Studi Peran Interaksi Bakteri Patogen Dan Lingkungan Terhadap Penyakit Ice-Ice Pada Rumput Laut Kappaphycus Alvarezii.

83 

Loading.... (view fulltext now)

Loading....

Loading....

Loading....

Loading....

Teks penuh

(1)

i

PADA RUMPUT LAUT Kappaphycus alvarezii

MARLINA ACHMAD

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(2)
(3)

iii

Dengan ini saya menyatakan bahwa Disertasi berjudul “Studi Peran Interaksi

Bakteri Patogen dan Lingkungan terhadap Penyakit Ice-ice pada Rumput Laut

Kappaphycus alvarezii” adalah benar karya saya dengan arahan dari Komisi Pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada Perguruan Tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan dan tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir Disertasi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

Bogor, Agustus 2016

Marlina Achmad

(4)
(5)

v

MARLINA ACHMAD. Studi Peran Interaksi Bakteri Patogen dan Lingkungan

terhadap Penyakit Ice-Ice pada Rumput Laut Kappaphycus alvarezii. Dibimbing

oleh ALIMUDDIN, UTUT WIDYASTUTI, SUKENDA dan ENANG HARRIS.

Pengembangan dan peningkatan produksi rumput laut Kappaphycus alvarezii

sangat penting perannya dalam upaya memenuhi permintaan berbagai industri yang memanfaatkan rumput laut sebagai bahan dasar produksinya. Indonesia sebagai salah satu negara produsen terbesar, harus mampu menjamin kualitas dan kuantitas produksi budidaya rumput laut dalam rangka persaingan antar produsen rumput laut di dunia. Budidaya merupakan jalan utama dalam mengupayakan pencapaian produksi massal rumput laut. Namun demikian, kegiatan budidaya seringkali dihadapkan suatu masalah terbesar, yakni munculnya wabah penyakit rumput laut. Penyakit semakin dipandang sebagai faktor utama dalam ekologi laut dan dampaknya diperkirakan akan meningkat dengan perubahan lingkungan seperti pemanasan global. Disertasi ini fokus pada pemahaman sebuah "pemutihan" (bleaching) penyakit ice-ice pada makroalga merah Kappaphycus alvarezii, terutama pada musim panas dengan pendugaan suhu yang meningkat dan kepadatan

bakteri yang semakin melimpah. Penyakit ice-ice diduga dapat dihasilkan secara in

vitro oleh kombinasi dari peningkatan suhu dan kehadiran bakteri patogen.

Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji: a) jenis bakteri dari rumput laut yang

terserang penyakit ice-ice, b) patogenisitas secara in vitro bakteri patogen dengan

menggunakan mikropropagul, c) performa secara morfologi dan mikroskopis pada

rumput laut yang diinkubasi pada suhu panas dan penginfeksian beberapa jenis bakteri patogen dengan konsentrasi bakteri yang berbeda.

Penelitian ini dilakukan melalui metode eksperimen dengan tiga tahapan. Tahapan I: isolasi bakteri dan identifikasi dengan pengujian biokimia dan molekuler melalui sekuensing untuk mengidentifikasi spesies dari bakteri pada rumput laut

yang terserang penyakit ice-ice; Tahapan II: Perlakuan penginfeksian bakteri

patogen dengan jenis bakteri yang berbeda untuk menentukan tingkat patogenisitas bakteri patogen terhadap rumput laut; Tahapan III: Perlakuan kombinasi suhu dengan jenis dan konsentrasi bakteri yang berbeda untuk mengevaluasi performa

morfologi dan mikroskopis jaringan rumput laut K. alvarezii.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat lebih dari satu jenis bakteri

yang teridentifikasi pada K. alvarezii yang terserang penyakit ice-ice, yakni

Shewanella haliotis strain DW01, Vibrio alginolyticus strain ATCC 17749,

Stenotrophomonas maltophilia strain IAM 12323, Arthrobacter nicotiannae DSM

20123, Pseudomonas aeruginosa strain SNP0614, Ochrobactrum anthropic strain

ATCC 49188, Catenococcus thiocycli strain TG 5-3 dan Bacillus subtilis

subsp.spizizenii strain ATCC 6633. Dari kedelapan jenis bakteri tersebut, sebanyak

lima jenis (62,5%) masuk dalam kelompok Gammaproteobacteria, lainnya

masing-masing satu jenis bakteri (12,5%) adalah Alphaproteobacteria, Firmicutes, dan

Actinobacteria. Hasil ini juga menunjukkan bahwa sebagian besar jenis bakteri

penyebab penyakit ice-ice adalah Proteobacteria.

Uji patogenisitas bakteri dilakukan secara in vitro dengan menggunakan

(6)

vi

sebelumnya, terdapat delapan jenis bakteri yang mungkin berasosiasi dengan

penyakit ice-ice. Penelitian ini bertujuan untuk menguji tingkat patogenisitas dari

isolat pada mikropropagul K.alvarezii dengan gejala serangan ice-ice berdasarkan

gejala klinis, morfologi dan jaringan rumput laut. Mikropropagul berukuran 2-4 cm

direndam dalam air laut yang mengandung 106 bakteri cfu / ml untuk menentukan

patogenisitas. Timbulnya gejala ice-ice diamati setiap hari secara visual. Hasil

penelitian menunjukkan bahwa bakteri yang paling cepat menimbulkan bleaching

pada mikropropagul adalah Stenotrophomonas maltophilia (5 jam pascainfeksi),

sedangkan paling lambat adalah dengan V. alginolyticus (44 jam pascainfeksi).

Bakteri lainnya dapat menyebabkan gejala ice-ice yakni 15-21 jam pascainfeksi.

Selanjutnya, bakteri Shewanella Haliotis dan V. alginolyticus ditemukan di talus

sehat. Ini adalah studi pertama yang melaporkan S.maltophilia terkait dengan

penyakit ice-ice pada K. alvarezii, dan bakteri ini mungkin berguna terhadap

penelitian khususnya terkait produksi rumput laut tahan terhadap penyakit ice-ice.

Penelitian tahap ketiga bertujuan untuk menginvestigasi asosiasi bakteri dengan

faktor lingkungan yang menyebabkan penyakit ice-ice pada K. alvarezii.

Penyebab timbulnya suatu penyakit tidak hanya akibat perubahan lingkungan, melainkan juga adanya peran bakteri yang saling berinteraksi dengan lingkungan. Interaksi faktor lingkungan (suhu dan salinitas) dan bakteri diduga dapat memperparah penyakit pada inang termasuk rumput laut. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengevaluasi efek interaksi suhu dan salinitas dengan bakteri patogen

terhadap timbulnya penyakit ice-ice pada rumput laut. K. alvarezii ditimbang

masing-masing sebanyak 50-51 g (untuk 39 akuarium), dikultur di dalam akuarium

(ukuran 30 cm x 30 cm x 30 cm) dengan suhu air 25 C dan 28 C serta

penurunan bobot lebih besar, dan jumlah cabang talus yang bleaching lebih banyak

dibandingkan dengan perlakuan suhu 25 C. Pada kedua suhu menunjukkan

signifikan terhadap jumlah bleaching pada semua bagian talus, sedangkan perlakuan

konsentrasi yang berbeda hanya menunjukkan signifikan terhadap jumlah bleaching

di talus sekunder, dan tidak signifikan terhadap jumlah bleaching di talus primer

dan tersier. Selanjutnya, untuk interaksi konsentrasi bakteri dan suhu tidak

menunjukkan signifikan baik terhadap penurunan bobot basah dan jumlah bleaching

pada setiap bagian talus rumput laut K.alvarezii. Lama waktu transmisi penyakit

(waktu selama perlakuan) berpengaruh terhadap struktur morfologi K. alvarezii

yang menunjukkan kondisi parah di hari keempat. Salinitas 28, 30, dan 35 g/L

menunjukkan penurunan bobot yang sama pada talus. Sedangkan, jumlah bleaching

yang tinggi pada talus sekunder dan tersier ditunjukkan pada salinitas 28 dan 35 g/L. Kondisi jaringan talus pada awal dan akhir pengamatan dapat dibedakan dengan jumlah protoplasma sel menurun dan jarak antar sel yang sangat renggang.

Faktor lingkungan suhu dan salinitas dapat memicu terjadinya penyakit ice-ice.

Hasil riset ini belum mengungkapkan secara detail interaksi antar faktor biotik dan

abiotik dalam menyebabkan penyakit ice-ice sehingga kedepannya perlu dilakukan

analisa lebih lanjut untuk menginvestigasi efek interaksi kedua faktor tersebut.

(7)

vii

MARLINA ACHMAD. Study of Pathogenic Bacteria and Environment Interaction to Ice-Ice Disease on Seaweed Kappaphycus alvarezii. Supervised by ALIMUDDIN, UTUT WIDYASTUTI, SUKENDA and ENANG HARRIS

Development and increased of seaweed Kappaphycus alvarezii production is

very important particularly its role in efforts to fulfill the demand of various industries that utilize the seaweed as raw material production. Indonesia as one of the nation's largest producers, should be able to ensure the quality and quantity of production of seaweed farming in the framework of the competition among seaweed producers in the world. Seaweed cultivation is as the main line in pursuing the achievement of mass production of seaweed. However, seaweed farming activities are often faced with the biggest problem of disease outbreaks. Disease is increasingly seen as a major factor in marine ecology and the impact is expected to rise to environmental changes such as global warming. This dissertation focused on

understanding a "bleaching" ice-ice disease on red macroalgae Kappaphycus

alvarezii, especially in the summer with the prediction of rising temperatures and

densities of bacteria were more abundant. Ice-ice disease might be generated in

vitro by a combination of rising temperatures and the presence of pathogenic bacteria.

