PENGARUH PEMBERIAN VITAMIN C TERHADAP KADAR KOLESTEROL TOTAL DAN KOLESTEROL HDL SERUM MARMOT (CAVIA PORCELLUS)

(1)

S K R I P S I

M J L i K

PEKHLiSTAKAAN *UNIVERS1TAS A i R L A N G G A "

S U R A B a V A

JEMY TANDRA

KK S

K K

F F 74]/9r

Ta h

p

PENGARUH PEMBERIAN VITAMIN C

TERHADAP KADAR KOLESTEROL TOTAL

DAN KOLESTEROL HDL SERUM

MARMOT

(CAVIA PORCELLUS)

(2)

PENGARUH PEMBERIAN VITAMIN C TERHADAP KADAR

KOLESTEROL TOTAL DAN KOLESTEROL HDL

SERUM MARMOT {CAVIA PORCELLUS)

Dibuat untuk memenuhi syarat

mencapai gelar Sarjana Farmasi pada

Fakultas Farmasi Universitas Airlangga

1995

Oleh :

Jemy Tandra

059011243

Disetujui oleh pembimbing : SKRIPSI

DR. Purwanto

Pembimbing utama

Drs. Siswandono, MS Drs. Robby Sondakh, MS

(3)

KATA PENGANTAR

Puji syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa atas

segala rahmat dan karunia yang telah dilimpahkanNya kepada

saya, sehingga tugas skripsi saya telah terselesaikan,

guna memenuhi syarat dalam mencapai gelar Sarjana Farmasi

di Fakultas Farmasi Universitas Airlangga.

Dengan selesainya tugas skripsi ini, maka pada kesem-

patan ini saya ingin menyampaikan terima kasih yang sebe-

sar-besarnya kepada :

1. Bapak DR. Purwanto dari Laboratorium Kimia

Medisinal Fakultas Farmasi Universitas Airlangga

selaku pembimbing utama.

2. Bapak Drs. Siswandono, MS dari Laboratorium Kimia

Medisinal Fakultas Farmasi Universitas Airlangga

selaku pembimbing serta.

3. Bapak Drs. Robby Sondakh, MS dari Laboratorium

Kimia Medisinal Fakutas Farmasi Universitas Air

langga selaku pembimbing serta.

4. Bapak Ketua Jurusan Kimia Farmasi, Kepala Labora

torium Kimia Medisinal, Kepala Laboratorium

Kimia Analisis Farmasi dan Kepala Laboratorium

Sintesis Farmasi Fakultas Farmasi Universitas

(4)

5. Ibu Dra. Hamidah Shahab, Bapak Drs. IGK Artawan,

Bapak Drs. Soegiyanto, MS dan Ibu Dra. Soemiati,

MS selaku dosen penguji.

6. Pengelola Unit Penunjang Hewan Percobaan Fakul

tas Farmasi Universitas Airlangga yang telah

banyak memberikan bantuan dan fasilitas selama

penelitian ini.

7. Segenap karyawan Laboratorium Kimia Medisinal,

Laboratorium Kimia Analisis dan Laboratorium

Sintesis Farmasi yang telah memberikan bantuan

dalam penelitian ini. •

*

8. Keluarga tercinta yang senantiasa memberikan ban

tuan, dorongan dan mendampingi dalam suka dan

duka.

9. Semua pihak yang tidak dapat saya sebutkan satu

persatu.

Semoga semua pihak yang telah memberikan bantuan

kepada saya akan mendapat balasan dari Tuhan Yang Maha Esa

dan semoga skripsi ini dapat memberikan sumbangan yang

bermanfaat bagi masyarakat, khususnya mahasiswa Fakultas

Farmasi Universitas Airlangga.

Surabaya, Januari 1995

(5)

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ... ii

DAFTAR ISI ... iv

DAFTAR GAMBAR ... vii

DAFTAR TABEL ... viii

DAFTAR LAMPIRAN ... ix

RINGKASAN ... x

BAB I. PENDAHULUAN ... 1

1. Latar Belakang Permasalahan ... 1

2. Permasalahan ... 5

3. Tujuan Penelitian ... 5

4. Hipotesis ... 5

5. Manfaat Penelitian ... 5

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ... 6

1. Tinjauan tentang Vitamin C ... 6

1.1. Sumber Vitamin C ... 6

1.2. Sifat Fisika Kimia Vitamin C ... 8

1.3. Stabilitas Vitamin C ... 9

1.4. Vitamin C dalam Tubuh ... '.... 10

2. Tinjauan tentang Kolesterol ... 11.

2.1. Sifat Fisika Kimia Kolesterol ... 11

2.2. Kolesterol dalam Tubuh ... 13

(6)

2.4. Faktor-faktor yang Mempengaruhi Kadar

Kolesterol dalam Darah .14

2.5. Kolesterol HDL ... .16

2.6. Ekskresi Kolesterol ...18

3. Tinjauan tentang Hewan Percobaan ...19

4. Tinjauan tentang Penentuan Kadar Kolesterol dengan Metode Liebermann-Burchard ...19

4.1. Penentuan Kadar Kolesterol Total ...20

4.2. Penentuan Kadar Kolesterol HDL ...22

5. Tinjauan tentang Metode Spektrofotometri .. 23

6. Tinjauan tentang Uji Validasi ...24

6.1. Kelurusan dan Trayek Kelurusan ... .25

6.2. Sensitivitas ...25

6.3. Presisi ...25

5.4. Akurasi ...26

BAB III. BAHAN, ALAT DAN METODE PENELITIAN ...27

1. Bahan-bahan yang Digunakan ...27

2. Alat-alat yang Digunakan ...27

3. Cara Kerja ... .27

3.1. Analisis Kualitatif terhadap Vitamin C 27 3.1.1. Pemeriksaan Organoleptis ... .27

3.1.2. Reaksi Warna ... .28

3.1.3. Pemeriksaan Titik Lebur ... .28

3.2. Hewan Percobaan ... .29

3.2.1. Rancangan Percobaan ... .29

(7)

