garfin 1990).

Perhitungan Konsentrasi Protein

Perhitungan konsentrasi protein terlarut menggunakan metode Lowry (Alakaline Copper Reduction assay). Kandungan protein diukur dengan memasukkan 1 ml sampel ke dalam tabung reaksi yang berisi larutan pereaksi mengandung 2 % natrium karbonat dalam NaOH 0.1 N dan 0.5 % CuSO45H2O

dalam 1% Na-K-Tartarat. Larutan diinkubasi dalam suhu ruang selama 10 menit, kemudian di tambah dengan 0.5 mL larutan folin ciocalteau. Konsentrasi protein diukur pada panjang gelombang 500 nm mengggunakan spektrofotometer. Standart protein yang digunakan adalah protein BSA.

Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrilamide Gel (SDS-PAGE)

Analisis SDS-PAGE dilakukan dengan konsentrasi akrilamida 15% untuk separating gel yang terdiri dari 5 mL akrilamid 30%, 2.5 mL Tris-HCl pH 8.8, 100 μL SDS 10%, 5 μL N, N, N', N'-tetramethylethylenediamine (TEMED) dan 50 μL ammonium persulfate (APS) 10% dan konsentrasi akrilamid 4,5% untuk stacking gel terdiri dari 0.33 mL akrilamid 30%, 0.25 mL Tris-HCl pH 6.8, 20 μL SDS 10 %, 10 μl APS dan 2 μl TEMED. Sampel protein ditambah dengan buffer Laemmli mengandung (Tris-HCl pH 6.8, Bromophenol blue, SDS 10% dan gliserol) dengan perbandingan 1:1, kemudian didenaturasi pada air mendidih selama 10 menit. Sampel yang sudah didenaturasi dimasukkan ke dalam sumur gel dan dielektroforesis pada 80 volt selama 3 jam. Hasil pemisahan protein selanjutnya diberi pewarna Commasie Briliant Blue (CBB) 1% (Garfin 1990).

Western Blot

Protein yang telah dipisahkan dengan SDS-PAGE ditransfer ke dalam membran nitroselulosa melalui aliran listrik sebesar 180 mA selama 45 menit menggunakan semidry Trans-Blot Electrophoretic (BioRad). Membran dicuci dengan PBS (Tris Buffered Saline) sebanyak 3 kali masing-masing 5 menit dan 1 kali dengan PBST mengandung tween. Setelah dicuci, protein pada membran diblocking dengan cara direndam 5% skim milk dalam PBST selama 20 menit. Membran diinkubasi dengan antibodi primer (anti-histidin antibodi) pada shaker, suhu 4 oC selama semalam. Membran dicuci kembali dengan PBS sebanyak 3 kali

masing-masin

(19)

7 10 ml buffer alkali fosfat. Proses pewarnaan diinkubasi dalam kondisi bebas cahaya sampai muncul pita protein pada membran.

ElektroelusiProtein

Protein rekombinan hasil SDS-PAGE yang masih tercampur dengan protein lain dipotong dari gel poliakrilamida dan dikeluarkan dengan metode elektroelusi protein. Gel poliakrilamida dipotong pada salah satu sumuran dan diwarnai dengan dengan commasie 1%, sumuran lainnya tanpa diwarnai. Gel yang telah diwarnai disejajarkan dengan gel tanpa pewarnaan, kemudian dipotong pada bagian pita protein target. Potongan dimasukkan ke dalam membran dengan buffer mengandung 25 mM Tris Base, 0.192 M glycine dan SDS 0.1%. Posisi gel dalam membran diletakkan pada kutub negatif. Protein dalam gel dikeluarkan dengan aliran listrik 100 Volt selama dua jam (Harrington 1990). Hasil purifikasi dengan elektroelusi dihitung konsentrasinya menggunakan metode Lowry dan visualisasi menggunakan SDS-PAGE.

