SITOTOKSISITAS EKSTRAK METANOL DAUN SUKUN (Artocarpus altilis), NANGKA (Artocarpus heterophyllus) DAN KLUWIH (Artocarpus camansi)
TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA MCF-7
Pratiwi Widowati dan Haryoto
Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta E-mail : [email protected]
Abstrak
Tanaman genus Artocarpus secara tradisional telah digunakan sebagai obat untuk berbagai penyakit seperti kanker, sirosis, malaria, hipertensi dan diabetes. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas sitotoksik dari ekstrak methanol daun sukun, nangka dan kluwih terhadap sel kanker payudara MCF-7. Penyarian ekstrak dilakukan dengan metode maserasi dan pelarut metanol. Uji fitokimia dilakukan dengan Kromatografi Lapis Tipis menggunakan fase diam silika GF-254 dan fase gerak etil asetat : n-heksan (2:8). Uji aktivitas antikanker dilakukan dengan MTT assay dengan konsentrasi sampel masing-masing sebesar 500, 250, 125, 62,5 dan 31,25 µg/mL. Pembacaan hasil uji menggunakan ELISA reader.Uji fitokimia menunjukkan adanya kandungan senyawa tanin dan alkaloid pada ketiga ekstrak. Hasil uji sitotoksik menunjukkan ketiga ekstrak memiliki aktivitas sitotoksik dengan potensi yang lemah pada sel kanker payudara MCF-7 dengan urutan potensi sukun
> kluwih > nangka dengan nilai IC50 berturut-turut sebesar 120,85 ; 339,46 dan 530,88 µg/mL.
Kata kunci : ekstrak, KLT, sitotoksik, MTT, MCF-7, IC50
PENDAHULUAN
Kanker merupakan penyebab kematian dengan urutan ke-2 di dunia dengan persentase sebesar 13% setelah penyakit kardiovaskular (Kemenkes, 2014). Data IARC (International Agency for Research on Cancer) tahun 2012 menunjukkan kanker payudara merupakan penyakit kanker dengan persentase kasus baru tertinggi, yaitu sebesar 43,3% dan persentase kematian sebesar 12,9%
(Kemenkes, 2015). Pengobatan kanker payudara dengan kemoterapi merupakan pilihan potensial yang banyak dipilih oleh penderita kanker di Indonesia. Namun, pengobatan kanker menggunakan agen kemoterapi mengakibatkan kegagalan pengobatan karena obat cenderung menimbulkan resistensi terhadap sel kanker itu sendiri (Stærk et al., 2002). Eksplorasi bahan herbal merupakan upaya untuk menemukan agen kemoterapi antikanker yang mempunyai daya sitotoksik tinggi dan mempunyai efek samping yang rendah.
Beberapa tanaman yang dapat dikembangkan sebagai agen kemoterapi antikanker adalah tanaman genus Artocarpus (sukun, nangka dan kluwih). Penelitian yang
telah dilakukan menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun sukun (Artocarpus altilis) mengandung sejumlah flavonoid yaitu geranyl dihydrochalcones yang terbukti mempunyai aktivitas sitotoksik pada sejumlah sel kanker seperti pada sel adenocarcinoma (SPC-A-1), sel kanker kolon (SW-480), dan sel kanker hepatocellular (SMMC-7721) (Wang et al., 2007). Penelitian lain menyebutkan bahwa ekstrak metanol kayu nangka (Artocarpus heterophyllus) mempunyai efek sitotoksik terhadap sel B16 melanoma dengan IC50
sebesar 10,3 µM dan 12,5 µM pada senyawa artocarpin dan crudaflavon B (Arung et al., 2010). Tanaman lain yang juga telah diteliti aktivitas sitotoksiknya adalah kluwih. Ekstrak etanol daun kluwih menunjukkan aktivitas sitotoksik pada sel kanker kolon HCT116 dengan IC50 sebesar 38,18 μg/ml (Tantengco and Jacinto, 2015). Menurut Saravanan et al., (2014) beberapa senyawa dari bahan herbal seperti flavonoid terbukti berpotensi untuk dikembangkan menjadi agen kemoterapi antikanker khususnya pada kanker payudara.