This study aimed to assess: a) bacteria strain of ice-ice infected seaweed, b)in

vitro pathogenicity of pathogenic bacteria using micropropagules, c) morphology and histological performances of thallus that incubated on temperature different temperatures and infected with pathogenic bacteria.

Bacteria are suspected to be the causative agent of ice-ice disease in seaweed

Kappaphycus alvarezii. Molecular approaches have been crucial for an understanding of community structure and phylogenetic composition of different marine macroalgae. This study was conducted to identify bacteria that induce the

onset of ice-ice disease in K. alvarezii. Bacteria were isolated from the thallus of K.

alvarezii exhibited ice-ice symptoms of whitening (bleaching) collected from the waters of Bulukumba, South Sulawesi, Indonesia. Identification of bacteria was conducted by biochemical tests and 16S rRNA gene sequence analysis. The results

revealed that eight species of bacteria were identified, namely: Shewanella haliotis

strain DW01, Vibrio alginolyticus strain ATCC 17749, Stenotrophomonas

maltophilia strain IAM 12323, Arthrobacter nicotiannae DSM 20123,

Pseudomonas aeruginosa strain SNP0614, Ochrobactrum anthropic strain ATCC

49188, Catenococcus thiocycli strain TG 5-3 and Bacillus subtilis subsp.spizizenii

strain ATCC 6633. The bacteria S. haliotis, V. alginolyticus, S. maltophilia, P.

aeruginosa and C. thiocycli included in Gammaproteobacteria group, O. anthropi

was Alphaproteobacteria, and while A. nicotianae and B. subtilis were beyond of

Proteobacteria group were of Actinobacteria and Firmicutes group Low GC, respectively.

As found in previous study, there were eight species of bacteria that may associate to ice-ice disease. This study aimed to test the level of pathogenicity of

those isolates on micropropagule K.alvarezii stricken ice-ice symptoms based on

(8)

viii

bleaching and the width area of bleaching in the end of experiment.

Micropropagules of 2-4 cm in length were soaked in seawater containing 106 cfu/ml

bacteria to determine the pathogenicity. Onset of ice-ice symptoms was visually observed every day. The results showed that fastest onset of ice-ice symptoms was

observed by S. maltophilia (5 hours post challenged), while the slowest was by V.

alginolyticus (44 hours post challenged). Other bacteria induced ice-ice symptoms

at 15-21 hours post challenged. On the other hand, Shewanella haliotis and V.

alginolyticus were found in healthy thallus. This is the first study reporting

Stenotrophomonas maltophilia linked to ice-ice disease in K.alvarezii, and this bacterium might be useful towards generation of ice-ice resistance seaweed. The future of study we will investigate of bacteria associated with environment factor to

cause ice-ice disease in K.alvarezii.

The onset of a disease might not only be induced by environmental changes but also the interaction of the bacteria and environmental condition. The purpose of this research was to examine the effect of the temperature, and salinity, and pathogenic bacterial interaction on disease ice-ice incidents in seaweed

Kappaphycus alvarezii. K. alvarezii as much as 50-51 g was cultivated in aquarium (size 30 cm x 30 cm x 30 cm) with a temperature of 25 °C and 28 °C, and

inoculated with Stenotrophomonas maltophilia with concentrations of 100-106

cfu/ml to the rearing media (water salinity of 30 g/L). Furthermore, treatment of salinity was 28 g/L, 30g/L, and 35 g/L, and inoculated by same bacteria at

concentration of 106 cfu/ml, and water temperature of 28 oC . The results showed

that the seaweed that have been infected with S. maltophilia and incubated at a

temperature of 28 °C showed a decrease in the weight and the number of branches having bleaching was higher than the temperature of 25 °C. The seaweed that

infected by concentration of bacteria 100 and 106 was significantly different on

decrease in the weight and the number of branches having bleaching on secondary thallus. Moreover, the number of bleaching on primary and tertier thallus were the same. Furthermore, for the interaction of bacterial concentration and temperature showed no significant on decrease in the wet weight and the amount of bleaching on

any part of the talus seaweed K.alvarezii. Long time transmission of disease (time

during treatment) influence on morphological structure K. alvarezii that shows

severe conditions in the fourth day. Salinity 28, 30, and 35 g/L showed a decrease equal weight to the thallus. Meanwhile, a high number of bleaching at secondary and tertiary was shown in salinity 28 and 35 g / L. Difference visual morphology and histology between the initial condition and after treatment were found. At the end of experiment protoplast cells number decreased significantly and spacing between cells been more tenuous in very severe bleaching symptoms of thallus. These results have not been revealed in detail the interaction between biotic and abiotic factors in causing diseases ice-ice so that future needs to do further analysis to investigate the effects of the interaction of these two factors.

(9)

ix

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB

(10)
(11)

xi

RUMPUT LAUT Kappaphycus alvarezii

MARLINA ACHMAD

Disertasi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor

pada

Program Studi Ilmu Akuakultur

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(12)

xii

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tertutup : Prof Dr Ir Rohani Ambo Rappe, MSi

Dr Ir Munti Yuhana, MSi

Penguji Luar Komisi pada Ujian Terbuka : Prof Dr Ir Rohani Ambo Rappe, MSi

Dr Ir Munti Yuhana, MSi

(13)
(14)
(15)

xv

Alhamdulillaahirobbil’alamiin, segala puji syukur penulis panjatkan kehadirat ALLAH SWT atas limpahan rahmat, karunia dan hidayah-Nya, sehingga Disertasi

dengan judul “Studi Peran Interaksi Bakteri Patogen Dan Lingkungan Terhadap

Penyakit Ice-Ice Pada Rumput Laut Kappaphycus alvarezii” ini dapat terselesaikan.

Disertasi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Ilmu Akuakultur, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Penulis sangat yakin dan menyadari bahwa proses penyelesaian penelitian dan penyusunan Disertasi ini tidak dapat berjalan lancar tanpa adanya dukungan serta bantuan banyak pihak. Oleh karena itu, penulis menghaturkan terima kasih dan penghargaan yang tak terhingga kepada Guru sekaligus Komisi Pembimbing; Dr. Alimuddin, Dr Utut Widyastuti, Dr Sukenda, dan Prof Dr Enang Harris yang telah mencurahkan banyak ilmu, waktu, kesabaran, semangat, bimbingan serta memberikan arahan, saran, masukan dan koreksi yang sangat berarti bagi penulis sejak penyusunan Proposal Penelitian, pelaksanaan penelitian, penyusunan Artikel Ilmiah hingga penyusunan Disertasi ini. Penulis juga menghaturkan terima kasih dan penghargaan kepada Prof Dr Komar Sumantadinata (alm.) atas ilmu, waktu, kesabaran, bimbingan dan semangat yang telah diberikan untuk penelitian.

Terima kasih penulis sampaikan kepada Kementerian Riset, Teknologi dan Pendidikan Tinggi Republik Indonesia atas kesempatan dan Beasiswa Pendidikan Pascasarjana (BPPS), sehingga penulis dapat melanjutkan dan menyelesaikan pendidikan pada Program Doktor (S3) di Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Penulis juga menghaturkan terima kasih kepada Dr Ir Widanarni, MSi, Dr Ir Dedi Jusadi, MSc dan Prof Dr Ir Enang Harris, MS selaku Dosen Penguji Luar Komisi pada Ujian Kualifikasi (Prelim Lisan). Terima kasih penulis sampaikan kepada Prof Dr Ir Rohani Ambo Rappe, MSi dan Dr Ir Munti Yuhana, MSi selaku Penguji Luar Komisi pada Ujian Tertutup dan Ujian Promosi.

Terima kasih dan penghargaan penulis sampaikan kepada Rektor, Dekan Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan, Ketua Jurusan Perikanan, Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan Universitas Hasanuddin yang telah memberikan ijin dan kesempatan untuk melanjutkan pendidikan Program Doktor (S3). Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Ketua dan sejawat anggota Program Studi Budidaya Perairan, Jurusan Perikanan, Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan Universitas Hasanuddin yang telah memberikan semangat, dorongan dan kebersamaan dalam memperjuangkan agar penulis dapat melanjutkan pendidikan Program Doktor (S3). Penulis juga menghanturkan terima kasih dan penghargaan kepada Prof Dr Ir Natsir Nessa, MS yang telah memberikan dukungan baik moril maupun materil selama penulis menempuh pendidikan mulai Program Sarjana hingga Program Doktor saat ini.

(16)

xvi

Ikan, Bapak Wasjan selaku Laboran Nutrisi Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor yang telah banyak membantu penulis selama penyelesaian penelitian.