4.1. Kelurusan ... .32

4.2. Sensitivitas ... .33

4.3. Presisi ... .33

4.4. Akurasi ... .34

5. Pembuatan Kurva Baku ...34

5.1. Pemilihan Panjang Gelombang Maksimum . 35 5.2. Pembuatan Kurva B a k u ... .35

6. Pengambilan Sampel Darah ... .36

7. Penentuan Kadar ... .36

7.1. Penentuan Kadar Kolesterol Total Serum 36 ' 7.2. Penentuan Kadar Kolesterol HDL serum . 36 8. Analisis Data ...39

BAB IV. HASIL PERCOBAAN ...45

1. Analisis sifat fisika kimia vitamin C .... .44

2. Penentuan panjang gelombang maksimum ... .46

3. Uji validasi ...47

3.1. Kelurusan ... 47

3.2. Sensitivitas ...49

3.3. Presisi ...50

3.4. Akurasi ...52

4. Hasil pemeriksaan kadar kolesterol total .. 53

5. Hasil pemeriksaan kolesterol HDL serum .... 58

BAB V. PEMBAHASAN ...64

BAB VI. KESIMPULAN ...72

BAB VII. SARAN ...73

(8)

DAFTAR GAMBAR

1. Penentuan panjang gelombang maksimum larutan

kolesterol ... 46

2. Kurva linier nilai serapan terhadap kadar -

larutan kolesterol pada panjang gelombang

maksimum... 48

(9)

Tabel

Serapan larutan kolesterol pada panjang

gelombang 620,5 nm dengan 10 macam kadar .... 47

Hasil pengamatan serapan blanko ... 50

Penentuan presisi ... 51

Penentuan akurasi . . . ... 52

Hasil pemeriksaan kadar kolesterol total

serum marmot ... 53

Hasil uji HSD pemeriksaan kadar kolesterol

total serum marmot kelompok I, II.1, II.2 dan

11. 3 ... 55

total serum marmot kelompok III, IV.1, IV.2

dan IV. 3 ... 57

Hasil pemeriksaan kadar kolesterol HDL serum

marmot ... 59

HDL serum marmot kelompok III, IV.1, IV.2 dan

(10)

DAFTAR LAMPIRAN

1. Hasil perhitungan koefisien korelasi ... 79

2. Hasil penentuan LOD dan LOQ ... 81

3. Analisa data uji Anakova untuk pemeriksaan kadar

kolesterol total serum marmot... 83

4. Analisa data uji Anakova untuk pemeriksaan kadar

kolesterol HDL serum marmot ... 87

5. Tabel harga koefisien korelasi pada derajat ke-

percayaan 5% dan 1% ... 91

6. Tabel distribusi F pada derajat kepercayaan 0,05 92

(11)

R I N G K A S A N

Untuk mengetahui apakah terdapat perbedaan efek dari

dosis vitamin C dilakukan penelitian tentang pengaruh

beberapa macam dosis vitamin terhadap kadar kolesterol

total dan kolesterol HDL serum marmot.

Pada penelitian ini digunakan 40 ekor marmot yang

dibagi menjadi 2 grup, masing-masing grup terdiri dari

4 kelompok, di mana masing-masing kelompok terdiri dari 5

ekor marmot. Kelompok-kelompok tersebut adalah sebagai

berikut :

Grup pertama :

Kelompok I : makanan dasar

Kelompok II.1 : makanan dasar + vitamin C dosis 1

Kelompok 11,2 : makanan dasar + vitamin C dosis 2

Grup kedua:

Kelompok III : makanan dasar + kolesterol 3% 1 ml

Kelompok IV.'l : makanan dasar + kolesterol 3% 1 ml

+ vitamin C dosis 1

Kelompok IV.1 : makanan dasar + kolesterol 3% 1 ml

+ vitamin C dosis 2

+ vitamin C dosis 3

(12)

vitamin C diberikan dalam bentuk larutan. Dosis vitamin C

yang diberikan merupakan dosis konversi dari dosis untuk

manusia. Pemberian kolesterol dan vitamin C dilakukan

secara per oral selama satu bulan. Sebelum perlakuan

dilakukan pemeriksaan kadar kolesterol total dan koleste

rol HDL serum. Setelah satu bulan kadar kolesterol total

dan kolesterol HDL serum diperiksa lagi. Sebelum satnpel

darah diambil hewan coba dipuasakan selama 12-14 jam. Pengambilan sampel darah dilakukan secara intra kardial.

Darah ditampung tanpa antikoagulan. Serum yang diperoleh

diperiksa kadar kolesterol total dan kolesterol HDL-nya

dengan metode Huang dan kawan-kawan, menggunakan pereaksi

warna Liebermann-Burchard. Untuk penentuan kadar koleste

rol HDL serum sebelum direaksikan dengan pereaksi warna

Liebermann-Burchard terlebih dahulu dilakukan teknik

pengendapan selektif secara kimiawi untuk lipoprotein-

lipoprotein lain selain HDL dengan menggunakan pereaksi

Heparin dan Mangan Klorida.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian vitamin

C dapat menurunkan kadar kolesterol total secara bermakna,

baik pada keadaan normal maupun hiperkolesterolemia,

Selain itu juga dapat meningkatkan kadar kolesterol HDL

serum pada keadaan hiperkolesterolemia, sedang pada kea

(13)

BAB I

PENDAHULUAN

1. Latar Belakang Permasalahan .

Penyakit jantung atau penyakit kardiovaskuler,

juga dikenal sebagai penyakit arteri koronaria, arte-

riosklerosis atau pengerasan ai'teri. Ciri penyakit ini

adalah terjadinya perubahan degeneratif dalam arteri.

