Yahdiana Har ahap, Har mita, Binsar Simanjuntak Depar temen Far masi, FM IPA-UI, Kampus UI Depok 1 6 4 2 4
O PTIM ASI PEN ETAPAN KADAR
AKRILAM IDA YAN G DITAM BAHKAN
KE DALAM KERIPIK KEN TAN G
SIM ULASI SECARA KRO M ATO GRAFI CAIR
KIN ERJA TIN GGI
Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. II, No.3, Desember 2005, 154 - 163 ISSN : 1693-9883
ABSTRACT
A method by high performance liquid chromatography for the analysis of acrylamide in potato chips, is reported. The retention time for the elution of acrylamide from the C18RP column ranged from 3 to 3,2 minutes, and the eluate was analyzed by UV -V IS detector. A linear response was found for the acrylamide standard tested within the concentration range of 0,8 – 10µg/ml and the corelation coefficient (r) greater than 0,999, with detection limit 0,06 ppm and quantitative limit 0,19 ppm. Sample prepa-ration was performed by means of solvent extraction using dichlormethane and subse-quent re-extraction of the organic solvent with water. This aqueous sample solution was found to be free of any interferences and gave acrylamide and recorveries higher than 90% .
Key words : acrylamide; high performance liquid chromatography; potato chips; dichlormethane.
daging sapi dan ayam, juga meng-hasilkan akrilamida dalam jumlah yang lebih kecil (Gruenwedel, Dieter. Whitaker, John, 1984).
A krilam id a terd ap at d alam makanan bukan karena cemaran dari luar, tetapi disebabkan pemanasan asam amino dan gula yang terdapat dalam makanan pada suhu tinggi (di atas 120ºC). Asparagin yang merupa-kan asam amino utama dalam ken-tang d an memiliki struktur yang mirip d engan akrilamid a d id uga sebagai senyaw a yang paling ber-PEN D A HULUA N
A . LA TA R BELA KA N G
p eran d alam p embentukan akri-lamida.
W o rld H ealth O rg aniz atio n (W HO) memutuskan bahw a akri-lamida bersifat karsinogenik (toksik terhadap materi genetik dalam sel). A krilamida dapat diabsorpsi pada saluran gastro intestinal, d id istri-busikan secara luas oleh cairan tubuh d an d ap at m enem bus m em bran plasenta. Senyaw a ini juga neuro -toksik (-toksik terhadap sel saraf), dan secara o ral mening katkan risiko kanker skrotal, tiroid, tumor adre-nal pada tikus jantan dan mening-katkan risiko kanker mammae, tiroid, dan tumor uterin pada tikus betina. Enviro nmental Pro tectio n A gency m eng klasifikasikan akrilam id a sebagai senyawa yang kemungkinan bersifat karsino g enik terhad ap manusia.
Dari pernyataan di atas, dapat d isim p ulkan bahw a akrilam id a berbahaya untuk dikonsumsi. Hal ini meng khaw atirkan, karena p eng -gemar makanan tersebut di atas jum-lahnya banyak, terutama kalangan remaja dan anak-anak. Makanan jenis ini sebenarnya juga tidak sehat untuk d iko nsumsi karena meng and ung karbohidrat dan lemak dalam jumlah berlebih.
Di Indonesia, masalah ini belum mend apat perhatian yang berarti. Penelitian tentang akrilamida dalam makanan dan berita di media massa masih sedikit. A nalisis akrilamida d alam makanan sebenarnya telah bany ak d ilakukan o leh p eneliti m ancaneg ara d eng an berbag ai
metode. Metode yang telah diguna-kan antara lain kolorimetri, kroma-to g rafi g as, kro m akroma-to g rafi g as spektrofotometri massa, dan kroma-tografi cair spektrofotometri massa. A nalisis y ang ad a umumny a menggunakan peralatan yang mod-ern, sulit didapatkan, dan meto de yang kompleks, sehinga dibutuhkan biaya dan keahlian yang tinggi. Oleh karena itu diperlukan metode yang lebih sederhana dan relatif murah tetapi dapat memberikan hasil yang baik.