Berdasarkan pada penelitian- penelitian di atas, maka penelitian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas antikanker ekstrak metanol daun sukun
(Artocarpus altilis), nangka (Artocarpus heterophyllus) dan kluwih (Artocarpus camansi) terhadap sel kanker payudara MCF-7 serta mengetahui kandungan senyawa yang terdapat dalam ketiga ekstrak tersebut. Hasil penelitian ini dapat dijadikan landasan untuk pengembangan agen kemoterapi antikanker yang lebih baik.
METODEPENELITIAN
Preparasi sampel simplisia. Sampel daun sukun, nangka dan kluwih didapatkan dari Kabupaten Sukoharjo, Jawa Tengah. Daun dicuci bersih dan diangin-anginkan sampai air yang menempel pada daun hilang, kemudian dijemur dibawah sinar matahari selama 4-5 hari sampai kering (simplisia).
Simplisia diserbuk dan ditimbang hasilnya
Ekstraksi simplisia daun. Serbuk simplisia sebanyak 200 gram direndam (maserasi) menggunakan 750 mL metanol selama 24 jam, kemudian disaring dengan vakum Buchner dan didapatkan larutan. Larutan tersebut dievaporasi sampai dihasilkan ekstrak kental. Ampas diremaserasi sebanyak 4x dengan perlakuan yang sama.
Hasil evaporasi dipindah ke dalam cawan porselen dan diletakkan di atas waterbath untuk menguapkan sisa pelarut dan mendapatkan ekstrak kental.
Uji skrining fitokimia. Optimasi fase gerak dilakukan dengan 5 perbandingan fase gerak (etil asetat : n-heksan) yaitu (5:5), (4:6), (3:7), (2:8) dan (1:9). Masing-masing ekstrak ditotolkan pada plat KLT dan dimasukkan dalam chamber berisi fase gerak yang optimal dan telah dijenuhkan. Elusi dilakukan dengan fase gerak optimal n- heksan : etil asetat (2:8). Plat kemudian disemprot untuk melihat kandungan senyawa secara kualitatif dengan beberapa reagen yaitu reagen dragendorff untuk deteksi alkaloid, FeCl3 untuk deteksi tanin dan sitroborat untuk deteksi flavonoid (Saifudin, 2014).
Uji sitotoksik. Suspensi sel sebanyak 100 µL dimasukkan ke dalam plate 96 dan diinkubasi selama 24-48 jam dalam inkubator CO2 5%. Pada akhir inkubasi, media pada masing-masing sumuran
dibuang, kemudian ditambahkan 100 µL sampel dalam tiap sumuran dengan variasi kadar 500, 250, 125, 62,5 dan 31,25 µg/mL.
Selanjutnya plate 96 diinkubasi dalam inkubator CO2 5% selama 48 jam pada suhu 37ºC. Pada akhir inkubasi, media pada masing-masing sumuran dibuang kemudian ditambahkan 100 µL MTT 5mg/ mL dalam PBS. Plate 96 diinkubasi lagi selama 2-4 jam dalam inkubator CO2 5% dengan suhu 37ºC.
Sel hidup akan bereaksi dengan MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil
tetrazolium bromida) membentuk formazan yang berwarna ungu. Reaksi pembentukan formazan dihentikan dengan penambahan 100 µL larutan SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) 10% dalam HCl 0,01N ke dalam masing-masing sumuran, lalu dibungkus kertas dan disimpan selama semalam pada suhu kamar di tempat yang gelap. Pada akhir masa inkubasi serapan dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 594 nm.
Persentase sel hidup dihitung melalui data absorbansi sel kemudian dibuat kurva hubungan log konsentrasi versus nilai % sel hidup dan dihitung harga IC50-nya.
Absorbansi yang didapat dari pembacaan dengan ELISA reader digunakan untuk menghitung persentase sel hidup dengan rumus :
% sel hidup =
(Absorbansi perlakuan−Absorbansi kontrol media) (Absorbansi kontrol sel−Absorbansi kontrol media) x 100%
Selanjutnya dibuat persamaan garis : y = Bx + A, dengan y = % sel hidup dan x = log konsentrasi (dibuat grafik log konsentrasi versus persentase sel hidup dan dihitung regresi liniernya). Untuk memperoleh nilai IC50 dimasukkan y = 50 pada persamaan regresi linier dan dicari x nya kemudian dihitung antilog dari konsentrasi tersebut (CCRC, 2013). Nilai IC50 menunjukkan konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian 50% dari populasi.