Jenis yang umum dari penyakit ini adalah aterosklerosis

[1]. Aterosklerosis merupakan penyebab kematian utama

di Amerika Serikat dan negara-negara Eropa [2]. Di

Indonesia jumlah angka kematian akibat penyakit ini

cenderung meningkat dari tahun ke tahun [3]. Penyakit

ini tidak hanya mempengaruhi orang-orang usia lanjut,

tetapi juga merupakan penyebab kematian dan cacat pada

usia setengah tua [4]. Faktor penyebab utama dari

penyakit ini adalah kadar kolesterol serum, tekanan

darah, dan kebiasaan merokok. Faktor lainnya adalah

umur, jenis kelamin dan keturunan [1]. Kadar kolesterol

total serum telah lama diketahui sebagai faktor penye

bab penyakit aterosklerosis yang paling besar [4].

Individu dengan kadar kolesterol total serum antara

200-239 mg/dl dianggap berada pada batas ambang atero

(14)

resiko yang tinggi [5j.

Di dalam darah, kolesterol, trigliserida, dan

fosfolipida terikat pada protein tertentu membentuk

lipoprotein. Lipoprotein dapat digolongkan menjadi

kilomikron, lipoprotein densitas sangat rendah (VLDL),

lipoprotein densitas rendah (LDL), lipoprotein densitas

sedang (IDL), dan lipoprotein densitas tinggi (HDL).

Ada hubungan berkebalikan antara konsentrasi HDL dan penyakit jantung koroner, dan beberapa ahli menganggap

bahwa hubungan yang paling dapat diramalkan adalah

perbandingan kolesterol LDL/HDL [6]. Penelitian para

ahli menunjukkan bahwa wanita jarang menderita penyakit

ini karena pada wanita kadar kolesterol HDL lebih

tinggi dibanding laki-laki, sehingga disimpulkan bahwa

kolesterol HDL merupakan faktor anti resiko terjadinya

penyakit aterosklerosis [7]. Kadar kolesterol LDL

antara 130-159 mg/dl dianggap sebagai batas dan di atas

160 mg/dl dianggap mempunyai resiko tinggi terhadap

timbulnya penyakit aterosklerosis [5]. Kadar kolesterol

HDL cukup 35-65 mg/dl agar tidak terjadi penyakit ini C8].

Jumlah kolesterol dalam darah ditentukan oleh

interaksi 4 faktor, yaitu [9]:

- Laju pembuatan kolesterol oleh hati dari asetat.

(15)

- Laju kolesterol yang diubah menjadi asam empedu dan

dibuang melalui usus halus.

- Laju asam empedu yang diserap kembali dan diubah

menjadi kolesterol.

Dalam perkembangan penyakit jantung, banyak pene

litian yang menaruh perhatian pada faktor-faktor dalam

makanan yang dapat mempengaruhi kadar kolesterol plas

ma. Hubungan antara makanan, kolesterol serum dan

penyakit aterosklerosis telah ditunjukkan selama Perang

Dunia Kedua, pada saat pendistribusian makanan di Eropa

Utara cenderung mengarah pada penurunan pemasukan

kalori total, peningkatan karbohidrat, dan penurunan

semua lemak makanan termasuk kolesterol. Data yang

didapat menunjukkan bahwa kematian akibat penyakit

aterosklerosis menurun dengan tiba-tiba pada tahun-

tahun pertama perang [4]. Pemasukan kolesterol per hari

harus kurang dari 300 mg [5]. Tetapi yang penting

adalah biokimia dan proses metabolisme kolesterol dalam

tubuh. Biokimia dan fungsi kedua lipoprotein LDL dan

HDL sangat penting dalam memahami siklus kolesterol.

LDL membawa kolesterol dalam darah, mendorong kole

sterol. sehingga menempel pada sel pembuluh. Se-

baliknya HDL membawa kolesterol kembali ke kandung

empedu, di mana kolesterol diubah menjadi asam empedu

(16)

Di Indonesia vitamin C banyak diperdagangkan se

bagai sediaan farmasi, baik sebagai suplemen maupun

obat. Kandungan vitamin C dalam sediaan-sediaan terse-

but bervariasi antara 20 mg sampai 1 g [10]. Vitamin C

dapat digunakan untuk terapi alkoholisme, alergi,

penyakit-penyakit defisiensi dan darah, infeksi dan

lain-lain [11]. •

Pada defisiensi vitamin C dijumpai adanya peningkatan kolesterol dalam serum darah dan penimbunan

kolesterol dalam hati. Hal ini disebabkan oleh keter-

lambatan pengubahan kolesterol dalam hati menjadi asam

empedu. Diduga vitamin C berfungsi mempengaruhi pengu

bahan kolesterol menjadi asam empedu di dalam hati

[12].

Obat-obat hipolipidemik, antara lain klofibrat,

asam nikotinat, dan resin dapat digunakan untuk menu-

runkan kadar kolesterol karena dapat mengganggu sinte-

sis kolesterol dalam tubuh. Tetapi banyak di antara

obat-obat ini yang mempunyai efek samping yang cukup

besar, sehingga sekarang sedang dipertimbangkan untuk

dihindari pengobatan dengan cara mengganggu sintesis

kolesterol [6]. Penggunaan obat-obat ini harus didasarkan pada kondisi fisiologis penderita dan tidak

boleh diberikan pada wanita hamil atau yang sedang

(17)

2. Permasalahan

Dari latar belakang di atas, maka timbul permasa

lahan bagaimanakah pengaruh pemberian vitamin C terha-

dap kadar kolesterol total dan kolesterol HDL serum

marmot ( Cavia porcellus) ?

3. Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui

pengaruh vitamin C terhadap kadar kolesterol total dan

kolesterol HDL serum marmot (Cavia porcellus).