Pada penelitian ini, dilakukan analisis akrilamida yang ditambah-kan pad a keripik kentang blanko secara kro m ato g rafi cair kinerja tinggi dengan menggunakan detek-tor UV-VIS. Akrilamida pada keripik kentang diekstrasi dengan diklo r-m etan (r-m eng and ung etano l 2% ) untuk m enarik akrilam id a d an memisahkannya dari senyawa polar yang lain. Diklo rmetan d icampur dengan air, kemudian dipanaskan pada suhu 700C sampai diklormetan menguap semua sehingga akrilamida d ap at d ip isahkan sari seny aw a organik pengganggu lainnya, agar diperoleh hasil yang tepat.
B. TUJUA N PEN ELITIA N
menghasilkan meto de yang relatif lebih murah dan cara kerja yang lebih sederhana.
C. BA HA N D A N CA RA KERJA
BA HA N
A krilam id a, reag en g rad e, Merck; Metanol, pro analisis, Merck; A seto nitril, p ro analisis, M erck; A quabidest, Ikapharmindo; Diklor-metan, pro analisis, Merck; Etanol, pro analisis, Merck; Asam fosfat 85%, Merck; Kentang; dan Bumbu kentang goreng
A LA T
HPLC Shimadzu model LC-6A yang d ilengkapi d engan d etekto r UV-Vis SPD-6AP, kolom C18 = 25 cm x 4,6 mm, 5µm dan pemroses data Class C-R4A; Syringe, Hamilton Co, N ev ad a; Filter eluen d an samp el 0,45µm Whatman; Pengaduk ultra-so nik Branultra-so n 3200; Penangas air; Labo rato ry Shaker, d an A lat-alat kimia.
CA RA KERJA
1. Pem buatan larutan stand ar akrilamida
Sebanyak 25,0 mg standar akri-lam id a d itim bang seksam a d an dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0 ml. Standar akrilamida dilarutkan dengan asam fosfat 10% sampai batas (larutan A). Sebanyak 1,0 ml larutan A dipipet dan dimasukkan ke dalam
labu ukur 25,0 ml kemudian ditam-bahkan d eng an asam fo sfat 10% sampai batas (larutan B). Larutan standar akrilamida konsentrasi 1,2,6, dan 10 ppm dibuat dengan meng-encerkan larutan B d engan asam fosfat 10%.
Sebanyak 20,0 mg standar akri-lam id a d itim bang seksam a d an dimasukkan ke dalam labu ukur 100,0 ml. Standar akrilamida dilarutkan dengan asam fosfat 10% sampai batas (larutan C). Sebanyak 1,0 ml larutan C dipipet dan dimasukkan ke dalam labu ukur 25,0 ml kemudian ditam-bahkan d eng an asam fo sfat 10% sampai batas (larutan D). Larutan standar akrilamida dengan konsen-trasi 0,4, 0,8, 4, dan 8 ppm dibuat d engan mengencerkan larutan D dengan asam fosfat 10%.
2. Pembuatan kurva serapan akri-lamida
Kurva serapan larutan standar akrilamid a 10 p p m d ibuat meng-gunakan spektrofotometer UV-VIS antara panjang gelombang 190 nm sampai 300 nm dengan blangko asam fosfat 10%.
3. Mencari ko nd isi analisis o pti-mum
yang tinggi dan waktu retensi yang relatif singkat.
Ko nd isi aw al perco baan yang digunakan :
Kolom : C18
Dimensi kolom : 25 cm x 4,6 mm, 5µm
Detektor : UV-VIS
Fase gerak : Asetronitril-Asam-Asam Fosfat (5:94:1)
Kecepatan alir : 1,0 ml/ menit Panjang gelombang : 230 nm 4. Uji keterulangan
Sebanyak 20 µl larutan standar 10 ppm disuntikkan ke dalam kolom menggunakan fase gerak dan kece-p atan alir y ang terkece-p ilih, d iulang sebanyak 6 kali, kemudian dicatat luas p uncakny a d an d ihitung koefisien variasinya.
5. Pengujian batas deteksi dan batas kuantitasi
Batas deteksi dan batas kuan-titasi dihitung secara statistik melalui g aris reg resi linier d ari kurv a kalibrasi. N ilai p engukuran akan sama dengan nilai b pada garis linier Y = aX + b, sedangkan simpangan baku blang ko sama d eng an sim-pangan baku residual Sy/ x
6. Pembuatan kurva kalibrasi Larutan standar 0,8, 1,2 , 6, dan 10 ppm masing-masing disuntikkan sebanyak 20 µl ke dalam kolom pada kondisi terpilih. Luas puncak yang diperoleh dicatat dan dibuat kurva perbandingan luas puncak dengan konsentrasi larutan.
