TEKNIK ISOLASI DAN ELEKTROFORESIS DNA TOTAL PADA TANAMAN UBI KAYU (Manihot esculenta Crantz.) GENOTIPE ROTI DAN MENGGALO
Nur Ocvania1, Dewi Indriyani Roslim2, Herman2
1
Mahasiswa Program S1 Biologi
2
Dosen Bidang Genetika Jurusan Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Riau Kampus Bina Widya Pekanbaru, 28293, Indonesia
nur_ocvania@yahoo.com
ABSTRACT
Cassava (Manihot esculenta Crantz.) is a wellknown plant in the world, especially in tropical countries. In Indonesia, cassava is the third primary food after rice and corn. Province of Riau has several varieties of cassava that have the potential to be developed and they are distributed in several districts such as Kampar and Siak. However, their DNA is not yet analized. The objective of this study was to isolate the total DNA of Roti and Menggalo cassava genotypes. The isolation of total DNA was conducted by taking 200 mg of cassava leaves. The DNA was isolated using modified Cethyl
Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) method. The total DNA were then migrated in
1.2% agarose gel to know the quantity and quality of total DNA obtained. The total DNA of Roti and Menggalo genotypes that obtained in this study showed good quality with thick band, intact and not smear. The quantity ranged from 500-667 ng/µl.
Keywords: Isolation, electrophoresis, cassava, DNA ABSTRAK
Ubi kayu (Manihot esculenta Crantz.) merupakan tanaman yang sangat populer di seluruh dunia, khususnya di negara-negara tropis. Ubi kayu di Indonesia merupakan makanan pokok ketiga setelah padi dan jagung. Provinsi Riau memiliki beberapa varietas ubi kayu yang berpotensi untuk dikembangkan dan tersebar di beberapa Kabupaten di antaranya Kampar dan Siak, akan tetapi belum pernah dilakukan analisis terhadap DNAnya. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi DNA total dari ubi kayu genotipe Roti dan Menggalo. Isolasi DNA total dilakukan dengan mengambil daun ubi kayu sebanyak 200 mg. Isolasi DNA total menggunakan metode Cethyl Trimethyl
Ammonium Bromide (CTAB) yang dimodifikasi. Setelah itu DNA total dimigrasikan
pada 1,2% gel agarose untuk mengetahui kuantitas dan kualitas DNA total yang diperoleh. DNA total ubi kayu genotipe Roti dan Menggalo yang diperoleh pada penelian ini menunjukkan kualitas relatif baik karena pita DNA total yang tebal, utuh dan tidak smear. Kuantitas molekul DNA total berkisar 500-667 ng/µl.
PENDAHULUAN
Ubi kayu (Manihot esculenta
Crantz.) merupakan tanaman
monoecious, dikotiledon, dan tergolong
ke dalam famili Euphorbiaceae. Ubi kayu merupakan salah satu tanaman yang dapat tumbuh sepanjang tahun (perennial) di daerah tropis. Tanaman ubi kayu merupakan tanaman penghasil karbohidrat yang dapat menjadi sumber energi. Selain itu, ubi kayu juga mengandung vitamin dan mineral. Potensi produksi ubi kayu (kalori perhektar pertahun) merupakan yang tertinggi di antara tanaman tropis lainnya. Jumlah produksi ubi kayu di Indonesia tahun 2010 diketahui sebesar 23.908.459 ton dengan luas area panen 1.182.604 ha (BPS 2010). Indonesia merupakan negara penghasil ubi kayu terbesar ke tiga setelah Brazil dan Thailand (FAO 2009).
Ubi kayu tergolong tanaman yang memiliki daya adaptasi yang tinggi terhadap berbagai kondisi tanah, seperti miskin hara, asam, dan kering, masih mampu tumbuh dan berproduksi pada lahan kurang subur ketika tanaman lain tidak tumbuh (Scott et al. 2000; Odubanjo et al. 2011; OECD 2014). Oleh karena itu, ubi kayu berpotensi untuk dikembangkan sehingga dapat mendukung program ketahanan pangan nasional yang berkelanjutan. Usaha pengembangan ubi kayu membutuhkan varietas ubi kayu yang memiliki karakter tertentu, seperti memiliki kadar pati yang tinggi, rasa yang tidak pahit atau kandungan HCN yang rendah, serta sifat toleran terhadap cekaman abiotik dan biotik.