4. Hipotesis

Vitamin C dapat menurunkan kadar kolesterol total

serum dan meningkatkan kadar kolesterol HDL serum.

5. Manfaat Penelitian

Dari hasil penelitian diharapkan dapat memberi

informasi tentang pentingnya vitamin C sebagai salah

(18)

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

1. Tinjauan tentang Vitamin C

1.1. Sumber Vitamin C

Vitamin C tersebar luas dalam hewan dan tumbuh-

an. Dalam jaringan hewan kadar tertinggi ditemukan

dalam korteks adrenal, lensa mata dan hati. Dalam

tumbuhan vitamin C dibentuk secara sinambung dalam

semua organ hijau dan berlimpah dalam daerah yang

paling aktif tumbuh. Kandungan terbesar ditemukan

dalam kulit buah dan dalam beberapa daun lebih banyak

daripada dalam batang [11]. Kadar vitamin C bervaria-

si dalam jaringan tumbuhan [13].

Dalam makanan kadar vitamin C ditemukan sangat

sedikit. dalam ikan, daging, susu yang dipasteurisasi

dan telur, sama sekali tidak ada dalam butir padi

kering dan juga butir padi kecuali mereka telah

bertunas. Kadar vitamin dalam makanan tergantung

kondisi pertumbuhan tanaman, maturasi tanaman dan

perlakuan terhadap bahan-bahan tanaman setelah sele-

sai panen [13].

Beberapa sumber vitamin C yang cukup penting

(19)

Tabel I. Kadar vitamin C dalam mg/100 g bahan

No Nama Bahan Kadar dalam mg

1. Jambu biji (guava) 300

2. Daun singkong 275

3. Buah jeruk (citrus fruit) 220

4. Black current 200

5. Jambu monyet . 197

6

.

Paterseli/daun sup 190

7. Daun melinjo 182

8. Cabe (green pepper) 120

9. Brokoli 113

10. Daun lobak 109

11. Sawi 102

12. Tomat 100

13. Squash (semacam labu) 90

14. Mangga muda 89

15. Bayam 80

24. Daun kecipir 29

25. Nanas 24

26- Pala 22

27. Sirsak 22

28. Sawo 21

29. Kacang buncis 19

30. ASI 5

31. Pisang ambon 3

(20)

1.2. Sifat Fisika Kimia Vitamin C

Vitamin C adalah sinonim dari asam askorbat. Asam askorbat merupakan serbuk kristal, tidak berwar-

na atau putih atau kuning pucat, tidak berbau atau

hampir tidak berbau, rasa asam [14].

Asam askorbat mempunyai dua bentuk isomer, yaitu

isomer L dan isomer D. Bentuk alamiah dari vitamin

ini adalah isomer L. Isomer D aktivitasnya 10%

isomer L [15].

Asam askorbat merupakan bentuk enol dari

3-okso-L-gulofuranolakton [14]. Struktur molekul asam

askorbat atau vitamin C adalah sebagai berikut [13]:

O

Nama kimia :

(21)

Kelarutan : larut dalam 3-3,5 bagian air, dalam

25 bagian alkohol dan dalam 10

bagian metanol; Larut dalam aseton;

Praktis tidak larut dalam eter,

kloroform dan petroleum eter [14].

pH : 2,0 padgi kadar 50 mg/ml [13]

Nilai pK pada 25°C [15] : pK1 =4,04

pK2 =11,4

1.3. Stabilitas Vitamin C

Kristal asam askorbat stabil dalam lingkungan

kering dan temperatur kamar [13]. Walaupun stabil

dalam bentuk padat, dalam bentuk larutan relatif

cepat teroksidasi menjadi asam dehidroaskorbat [16].

Larutan asam askorbat dalam air pH S 7,6 tidak di-

oksidasi oleh udara asal tidak ada tembaga dan bahan

lain yang dapat mengkatalisa reaksi [13].

Reaksi yang penting untuk asam askorbat adalah

(22)

Q = C

---Asam askorbat sangat peka terhadap berbagai cara

degradasi. Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi

degradasi antara lain temperatur, enzim, pH, katalis

logam, kadar awal asam askorbat dan rasio asam askor

bat menjadi asam dehidroaskorbat [15].

1.4. Vitamin C dalam Tubuh

Peran vitamin C dalam nutrisi telah dikarak-

terisasi dengan baik. Vitamin C penting dalam nutrisi

manusia karena ia menjaga bahan-bahan semen yang

terletak antara sel-sel jaringan tubuh dalam kondisi

baik. Sebagai hasil dari aksi ini, vitamin C mencegah

perdarahan dan sakit gusi, hemorrhage jaringan dan

beberapa bentuk anemia. Vitamin C membantu perkem-

(23)

Setelah pemberian oral, vitamin C diabsorbsi

dengan cepat. Bagian dosis terabsorbsi cenderung

menurun dengan meningkatnya dosis. Didistribusi

secara luas dalam jaringan tubuh. Kadar dalam lekosit

dan platelet lebih tinggi daripada dalam eritrosit

dan plasma. Asam askorbat dimetabolisme menjadi asam.

dehidroaskorbat, asam 2,3-diketogulonat, oksalat dan karbon dioksida. Terjadi sedikit konjugasi dengan

sulfat membentuk askorbat-3-sulfat. Asam askorbat

melebihi kebutuhan tubuh dieliminasi dengan cepat

dalam urin. Kurang lebih 85% dosis intravena diberi

kan pada subyek yang belum tersaturasi dengan vitamin ini diekskresi dalam urin dalam 24 jam, dengan kurang

lebih 70% dari dosis diekskresi dalam bentuk tidak

berubah dan 15% sebagai asam dehidroaskorbat dan asam

diketogulonat. Jumlah normal yang ada dalam tubuh

melebihi 1,5 g. Kadar dalam plasma dan lekosit secara normal kurang lebih 5-12 ug/ml dan 25-30 ug/10® sel. Berikatan dengan protein plasma kurang lebih 25%

[17 3.