Pengendapan Protein

Pengendapan protein menggunakan aseton dengan variasi konsentrasi 30%, 40% dan 50% untuk melihat konsentrasi optimum dari aseton dalam mengendapkan protein MmCuZnSOD. Sampel protein sebanyak 750 µL hasil purifikasi dengan elektroelusi dicampur dengan aseton sesuai konsentrasi yang digunakan. Larutan diinkubasi pada suhu -20 oC selama 18 jam. Selanjutnya

(20)

8

3

HASIL DAN PEMBAHASAN

Konstruksi Vektor Rekombinan

Gen penyandi protein MmCuZnSOD berhasil diisolasi dari vektor kloning pGEM-MmCuZn-SOD dengan teknik PCR menggunakan primer yang didesain dari start codon sampai stop codon dengan penambahan sekuen situs pemotongan enzim XhoI (CTCGAG) pada ujung 5’ dan enzim BamHI (GGATTC) pada ujung 3’. Pemilihan situs restriksi yang berbeda pada posisi yang berbeda dimaksudkan untuk menghindari orientasi DNA sisipan yang tidak benar. Amplifikasi gen MmCuZnSOD menghasilkan fragmen pada posisi 475 pb (Gambar 2a) sesuai dengan ukuran open reading frame (ORF) gen dan penambahan situs restriksi. Gen ini disisipkan ke dalam vektor ekspresi pET-14b menggunakan metode pemotongan dengan enzim restriksi XhoI dan BamHI (Gambar 2b) dan penyambungan dengan enzim T4 ligase. Hasil ligasi antara fragmen sisipan (gen MmCuZnSOD) dengan vektor pET-14b diintroduksikan ke dalam E. coli DH5α. Hasil transformasi menggunakan metode heat shock menunjukkan bahwa terdapat beberapa koloni yang mampu tumbuh dalam media seleksi yang mengandung ampisilin 50 mg mL-1 (Gambar 3). Vektor pET-14b mengandung gen resisten

ampisilin yang menyandi enzim β-laktamase. Enzim tersebut dapat memecah cincin β-laktam pada antibiotik ampisilin (Read 2000).

a b

Gambar 2. Konstruksi vektor rekombinan. a) Hasil PCR gen MmCuZnSOD (475 bp) b) Peta konstruksi plasmid pET-14b- MmCuZnSOD (5130 bp)

(21)

9 Enam koloni E. coli transforman putatif yang tumbuh dalam media seleksi dikonfirmasi dengan teknik PCR koloni menggunakan pasangan primer T7P-F dan BamHISOD-R. Penggunaan kombinasi primer dari bagian vektor dan DNA insert bertujuan untuk membuktikan bahwa gen telah tersisip pada situs yang benar. Hasil amplifikasi menunjukkan bahwa empat dari enam koloni yang diidentifikasi adalah positif membawa fragmen gen penyandi MmCuZnSOD pada posisi609 pb sesuai dengan ukuran dari daerah promoter sampai multiple cloning site (150 pb) dan gen MmCuZnSOD (459 bp) (Gambar 4a).

Plasmid rekombinan pET-14b-MmCuZnSOD telah diperbanyak dalam E. coli DH5α dan diisolasi untuk verifikasi menggunakan enzim restriksi NdeI dan EcoRI. Pemotongan dengan kedua enzim tersebut menghasilkan dua pita DNA berukuran 4152 pb dan 978 pb untuk pET-14b-MmCuZnSOD sedangkan pada kontrol menghasilkan potongan yang berbeda yaitu pita berukuran 4159 pb dan 512 pb (Gambar 4b). Perbedaan ukuran ini dikarenakan vektor pET-14b telah tersisipi gen MmCuZnSOD sebesar 459 pb sehingga ketika dipotong dengan enzim restriksi yang sama menghasilkan ukuran DNA yang lebih besar dibandingkan plasmid yang tidak tersisipi gen asing.

a) b)

Gambar 4. Verifikasi konstruksi cDNA-MmCuZnSOD pada plasmid pET-14b dalam Escherichia coli. a) Analisis PCR koloni menggunakan

pasangan primer T7-F & SODBamHI-R; (1, 2, 5, 6) koloni positif dan (3,4) koloni negatif. b) Analisis enzim restriksi menggunakan NdeI dan EcoRI; 1: plasmid rekombinan pET-14b- MmCuZnSOD, 2: plasmid kontrol pET-14b

(22)

10

operator Lac (Sorensen dan Mortensen 2004). Vektor ini mengandung 6x-His•Tag pada N-terminal yang digunakan untuk deteksi dalam verifikasi ekspresi protein dan penanda dalam purifikasi afinitas. Histidin tag (6x-His•Tag) merupakan penanda yang paling sering digunakan untuk purifikasi afinitas (Zhao et al. 2013).