Kajian karakteristik mendalam dari ubi kayu sangat perlu dilakukan
mengingat potensinya yang besar serta adaptasi yang tinggi terhadap berbagai kondisi lingkungan yang umum dijumpai di Provinsi Riau. Salah satunya, yaitu dengan mengisolasi DNA total pada ubi kayu yang dapat digunakan sebagai stok untuk penelitian analisis genetik seperti keanekaragaman genetik.
METODE PENELITIAN
Penelitian dilakukan pada bulan Maret 2014 - Januari 2015 di Laboratorium Genetika Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Universitas Riau. Alat yang digunakan adalah tabung 50 ml, tabung mikro berukuran 1,5 ml, rak tabung mikro, pipet mikro berukuran 10 µl, 100 µl, dan 1000 µl, tip, gunting, pinset, mortar dan pestel, spatula,
waterbath, mesin sentrifus, perangkat
elektroforesis horizontal, timbangan analitik, aluminium foil, hot plate, stirer, kamera, UV transluminator. Bahan yang digunakan adalah ubi kayu koleksi Laboratorium Genetika yang ditanam di kebun Jurusan Biologi, Universitas Riau yang berasal dari Kampar (Roti) dan Siak (Menggalo). Bahan kimia yang digunakan adalah nitrogen cair, buffer CTAB (dH2O; 1 M Tris-HCL pH 9,0; 5 M NaCl; 0,5 M EDTA pH 8,0; 4 M ß-mercaptoetanol; CTAB 2%), kloroform, fenol, isopropanol, etanol 70%, buffer TE (dH2O; 1 M Tris-HCL pH 8,0; 0,5 M EDTA pH 8,0), 1× buffer TBE (Tris-Borate; EDTA), etidium bromida,
loading dye, gel agarose 1,2%, dan 1 kb
a. Isolasi DNA Total
Isolasi DNA dilakukan setelah tanaman ubi kayu berumur dua bulan. Prosedur isolasi DNA menggunakan metode Cethyl Trimethyl Ammonium
Bromide (CTAB) yang dimodifikasi
(Saghai-Maroof et al. 1984). Daun pucuk ubi kayu diambil dari enam tanaman, lalu ditimbang sampai 200 mg kemudian dipotong halus menggunakan gunting, dimasukkan ke dalam mortar dan ditambahkan nitrogen cair secukupnya, lalu digerus sampai halus. Hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung berukuran 50 ml yang baru dan steril, kemudian ditambahkan 1 volume buffer CTAB, lalu tabung diinkubasi pada suhu 65oC di waterbath selama 90 menit, setiap 10 menit tabung dibolak-balik secara perlahan, kemudian sampel didinginkan pada suhu ruang.
Setelah dingin ditambahkan 1 volume kloroform, lalu dibolak-balik sampai homogen selama ± 10 menit. Sentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit. Setelah disentrifus akan ada dua fase, yaitu fase cair (supernatan) dan fase padat (pelet). Fase cair diambil dan dimasukkan ke dalam tabung 1,5 ml yang baru dan steril. Selanjutnya ditambahkan 1 volume isopropanol, lalu dibolak-balik sampai terbentuk benang-benang DNA yang berwarna putih.
Disentrifus kembali dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit, kemudian fase cair dibuang dan fase padat yang mengandung DNA didasar tabung dikeringkan pada suhu 37°C atau pada suhu ruang. Setelah kering ditambahkan 500 µl buffer TE pH 8,0 kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama semalam.