HASILDANPEMBAHASAN
Hasil ekstraksi simplisia dengan methanol menghasilkan rendemen sebesar 10,39% untuk ekstrak daun nangka, 11,85%
untuk daun sukun dan 10,60% untuk daun kluwih. Hasil optimasi fase gerak pada uji pendahuluan adalah perbandingan etil asetat : n-heksan (2:8). Fase diam yang digunakan untuk analisis adalah silica GF-254 yang mampu berfluoresensi pada panjang gelombang 254 nm. Uji skrining fitokimia dilakukan untuk senyawa flavonoid, tanin dan alkaloid. Hasil analisis KLT menunjukkan ekstrak metanol daun sukun, nangka dan kluwih mengandung tanin pada deteksi dengan reagen semprot FeCl3. Hasil positif ditandai dengan adanya bercak berwarna abu-abu pada sinar tampak (Saifudin, 2014). Hasil penelitian ini sejalan dengan penelitian Pradhan et al.
(2012) yang menunjukkan adanya senyawa tanin dalam ekstrak metanol daun sukun. Hasil penelitian Moura Burci et al. (2015) menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat nangka mempunyai kandungan tanin, sehingga hasil tersebut sesuai dengan penelitian ini karena senyawa tanin juga dihasilkan pada uji fitokimia ekstrak tetapi pelarut yang digunakan adalah metanol. Hasil deteksi dengan reagen semprot Dragendorff menunjukkan ekstrak metanol daun sukun, nangka dan kluwih positif mengandung alkaloid yang ditunjukkan dengan bercak berwarna kecoklatan pada sinar tampak (Saifudin, 2014). Hasil penelitian ini sejalan dengan penelitian Khan et al. (2003) yang menghasilkan senyawa alkaloid dalam ekstrak metanol daun nangka. Penelitian yang dilakukan oleh Tehubijuluw and Tenggara (2013) menyatakan bahwa ekstrak metanol daun sukun mengandung alkaloid yang sejalan dengan penelitian ini. Deteksi dengan reagen semprot sitroborat menunjukkan hasil yang negatif terhadap senyawa flavonoid dalam ekstrak metanol daun sukun, nangka dan kluwih. Hasil yang positif ditandai dengan adanya bercak berwarna kuning-kehijauan pada UV 366 nm (Markham, 1988). Hasil penelitian Apsari (2007) menunjukkan adanya senyawa flavonoid dalam ekstrak metanol kulit batang kluwih, sehingga hasilnya berbeda dengan penelitian ini. Hal ini disebabkan karena bagian tanaman yang digunakan berbeda. Penelitian yang dilakukan oleh
(Mohan et al., 2012) menyatakan bahwa senyawa alkaloid mempunyai aktivitas sebagai agen antikanker dengan menghambat enzim topoisomerase yang terlibat dalam replikasi DNA, menginduksi apoptosis dan ekspresi gen p53.
Uji sitotoksik dilakukan dengan melarutkan ekstrak dalam DMSO. Kadar akhir DMSO yang digunakan adalah 0,01% v/v.
Secara teori penggunaan DMSO pada konsentrasi yang tinggi dapat menyebabkan kematian sel. Namun, penelitian oleh Jamalzadeh et al. (2016) menyatakan penggunaan DMSO hingga konsentrasi 0,5%
v/v tidak mempengaruhi viabilitas sel MCF-7.
Pengamatan morfologi sel menunjukkan tidak adanya perbedaan antara kontrol sel MCF-7 dan kontrol perlakuan DMSO. Hasil uji ekstrak metanol daun sukun, nangka dan kluwih memperlihatkan nilai IC50 sebesar 120,85 ; 530,88 dan 339,46 μg/mL (Tabel 1). Perubahan morfologi sel terjadi karena perlakuan ekstrak.