Optimasi Ekspresi Protein Rekombinan MmCuZnSOD

Protein rekombinan MmCuZnSOD berhasil diekspresikan di dalam inang E. coli strain Rosetta (DE3). E. coli strain Rosetta (DE3) dapat meningkatkan ekspresi protein yang rendah yang disebabkan oleh kodon bias dibandingkan dengan E. coli BL-21. Beberapa asam amino disandi oleh lebih dari satu kodon dan masing-masing organisme membawa kodon bias dalam penggunaan 61 kodon asam amino. Pada masing-masing sel, jumlah tRNA dalam E. coli sangat berkaitan terhadap kodon bias. Ketika mRNA dari gen heterolog diekspresikan secara berlebih dalam E.coli, perbedaan pada penggunaan kodon dapat menghambat translasi karena jumlah tRNA yang tidak seimbang dengan banyaknya mRNA. Kurangnya populasi tRNA dapat menyebabkan translasi lambat, terminasi translasi yang prematur, pergeseran terjemahan, dan melewatkan penterjemahan asam amino. Strain Rosetta (DE3) mengandung plasmid pRARE yang membawa gen tRNA leuW, proL, met, argW, thrT, glyT, tyrU, thrU, argU, dan ileX untuk meningkatkan ekspresi protein dari gen yang mengandung kodon langka pada E. coli (Novy et al. 2001).

Optimasi ekspresi protein rekombinan dilakukan dengan menentukan konsentrasi induser (IPTG), lama waktu induksi dan suhu induksi. IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) merupakan induser yang umum digunakan untuk induksi ekspresi protein heterolog. Dari empat variasi konsentrasi IPTG yang digunakan, tidak terdapat perbedaan ekspresi protein MmCuZnSOD yang signifikan (Gambar 5a) dan tidak ditemukan ekpresi protein rekombinan pada kontrol tanpa induser. Hasil ini sesuai dengan pernyataan Donovon et al. (1996) bahwa IPTG tidak dapat dimetabolisme oleh sel, sehingga tingkat induksi selalu konstan meskipun ada penambahan konsentrasi IPTG. Namun, konsentrasi induser yang terlalu rendah menyebabkan ekspresi tidak optimum seiring dengan penambahan jumlah sel setiap satuan waktu sedangkan konsentrasi yang tinggi akan menyebabkan kematian sel.

(23)

11

a) b)

Gambar 5. Analisis optimasi kondisi ekspresi protein rekombinan MmCuZnSOD menggunakan SDS-PAGE. a) Pengaruh

konsentrasi IPTG. M: prestained marker protein M: marker protein; baris 1-4: setelah induksi dengan konsentrasi IPTG 0.1 mM, 0.3 mM, 0.5 mM dan 1 mM; CTRL: non-induksi. b)

Pengaruh lama waktu induksi. M: prestained marker protein; baris 1-4: lama induksi 2 jam, 4 jam, 6 jam, dan 8 jam dengan induksi 0.5 mM IPTG pada suhu 37 oC, CTRL: non-induksi. Penentuan suhu optimum dianalisis menggunakan SDS-PAGE dan western blot menggunakan antibodi monoklonal anti-histidin terhadap protein kasar dari delapan klon E. coli rekombinan. Analisis SDS-PAGE menunjukkan bahwa adanya pita protein yang tebal dengan ukuran 15 kDa pada semua klon yang ditumbuhkan pada suhu 37 oC (Gambar 6a). Protein ini tidak ditemukan di E. coli rekombinan yang ditumbuhkan pada suhu 30 oC dan kontrol yang tidak diinduksi. Ukuran pita tersebut sesuai dengan berat molekul yang diprediksi pada sekuen asam amino MmCuZnSOD. Hasil yang sama dibuktikan dengan analisis western blot (Gambar 6b) dengan menggunakan anti-histidin yang bersifat spesifik dan sensitif yang hanya mendeteksi protein fusi dengan 6x-His•Tag dan tidak mengenali histidin alami dalam protein karena umumnya protein alami tidak memiliki enam histidin yang berurutan.