Penulis juga sampaikan terima kasih kepada rekan-rekan mahasiswa Program Doktor (S3) Program Studi Ilmu Akuakultur, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor, khususnya Angkatan 2011 (Dr Akhmad Taufiq Mukti, Dr Ade Sunarma, Dr Azis, Dr Irzal Effendi, Dr Mohammad Amin, Dr Muh. Alias L. Rajamuddin, Dr Ricky Jauhari, Ir Ridwan Tobuku, MSi, Dr Surya Syahputra, dan Dr Iis Diatin, Dr Media Fitri Isma Nugraha, Dr Yani Hadiroseyani), Dr Khairunnisa, Nuril Farizah, SPi, MSi, Muh.Safir, SPi, MSi, Dendi Hidayatullah, SPi, MSi, Amalia Nur Anshary, SPi, Hasan Nasrullah, SPi, Yanti Inneke Nababan, SPi, Abung Maruli Simanjuntak, SPi, MSi, Iin, SPi, Deni Yunus Wijaya, SPi, Haryayu, SPi, Reni Agustina, SSi, Indranita Idris, SPi atas kebersamaan, kekeluargaan, semangat dan bantuan materil maupun moril selama penulis menempuh pendidikan Program Doktor (S3).

Terima kasih yang tidak terhingga penulis haturkan kepada Ayahanda Achmad Sadarang (alm.) dan Ibunda Radiah Abubakar, Tante Haniah Abubakar (alm) serta Ayahanda Asikin Kasim (alm.) dan Ibunda Muriati Sapareng atas kasih

sayang, do’a, semangat, perhatian dan dukungan hingga saat ini. Penulis sampaikan terima kasih dan penghargaan kepada suami tercinta Fahrul, SPi, MSi. beserta

putra-putra tercinta Muhammad Faqih Ubaidillah, Muhammad Fadhlul

Ma’rifatullah atas inspirasi, kasih sayang, do’a, semangat, perhatian, pengertian dan kesabaran selama ini hingga penulis dapat menyelesaikan pendidikan Program Doktor (S3). Tidak lupa pula penulis sampaikan terima kasih kepada kakak Rachmad Achmad, dan adik-adik (Mardiana Achmad, SHut, Wahyuningsih, SP,

MSi dan Nurul Chaerani, SPi), ipar-ipar dan seluruh keluarga atas do’a, perhatian,

semangat dan dukungan selama ini.

Setiap bagian riset disertasi ini telah dimasukkan pada jurnal ilmiah. Bagian pertama dan kedua disertasi dengan judul artikel ilmiah "Molecular identification of

new bacterial causative agent of ice-ice disease on seaweed Kappaphycus alvarezii

telah diperiksa reviewer pada jurnal Peer J (terindeks SCOPUS, impact factor 2.1).

Bagian ketiga disertasi dengan judul artikel ilmiah “The effect of Stenotrophomonas maltophlia bacteria-temperture interaction on the growth, morphology and tissue

structure of Kappaphycus alvarezii” telah dimasukkan pada jurnal Tropical Life

Sciences Research (terindeks SCOPUS, impact factor 0.13).

Penulis juga sampaikan terima kasih dan penghargaan kepada semua pihak yang telah memberikan sumbangan pemikiran dan masukan untuk perbaikan dan penyelesaian penelitian dan penyusunan Disertasi ini. Penulis sangat menyadari bahwa Disertasi ini masih jauh dari kesempurnaan karena keterbatasan pengetahuan wawasan dan keilmuan penulis, sehingga saran, masukan dan kritik penulis sangat harapkan untuk perbaikan di masa mendatang. Penulis berharap semoga Karya Ilmiah Disertasi ini bermanfaat bagi perkembangan dan kemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi, khususnya bidang akuakultur di Indonesia.

Bogor, Agustus 2016

(17)

xvii

2 IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI PENYEBAB PENYAKIT ICE-ICE PADA RUMPUT LAUT Kappaphycus alvarezii ... 5 MIKROPROPAGUL RUMPUT LAUT Kappaphycus alvarezii……… 16

(18)

xviii

4.2.2 Bahan dan Metode 30

4.3 Hasil dan Pembahasan ... 32

4.2.1 Suhu 32

4.2.2 Salinitas 39

4.4 Simpulan ... 41

5 PEMBAHASAN UMUM ... 42

6 SIMPULAN DAN SARAN UMUM ... 45

6.1 Simpulan ... 45

6.2 Saran ... 45

UCAPAN TERIMA KASIH ... 45

DAFTAR PUSTAKA ... 46

LAMPIRAN ... 51

(19)

xix

3. Skala tingkat keparahan infeksi pada mikropropagul sebagai akibat penginfeksian jenis bakteri yang berbeda ... 23

4. Hasil penginfeksian rumput laut dengan konsentrasi bakteri S.maltophilia, dan suhu yang berbeda terhadap penurunan bobot basah dan jumlah talus rumput laut yang terserang ice-ice ... 33

(20)

xx

DAFTAR LAMPIRAN

1. Kondisi lingkungan perairan pengambilan rumput laut

Kappaphycus alvarezii ... 53 2. Prosedur histologi rumput laut ... 54

3. Kegiatan penginfeksian bakteri rumput laut Kappaphycus alvarezii ... 55

4. Analisis Ragam dan Uji Duncan perubahan bobot basah rumput laut

K. alvarezii akibat penginfeksian bakteri S. maltophilia pada suhu yang berbeda dan konsentrasi bakteri yang berbeda ... 56 5. Analisis Ragam dan Uji Duncan jumlah talus yang tidak terserang

bleaching pada rumput laut K. alvarezii akibat penginfeksian bakteri

S. maltophilia pada suhu yang berbeda dan konsentrasi bakteri yang berbeda ... 57 6. Analisis Ragam dan Uji Duncan penurunan bobot basah pada rumput

laut K. alvarezii akibat penginfeksian bakteri S.maltophilia pada

salinitas yang berbeda ... 59

7. Analisis Ragam dan Uji Duncan jumlah bleaching setiap bagian talus

pada rumput laut K. alvarezii akibat penginfeksian bakteri S. maltophilia

(21)

1

PENDAHULUAN UMUM

1.1 Latar Belakang

Potensi pengembangan budidaya rumput laut sangat besar di Indonesia karena lahan yang tersedia masih sangat luas, keanekaragaman jenis rumput laut yang tinggi, teknologi budidaya sederhana, dan modal yang dibutuhkan relatif kecil. Rumput laut terdiri atas beberapa jenis tergantung pada morfologi dan

warnanya. Jenis Kappaphycus alvarezii dan Gracilaria sp. diklasifikasikan

sebagai alga merah (Rhodophyceae) yang bernilai ekonomis penting di Indonesia.

Rumput laut K. alvarezii merupakan sumber kappa-karaginan yang banyak

digunakan untuk kebutuhan industri di dunia (Bixler 1996; Munoz et al. 2004).

Kappaphycus secara alami ditemukan 0.5-2.0 m garis pasang surut pada substrat pasir berbatu sampai koral di perairan intertidal tropis dan subtidal. Budidaya rumput laut ini dimulai di Mindano Selatan pada pertengahan tahun 60-an d60-an kemudi60-an diperluas lagi di daerah bagi60-an lain Filipina sampai ke negara Indonesia, Fiji, Micronesia, Vietnam, China, dan Afrika Selatan. Selanjutnya

penelitian Ohno et al. (1994), dan Ask dan Azanza (2002) menemukan bahwa laju

pertumbuhan yang optimal tidak dapat dicapai jika suhu air di bawah 20 oC dan

kisaran suhu optimum adalah 25-28 oC. Pada daerah tropis dilaporkan bahwa

Kappaphycus memiliki pertumbuhan yang pesat dan biomassa yang tinggi pada

saat suhu air 25-30 oC (Ask & Azanza 2002).

Rumput laut khususnya K. alvarezii merupakan suatu komoditas perikanan

yang bernilai ekonomis tinggi dan memiliki prospek yang besar untuk terus

dikembangkan di Indonesia. K. alvarezii memiliki manfaat yang sangat besar,

yakni dapat digunakan sebagai bahan makanan, kosmetik, farmasi, dan fotografi (Yu et al. 2002), serta sebagai bioremediasi (Rodrigueza & Montano 2007).

Pemerintah Indonesia mencapai target produksi budidaya K.alvarezii dengan

peningkatan rata-rata setiap tahun 27,71 % dari 3,9 juta ton pada tahun 2010 menjadi 10,2 juta ton pada tahun 2014 (http://kkpnews.kkp.go.id/index.php/.). Peningkatan volume dan nilai ekspor rumput laut Indonesia dalam kurun waktu 2005 hingga 2010 yakni dari 94.000 kg naik hingga 129.000 kg atau mengalami kenaikan sebesar 34%.

Permintaan rumput laut K. alvarezii pada tahun 2008-2012 menunjukkan

tren positif yang dilaporkan melalui perkembangan ekspor rumput laut Indonesia

sebesar 10.29%. Selanjutnya, diketahui bahwa jenis rumput laut K.alvarezii

sebagai penyumbang utama produksi rumput laut Indonesia yakni sekitar delapan juta ton (FAO 2014). Upaya peningkatan produksi dilakukan dengan meningkatkan jumlah penanaman rumput laut pada daerah pantai yang cocok

untuk kegiatan budidaya rumput laut K. alvarezii. Namun demikian, sampai saat

ini usaha budidaya rumput laut masih menghadapi masalah serius akibat serangan

penyakit ice-ice (Santoso & Nugraha 2008).