2. Tinjauan tentang Kolesterol

2.1. Sifat Fisika Kimia Kolesterol

Kolesterol merupakan sterol penting yang telah

dipelajari selama bertahun-tahun. Kolesterol merupa-

kan serbuk atau granul halus, warna putih atau

(24)

dalam air, perlahan-lahan larut dalam 100 bagian

alkohol dan dalam 50 bagian dehidrat alkohol, larut

dalam aseton, kloroform, dioksan, eter, etil asetat,

petroleum eter, dan minyak tumbuhan (14).

Rumus bangun kolesterol adalah sebagai berikut:

BM = 386,7

Kolesterol memberikan sejumlah reaksi warna yang

karakteristik, antara lain dengan reaksi Liebermann-

Burchard, di mana larutan kolesterol dalam kloroform

dengan penambahan asetat anhidrida dan asam sulfat

pekat akan memberikan warna hijau kebiruan sampai

hijau. Intensitas warna yang diperoleh bervariasi sesuai dengan jumlah kolesterol yang ada, oleh karena

itu reaksi ini merupakan dasar perhitungan kuanti-

tatif. Reaksi warna yang lain dikembangkan oleh

(25)

Salkowski, yaitu larutan kolesterol dalam kloroform

dengan penambahan asam sulfat pekat akan memberikan

warna merah kebiruan sampai violet [18].

2.2. Kolesterol dalam Tubuh

Bagian terbesar kolesterol dalam tubuh berasal

dari biosintesis yaitu sekitar 1 gram/hari, dan hanya

sekitar 0,3 gram/hari yang berasal dari makanan

(diet) biasa. Sebenarnya semua jaringan yang mengan-

dung sel berinti mampu mensintesis kolesterol, ter-

utama hepar, korteks adrenalis, Jrulit, usus, testis,

dan aorta. Fraksi mikrosom dan sitosol sel bertang-

gungjawab untuk biosintesis kolesterol [6].

Kolesterol plasma manusia terutama diangkut

dalam LDL dan sedikit dalam HDL dan VLDL. Dalam

populasi orang Amerika terdapat kenaikan kolesterol

yang terus-menerus sampai tercapai maksimum, kira-

kira pada usia 55-60 tahun. Pada usia 21 tahun,

kadar kolesterol plasma rata-rata kurang lebih

180 mg/dl. Setelah usia 25 tahun, kadar akan me-

ningkat sampai 200-250 mg/dl [4].

2.3. Absorbsi dan Transport Kolesterol

Kolesterol dalam makanan diserap dari usus dan

bersama dengan lipid lain, termasuk kolesterol yang

disintesa dalam usus, digabungkan dalam kilomikron

(26)

dalam getah bening diesterifikasi dengan asam lemak

rantai panjang. Esterifikasi dapat terjadi dalam

mukosa usus. Sterol tanaman (sitosterol) diabsorbsi

kurang baik. Pada saat sisa kilomikron bereaksi

dengan hepar, sebagian besar ester kolesteril

terhidrolisa dan kolesterol diambil oleh hepar.

VLDL yang dibentuk dalam hepar mentransport

kolesterol ke dalam plasma [6].

Sebagian besar kolesterol ditemukan dalam

bentuk ester dan diangkut sebagai lipoprotein

dalam plasma. Lipoprotein ini merupakan partikel

kompleks yang mengandung apoprotein, protein yang dapat mengikat lipida, dan membantu pengaturannya

dari hepar ke dalam plasma [6].

Berdasarkan densitasnya dapat dibagi lima

fraksi lipoprotein dan di antara kelima fraksi

lipoprotein tersebut, fraksi lipoprotein dengan

. densitas tinggi (HDL) adalah faktor pelindung

(anti resiko) terhadap terjadinya aterosklerosis.

2.4. Faktor-faktor yang Mempengaruhi Kadar Kolesterol

dalam Darah

Adanya kolesterol sebagai salah satu faktor

resiko terjadinya penyakit jantung koroner telah

menyebabkan usaha-usaha untuk menurunkan kadar

(27)

- Peningkatan jumlah kolestero-l yang dimakan sedikit

meningkatkan konsentrasi kolesterol dalam plasma.

Biasanya, konsentrasi kolesterol plasma tidak dapat

berubah lebih dari ± 15% dengan mengubah diet,

walaupun kolesterol yang ekstrem dalam diet mungkin

dapat mengubah kadar sampai sebanyak ± 30% [19].

Peningkatan kolesterol dalam makanan sebanyak

100 mg menyebabkan peningkatan kadar kolesterol

sebesar 5 mg per 100 ml serum [6].

- diet yang jenuh lemak meningkatkan konsentrasi

kolesterol darah sebanyak 15-25% [19].

- makan lemak yang mengandung banyak asam lemak

tidak jenuh biasanya menekan konsentrasi koleste

rol darah dalam jumlah ringan sampai moderat [19].

- kekurangan hormon tiroid meningkatkan kolesterol

darah dan sebaliknya [19].

- pada diabetes melitus kolesterol darah sangat me-

ningkat, hal ini diduga akibat peningkatan umum

mobilisasi lipid pada keadaan ini [19].

- hormon seks wanita, estrogen, menurunkan kolesterol

darah, sedangkan hormon seks pria, androgen,

meningkatkan kolesterol darah. Efek ini penting

sekali karena makin tinggi kadar kolesterol pada

laki-laki erat hubungannya dengan peningkatan

kemungkinan terjadinya aterosklerosis [19].

(28)

sangat meningkat.

- sterol tanaman (sitosterol) berkompetisi dengan

kolesterol pada proses absorbs! dalam usus. Jika

dikonsumsi dalam jumlah besar, akan dapat menurun-

kan kadar kolesterol plasma [4].