7. Pembuatan keripik kentang blangko
Kulit kentang dikupas dan diiris tipis, kemudian dipanaskan dalam oven, 1000C sampai kentang menjadi reny ah (kurang lebih tig a jam ). Kentang digerus sampai halus kemu-dian diberi bumbu kentang goreng secukupnya.
8. Uji perolehan kembali (aku-rasi)
D . HA SIL D A N PEM BA HA SA N
HA SIL PERCO BA A N 1. Spektrum Serapan
Akrilamida memberikan serapan maksimum pada panjang gelombang 197 nm dengan pelarut asam fosfat 10%.
2. Kondisi percobaan Kondisi percobaan
Kolom : C18RP, 25 cm x 4.6 mm, 5mm, Supelco
Detekto r : UV-VIS SPD-6A P, Shimadzu
Pompa : LC-6A, Shimadzu Fase gerak : Asetronitril : Asam : Asam Fosfat (5:94:1)
Pelarut : Asam fosfat 10% Panjang gelombang : 230 nm
Kecepatan alir : 1,2 ml/ menit Volume injeksi : 20 µl
3. Batas Deteksi dan Batas Kuan-titasi
Batas deteksi untuk akrilamida adalah 0,06 ppm, sedangkan batas kuantitasiny a ad alah 0,19 p p m dengan volume penyuntikkan 20 µl. 4. Uji keterulangan (Presisi)
Hasil uji keterulangan untuk akrilamida dengan ko nsentrasi 10 ppm adalah 0.63%.
5. Kurva kalibrasi (Linieritas) Kurva kalibrasi akrilamida : Persamaan garis :
Y = 23636,5055X + 51,7911 Koefisien korelasi (r) : 0,99999
Gambar 1. Kromatogram akrilamida 6 ppm dengan fase gerak asetonitril-air-asam
Gambar 2. Kromatogram keripik kentang blangko dengan fase gerak
asetronitril-air-asam fosfat (5:94:1), pelarut asam fosfat 10%, volume penyuntikan 20 µl dan laju alir 1,2 ml/menit
Gambar 3. Kromatogram akrilamida yang ditambahkan ke dalam keripik kentang
6. Uji perolehan kembali (Akurasi)
Hasil uji perolehan kembali akrilamida rata-rata : 96,93% ± 0,52%.
PEM BA HA SA N
Pada penelitian ini ditentukan meto d e analisis akrilamid a y ang d itam bahkan ke d alam kerip ik kentang simulasi secara kromatografi cair kinerja tinggi. Sebenarnya, telah banyak metode yang dikembangkan oleh peneliti mancanegara, seperti kromatografi gas, kromatografi gas spektrofotometri massa, dan kroma-tografi cair spektrofotometri massa. Analisis ini umumnya menggunakan peralatan yang modern, sulit dida-patkan, dan metode yang kompleks. Meto de kero mato grafi cair kinerja tinggi dipilih karena w aktu anali-sisnya cepat, cara kerjanya sederhana, dan relatif murah.
Detektor yang digunakan pada penelitian ini adalah detektor UV-VIS. Akrilamida mempunyai gugus kromofor (gugus yang mempunyai ikatan rangkap berko njugasi) d an
gugus auksokrom (gugus yang me-m iliki p asang an elektro n bebas) sehing g a d ap at terjad i transisi elektro nik w alaupun lemah. Pad a pembuatan spektrum serapan akri-lamida diperoleh panjang gelombang maksimumnya 197 nm.
Pad a p enelitian ini tid ak d i-gunakan panjang gelombang 197 nm tetapi digunakan panjang gelombang 230 nm. Panjang gelombang 230 nm merupakan panjang gelombang yang mendekati panjang gelombang mak-simum d an memberikan ko nd isi analisis yang baik (bebas dari gang-g uan p elarut), tetap i intensitas serapan menjadi lebih lemah yang mengakibatkan berkurangnya kepe-kaan metode ini (intensitas serapan pad a panjang gelo mbang 230 nm kurang lebih sup ersembilan d ari serapan pad a panjang gelo mbang maksimum 197 nm).