Penyakit ice-ice yang menyerang rumput laut jenis Kappaphycus sp.

umumnya disebabkan oleh kondisi suhu dan salinitas yang tidak stabil atau perubahan kondisi lingkungan lainnya secara mendadak di lokasi budidaya. Pada

saat stres lingkungan terjadi, Kappaphycus sp. akan membebaskan substansi

(22)

2

merangsang banyak bakteri tumbuh di sekitarnya (Largo 2002). Dua jenis bakteri

telah dilaporkan bersifat patogen bagi Kappaphycus sp., yakni Vibrio-Aeromonas

complex dan Cytophaga-Flavobacterium (Largo et al. 1995a). Pertumbuhan bakteri pada talus menyebabkan pertumbuhan rumput laut melambat, perubahan warna menjadi pucat dan pada beberapa talus menjadi putih dan membusuk, dan

akhirnya hancur dan rontok. Serangan penyakit ice-ice pada rumput laut yang

semakin meluas di lokasi budidaya, mendorong untuk dilakukan upaya

penanggulangan atau dihasilkannya varietas rumput laut tahan penyakit ice-ice.

Selain itu, jenis bakteri penyebab utama dan populasi bakteri pada rumput laut

yang terserang penyakit ice-ice dapat bervariasi antarperairan.

Secara faktual, kajian tentang penyakit ice-ice dan pengendaliannya

termasuk uji daya tahan rumput laut terhadap penyakit ice-ice adalah masih sangat

minim. Sebagai langkah awal produksi rumput laut yang tahan penyakit ice-ice

telah dilakukan pengembangan metode introduksi gen penyandi enzim lisozim

(Handayani et al. 2014), dan enzim superoksida dismutase (Triana et al. 2016).

Daya tahan rumput laut transgenik tersebut perlu diuji tantang menggunakan

patogen penyebab ice-ice. Oleh karena itu, pada penelitian disertasi ini dilakukan

isolasi dan identifikasi bakteri dari rumput laut yang terserang ice-ice (Riset

Tahap 1). Hasil isolasi dan identifikasi ini diharapkan dapat menentukan jenis

bakteri yang menjadi penyebab utama terhadap penyakit ice-ice. Pada riset tahap

2 dilakukan uji patogenisitas bakteri yang diperoleh dari riset tahap 1. Selanjutnya, pada riset tahap 3 dikaji interaksi suhu dan bakteri patogen terhadap

tingkat keparahan penyakit ice-ice pada K. alvarezii.

1.2 Rumusan Masalah dan Ruang Lingkup Penelitian

Penyakit ice-ice yang menyerang rumput laut jenis Kappaphycus sp.

diduga disebabkan oleh kondisi suhu dan salinitas yang tidak stabil atau perubahan kondisi lingkungan lainnya secara mendadak di lokasi budidaya. Pada

saat stres lingkungan terjadi, Kappaphycus sp. mengeluarkan substansi organik

(enzim hidrolitik) yang menyebabkan talus berlendir dan diduga merangsang berbagai jenis bakteri tumbuh di sekitar talus (Largo 2002). Dua jenis bakteri telah

dilaporkan bersifat patogen bagi Kappaphycus sp., yakni Vibrio-Aeromonas

complex dan Cytophaga-Flavobacterium (Largo et al. 1995a). Selanjutnya bakteri

yang berbeda diisolasi dari rumput laut K.alvarezii. Bakteri jenis Vibrio,

Flavobacterium, Pseudomonas, Plesiomonas diisolasi dari rumput laut K.alvarezii

yang terserang penyakit ice-ice di Pulau Seribu, Indonesia (Aris 2011). Bakteri

jenis lain seperti Acinetobacter, Flavobacterium, Bacillus, Pseudomonas,

Enterobactericea dan Vibrio juga diisolasi dari rumput laut K.alvarezii yang

terserang penyakit ice-ice di daerah Jeneponto, Bantaeng, dan Barru Sulawesi

Selatan,Indonesia (Zainuddin et al. 2014). Spesies bakteri patogen berbeda dari

perairan yang berbeda sangat dimungkinkan terjadi. Oleh karena itu, perlu

dilakukan penelitian lebih lanjut di perairan yang banyak dilakukan budidaya K.

alvarezii. Identifikasi bakteri dapat dilakukan secara biokimia, menggunakan kit API, dan secara molekuler. Ketiga metode tersebut digunakan pada riset ini untuk meningkatkan akurasi penentuan spesies.

Pada penelitian terdahulu, uji patogenisitas kandidat bakteri penyebab

(23)

bakteri dalam jaringan yang berasosiasi dengan penyakit ice-ice sangat mungkin terjadi. Oleh karena itu, pada penelitian uji patogenisitas dalam disertasi ini digunakan mikropropagul hasil kultur jaringan. Bakteri yang cepat dan

menyebabkan bleaching yang parah pada talus dipilih untuk riset selanjutnya.

Hingga saat ini diyakini bahwa faktor lingkungan utama yang

menginduksi penyakit ice-ice adalah suhu, dan/atau salinitas. Studi komprehensif

yang mempelajari interaksi faktor lingkungan dan bakteri patogen penyebab

ice-ice belum dilaporkan. Oleh karena itu, tema riset tersebut menjadi riset tahap

akhir pada disertasi ini. Dengan pertimbangan keterbatasan jumlah dan ukuran

mikropropagul yang kecil, maka pada riset tahap akhir digunakan talus K.

alvarezii yang didesinfeksi dengan antibiotik. Alur dan kaitan antartahap penelitian disertasi ini ditunjukkan pada Gambar 1.

Gambar 1. Diagram alir kaitan antar tahap penelitian disertasi ini

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan umum penelitian ini adalah mengevaluasi peran bakteri dan faktor

suhu dan salinitas terhadap timbulnya penyakit ice-ice pada K. alvarezii. Secara

rinci tujuan khusus dari penelitian ini adalah:

1. Mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri dari rumput laut yang terserang

penyakit ice-ice

2. Mengkaji patogenisitas isolat bakteri untuk menentukan kandidat bakteri

penyebab utama penyakit ice-ice

3. Mengevaluasi interaksi faktor lingkungan (suhu dan salinitas) dan patogen

(24)

4

1.4 Hipotesis Penelitan

Hipotesis yang diajukan pada penelitian ini adalah:

1. Bakteri utama penyebab ice-ice dapat diperoleh.

2. Pada kondisi penelitian skala laboratorium, bakteri menyebabkan ice-ice lebih

parah daripada akibat stres suhu dan salinitas.

3. Interaksi faktor lingkungan (suhu dan salinitas) dan bakteri patogen dapat

memperparah kejadian ice-ice pada K. alvarezii.

1.5 Kebaruan Penelitian

Kebaruan (novelty) dalam penelitian ini adalah diperoleh isolat bakteri jenis

baru penyebab penyakit ice-ice pada K. alvarezii, dan kajian interaksi faktor

lingkungan dan bakteri patogen terhadap tingkat keparahan ice-ice pada K.

(25)

2 IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI PENYEBAB

PENYAKIT ICE-ICE PADA RUMPUT

LAUT Kappaphycus alvarezii

ABSTRAK

Bakteri sebagai agen penyebab penyakit ice-ice pada rumput laut

Kappaphycus alvarezii. Pendekatan molekuler telah menjadi hal penting untuk mengetahui struktur komunitas dan komposisi filogeni dari makroalga laut yang berbeda. Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengidentifikasi bakteri

yang memicu serangan penyakit ice-ice pada K. alvarezii. Bakteri diisolasi dari

talus K.alvarezii yang menunjukkan gejala bleaching dan yang diperoleh dari

Perairan Bulukumba, Sulawesi Selatan, Indonesia. Identifikasi yang dilakukan adalah pengujian secara biokimia dan analisis sekuen gen 16S rRNA. Hasil penelitian menghasilkan delapan spesies bakteri yang teridentifikasi sebagai:

Shewanella haliotis strain DW01, Vibrio alginolyticus strain ATCC 17749,

Stenotrophomonas maltophilia strain IAM 12323, Arthrobacter nicotiannae DSM

20123, Pseudomonas aeruginosa strain SNP0614, Ochrobactrum anthropic strain

ATCC 49188, Catenococcus thiocycli strain TG 5-3 dan Bacillus subtilis

subsp.spizizenii strain ATCC 6633. Berdasarkan filogeninya, spesies S. haliotis,

V. alginolyticus, S. maltophilia, P. aeruginosa dan C. thiocycli termasuk

kelompok Gammaproteobacteria; O. antropic masuk ke dalam kelompok

Alphaproteobacteria; A. nicotianae termasuk kelompok Actinobacteria dan B. subtilis masuk ke dalam kelompok Firmicutes.