a) b)

Gambar 6. Analisis optimasi suhu induksi ekspresi protein rekombinan MmCuZnSOD (a) SDS-PAGE 15% gel poliakrilamid (b) Western blot dengan anti-histidin sebagai antibodi primer dan Goat anti mouse sebagai antibodi sekunder. Delapan klon ditumbuhkan pada dua suhu yang berbeda yaitu suhu 30 oC dan suhu 37 oC. CTRL:

(24)

12

Suhu optimum ekspresi protein rekombinan MmCuZnSOD adalah pada suhu 37 oC. Meskipun dalam beberapa penelitian menyebutkan bahwa suhu

pertumbuhan E. coli pada 37 oC menyebabkan protein terakumulasi dalam bentuk bodi inklusi dan ketika inkubasi pada suhu yang lebih rendah menyebabkan sintesis protein menjadi lebih lambat dan menyediakan waktu yang cukup untuk melipat membentuk konformasi asli protein sehingga akan meningkatkan protein rekombinan dalam bentuk soluble (Baneyx dan Mujacic 2004), namun protein rekombinan tidak terkespresi pada suhu 30 oC.

Berdasarkan hasil optimasi dari ketiga faktor, kondisi optimum untuk ekspresi protein rekombinan MmCuZnSOD yang optimum adalah konsentrasi IPTG 0.5 mM dengan lama induksi enam jam pada suhu 37 oC. Kondisi ini

selanjutnya digunakan dalam produksi dan purifikasiprotein rekombinan.

Analisis lebih lanjut yang dilakukan menentukan fraksi ekpresi protein rekombinan dengan memisahkan fraksi soluble dan insoluble. Ekstraksi protein menggunakan lisosim dan sonikasi untuk memecah membran sel. Hasil SDS-PAGE menunjukkan bahwa protein MmCuZnSOD terekspresi pada kedua fraksi soluble dan insoluble (Gambar 7). Adanya protein dalam bentuk soluble ini terjadi karena secara alami protein MmCuZnSOD memiliki berat molekul kecil yaitu 15 kDa. Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan oleh Dyson et al. (2004) dengan membandingkan berat molekul dari beberapa protein yang memiliki berat molekul berbeda terhadap tingkat solubelitas protein rekombinan menunjukkan bahwa protein yang memiliki ukuran di bawah 30 kDa tidak membutuhkan fusi dengan enhancer solubelitas dan protein cenderung terekspresi dalam bentuk soluble. Sedangkan bentuk insoluble dikarenakan protein ini di ekspresikan secara berlebih dan heterolog dalam E. coli sehingga masih memungkinkan terbentuknya bodi inklusi. Jumlah protein rekombinan yang tinggi dalam sel tidak mempunyai cukup waktu untuk melipat sehingga terjadi pengikatan antar protein rekombinan membentuk agregat yang disebut bodi inklusi (Schein 1989). Terekspresinya protein rekombinan dalam bentuk bodi inklusi memberikan keuntungan untuk memudahkan proses isolasi protein dengan kemurnian yang lebih tinggi.

Gambar 7. Analisis SDS-PAGE fraksinasi protein rekombinan MmCuZnSOD. Ekspresi protein diinduksi pada suhu 37 oC dengan konsentrasi 0.5

(25)

13

Purifikasi Protein Rekombinan MmCuZnSOD

Protein MmCuZnSOD telah berfusi dengan residu 6x-His•Tag pada ujung N-terminal sehingga dapat digunakan sebagai penanda dalam purifikasi menggunakan resin mengandung ion nikel (Ni2+) yang telah di imobilisasi secara kovalen dengan nitrilotriacetic acid (NTA). Pada prinsipnya resin Ni-NTA yang mengandung ion nikel (Ni2+) akan berikatan dengan protein yang memiliki protein

fusi 6x-His•Tag. Ikatan tersebut dapat dielusi menggunakan imidazol dengan konsentrasi yang tinggi yaitu 100-250 mM. Hal ini bertujuan untuk melepaskan protein, imidazol menggantikan ikatan antara histidin dengan ion nikel (Sambrook dan Russell 2001).