Tabel 1. Uji Perolehan Kembali
Konsentrasi Waktu Luas Luas puncak RSD Konsentrasi yang Uji perolehan Sampel (ppm) retensi Puncak rata-rata ( % ) didapatkan (ppm) kembali (%)
8,22 3,061 184481 187432 1,68 7,93 96,47
3,112 187067 3,087 190747
8,27 3,054 189461 189489 0,23 8,01 96,86
3,042 189937 3,091 189070
8,25 3,072 191792 190095 1,39 8,04 97,45
Pada pencarian kondisi analisis d ivariasikan ko mpo sisi eluen d an laju alir. Pada kondisi awal digunakan eluen aseto nitril:air:asam fo sfat (5:94:1). Dari percobaan didapatkan dua puncak pada menit ke 2,9 dan menit 3,7. Puncak pad a menit 3,7 adalah akrilamida, sedangkan puncak pada menit ke 2,9 adalah pelarut. Hal ini ditunjukkan pada penyuntikan pelarut saja hanya terdapat puncak pad a menit ke 2,9. Reso lusi yang dihasilkan adalah 2,29. Kemudian eluen diubah komposisinya menjadi asetronitril:air:asam fosfat (15:84:1), dan dipero leh w aktu retensi akri-lamid a 3,3 menit d engan reso lusi 1,18. Maka dapat disimpulkan bahwa penambahan asetonitril akan mem-percepat w aktu retensi akrilamida d an memperlambat w aktu retensi pelarut, sehingga resolusi yang di-hasilkan semakin kecil, bahkan di baw ah 1,5 (nilai minimum resolusi yang masih dikatakan baik (Snyder LR, Kirkland JJ, Glajch JL. 1997).
Eluen asetronitril:air:asam fosfat (5:94:1) dipilih sebagai eluen yang digunakan pada analisis karena reso-lusinya yang lebih baik dan peng-gunaan asetonitril yang lebih sedikit sehingga biaya relatif lebih murah. Pad a eluen ini d iv ariasikan laju alirnya. Laju alir 1 ml/ menit mem-berikan resolusi 2,29 dengan w aktu retensi 3,7 menit, laju alir 0.8 ml/ m enit m em berikan reso lusi 2,69 dengan waktu retensi 4,5 menit, dan laju alir 1,2 ml/ menit memberikan resolusi 2,21 dengan waktu retensi 3,1 menit. Laju alir 1,2 ml/ menit dipilih
karena memberikan w aktu analisis yang singkat dengan resolusi yang masih baik (reso lusi d i atas 1,5) (Snyder LR, Kirkland JJ, Glajch JL. 1997).
Dari hasil uji keterulangan, di-peroleh koefisien variasi akrilamida dengan konsentrasi 10 ppm sebesar 0,63%. Dengan nilai koefisien variasi di bawah 2% maka dapat disimpul-kan bahw a m eto d e analisis ini memberikan hasil y ang seksama (Snyder LR, Kirkland JJ, Glajch JL. 1997).
Dari pembuatan kurva kalibrasi, d ip ero leh p ersam aan g aris Y = 51,7911 + 23636,5055X d eng an ko efisien ko relasi 0,99999. Hal ini menunjukkan bahwa kurva kalibrasi akrilamid a memberikan linieritas yang baik, sehingga penetapan kadar d eng an kurv a kalibrasi terjamin kebenarannya (Snyder LR, Kirkland JJ, Glajch JL. 1997).
Batas deteksi untuk akrilamida adalah 0,06 ppm, sedangkan batas kuantitasiny a ad alah 0,19 p p m dengan volume penyuntikan 20 µl. Perhitungan dilakukan secara sta-tistik melalui garis linier dari kurva kalibrasi. Penentuan batas deteksi dan batas kuantitasi sangat tergan-tung kepada nilai b yang menggam-barkan galat sistematis. Jika nilai b < 0, m aka batas d eteksi d an kuantitasi akan lebih besar yang berarti metode analisis kurang peka. Cara ini umum digunakan karena lebih sederhana (Ibrahim S., 1998).
simulasi (spiked placebo recovery). Dalam meto d e ini, sejumlah akri-lam id a d itam bahkan ke d aakri-lam keripik kentang blangko, kemudian keripik kentang tersebut dianalisis d an d iband ingkan d engan kad ar akrilam id a y ang d itam bahkan. Kerip ik kentang blang ko ad alah kentang yang tid ak mengand ung akrilam id a. A krilam id a d alam kentang terbentuk pada suhu di atas 1200C, m aka p em buatan kerip ik kentang harus di baw ah suhu ter-sebut.