Sebelum 1952 kandungan lemak total dalam

makanan dianggap sebagai faktor yang menentukan

kadar kolesterol plasma. Pada waktu itu Kinsell

melaporkan bahwa lemak hewani meningkatkan kole

sterol plasma, sedangkan lemak tumbuhan menurun-

kannya. Kemudian Keys menemukan bahwa lemak jenuh

meningkatkan kolesterol darah, lemak tak jenuh

banyak menurunkannya, sedangkan lemak tak jenuh

tunggal tidak berpengaruh [4].

2.5. Kolesterol HDL

Lemak bertanggung jawab atas penyediaan energi

bagi tubuh, tetapi terdapat permasalahan dalam

pengangkutan lemak yang bersifat hidrofobik dalam

sirkulasi darah. Hal ini diatasi dengan pembentukan

ikatan antara lemak tidak larut dengan golongan yang

lebih polar seperti fosfolipida, kemudian menggabung- kannya dengan kolesterol dan protein membentuk kom-

pleks lipoprotein yang hidrofilik [6].

Fraksi protein dalam lipoprotein dikenal sebagai

apoprotein. Ada beberapa macam apoprotein, yaitu :

(29)

- Apoprotein B.

- Apoprotein C-I, Apoprotein C-II, Apoprotein C-III.

- Apoprotein E

Ada lima golongan lipoprotein yaitu kilomikron,

VLDL, LDL, IDL, dan HDL. Di antara kelima golongan

tersebut yang merupakan faktor anti resiko terhadap

terjadinya aterosklerosis adalah HDL.

HDL disintesa dan disekresi dari hepar dan

usus. HDL yang baru terbentuk (nascent) dari usus

tidak mengandung apoprotein C, tapi hanya apopro

tein A. Oleh sebab itu, tampaknya apoprotein C hanya

disintesa dalam hepar dan dipindahkan pada HDL

intestinal pada saat HDL intestinal memasuki plasma.

HDL yang dibentuk dalam hepar terdiri dari dua

lapisan fosfolipida diskoid yang mengandung apopro

tein dan kolesterol bebas. Lipoprotein-lipoprotein

ini mirip dengan partikel-partikel yang ditemukan

dalam plasma penderita defisiensi enzim lesitin-

kolesterol-asil-transferase (LCAT) [6],

Katalisis oleh enzim LCAT akan mengubah fosfoli

pida dan kolesterol bebas menjadi ester kolesterol

dan lisolesitin. Ester kolesterol akan bergerak

menuju bagian dalam lapisan fosfolipida, sedangkan

lisolesitin dipindahkan ke albumin plasma. Reaksi

berlanjut menghasilkan suatu inti nonpolar yang

(30)

dilapisi oleh suatu film dari lemak-lemak polar dan

apoprotein. Hepar dan mungkin juga usus merupakan

tempat €erakhir degradasi apoprotein HDL [6].

Faktor-faktor yang mempengaruhi kadar HDL dalam

darah antara lain :

1. Jenis kelamin

Kadar HDL pada wanita lebih tinggi daripada pria

[6].

2. Aktivitas atau latihan fisik

Latihan dapat menurunkan VLDL dan LDL, meningkat

kan HDL [1].

3. Kafein dan kebiasaan merokok

Dapat meningkatkan LDL dan menurunkan HDL [1].

4. Alkohol

Konsumsi alkohol yang tidak berlebihan dapat

meningkatkan kadar HDL [1].

5. Mineral

Defisiensi tembaga menyebabkan peningkatan kadar

LDL plasma dan penurunan kadar HDL [1].

6. Vitamin C

Terapi vitamin C dosis tinggi menyebabkan penu

runan LDL dan kolesterol total, dan peningkatan HDL Cl].

2.6. Ekskresi Kolesterol

Kira-kira separuh dari' kolesterol yang dielimi-

(31)

■ menjadi garam empedu. Sisanya diekskresikan sebagai

steroid netral. Sebagian besar kolesterol yang dieks

kresi dalam empedu direabsorbsi, dan dipercaya bahwa

kolesterol yang berfungsi sebagai prekursor sterol

feces berasal dari mukosa usus. Koprostanol adalah

sterol utama dalam feces, dibentuk dari kolesterol

dalam usus bagian bawah oleh bakteri-bakteri usus.

Sebagian besar garam-garam empedu dari

ekskresi bilier direabsorbsi ke dalam sirkulasi

portal, diambil oleh hepar, dan diekskresi kembali

di dalam empedu. Ini dikenal sebagai sirkulasi

enterohepatik. Garam-garam empedu yang tidak direab

sorbsi atau turunannya diekskresi dalam feces [6].

3. Tinjauan tentang Hewan Percobaan

Pada penelitian, hewan coba yang dapat digunakan

antara lain marmot, tikus, babi, ayam, kelinci dan

kera. Marmot dipilih sebagai hewan coba dengan alasan

sebagai berikut [20]:

- biayanya relatih murah.

- pemeliharaan relatif mudah.

- pertimbangan volume darah yang akan diambil.

- tidak memerlukan tempat pemeliharaan yang luas.

4. Tinjauan tentang Penentuan Kadar Kolesterol dengan

(32)

4.1. Penentuan Kadar Kolesterol Total

Penentuan kadar kolesterol total dengan menggu

nakan metode Liebermann-Burchard pertama kali dite

mukan oleh Liebermann pada tahun 1885, dan digunakan

untuk analisis kolesterol oleh Burchard tidak lama

kemudian. Pada penelitian-penelitian awal digunakan

kloroform sebagai pelarut, tetapi reaksi Liebermann-

Burchard sekarang ini menggunakan medium asam asetat-

asam sulfat-asetat anhidrida [21].