Analisis terhadap protein yang dipurifikasi dengan SDS-PAGE tidak menunjukkan adanya protein, tetapi dengan western blot menggunakan anti-histidin menunjukkan ada pita protein berukuran 15 kDa pada elusi pertama (E1) yang mengindikasikan bahwa protein yang dapat dielusi masih rendah (Gambar 8a). Protein rekombinan MmCuZnSOD juga masih terdapat pada fraksi unbinding karena histidin memiliki ikatan yang lemah dengan Ni-NTA. Deteksi dengan anti-histidin sangat sensitive sehingga pita protein yang tidak dapat dideteksi dengan commasie staining dapat dideteksi dengan anti-histidin (Gambar 8).

a) b)

Gambar 8. Purifikasi protein rekombinan MmCuZnSOD menggunakan kolom afinitas Ni-NTA. a) Analisis SDS-PAGE dengan gel

poliakrilamida 15% yang diwarnai dengan Commasie brliant blue.

(26)

14

purifikasi secara elektroelusi dikarenakan hanya pita protein target yang dipotong yang kemudian dikeluarkan menggunakan medan listrik.

Perhitungan kadar protein menggunakan metode Lowry untuk mengukur kadar protein rekombinan MmCuZnSOD secara kuantitatif menggunakan standart Bovine Serume Albumine (BSA). Hasil pengukuran konsentrasi protein berdasarkan kurva standart dapat dilhat pada Tabel 1.

Tabel 1. Hasil pengukuran protein

Sampel Konsentrasi Konsentrasi total

Ptotein MmCuZnSOD 0.0375 µg µL-1 3.75 mg/350 mL kultur

Hasil purikasi dengan elektroelusi (Tabel 1) menunjukkan bahwa konsentrasi protein sangat rendah yaitu 0.0375 µg µL-1 yang disebabkan protein

yang terukur adalah protein tunggal MmCuZnSOD. Konsentrasi total protein murni yang dihasilkan sebesar 3.75 mg dari 350 mL kultur E. coli. Protein ini selanjutnya diendapkan untuk mendapatkan konsentrasi yang lebih tinggi dengan volume sedikit.

Pengendapan protein murni dilakukan dengan aseton sebagai pelarut organik. Berdasarkan hasil visualisasi SDS-PAGE dari volume protein yang sama dapat dilihat bahwa ketebalan pita protein berbeda-beda (Gambar 9). Pita protein paling tebal pada lajur ke-4 yaitu pengendapan menggunakan aseton 50%. Ketebalan pita ini sangat jauh berbeda dengan pita protein sebelum pengendapan pada lajur ke-5. Protein dapat diendapkan dengan pelarut organik aseton yang diinkubasi pada suhu -20oC. Solubelitas protein tergatung dari dielektrik konstan

dalam larutan. Umumnya larutan yang memiliki konstanta dielektrik yang tinggi, seperti dapat menstabilkan interaksi molekul air dan protein sehingga protein larut dalam air.

(27)
(28)

16

4

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Vektor ekspresi pET-14b-CuZnSOD yang telah berhasil dikonstruksi dan telah diintroduksi ke dalam E. coli Rosetta (DE3). Protein MmCuZnSOD telah berhasil di sintesis dengan kondisi optimal pada penggunaan induser IPTG 0.5 mM selama enam jam pada suhu 37oC. Protein ini berukuran 15 kDa yang terdapat pada kedua fraksi soluble dan insoluble. Protein rekombinan MmCuZnSOD murni diperoleh melalui purifikasi dengan kolom afinitas Ni-NTA menggunakan 6x-His•Tag sebagai penanda dan elektroelusi. Protein murni yang dihasilkan sebesar 3.75 mg dari 350 mL kultur E. coli.