Setelah itu volume DNA diperbesar dengan penambahan 200 µl buffer TE pH 8,0 lalu ditambahkan 700 µl fenol. Campuran tersebut dihomogenkan dengan cara dibolak-balik secara perlahan selama 10 menit, lalu disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit. Larutan DNA pada fase cair bagian atas dipindahkan ke dalam tabung 1,5 ml yang baru dan steril. Kemudian ditambahkan 0,8 volume isopropanol lalu tabung kembali dibolak-balik hingga terbentuk benang-benang DNA yang berwarna putih. Tabung disentrifus kembali dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit. Selanjutnya DNA yang terdapat didasar tabung pada fase padat dikeringkan pada suhu 37°C atau pada suhu ruang, kemudian endapan DNA dibilas dengan etanol 70% sebanyak 500 µl, lalu dibolak-balik kemudian dikeringkan. Setelah kering ditambahkan 100 µl buffer TE pH 8,0 untuk melarutkan DNA kembali. Larutan DNA total disimpan pada suhu -20°C, sedangkan larutan DNA kerja dengan konsentrasi 100 ng/µl disimpan pada suhu 4°C. b. Elektroforesis DNA Total
Molekul DNA total diperiksa kualitas dan kuantitasnya melalui proses elektroforesis (Fison Mode FEC 360,
Large Horizontal Gel System), yaitu
dengan memigrasikannya pada gel agarose 1,2% dalam 1× buffer TBE pH 8,0 pada 75 Volt selama 30 menit. Gel hasil elektroforesis diwarnai dengan 4 µg/ml etidium bromida, lalu divisualisasikan diatas lampu UV (WiseUv WUV-M20, Daihan Scientific) dan difoto menggunakan kamera (Olympus SP-500 UZ).
HASIL DAN PEMBAHASAN Molekul DNA Total
Cethyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) merupakan metode
yang umum digunakan dalam isolasi DNA tanaman yang banyak mengandung polisakarida dan senyawa polifenol (Ardiana 2009). Ada tiga langkah utama dalam isolasi DNA, yaitu lisis dinding sel dan membran sel, purifikasi serta presipitasi (Surzycki 2003).
Pada penelitian ini proses pemecahan dinding sel dilakukan dengan mortar dan pestel ditambah nitrogen cair. Penambahan nitrogen cair bertujuan untuk mempermudah penggerusan dan menjaga DNA agar tidak mengalami kerusakan. Buffer CTAB berfungsi untuk mendegradasi dinding sel, membran plasma, dan membran inti sehingga semua isi sel dapat keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstraksi.
Purifikasi DNA dilakukan menggunakan kloroform dan fenol, yang merupakan pelarut organik yang berfungsi sebagai pendenaturasi protein, sedangkan DNA dan RNA tidak terdenaturasi karena molekul ini tidak larut di dalam pelarut organik. Purifikasi DNA juga dilakukan dengan sentrifus, yang akan memisahkan molekul berdasarkan ukurannya.
Selanjutnya dilakukan presipitasi DNA dengan menggunakan isopropanol yang akan mengendapkan DNA, sehingga DNA menggumpal membentuk struktur fiber, dan kemudian terbentuk pelet setelah dilakukan sentrifus. Pada saat isopropanol dibuang dan pelet dikeringanginkan, maka pelet yang
tersisa dalam tabung adalah DNA pekat. Setelah itu pelet DNA dibilas dengan etanol 70%, lalu etanol dibuang dan pelet dikeringanginkan, perlakuan tersebut bertujuan untuk menghilangkan residu pelarut yang digunakan pada tahap sebelumnya dari pelet DNA. Tahapan terakhir ditambahkan buffer TE, yang berfungsi sebagai pelarut DNA dan melindungi DNA dari enzim nuklease agar DNA tidak mudah rusak.
Molekul DNA total yang diperoleh dari hasil isolasi, selanjutnya dilakukan pengecekan kualitas dan kuantitas DNA dengan teknik elektroforesis. Elektroforesis adalah teknik memigrasikan partikel bermuatan di bawah pengaruh medan listrik dalam kondisi yang konstan. Elektroforesis DNA akan memisahkan sampel DNA berdasarkan ukuran dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan adalah agarose yang merupakan polisakarida turunan yang berasal dari alga merah. Elektroforesis gel agarose dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA yang berukuran 200-50.000 bp, sedangkan untuk memisahkan DNA dengan ukuran lebih pendek yang berkisar 5-500 bp dapat digunakan gel poliakrilamid (Green & Sambrook 2012). Molekul DNA bermuatan negatif, sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Semakin besar ukuran molekulnya, semakin rendah laju migrasinya (Fairbanks & Andersen 1999). Ukuran atau berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan cara membandingkan laju migrasi fragmen DNA dengan laju migrasi DNA ladder yang telah diketahui ukurannya.