Secara teori hubungan antara persentase sel hidup dan konsentrasi ekstrak merupakan suatu hubungan yang berbanding terbalik. Semakin rendah konsentrasi ekstrak yang diberikan maka semakin tinggi persentase sel hidup (fenomena dose dependent) (Khademvatan et al., 2016; Shiezadeh et al., 2013). Hasil penelitian ini menunjukkan adanya fenomena dose dependent (Gambar 1).
Gambar 1. Hubungan konsentrasi ekstrak metanol daun sukun, nangka dan kluwih dengan persentase sel hidup MCF-7
Hasil perhitungan menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun sukun mempunyai aktivitas sitotoksik yang paling tinggi dibandingkan dengan ekstrak nangka dan kluwih. Berdasarkan kriteria dari United
0 20 40 60 80 100
0 200 400
% sel hidup
konsentrasi (μg/mL)
ekstrak daun sukun ekstrak daun nangka ekstrak daun kluwih
States National Cancer Institute, suatu senyawa diklasifikasikan mempunyai efek sitotoksik yang potensial jika nilai IC50 ≤ 20 μg/mL. Melihat hasil perolehan nilai IC50 pada penelitian ini, dapat dikatakan bahwa tiga ekstrak dari genus Artocarpus ini memiliki
aktivitas sitotoksik yang lemah terhadap sel kanker payudara MCF-7 dengan urutan potensi sebagai berikut, ekstrak sukun >
kluwih > nangka. Hasil penelitian ini menunjukkan perbedaan dengan penelitian yang telah dilakukan sebelumnya (Tabel 1).
Tabel 1. Data uji sitotoksik pada penelitian terdahulu
Jenis tanaman
Bagian
tanaman Pelarut Jenis sel kanker Kandungan
senyawa IC50 Pustak a
Sukun
Daun Metanol
SPC-A-1 (adenocarsinoma)
Geranil dihidrokalkon
28,14
µM Wang
et al., 2007
SW-480 (kolon) 34,62
µM SMMC-7721
(hepatocelullar)
49,86 µM
Kulit kayu Dieter etil T47D Artocarpin 6,19
µg/mL
Arung et al., 2009
Nangka Daun
Etanol H460 (paru-paru)
Artocarpin 7,9 µM Di, 2013
PC-3 (prostat) 8,3 µM
Metanol A549 (paru-paru) Flavonoid 35,26 µg/mL
Patel and Patel, 2011
Kluwih Daun Etanol
HCT116 (kolon)
_
38,18 µg/mL
Tanten gco and Jacinto
, 2015
MCF-7 (payudara) 9,58
µg/mL
Melihat data tersebut, penelitian ini mempunyai nilai IC50 yang jauh berbeda dengan penelitian terdahulu. Hal ini disebabkan karena jenis sel kanker yang digunakan untuk uji sitotoksik berbeda, selain itu bagian tanaman dan pelarut ekstraksi yang digunakan juga berbeda. Kandungan senyawa yang berpotensi menimbulkan aktivitas sitotoksik pada penelitian terdahulu adalah flavonoid dan turunannya. Senyawa tersebut tidak ditemukan pada penelitian ini, sehingga hasil perolehan IC50-nya berbeda.
KESIMPULANDANSARAN Kesimpulan
Berdasarkan pembahasan yang telah dituliskan, maka kesimpulan pada penelitian ini adalah :
a. Ekstrak metanol daun sukun, nangka dan kluwih mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker payudara MCF-7 dengan potensi lemah.
b. Ekstrak metanol daun sukun, nangka dan kluwih mempunyai nilai IC50 masing-masing sebesar 120,85 ; 530,88 dan 339,46 µg/mL.
c. Golongan senyawa yang terkandung dalam ekstrak metanol daun sukun, nangka dan kluwih adalah alkaloid dan tanin.
Saran
Berdasarkan kesimpulan, maka dapat disarankan sebagai berikut :
a. Perlu dilakukan uji sitotoksik menggunakan tanaman yang masih dalam satu genus Artocarpus.
b. Perlu dilakukan uji sitotoksik pada jenis sel kanker yang berbeda menggunakan bagian tanaman lain dari tanaman sukun, nangka dan kluwih.
REFERENSI
Apsari K., 2007, Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Kimia Dari Ekstrak n-heksan Kulit Batang Kluwih (Artocarpus altilis Park) Serta Efek Sitotoksiknya Terhadap Sel HeLa, Phytochemistry, 7 (2), 45–51.