Saran

(29)

17

DAFTAR PUSTAKA

Alscher RG, Erturk N, Heath LS. 2002. Role of superoxide dismutases (SODs) in controlling oxidative stress in plants. Journal of Experimental Botany. 53 (372): 1331-1341. doi: 10.1093/jexbot/53.372.1331

Aydin S, Buyuk I, Sümer E, Aras. 2014. Expression of SOD gene and evaluating its role in stress tolerance in NaCl and PEG Stressed Lycopersicum esculentum. Turkey Jurnal Botany. 38: 89-98. doi:10.3906/bot-1305-1 Babaeipour V, Shojaosadati SA, Robatjazi SM, Khalilzadeh R, Maghsoudi N.

2007. Over-production of human interferon-g by HCDC of recombinant Escherichia coli. Process Biochemistry. 42:112–117. doi: 10.1016/j.procbio.2006.07.009

Basu U, Good AG, Taylor G J. 2001. Transgenic Brassica napus plants overexpressing aluminium-induced mitochondrial manganese superoxide dismutase cDNA are resistant to aluminium. Plant Cell and Environment. 24: 1269–1278. doi: 10.1046/j.0016-8025.2001.00783.x

Baneyx F, Mujacic M. 2004. Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 22: 1399-1407. doi.org/10.1038/nbt1029

Davis LOMM. 2012. Transformasi genetik padi japonica (Oryza sativa L. subsp. Japonica) dengan gen penyandi superoksida dismutase dari Melastoma malabathricum menggunakan perantara Agrobacterium tumefaciens [Tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor

Donahue JRA, Bebee RL. 1999. BL21-SITm competent cells for protein expression in Escherichia coli. Life Technologies. 21: 49-51

Donovan RS, Robinson CW, Glick BR. 1996. Optimizing inducer and culture conditions for expression of foreign proteins under the control of the lac promoter. Journal of Industrial Microbiologi 16: 145-154. http:// link. springer.com/article/10.1007%2FBF01569997

Dunbar BS, Schwoebel ED. 1990. Preparation of polyclonal antibodies. Methods in Enzymology. 49: 663-760

Dyson MR, Shadbolt SP, Vincent KJ, Perera RL, McCafferty J. 2004. Production of soluble mammalian proteins in Escherichia coli: identification of protein features that correlate with successful expression. BMC Biotechnology. 4: 32. doi.org/10.1186/1472-6750-4-32

Garfin DE. 1990. One-dimensial gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 425:441

Hackel N, Schauer N, Carrari F, Fernie AR, Grimm B, Kuhn C. 2006. Sucrose transporter LeSUT1 and LeSUT2 inhibition affects tomato fruit development in different ways. The Plant Journal. 45: 180-192. doi: 10.1111/j.1365-313X.2005.02572

Hannum S. 2012. Isolasi, pengklonan, dan analisis ekspresi gen penyandi Copper/Zinc Superoxide Dismutase (CuZn-SOD) dari Melastoma malabathricum L [Disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor

(30)

18

Khoo TK, Santhanam A, Noordin R, Arifin N. 2010. Production of Brugia malayi BmSXP recombinant protein expressed in Escherichia coli. Malaysian Journal of Microbiology. 6: 115-122.

Larentis AL, Nicolau JFMQ, Esteves GDS, Vareschini DT, Almeida FVR, Reis MG, Galler R, Medeiros MA. 2014. Evaluation of pre-induction Immunolocalization of the PmSUC1 sucrose transporter in plantago major flowers and reporter-gene analysis of the PmSUC1 promoter suggest a Role in sucrose release from the inner integument. Plant Biology. 9: 357-65. doi 10.1055/s-2006-924659