Fragmen DNA hasil elektroferesis dapat divisualisasikan dengan beberapa cara, yaitu dengan penambahan etidium bromida ke dalam gel sewaktu pembuatannya atau dengan cara gel direndam di dalam larutan etidium bromida sebelum divisualisasikan di bawah UV transluminator. Etidium bromida merupakan pewarna mutagenik yang akan berikatan dengan bagian basa dari DNA dan menyebabkan transmisi sinar UV menjadi dapat dilihat (Surzycki 2003).
Hasil elektroforesis keenam sampel ubi kayu yang diuji menunjukkan pita yang dihasilkan baik. Hal ini ditandai dengan pita yang tebal, utuh dan tidak
smear (Gambar 1). Pita DNA yang tebal
menunjukkan konsentrasi DNA total yang diperoleh cukup tinggi, yaitu sekitar 500-667 ng/µl.
Gambar 1 Profil pita DNA total ubi kayu menggunakan 1,2% gel agarose. (A) Ubi kayu genotipe Roti dan (B) Ubi kayu genotipe Menggalo.
Keterangan: (M)
GeneRulerTM 1 kb DNA
ladder (Thermo Scientific);
(1-3) Sampel ubi kayu KESIMPULAN
Sebanyak enam sampel ubi kayu telah berhasil diisolasi dari Kabupaten Kampar dan Siak, Provinsi Riau. Kuantitas DNA berkisaran antara 500-667 ng/µl. Kualitas molekul DNA total yang diperoleh baik, yaitu ditandai dengan pita yang tebal, utuh dan tidak
smear. Molekul DNA total ubi kayu
dapat digunakan sebagai DNA cetakan pada berbagai analisis genetik seperti analisis keanekaragaman genetik.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada SIMLITABMAS DIKTI yang telah mendanai penelitian ini melalui Hibah Penelitian Fundamental tahun kedua 2015 atas nama Dr. Dewi Indriyani Roslim, M.Si.
DAFTAR PUSTAKA
Ardiana DW. 2009. Teknik isolasi DNA genom tanaman pepaya dan jeruk dengan menggunakan modifikasi buffer CTAB.
Buletin Teknik Pertanian
14(1):12-16.
[BPS] Badan Pusat Statistik Republik Indonesia. 2010. Luas panen produktivitas tanaman ubi kayu
seluruh provinsi.
http://www.bps.go.id [25 Mei 2014].
Fairbanks DJ, Andersen WR. 1999.
Genetics: The Continuity of Life. New York: Brooksdole
Publishing Company.
[FAO] Food and Agriculture Organization of The United Nations. 2009. Food outlook. Global market analysis: Cassava. http://www.fao.org [26 September 2014].
Green MR, Sambrook J. 2012.
Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. 4th ed.
New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Odubanjo OO, Olufayo AA, Oguntunde PG. 2011. Water use, growth, and yield of drip irrigated cassava in a humid tropical environment. Soil & Water Res 6(1):10–20.
[OECD] Organisation for Economic Co-operation and Development. 2014. Consensus document on the biology of cassava (Manihot
esculenta Crantz.). Series on harmonisation of regulatory oversight in biotechnology No.
57. OECD. Paris.
http://www.oecd.org/biotrack [14 Januari 2015].
Saghai-Maroof MA, Solimah KM, Jorgensen RA, Allard RW. 1984. Ribosomal DNA spacer length polymorphisme in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and population dynamics. Proc Natl
Acad Sci 81:8014-8018.
Scott GJ, Best R, Rosegrant M, Bokanga M. 2000. Roots and tubers in
the global food system: A vision. Statement to the year 2020. Lima, Peru: A
co-publication of The International Potato Center, Centro Internacional de Agricultura Tropical, International Food Policy Research Institute, International Institute of Tropical Agriculture and International Plant Genetic Resources Institute.
Surzycki S. 2003. Human Molecular
Biology Laboratory. USA: Blackwell Science Ltd.