Arung E.T., Yoshikawa K., Shimizu K. and Kondo R., 2010, Isoprenoid-substituted Flavonoids from Wood of Artocarpus heterophyllus on B16 Melanoma Cells : Cytotoxicity and Structural Criteria, Fitoterapia, 81 (2), 120–123.
CCRC, 2013, Uji Sitotoksik Metode MTT,
Terdapat di:
http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/ [Diakses pada 15 Mei 2016].
Haidara K., Zamir L., Shi Q. and Batist G., 2005, The flavonoid Casticin has multiple mechanisms of tumor cytotoxicity action, Cancer Letters, 1–
11.
Haryoto, 2013, Teknik Uji Hayati Untuk Pengembangan Obat (TUHPO), Fairuz Media, Surakarta.
Jamalzadeh L., Ghafoori H., Sariri R., Rabuti H., Nasirzade J., Hasani H. and Aghamaali M.R., 2016, Cytotoxic Effects of Some Common Organic Solvents on MCF-7, RAW-264.7 and Human Umbilical Vein Endothelial Cells, Avicenna Journal of Medical Biochemistry, In press.
Khademvatan S., Eskandari A., Saki J., Foroutan-Rad M., Khademvatan S., Eskandari A., Saki J. and Foroutan-Rad M., 2016, Cytotoxic Activity of Holothuria leucospilota Extract Against Leishmania infantum In Vitro, Advances in Pharmacological Sciences, 2016, 1–6.
Khan M.R., Omoloso A.D. and Kihara M., 2003, Antibacterial Activity of Artocarpus heterophyllus, Fitoterapia, 74 (5), 501–505.
Markham, K.R., 1988, Cara Mengidentifikasi Flavonoid, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, 15, Penerbit ITB, Bandung.
Mohan K., Jeyachandran R. and Mohan Assistant Professor K., 2012, Alkaloids as Anticancer Agents, Annals of Phytomedicine, 1 (1), 46–53.
Moura Burci L., Bezerra da Silva C., de
Oliveira M., Dalarmi L., Maria Warumby Zanin S., Gomes Miguel O., de Fátima Gaspari Dias J. and Dallarmi Miguel M., 2015, Determination of Antioxidant, Radical Scavenging Activity and Total Phenolic Compounds of Artocarpus heterophyllus (Jackfuit) Seeds Extracts, Journal of Medicinal Plants Research, 8 (40), 1013–1020.
Pradhan C., Mohanty M. and Rout A., 2012, Phytochemical Screening and Comparative Bioefficacy Assessment of Artocarpus altilis Leaf Extracts for Antimicrobial Activity, Frontiers in Life Science, 6 (3–4), 71–76.
Saifudin A., 2014, Senyawa Alam Metabolit Sekunder (Teori, Konsep, dan Teknik Pemurnian), Deepublish, Yogyakarta.
Saravanan R., Brindha P. and Ramalingam S., 2014, A Review on the Role of Phytoconstituents in Breast Cancer Cells, International Journal of PharmTech Research, 6 (2), 799–808.
Shiezadeh F., Mousavi S.H., Amiri M.S., Iranshahi M., Tayarani-Najaran Z. and Karimi G., 2013, Cytotoxic and Apoptotic Potential of Rheum turkestanicum Janisch Root Extract on Human Cancer and Normal Cells., Iranian journal of pharmaceutical research : IJPR, 12 (4), 811–9.
Tantengco O.A.G. and Jacinto S.D., 2015, Cytotoxic Activity of Crude Extracts and Fractions from Premna odorata (Blanco), Artocarpus camansi (Blanco) and Gliricidia sepium (Jacq.) Against Selected Human Cancer Cell lines, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 5 (12), 1037–1041.
Tehubijuluw H. and Tenggara A., 2013, Screening Of Phytochemicals and Bioactivity Test of The Leaves Breadfruit (Artocarpus altilis), Ind. J.
Chem. Res., 1, 28–32.
Wang Y., Xu K., Lin L., Pan Y. and Zheng X., 2007, Geranyl Flavonoids from The Leaves of Artocarpus altilis, Phytochemistry, 68 (9), 1300–1306.