Lee SH, Ahsana N, Leea K, Kima D, Leea D, Kwakc S, Kwonc S, Kimd T, Leea B. 2007. Simultaneous overexpression of both CuZn superoxide dismutase and ascorbate peroxidase in transgenic tall fescue plants confers increased tolerance to a wide range of abiotic stresses. Journal of Plant Physiology. 164: 1626-1638. doi.org/10.1016/j.jplph.2007.01.003 Lowry, Rosenbrough, Farr, Randal. 1951. Protein Measurement with the folin

phenol Reagent. New York: Kluwer Academic Publishers

Luo X, Wu J, Li Y, Nan Z, Guo X, Wang Y, Zhang A, Wang Z, Xia G, Tian Y. 2013. Synergistic Effects of GhSOD1 and GhCAT1 overexpression in cotton chloroplasts on enhancing tolerance to methyl viologen and salt stresses. PLoS ONE. 8:1 e54002. doi.org/10.1371/journal.pone.0054002. Mohtar SH, Loh HS, Massawe F, Omar AR. 2003. Antigenicity and

immunogenicity evaluations of plant-based VP2 protein of Malaysian Highly Virulent Infectious Bursal Disease Virus (hvIBDV) expressed in Nicotiana tabacum. IOSR Journal of Agriculture and Veterinary Science. 2: 64-72.

Novy R, Drott D, Yaeger K, Mierendorf R. 2001. Overcoming the codon bias of Eschrichia coli for enhanced protein expression. Newsletter of Novagen. 2: 1-3.

Qu CP, Xu R, Liu J, Liu C, Li Y, Wei Z, Liu G. 2010. Differential expression of copper-zinc superoxide dismutase gene of Polygonum sibiricum leaves, stems and underground stems, subjected to high-salt stress. International Journal Molecular Science. 11: 5234-5245. doi:10.3390/ijms11125234 Rao CV. 2002. An Introduction to immunology. Mumbai: Alpha Science

International Ltd.

Read D. 2000. Use of Antibiotic Resistance Marker Genes in Genetically Modified Organisms. New Zaeland: ERMA New Zaeland

Rueda JM, Tsai CJ, Kirby EG. 2013. The populus superoxide dismutase gene family and its responses to drought stress in transgenic poplar overexpressing a pine cytosolic glutamine synthetase. (GS1a). PLoS ONE. 8:2 e56421. doi:10.1371/journal.pone.0056421.

(31)

19 Sakhuja AG, Sears JL, Nu˜nez A, Liua H. 2009. Production of polyclonal antibodies against Pelargonium zonate spot virus coat protein expressed in Escherichia coli and application for immunodiagnosis. Journal of Virological Methods. 160: 29-37. Doi: 10.1016/j.jviromet.2009.04.005. Sambrook J, Russel DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New

York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Schein CH. 1989. Production of soluble recombinant proteins in bacteria. Nature Biotechnology. 7: 1141-1149. doi: 10.1038_nbt1189-1141.

Simpson DM, Beynon RJ. 2010. Acetone precipitation of proteins and the modification of peptides. Journal of Proteome Research. 9 (1): 444-450. doi: 10.1021/pr900806x

Sorensen HP, Mortensen KK. 2004. Advanved genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. Journal of Biotechnology. 115: 113-128. doi.org/10.1186/1475-2859-4-1

Verma S, Dubey RS. 2003. Lead toxicity induces lipid peroxidation and alters the activities of antioxidant enzymes in growing rice plants. Plant Science. 164: 645-655. doi:10.1016/S0168-9452(03)00022-0

(32)

20

(33)

21 Lampiran 2 Komposisi media pertumbuhan bakteri Luria-Bertani (LB)

Komposisi media Gram/lt

Tripton 10

Yeast extract 5

(34)

22

Lampiran 3 Komposisi Reagen Lowry

Larutan Komposisi

Pereaksi A Natrium Karbonat 2% NaOH 1N

Pereaksi B CuSO4 5H2O 0.5%

Na-K-tartarat 1%

(35)

23 Lampiran 4 Komposisi gel SDS-PAGE 15%

Komposisi media Separating gel Stacking gel

1.5 mM Tris HCl pH 8.8 2.5 mL -

0.5 mM Tris HCl pH 6.8 - 0.25 mL

30% Akrilamida 5 mL 0.33 mL

dDH2O 2.3 mL 1.4 mL

SDS 10% 100 µL 20 µL

APS 10% 100 µL 20 µL

(36)

24

Lampiran 5 Komposisi larutan western blot

Larutan Komposisi Jumlah Volume

Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4

NaCl 8 g

1000 mL

KCl 0.2 g

Na2HPO4 1.44 g

KH2PO4 0.24 g

Alkaline Phosphate Buffer pH 9.5

100mM Tris-HCl 15.8 g

1000 mL

100 mMNaCl 5.8 g

(37)