Kata kunci: identifikasi molekuler, bakteri, ice-ice, Kappaphycus alvarezii

ABSTRACT

Bacteria are suspected to be the causative agent of ice-ice disease in seaweed

Kappaphycus alvarezii. Molecular approaches have been crucial for an understanding of community structure and phylogenetic composition of different marine macroalgae. This study was conducted to identify bacteria that induce the

onset of ice-ice disease in K. alvarezii. Bacteria were isolated from the thallus of

K. alvarezii exhibited ice-ice symptoms of whitening (bleaching) collected from the waters of Bulukumba, South Sulawesi, Indonesia. Identification of bacteria was conducted by biochemical tests and 16S rRNA gene sequence analysis. The

results revealed that eight species of bacteria were identified, namely: Shewanella

haliotis strain DW01, Vibrio alginolyticus strain ATCC 17749, Stenotrophomonas maltophilia strain IAM 12323, Arthrobacter nicotiannae DSM 20123,

Pseudomonas aeruginosa strain SNP0614, Ochrobactrum anthropic strain ATCC

49188, Catenococcus thiocycli strain TG 5-3 and Bacillus subtilis subsp.spizizenii

strain ATCC 6633. The bacteria S. haliotis, V. alginolyticus, S. maltophilia, P.

aeruginosa and C. thiocycli were included in Gammaproteobacteria group, O.

IDENTIFICATION OF BACTERIAL CAUSATIVE AGENT OF

(26)

6

anthropi was Alphaproteobacteria, and A. nicotianae and B. subtilis were

Actinobacteria and Firmicutes groups, respectively.

Keywords: molecular identification, bacteria, ice-ice, Kappaphycus alvarezii.

2.1 Pendahuluan

Rumput laut, khususnya Kappaphycus alvarezii merupakan komoditas

penting bagi perikanan budidaya di Indonesia. K. alvarezii merupakan sumber

kappa-karaginan yang dapat digunakan sebagai bahan pangan, kosmetik, farmasi

dan fotografi (Yu et al. 2002). Pada musim tertentu, kegiatan budidaya rumput

laut dihadapkan pada masalah besar, yaitu serangan penyakit ice-ice. Penyakit

ice-ice ditandai dengan munculnya gejala pemutihan (bleaching) pada permukaan

talus rumput laut. Penyakit ice-ice dapat disebabkan oleh bakteri patogen

oportunistik (Largo et al. 1995a; Vairappan et al. 2001; Aris 2011). Jenis bakteri

terkait penyakit ice-ice yang dilaporkan dari riset sebelumnya adalah

berbeda-beda. Perbedaan sumber isolat diduga menjadi penyebab perbedaan tersebut. Bakteri membentuk biofilm pada permukaan organisme lain seperti rumput laut karena ketersediaan nutrien berasal dari luar dan hasil fotosintesis yang

dilepaskan oleh organisme inang (Seymour et al. 2009; Azanza et al. 2013).

Meskipun banyak bakteri yang telah diidentifikasi sebagai patogen makroalga laut

khususnya pada rumput laut, seperti Pseudoalteromonas (Wang et al. 2008),

Vibrio (Fujita 1990; Largo et al. 1995a; Wang et al 2008; Vairappan et al. 2009),

Flavobacterium (Sunairi et al. 1995; Largo et al. 1995a), peran fungsional bakteri ini dalam ekosistem alami masih belum jelas. Sebagai epifit oportunistik diketahui

dapat menurunkan dan melemahkan jaringan alga (Kupper et al. 2002,

Weinberger & Friedlander 2000).

Jenis bakteri yang diketahui hidup pada talus rumput laut K. alvarezii adalah

bakteri patogen opurtunistik Vibrio sp. (P11) dan Cytophaga sp. (P25). Bakteri

P11 dan P25 telah diuji patogenisitas pada rumput laut K. alvarezii hasil budidaya

yang sudah didesinfeksi (Largo et al. 1999). Namun demikian, uji patogenisitas

terhadap rumput laut bebas penyakit belum dilakukan. K. alvarezii bebas penyakit

dapat dihasilkan melalui kultur jaringan. Keberhasilan kultur jaringan K. alvarezii

telah dilaporkan oleh Sulistiani dan Yani (2014). Pemeliharaan kalus kultur

jaringan selama 2 bulan akan dihasilkan mikropropagul (Reddy et al. 2008).

Mikropropagul tersebut potensial digunakan untuk menguji patogenisitas bakteri

kandidat penyebab penyakit ice-ice.

Teknik identifikasi jenis bakteri yang telah berkembang pesat saat ini adalah teknik molekuler, yaitu analisis sekuen gen 16S rRNA. Penggunaan sekuen gen 16S rRNA untuk studi filogeni bakteri dan taksonomi adalah berdasarkan fakta, yaitu: (i) Terdapat pada hampir seluruh bakteri, (ii) fungsi gen 16S rRNA dari waktu ke waktu tidak berubah, atau perubahannya secara acak sehingga pengukurannya lebih akurat, dan (iii) panjang sekuen gen 16S rRNA cukup besar (Patel 2001; Janda & Abott 2007). Analisis filogenetik menggunakan gen 16S rRNA telah diaplikasikan pada komunitas bakteri yang berasosiasi dengan

makroalga hijau Ulva australis (Tujula et al. 2009; Burke et al. 2010), lamun

(27)

(Fernandez 2011). Hingga saat ini, belum ada publikasi yang melaporkan analisis

filogenetik jenis bakteri penyebab ice-ice menggunakan gen 16S rRNA pada alga

merah Kappahycus alvarezii. Sebelumnya Aris (2011) melaporkan pengembangan

metode deteksi secara molekuler untuk bakteri penyebab penyakit ice-ice dengan

primer spesifik PCR berdasarkan sekuen gen 16S rRNA. Dengan demikian penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi bakteri kandidat penyebab

penyakit ice-ice melalui uji biokimia dan uji molekuler menggunakan metode

sekuensing dengan target gen 16S rRNA.

2.2 Metode Penelitian

2.2.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan Januari-Desember 2015. Sampel rumput

laut yang terserang ice-ice dikoleksi dari pembudidaya Kelompok Tani Menara di

Perairan Bulukumba, Sulawesi Selatan. Isolasi bakteri, uji biokimia dan histologi dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan (BDP), Fakultas Perikanan dan Kelautan (FPIK), Institut Pertanian Bogor (IPB).

Ekstraksi DNA, amplifikasi polymerase chain reaction (PCR) dilakukan di

Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik, Departemen BDP,

FPIK, IPB dan sekuensing gen 16S rRNA dilakukan di First Base Laboratories,

Malaysia.

2.2.2 Bahan dan Metode

Isolasi dan identifikasi bakteri secara biokimia

Bakteri diisolasi dari talus K. alvarezii yang menunjukkan terserang dan

tidak terserang ice-ice. Talus diambil sebanyak 1 g dan digerus. Cairan hasil

gerusan diambil sebanyak 0,1 ml dan disebar ke cawan petri berisi media padat

sea water complex (SWC) yang terdiri dari komposisi 5 g bacto-peptone, 5 g yeast extract, 3 ml gliserol, 250 ml akuades, 750 ml air laut steril dan 20 g bactoagar. Bakteri dikultur pada suhu 28 °C selama 24 jam. Kemudian, hasil isolasi bakteri digores ulang beberapa kali untuk memperoleh isolat murni dan dilanjutkan evaluasi tipe koloni dan identifikasi secara biokimia.

Ekstraki DNA genom

DNA genom bakteri diekstraksi menggunakan Presto™ mini gDNA bacteria

kit (Geneaid, Taiwan). Lisis sel bakteri Gram negatif dilakukan menggunakan

bufer GT berisi proteinase K 20 µl dan diinkubasi pada suhu 60 °C selama 10 menit, sedangkan lisis bakteri Gram positif dilakukan menggunakan bufer GT yang mengandung lisozim (4 mg/ml) dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 30 menit. Selanjutnya, 20 µl proteinase K ditambahkan dan inkubasi dilanjutkan pada suhu 60 °C selama 10 menit.

DNA dilarutkan menggunakan 100 µl elution buffer. Hasil isolasi DNA

dikonfirmasi dengan pengukuran konsentrasi DNA menggunakan Genquant

(Teare et al. 1997) dan pemisahan DNA dilakukan menggunakan elektroforesis

(28)

8

bromida dengan bantuan cahaya ultraviolet. Larutan DNA disimpan pada suhu -20 °C hingga proses selanjutnya.

Amplifikasi PCR dan analisis nukleotida

Amplifikasi gen 16S rRNA dilakukan menggunakan primer universal

(Marchesi et al. 1998), yakni 63F (5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’)

dan 1387R (5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3’). Program PCR yang

digunakan adalah pre-denaturasi 94 °C selama 2 menit, 30 siklus amplifikasi

pada suhu denaturasi 92 °C selama 30 detik, annealing 55 °C selama 30 detik,

ekstensi 72 °C selama 1 menit dan ekstensi akhir pada suhu 75 °C selama 20 menit. Produk PCR dipisahkan menggunakan elektroforesis pada gel agarosa 1% untuk konfirmasi adanya produk amplifikasi. Selanjutnya, produk PCR

dipurifikasi menggunakan PCR clean up dan gel extraction (Geneaid). Hasil

purifikasi disekuensing menggunakan mesin ABI3730XL.