Metode lain yang banyak digunakan adalah reaksi

Zak, yang untuk pertama kali digunakan dalam analisis

kolesterol oleh Zlatkis, Zak dan Boyle pada tahun

1953, pembawanya adalah asam asetat-asam sulfat,

tanpa asetat anhidrida. Untuk mendapatkan warna yang

diinginkan harus ditambahkan Fe^+ [21].

Metode menurut Huang dan kawan-kawan yang meng

gunakan pereaksi Liebermann-Burchard mempunyai banyak

keuntungan jika dibandingkan dengan metode lainnya.

Keuntungan metode Huang dan kawan-kawan ini antara

lain [22]:

- prosedur pelaksanaannya relatif mudah.

- hanya menggunakan satu pereaksi warna dan dengan

pemeriksaan secara langsung.

- pereaksi yang digunakan stabil selama 2 minggu pada

suhu kamar dan 4 minggu di dalam almari es.

(33)

menit dan warna yang terjadi tetap stabil selama 20

menit.

- faktor suhu tidak begitu mempengaruhi reaksi warna.

Pada pemeriksaan antara suhu 21-25°C tidak memberi-

kan hasil yang berbeda.

Metode lain yang dianggap sebagai metode

rujukan adalah metode Abel dan kawan-kawan. Metode

ini tnemerlukan beberapa tahap reaksi, antara lain

penyabunan dari ester kolesterol dan ekstraksi dari

kolesterol bebas. Dengan demikian diperlukan pera-

latan yang banyak dan perlu ketrampilan khusus serta

memakan waktu yang lebih lama dan memungkinkan ter

jadinya kesalahan yang lebih besar, disamping itu

pereaksi warna yang digunakan hanya stabil selama

satu jam sehingga harus selalu dibuat baru [22].

Prinsip reaksi Liebermann-Burchard menurut

metode Huang dan kawan-kawan yaitu berdasarkan sifat

kolesterol yang dapat bereaksi dengan suatu asam

kuat membentuk suatu senyawa kolestapoliena yang

berwarna hijau kebiruan. Kadar senyawa kolestapo

liena ini dapat diukur secara kolorimetri atau

spektrofotometri. Pada metode menurut Huang dan

kawan-kawan ini digunakan pereaksi Liebermann-

Burchard yang mengandung 30% asam asetat glasial, 60%

asetat anhidrida, dan 10% asam sulfat pekat [23].

(34)

Kolesterol ion. karbanium

dari 3 ,5-Dien

Asetat anhidrida SO.

Kation Pentenil max 620 nm

4.2 Penentuan Kadar Kolesterol HDL

Kolesterol HDL ditentukan dengan menggunakan

metode pengendapan selektif yaitu dengan menggunakan

heparin dan Mangan klorida. Prinsip dari metode ini

adalah : lipoprotein-lipoprotein di dalam serum

kecuali HDL diendapkan. Dua tahapan yang harus dila

kukan pada penentuan kadar kolesterol HDL yaitu tahap

(35)

Oleh karena itu faktor yang mempengaruhi metode ini

adalah tergantung pada kesempurnaan dari pengendapan

lipoprotein-lipoprotein selain HDL [24].

Metode pengendapan selektif ini berdasarkan pada

sifat lipoprotein dalam darah [selain HDL], yaitu

kemampuannya bereaksi dengan kation bervalensi dua n *

(Mn^ ) dan polianion (heparin), membentuk partikel kompleks yang tidak larut. Semakin besar molekul

polianion atau molekul lipoproteinnya, akan semakin

besar pula kecenderungan molekul-molekul tersebut

untuk bergabung menjadi partikel kompleks. Maka

, dengan jalan memilih pereaksi yang sesuai, dapat dilakukan pengendapan selektif terhadap fraksi-fraksi lipoprotein selain HDL. Untuk selanjutnya fraksi HDL

yang terlarut ditentukan kadar kolesterolnya seperti

pada penentuan kadar kolesterol total.

5. Tinjauan tentang Metode Spektrofotometri

Metode spektrofotometri adalah salah satu metode

instrumental yang didasarkan atas pengukuran serapan dari molekul terhadap sinar. Metode spektrofotometri

dapat digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Jika pada panjang gelombang tertentu suatu zat

mempunyai serapan yang spesifik, maka metode ini dapat

digunakan untuk penentuan identifikasi zat tersebut. Untuk analisis kuantitatif didasarkan pada nilai sera

(36)

Pengukuran serapan biasanya dilakukan pada panjang

gelombang maksimum. Pada pengukuran serapan suatu

larutan hampir selalu digunakan blanko untuk mengatur

spekrofotometer, sehingga pada panjang gelombang pengu

kuran mempunyai serapan nol. Maksud dari blanko terse

but adalah untuk koreksi serapan yang disebabkan oleh

pelarut. pereaksi, sel ataupun pengaturan alat.

Analisis kuantitatif dengan spektrofotometer

didasarkan pada hukum Lambert-Beer, yaitu [26]:

A = a.b.c

dimana : A = serapan

a = daya serap

b = tebal medium

c = kadar senyawa yang menyerap

6. Tinjauan tentang Uji Validasi

Validasi dari suatu metode analisis adalah suatu

proses untuk meyakinkan bahwa karakteristik dari metode

memenuhi persyaratan untuk diterapkan pada analisis

yang dimaksud. Parameter validasi dari metode analisis

yang dipakai sebagai pedoman untuk pengujian mutu

adalah presisi, akurasi, sensitivitas, selektivitas,

kelurusan dan ketidakrataan [27].