25 Lampiran 6 Komposisi larutan elektroforesis SDS-PAGE

Larutan Komposisi Jumlah Volume

1.5 mM Tris HCl Tris Base 18.2 g 100 mL

0.5 mM Tris HCl Tris Base 6 g 100 mL

30% Akrilamida Akrilamida 29.2 g 100 mL

Bis-Akrilamida 0.8 g

SDS 10% Sulphate Sodium Dodecyl 10 g 100 mL

APS 10% Ammonium persulfat 1 g 10 mL

Buffer Running 1x pH 8.3

Tris Base 3 g

1000 mL

Glisin 14.4 g

SDS 1 g

Pewarna Commasie Blue (Staining)

Metanol 250 mL

500 mL Commasie Briliant Blue 0.5 g

Asam Asetat 50 mL

Akuades 200 mL

Destaining Metanol Asam Asetat 200 mL 50 mL 500 mL

Akuades 250 mL

Buffer Laemmli

0.5 mM Tris HCl pH 6.8 12.5 mL

100 mL

Gliserol 20 mL

Akuades 53 mL

SDS 10 % 40 mL

(38)

26

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Lumajang Jawa Timur pada tanggal 21 Desember 1989 dari ayah Ashari dan Ibu Sumi. Penulis merupakan anak tunggal.

Penulis menyelesaikan pendidikan menengah ke atas di SMA Zainul Hasan 1 Genggong Probolinggo pada tahun 2007. Pada tahun yang sama, penulis melanjutkan pendidikannya di Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Jember Melalui Jalur Beasiswa Masuk Universitas (BMU). Pada tahun 2012 penulis mendapatkan gelar sarjana dari UNEJ. Tahun 2013, penulis melanjutkan studinya di Departemen Bioteknologi, Program Multidisiplin, Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor melalui jalur beasiswa dari DIKTI Program BPPDN (Beasiswa Pendidikan Pascasarjana Dalam Negeri) dan lulus pada tahun 2015.

Gambar

Gambar 1. Peta plasmid pGEM-MmCuZn SOD (3839 bp) yang terdiri dari
Gambar 2. Konstruksi vektor rekombinan. a) Hasil PCR gen MmCuZnSOD (475
Gambar 5. Analisis
Gambar 9. Analisis SDS-PAGE protein rekombinan MmCuZnSOD hasil

Referensi

Dokumen terkait

Degree”) dengan sikap, tingkah laku, dan kemampuan profesional, serta mampu melaksanakan asuhan keperawatan dasar (sampai degan kerumitan tertentu) secara mandiri. Sebagai

Pendidikan nasional berakar pada kebudayaan bangsa Indonesia dan berdasarkan Pancasila dan Undang-Undang Dasar 1945. Undang-Undang Dasar 1945 mengamanatkan upaya untuk

Berdasarkan analisis data hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa kemampuan menyelesaikan soal matematika berdasarkan Taksonomi SOLO peserta didik dengan gaya

Semoga usaha Anda akan membawa hasil positif, dan bank atau penyandang dana lain akan menyadari bahwa hubungan keuangan dengan perusahaan perkebunan kelapa sawit yang

Masalah perekonomian yang timbul sesuai dengan dugaan penulis dalam tinjauan pustaka, dapaknya adalah: Pertama, kemiskinan, adalah dimana korban dari sebuah konflik

Ketika memainkan aplikasi game puzzle grow ini dan menggabungkan 2 gambar 4.3 maka pemain akan mendapatkan tambahan nilai score yaitu 16 dan gambar 4.3 akan berubah menjai

Equity Ratio, Return of Investment, Harga Emas, Harga Minyak, Indeks DJIA, dan Kurs sebagai variabel-variabel fundamental dan teknikal, variabel manakah yang

penulis melakukan penelitian dibidang Reproduksi Veteriner, dengan judul “Pengaruh Frekuensi Penampungan Terhadap Konsentrasi dan Abnormalitas Spermatozoa Burung