Pem buatan kerip ik kentang blang ko p ad a p erco baan m eng -gunakan oven dengan suhu 1000C. Penambahan bumbu kentang goreng d imaksud kan supaya simulasi se-mirip mungkin dan faktor yang dapat mengganggu analisis d apat d ike-tahui. (Ibrahim S., 1998; Wedzicha B, Mottram D., 2004).
Keripik kentang blangko yang telah disiapkan (sudah ditambahkan akrilam id a) d iekstraksi d eng an diklormetan menggunakan laboratory shaker selam a tig a p uluh m enit. Diklo rmetan merup akan p elarut organik yang masih dapat melarut-kan akrilamida dan dengan penam-bahan etano l 2% maka kelarutan akrilamida dalam diklormetan dapat bertam bah. Pad a ekstraksi ini d iharapkan penarikan akrilamid a dari kentang tanpa disertai senyawa p o lar lainny a. Filtrat kem ud ian d isaring sehingga d i d alam filtrat hany a terd ap at akrilam id a d an senyaw a organik. Filtrat kemudian ditambahkan air (asam fosfat 10%).
Akrilamida memiliki kelarutan yang besar d alam air, sehing g a d ap at ditarik lagi dari diklormetan tanpa terbaw anya senyaw a organik yang tid ak larut d alam p elarut p o lar. A krilam id a tid ak d ap at d itarik seluruhnya dari dikormetan, karena itu d iklo rmetan d iuapkan sampai habis dan yang tersisa hanya air. Suhu penguapan dilakukan di bawah titik d id ih air d an d i atas titik d id ih d iklo rmetan. Filtrat ini kemud ian d isaring d an d id ap atkan larutan akrilamida yang diharapkan bebas d ari gangguan zat lain (Barnd l F, Demiani S, Ewender J., 2004).
terbentuk dua fase cairan (diklo r-metan pada lapisan baw ah dan air pada lapisan atas). Cairan ini kemu-d ian kemu-d ip anaskan kemu-d an jika kemu-d iklo r-metan menguap, akrilamid a yang terbaw a terlarut kembali di dalam air. Cara ini m eng hasilkan uji perolehan kembali yang didapatkan sekitar 97% , tetap i w aktu y ang dibutuhkan untuk penguapan sangat lama (sekitar 4 sampai 5 jam) (Mar-tin A , Sw arbrick J, Cammarata A ., 1990).
E. KESIM PULA N
KESIM PULA N
1. Metode kromatografi cair kinerja tinggi dalam menganalisis akri-lamida dalam keripik kentang memberikan ko ndisi o ptimum dengan menggunakan kolom C18, 25 cm x 4.6 mm, 5mm, Supelco; D etekto r UV -V IS SPD -6A P, Shimadzu; Pompa LC-6A , Shi-madzu; Fase gerak Asetronitril : A sam : A sam Fo sfat (5:94:1); Pelarut A sam fosfat 10%; Pan-jang gelombang 230 nm; Kece-patan alir 1,2 ml/ menit; Volume injeksi 20 µl.
2. M eto d e ekstraksi akrilamid a dalam keripik kentang simulasi memberikan uji perolehan kem-bali sebesar 96,93% + 0,52%
D A FTA R PUSTA KA
Barndl F, Demiani S, Ew ender J. A Rapid and Convenient Procedure for the D etermination A crylamide in Foodstuffs : 6 halaman. http:/ / ejeaf c he.u v ig o .es/ 1( 3) 2002/ 001132002F.htm 26 Januari 2004, pk.9.15.
Gruenwedel, Dieter. Whitaker, John. Fo o d A nalysis Princip les and Technique v o lume 4, M arcel Dekker Inc, N ew Yo rk, 1984: 247-249.
Ibrahim S. Penggunaan Statistika Dalam Validasi M etode Analitik dan Penerapannya, Pro siding Temu Ilmiah Nasional Bidang Farmasi VI, 1998: 15 – 37.
Martin A , Sw arbrick J, Cammarata A. Farmasi Fisik Dasar-Dasar Kimia Fisik Dalam Ilmu Farmasetik edisi ketiga, terj. dari Physical Pharmacy, oleh Yoshita. UI-Press, 1990: 139-152.
Snyder LR, Kirkland JJ, Glajch JL. Practical HPLC M ethod Develop-ment Second Edition, John Wiley & So ns, Inc, New Yo rk, 1997: 616-712.