Hasil sekuensing diedit dengan bantuan program Bioedit v.7,4 (Tamura et

al. 2011; Azanza et al. 2013). Selanjutnya, sekuen dianalisis menggunakan basic

local alignment search tool (Altschul et al. 1990; Azanza et al. 2013) untuk menentukan spesies bakteri hasil isolasi dengan membandingkan (analisis

homologi) antara sekuen 16S rRNA isolat dan bakteri yang ada di database.

Analisis filogeni

Hasil sekuensing 16S rRNA disejajarkan (alignment) menggunakan program

ClustalW. Analisis filogeni dibuat menggunakan program MEGA v.5,0 (Azanza

et al. 2013) dengan boostrap pengulangan sampel 1.000 kali.

2.3 Hasil dan Pembahasan

2.3.1 Identifikasi isolat bakteri

Hasil uji biokimia dilakukan untuk menentukan genus dari isolat bakteri. Berdasarkan uji biokimia diketahui sebagian besar isolat adalah kelompok Gram negatif (Tabel 1). Bakteri yang termasuk Gram negatif ada 6 isolat, yaitu

Shewanella sp., Vibrio sp., Stenotrophomonas sp., Pseudomonas sp. dan

Ochrobactrum sp. Dua isolat yang termasuk bakteri Gram positif adalah

Arthrobacter sp. dan Bacillus sp. Bakteri yang diisolasi dari permukaan rumput

laut K. alvarezii umumnya adalah Gram negatif dan berbentuk batang. Hal ini

sejalan dengan yang umum ditemukan di lingkungan laut (Austin 1988) dan juga

pada rumput laut Gracilaria gracilis (Jaffray 1998), yakni bakteri Gram negatif

dan berbentuk batang.

Komunitas epibakterial berada pada tempat yang berbeda-beda (distribusi temporal dan spasial pada talus) pada permukaan inang karena keanekaragaman

komposisi biokimia dari talus ganggang coklat, merah dan hijau (Longford et al.,

2007) dan metabolitnya (Steinberg et al., 2002; Paul et al., 2006). Sebagai contoh

(29)
(30)

10

menyebabkan kolonisasi selektif bakteri Gram positif pada talus alga merah

(Steinberg et al., 2002). Demikian pula, senyawa kimia dari permukaan dan

komposisi luar dari inang alga dapat menentukan komposisi komunitas

epibakteria pada rumput laut (Collen & Davison, 2001; Sapp et al., 2007). Pada

penelitian ini diperoleh sebagain besar adalah bakteri Gram negatif, berbeda

dengan yang dilaporkan oleh Steinberg et al. (2002). Mekanisme kolonisasi

bakteri pada K. alvarezii perlu diteliti lebih lanjut.

Analisis sekuen nukleotida gen 16S rRNA digunakan untuk menentukan

spesies isolat bakteri (Tabel 2). Bakteri yang berhasil diidentifikasi adalah S.

haliotis strain DW01, V. alginolyticus strain ATCC 17749, S. maltophilia strain

IAM 12323, P. aeruginosa strain SNP0614 dan O. anthropi strain ATCC 49188,

A. nicotianae strain DSM 20123, dan B. subtilis subsp. spizizenii strain ATCC

6633. Tingkat kemiripan sekuen nukleotida gen 16S rRNA isolat dengan database

adalah tinggi, lebih dari 90% (Tabel 2). Bakteri S. haliotis strain DW01 dan C.

thiocycli strain TG 5-3 memiliki tingkat kemiripan paling tinggi dengan sekuen

nukleotida dari database Bank Gen, yaitu 98%, sedangkan kemiripan yang paling

rendah 95% adalah isolat bakteri O. anthropi strain ATCC 49188. Hal ini

menunjukkan bahwa sekuen dari isolat-isolat uji identik dengan jenis bakteri yang

ada pada database di Bank Gen.

Bakteri-bakteri yang diisolasi dari talus rumput laut yang tidak

menunjukkan gejala penyakit ice-ice adalah genus Shewanella dan Vibrio,

sedangkan bakteri Stenotrophomonas, Arthrobacter, Pseudomonas,

Ochrobactrum, Catenococcus, dan Bacillus diisolasi dari talus dengan gejala

ice-ice. Bakteri-bakteri tersebut diketahui sebagai bakteri laut yang umumnya

ditemukan di laut, baik dari air laut, substrat, maupun organismenya. Hal ini

sejalan dengan beberapa penemuan sebelumnya yakni bakteri Shewanella

ditemukan sebagai patogen pada timun laut (Li et al. 2010), dan sedimen laut di

Pasifik barat (Xiao et al. 2007). Bakteri Vibrio telah diisolasi dari air laut (Arias et

al. 1999), dan sebagai penyebab kematian massal beberapa jenis invertebrata laut

(Vezulli et al. 2010). Selanjutnya, bakteri Stenotrophomonas sebagai patogen

oportunistik invertebrata laut dalam (Romanenko et al. 2008), dan sebagai

antibiotik aktif pada alga coklat (Wiese et al. 2009). Namun demikian, studi lebih

lanjut dibutuhkan untuk menentukan tingkat patogenisitas isolat bakteri yang diperoleh dari penelitian ini.

Bakteri lainnya yakni Arthrobacter telah diisolasi dari sedimen laut (Chen

et al. 2005), dan air laut (Chen et al. 2009). Bakteri Pseudomonas diisolasi dari sedimen laut dalam (Zhang & Zeng 2008), dan dilaporan dapat menyebabkan

penyakit “winter” pada ikan seabream Sparus aurata (Domenech et al. 1999).

Selanjutnya, bakteri Ochrobactrum telah diisolasi dari sedimen laut (Yirui et al.

2009), dan infeksi dapat perusak alginat pada alga cokelat (Mao-hong et al. 2007).

Bakteri Catenococcus diisolasi dari air laut (Sorokin 1992), dan bakteri Bacillus

(31)

11 Isolat Nama Bakteri homologi

(%)

Query/ Subject Nomor akses

Isolat 1 Shewanella haliotis strain DW01 98% 1197/1227 NR_117770.1

Isolat 2 Vibrio alginolyticus strain ATCC 17749 97% 1196/1229 NR_117895.1

Isolat 3 Stenotrophomonas maltophilia strain IAM 12323 97% 1102/1136 NR_041577.1

Isolat 4 Arthrobacter nicotianae strain DSM 20123 96% 1183/1231 NR_026190.1

Isolat 5 Pseudomonas aeruginosa strain SNP0614 97% 1277/1316 NR_118644.1

Isolat 6 Ochrobactrum anthropi strain ATCC 49188 95% 1075/1134 NR_074243.1

Isolat 7 Catenococcus thiocycli strain TG 5-3 98% 1195/1220 NR_104870.1

(32)

12

2.3.2 Analisis filogeni komunitas bakteri pada Kappaphycus alvarezii

Hasil analisis filogeni isolat bakteri dari rumput laut Kappaphycus

alvarezii disajikan pada Gambar 2. Tingkat kekerabatan isolat bakteri yang

diisolasi dari K. alvarezii dengan spesies database pada Bank Gen berkisar

80-100%. Isolat 1 memiliki kekerabatan paling dekat dengan Shewanella marina

strain C4 (NR044453.1), isolat 2 kekerabatannya dekat dengan isolat 7 dan

dengan Vibrio fluvialis strain VL 5125 (NR036790.1). Selanjutnya, isolat 3

kekerabatannya dekat dengan Stenotrophomonas maltophilia strain e-a22

(AJ293474.1), S.maltophilia isolat FLX (DQ077704.1), dan Xanthomonas

maltophilia (M59158.1). Isolat 4 kekerabatannya dekat dengan Arthrobacter arilaitensis strain abk7 (KU200946.1), dan A. nicotianae strain Na44RA-2

(KP296222.1). Isolat 5 memiliki kekerabatan paling dekat dengan Pseudomonas

aeruginosa (AY665977.1), isolat 6 Ochrobactrum anthropi berkerabat dekat

dengan A. pituitosum strain CCUG 50899 (NR115043.1), dan isolat 8 dekat

dengan Bacillus pumilus strain ST277 (EU350371.1).

Selanjutnya, pohon filogeni menunjukkan bahwa terdapat 5 jenis bakteri

atau 62,5% termasuk kelompok Gammaproteobacteria, selanjutnya 1 jenis bakteri

atau 12,5% untuk masing-masing kelompok bakteri Alphaproteobacteria,

Firmicute, dan Actinobacteria (Gambar 2). Spesies yang diidentifikasi sebagai

Stenotrophomonas sp. adalah satu isolat (isolat no.3), Pseudomonas sp. adalah

satu isolat (isolat no. 5), Shewanella sp. adalah satu isolat (isolat no.1), dan Vibrio

sp. adalah dua isolat, yaitu no. 2 dan no. 7. Selanjutnya, spesies yang tergolong

Ochrobactrum sp. adalah satu isolat (isolat no.6), Bacillus sp. adalah satu isolat

(isolat no.8), dan Athrobacter sp. adalah satu isolat (isolat no.4). Secara

molekuler, bakteri V. alginolyticus memiliki hubungan yang dekat dengan bakteri

S. haliotis. Hal ini sejalan dengan Kita-Tsukamoto et al. (1993) dan Thompson et

al. (2004) yang menemukan bahwa berdasarkan sekuen parsial 16S rRNA dari 50

spesies, termasuk dalam famili Vibrionaceae, umumnya spesies Vibrio dan

spesies Aeromonas, Deleya, Escherchia, Marinomonas, Pseudomonas dan

Shewanella. Isolat C. thiocycli juga berada dalam satu cabang dengan V. alginolyticus. Berdasarkan tingkatan taksonomi C. thiocycli termasuk dalam

(33)

Gambar 2. Pohon filogenetik berdasarkan sekuen nukleotida gen 16S rRNA isolat

bakteri dari rumput laut K. alvarezii yang terserang penyakit ice-ice.

Jenis bakteri yang diberi garis bawah merupakan hasil penelitian ini. Jarak taksonomi dihitung menggunakan program Mega 5. Analisis

bootstrap digunakan untuk mengukur tingkat kepercayaan dari pohon filogenetik.

Selanjutnya, dengan dukungan bootstrap sebanyak 1.000x pada pohon

filogenetik diketahui bahwa sebagian besar isolat bakteri termasuk dalam

Proteobacteria. Kelompok bakteri Proteobacteria yang termasuk dalam subdivisi

Gammaproteobacteria adalah S. haliotis, V. alginolyticus, S. maltophilia, P. aeruginosa dan C. thiocycli, sedangkan subdivisi Alphaproteobacteria adalah O. anthropi. Bakteri lainnya adalah B. subtilis subsp. Spizizenii, dan A. nicotianae

masing-masing termasuk dalam kelompok Firmicutes-Gram positive Low GC,

dan Actinobacteria-Gram positive high GC.

Bakteri hasil identifikasi umumnya termasuk dalam kelompok

Gammaproteobacteria, merupakan kelompok bakteri yang banyak dikaitkan sebagai penyebab penyakit. Sejumlah studi genom telah dilakukan untuk

mengidentifikasi protein yang unik pada spesies bakteri Gammaproteobacteria

yang terkait dengan virulensinya (Van Sluyset al. 2002; Gao et al. 2009).

Kelompok Gammaproteobacteria merupakan bakteri dominan yang ditemukan di

permukaan makroalga seperti pada Enteromorpha dan Ulva (Patel et al. 2003;

Tait et al. 2005), Corallina officinalis (Huggett et al. 2006). Kelimpahan

Gammaproteobacteria pada rumput laut dapat berkonstribusi terhadap

kecenderungan untuk membentuk biofilm (Taits et al. 2009). Tingkat

AJ293474.1| Stenotrophomonas maltophilia strain e-a22

DQ077704.1| Stenotrophomonas maltophilia isolate FLX

Isolat 3 | Stenotrophomonas maltophilia strain IAM 12323

M59158.1 Xanthomonas maltophilia

Isolat 5 | Pseudomonas aeruginosa strain SNP0614

AY665977.1| Pseudomonas aeruginosa

KC495571.1| Pseudomonas fluorescens strain KP6

AF438148.1| Pseudomonas sp. AMSN

Isolat 1 | Shewanella haliotis strain DW01

NR 044453.1| Shewanella marina strain C4

NR 036790.1| Vibrio fluvialis strain VL 5125

Isolat 2 | Vibrio alginolyticus strain ATCC 17749

Isolat 7 | Catenococcus thiocycli strain TG 5-3

AF526515.2| Ochrobactrum intermedium isolate ADV24

Isolat 6 | Ochrobactrum anthropi strain ATCC 49188

NR 115043.1| Ochrobactrum pituitosum strain CCUG 50899

Isolat 8 | Bacillus subtilis subsp. spizizenii strain ATCC 6

EU350371.1| Bacillus pumilus strain ST277

Isolat 4 | Arthrobacter nicotianae strain DSM 20123

(34)

14

patogenisitas kelimat spesies isolat bakteri kelompok Gammaproteobacteria yang

diperoleh dari riset ini menjadi hal menarik untuk diteliti lebih lanjut.

Permukaan makroalga merupakan inang hidup bagi bakteri (Burke et al.

2011). Selain Gammaproteobacteria, bakteri kelompok Alphaproteobacteria juga

diidentifikasi pada penelitian ini. Bakteri Alphaproteobacteria dilaporkan

ditemukan di rumput laut Jepang (Azanza et al. 2013). Kelompok Firmicutes juga

diidentifikasi pada penelitian ini. Firmicutes dilaporkan merupakan bakteri

dengan kelimpahan terbanyak kedua pada permukaan alga hijau Ulva dan

Gracilaria, serta berkonstribusi sekitar 15-30% dari asimilasi

dimethylsulfoniopropionate (Malmstrom et al. 2004; Singh et al. 2015).

Kelompok lain yang berhasil diidentifikasi pada penelitian ini adalah

Actinobacteria. Actinobacteria juga sudah dilaporkan diperoleh dari air laut

(Venter et al. 2004; Giovannoni & Stingl 2005), mangrove, dan sedimen

(Sivakumar et al. 2007).

Kelompok bakteri Proteobacteria diketahui tidak hanya ditemukan pada

alga merah, tetapi juga alga hijau (Patel et al., 2003; Burke et al. 2010; Tujula et

al. 2009), dan alga cokelat (Salaün et al., 2010). Hal ini mengindikasikan bahwa

kelompok bakteri Proteobacteria melimpah di permukaan makroalga laut.

Kelompok Proteobacteria yang meliputi anggota bakteri Gammaproteobacteria

dan Alphaproteobacteria memiliki distribusi yang luas di perairan laut dan pantai

(Venter et al., 2004; Rusch et al., 2007). Komunitas bakteri yang diidentifikasi

pada penelitian ini umumnya hampir sama yang didentifikasi pada rumput laut

yang berbeda (Azanza et al. 2013). Namun demikian, jenis isolat bakteri yang

diperoleh dari riset ini berbeda dengan yang dilaporkan sebelumnya dari rumput

laut K. alvarezi (Largo et al. 1995b; Aris 2011).

Jenis bakteri yang diperoleh berbeda dengan bakteri yang disolasi dari

rumput laut K. alvarezii oleh Largo (1995a) dan Aris (2011). Hal ini diduga

adanya perbedaan waktu dan lokasi pengambilan rumput laut. Pada penelitian ini, bakteri diisolasi dari bagian talus ujung dan di permukaan, sedangkan Largo (1995a) dan Aris (2011) bakteri yang diisolasi dari seluruh bagian talus. Hal

tersebut sejalan dengan yang dikemukakan oleh Armstrong et al. (2000) dan

Bengtsson et al. (2010) bahwa kelimpahan jenis bakteri rumput laut umumnya

bervariasi antar jenis rumput laut, bagian talus, dan musim. Selain itu, terdapat perbedaan kondisi lingkungan perairan pada ketiga lokasi pengambilan sampel (Lampiran 1). Hal ini diduga juga menjadi penyebab jenis bakteri yang diisolasi adalah berbeda.

Stres pada inang dan gangguan sistem pertahanan merupakan faktor ideal

untuk kolonisasi bakteri (Case et al. 2011). Inang mengalami stres apabila

melewati batas adaptasi dan toleransi inang terhadap kondisi lingkungan, dan hal ini dapat menimbulkan gejala penyakit. Pada rumput laut telah dilaporkan bahwa

peningkatan suhu dan penurunan salinitas dapat meningkatkan bleaching pada

Laminaria religiosa (Vairappan et al. 2011). Selanjutnya telah dilaporkan juga

diketahui pada suhu ≥ 30 oC, dan salinitas ≤ 20 g/L dapat meningkatkan bleaching

dan menyebabkan kematian pada K. alvarezii (Largo et al. 1995b). Namun

demikian interaksi isolat bakteri dan faktor lingkungan terhadap bleaching belum

(35)

2.4 Simpulan

Isolat yang diperoleh dari rumput laut K. alvarezii terdiri atas enam jenis

bakteri dari talus dengan gejala penyakit ice-ice, dan dua jenis diisolasi dari talus

tanpa gejala penyakit ice-ice. Berdasarkan analisis sekuen gen 16S rRNA, bakteri

teridentifikasi sebagai: Shewanella haliotis strain DW01, Vibrio alginolyticus

strain ATCC 17749, Stenotrophomonas maltophilia strain IAM 12323,

Arthrobacter nicotiannae DSM 20123, Pseudomonas aeruginosa strain SNP0614,

Ochrobactrum anthropic strain ATCC 49188, Catenococcus thiocycli strain TG

5-3 dan Bacillus subtilis subsp.spizizenii strain ATCC 6633. Hasil analisis filogeni

membagi delapan spesies bakteri menjadi Gammaproteobacteria (5 isolat),

Alphaproteobacteria (1 isolat), Firmicutes (1 isolat) dan Actinobacteria (1 isolat).

Isolat yang diperoleh adalah berbeda dengan yang dilaporkan sebelumnya dari K.

(36)

16

3 UJI IN VITRO PATOGENISITAS BAKTERI PENYEBAB

ICE-ICE PADA MIKROPROPAGUL RUMPUT LAUT

Kappaphycus alvarezii

ABSTRAK

Penelitian sebelumnya menghasilkan delapan spesies bakteri yang diduga

menjadi penyebab penyakit ice-ice pada rumput laut Kappaphycus alvarezii.

Penelitian ini bertujuan untuk menguji patogenisitas masing-masing isolat

terhadap mikropropagul rumput laut K. alvarezii dalam menginduksi serangan

ice-ice berdasarkan gejala klinis, morfologi dan secara histologi. Analisis yang

dilakukan terhadap gejala penyakit ice-ice adalah waktu awal munculnya

bleaching, jumlah titik bleaching dan luas area bleaching yang dihasilkan pada akhir pengamatan. Mikropropagul yang digunakan berukuran panjang 2-4 cm

dimasukkan ke media yang mengandung konsentrasi bakteri 106 cfu/ml untuk

menentukan patogenisitas. Pengamatan gejala ice-ice diobservasi secara visual

setiap hari. Hasil penelitian menunjukkan bahwa bakteri Stenotrophomonas

maltophilia memunculkan gejala ice-ice paling cepat yakni lima jam pascainfeksi, dan Vibrio alginolyticus paling lambat yakni 44 jam pascainfeksi. Selanjutnya,

S.maltophilia juga menghasilkan jumlah titik bleaching paling banyak yakni 17

titik, meskipun luas area bleaching 1.87 mm2 masih lebih kecil dibanding

V.alginolyticus. Dari tiga analisis dibuat dalam bentuk skala atau scoring tingkat

keparahan dan menunjukkan S.maltophilia sebagai bakteri paling ganas dalam

menyebabkan penyakit ice-ice. Penelitian ini adalah yang pertama melaporkan

bakteri S.maltophilia dikaitkan dengan timbulnya penyakit ice-ice pada

K.alvarezii, dan mungkin bermanfaat untuk ketahanan rumput laut terhadap penyakit ice-ice.

Kata kunci: patogenisitas, bakteri, mikropropagul, K.alvarezii, histologi

IN VITRO PATHOGENICITY ASSAY FOR ICE-ICE CAUSED

BACTERIA ON MICROPROPAGULE

Kappaphycus alvarezii

Abstract

As found in previous study, there were 8 species of bacteria that may associate to ice-ice disease. This study aimed to test the pathogenicity of those isolates on

micropropagul seaweed K.alvarezii in inducing ice-ice symptoms based on

clinical symptoms, visual morphology and histology, and to analyze the ice-ice disease transmission based on time of occurrence. Analysis was conducted by time early emerging ice-ice disease, the number of spots and the width area of bleaching in the end of experiment. Micropropagules of 2-4 cm in length were

soaked in seawater containing 106 cfu/ml bacteria to determine the pathogenicity.

Onset of ice-ice symptoms was visually observed every day. The results showed

(37)

maltophilia (5 hours post challenged), while the slowest was by V. alginolyticus

(44 hours post challenged). Furthermore, S.maltophilia also produced the highest

of number of bleaching spot was 17 spot, while wide of bleaching area smaller

was 1.87 mm2 than V. alginolyticus. Based on third of analysis, we arranged the

level of severity and concluded that S.maltophilia as causative agent on ice-ice

disease. This is the first study reporting S. maltophilia linked to ice-ice disease in

K.alvarezii, and this bacterium might be useful towards generation of ice-ice resistance seaweed.

Keywords: patogenisity, bacterai, micropropagule, K. alvarezii, histology

3.1 Pendahuluan

Patogen adalah mikroorganisme yang mampu menyebabkan penyakit pada tumbuhan, dan hewan. Patogenisitas adalah kemampuan untuk menghasilkan penyakit pada organisme inang. Ada dua mekanisme yang mendasari bakteri patogen dapat menyebabkan penyakit, yakni: (1) invasif, yaitu kemampuan untuk menyerang jaringan. Invasif mencakup mekanisme untuk kolonisasi (multiplikasi awal), produksi zat ekstraseluler yang memfasilitasi invasi (invasins) dan kemampuan untuk memotong atau mengatasi mekanisme pertahanan inang; (2) toksigenesis, adalah kemampuan untuk menghasilkan racun. Bakteri dapat menghasilkan dua jenis racun yang disebut eksotoksin dan endotoksin. Eksotoksin diekskresikan oleh mikroorganisme yang dapat menyebabkan kerusakan pada inang dengan menghancurkan sel-sel atau mengganggu metabolismenya. Sementara itu, endotoksin adalah toksin pada bakteri Gram negatif berupa lipopolisakarida pada membran luar dari dinding sel yang pada keadaan tertentu bersifat toksin pada inang tertentu.

Kemampuan bakteri patogen dalam menyebabkan penyakit ditentukan

oleh faktor virulensinya (Gal Mor & Finlay 2006, Hochhut et al. 2005; Fernandez

2011). Faktor virulensi bakteri dapat dikelompokkan ke dalam 7 kelompok: (a) faktor adhesi yang memungkinkan bakteri untuk melekat ke permukaan inang dan

untuk memulai proses infeksi; (b) siderophores yang memungkinkan akuisisi the

essential element iron; (c) eksotoksin atau cytolysins, yang menghancurkan atau mempengaruhi fungsi sel-sel eukariotik; (d) gen invasi, yang memediasi masuknya bakteri ke dalam sel eukariotik; (e) sistem sekresi yang memberikan protein efektor bakteri untuk mampu memodulasi fungsi inang; (f) mekanisme pertahanan yang memungkinkan bakteri mampu hidup pada lingkungan yang tidak menguntungkan untuk jaringan inang, dan (g) mekanisme mengelak yang memungkinkan bakteri bertahan hidup dan mengatasi mekanisme pertahanan

bawaan dan adaptif inang (Gal Mor & Finlay 2006, Hochhut et al. 2005).

Sampai saat ini mekanisme patogenisitas bakteri terkait penyakit ice-ice

pada rumput laut K. alvarezii belum banyak dilaporkan. Yang sudah dilaporkan

adalah patogenisitas bakteri terkait dengan luka dan gejala bleaching pada rumput

laut Laminaria religiosa (Vairappan et al. 2001), dan patogenisitas bakteri yang

dikaitkan dengan penurunan bobot tubuh dan kandungan karaginan pada rumput

Figur

Gambar 1.  Diagram alir kaitan antar tahap penelitian disertasi ini
Gambar 1 Diagram alir kaitan antar tahap penelitian disertasi ini . View in document p.23
Tabel 1. Biokimia dan karakteristik fisiologis isolat bakteri dari rumput laut K. alvarezii
Tabel 1 Biokimia dan karakteristik fisiologis isolat bakteri dari rumput laut K alvarezii . View in document p.29
Tabel 2. Persentase kemiripan sekuen nukleotida gen 16S rRNA isolat bakteri dari rumput laut K
Tabel 2 Persentase kemiripan sekuen nukleotida gen 16S rRNA isolat bakteri dari rumput laut K. View in document p.31
Gambar 2.  Pohon filogenetik berdasarkan sekuen nukleotida gen 16S rRNA isolat
Gambar 2 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen nukleotida gen 16S rRNA isolat . View in document p.33
Gambar 4. Awal munculnya serangan ice-ice pada mikropropagul K. alvarezii
Gambar 4 Awal munculnya serangan ice ice pada mikropropagul K alvarezii . View in document p.40
Gambar 5. Jumlah titik dan luas bleaching pada mikropropagul pascainfeksi
Gambar 5 Jumlah titik dan luas bleaching pada mikropropagul pascainfeksi . View in document p.41
Gambar 6. Morfologi mikropropagul pascainfeksi bakteri penyebab ice-ice pada
Gambar 6 Morfologi mikropropagul pascainfeksi bakteri penyebab ice ice pada . View in document p.44
Gambar 7.  Histologi mikropropagul rumput laut Kappaphyucus alvarezii
Gambar 7 Histologi mikropropagul rumput laut Kappaphyucus alvarezii . View in document p.45
Gambar 8.  Segmen talus (lingkar kuning) rumput laut K. alvarezii. (1) Talus
Gambar 8 Segmen talus lingkar kuning rumput laut K alvarezii 1 Talus . View in document p.51
Gambar 9.  Perubahan kondisi morfologi talus rumput laut pascainfeksi bakteri pada suhu 25 oC (A) dan 28 oC (B)
Gambar 9 Perubahan kondisi morfologi talus rumput laut pascainfeksi bakteri pada suhu 25 oC A dan 28 oC B . View in document p.56
Gambar 10.  Histologi talus yang terserang ice-ice pada suhu inkubasi 25 oC (I)
Gambar 10 Histologi talus yang terserang ice ice pada suhu inkubasi 25 oC I . View in document p.58
Gambar 11.  Perubahan kondisi morfologi talus rumput laut pascainfeksi bakteri pada salinitas 28 g/L (A), 30 g/L (B), dan 35 g/L (C)
Gambar 11 Perubahan kondisi morfologi talus rumput laut pascainfeksi bakteri pada salinitas 28 g L A 30 g L B dan 35 g L C . View in document p.60

Referensi

Memperbarui...