Yang akan dilakukan pada penelitian ini adalah

(37)

6.1. Kelurusan dan Trayek Kelurusan

Kelurusan suatu metode analisis adalah kemam-

puan memberikan hasil uji yang secara langsung atau

melalui transformasi matematik, sebanding dengan

konsentrasi analit dalam sampel dengan rentang yang

diberikan. Linieritas suatu metode analisis diper-

oleh dengan melakukan penyelesaian matematik ter

hadap hasil-hasil analisis terhadap sampel dengan

berbagai kadar analit. Trayek kelurusan adalah jarak

dari yang terendah sampai yang tertinggi yang

masih sesuai dengan hukum yang berlaku [27].

6.2. Sensitivitas

Sensitivitas dinyatakan dengan LQD (Limit of

Detection) untuk analisis kualitatif dan LOQ (Limit

of Quantitation) untuk analisisx kuantitatif. LOD

adalah batas kadar terkecil dari arvalit (zat yang

dianalisis) dalam sampel yang masih blsa dideteksi.

LOQ adalah batas kadar terkecil dari analit dalam

sampel yang ditetapkan secara kuantitatif dengan

presisi dan akurasi yang dapat diterima [27].

6.3. Presisi

Presisi adalah suatu derajat keterulangan dari

metode analisis pada kondisi pelaksanaan yang

normal. Biasanya dinyatakan dengan simpangan baku

(38)

kecil harga prosen koefisien v&riasi maka makin

baik presisi suatu metode analisis [27].

6.4. Akurasi

Akurasi adalah kedekatan hasil yang diperoleh

dari suatu metode analisis dengan kadar yang sebe-

narnya. Biasanya dinyatakan dengan prosen perolehan

(39)

ALAT, BAHAN DAN METODE PENELITIAN BAB III

1. Bahan-bahan yang Digunakan .

- Asam askorbat/vitamin C p.a. (E. Merck)

- Kolesterol p.a. (E. Merck)

- Asam asetat glasial p.a. (E. Merck)

- Asetat anhidrida p.a. (E. Merck)

- Asam sulfat pekat p.a. (Riedel de Haen)

- Natrium sulfat anhidrat p.a. (Ferak)

- Heparin (Leo)

- Mangan klorida tetrahidrat p.a. (E. Merck)

2. Alat-alat yang Digunakan

- Spectrofotometer Hitachi dual wavelength double beam

type 557

- Fisher melting point apparatus

- Tabung pemusing

- Labu ukur

- Pipet volume

- Mikropipet

- Timbangan analitik Sartorius-Werke GMBH Type 2472

3.Cara Kerja

3.1. Analisis Kualitatif terhadap Vitamin C

3.1.1. Pemeriksaan Organoleptis

(40)

3.1.2. Reaksi Warna

- Larutan dalam air mereduksi perak nitrat dengan segera dalam keadaan dingin, menghasilkan endapan

hitam [28].

- 2 ml dari suatu larutan 2,0% ditambah 2 ml air,

0,1 g natrium bikarbonat dan kurang lebih 0,02 g

ferro sulfat, kocok dan biarkan, dihasilkan warna

deep-violet (lembayung tua), yang hilang pada

penambahan 5 ml asam sulfat encer [28].

- Larutan dalam air diberi 1 tetes larutan natrium

nitroprussid dan 3 tetes natrium hidroksida

encer, maka pada penambahan hidrogen klorida encer tetes demi tetes terjadi warna biru [293

- Dalam keadaan dingin, mereduksi larutan Fehling

dengan terbentuk endapan merah coklat sampai

jingga kuning [29],

- Larutan dalam air diberi 1 tetes larutan biru

metilen, maka lama-lama warna akan menjadi pucat bila diletakkan di tempat yang terang [29].

3.1.3. Pemeriksaan Titik Lebur

Kurang lebih 1 mg serbuk vitamin C dimasukkan dalam pipa kapiler berdinding gelas tipis dengan panjang 8 cm dan diameter 1 mm, yang salah satu

ujungnya tertutup. Bahan didorong masuk melalui

ujung pipa kapiler yang terbuka, kemudian ujung

(41)

mencapai ujungnya. Pipa kapiler ini dipasang pada

tempatnya, kemudian penangas air, dipanaskan perlahan-lahan. Ketika temperatur sekitar 15°C di bawah

titik leburnya, atur nyala api sehingga temperatur

meningkat dengan kecepatan 1-2°C per menit.

Temperatur saat bahan mulai melebur sampai melebur

sempurna disebut jarak titik lebur.

Titik lebur vitamin C adalah 190°C, diikuti dekomposisi [13, 14].

3.2. Hewan Percobaan

3.2.1. Rancangan Percobaan

heirirt percobun

( tin o U

dipuasikia s e lm

I2-H jii •

(files kolesterol to tii

din kolesterol H#L

Grnp pertata Grup kedua

Keloipok I Keloipok 11 (elotpok I I I Keloipok IV

(42)

Keterangan :

Kelompok I : makanan dasar

Kelompok II.l : makanan dasar + vitamin C dosis 1

Kelompok III : makanan dasar + kolesterol 3% 1 ml

+ vitamin C dosis 1

+ vitamin C dosis 2

+ vitamin C dosis 3

Dalam penelitian ini digunakan 40 ekor marmot

( Cavia porcellus) yang diperoleh dari Peternakan,

Jl. Raya Selecta No. 37, Batu, dengan kriteria

sebagai berikut :

- berjenis kelamin jantan

- berumur 2-3 bulan

- bobot badan 250-400 gram

- berada dalam keadaan normal dan sehat

Pada awal percobaan, 40 ekor marmot tersebut

dibagi menjadi 8 kelompok (masing-masing kelompok

5 ekor marmot) sebagai berikut :

I. Kontrol normal : hewan pecobaan diberi

makanan dasar (kangkung, ubi dan jagung).

(43)

vita-min C, yang dikelompokkan atas :

11.1. Diberi makanan dasar dan vitamin C

dosis 1.

dosis 2.

dosis 3.

III. Dengan pemberian makanan dasar dan kole

sterol 3% 1 ml.

IV. Dengan pemberian makanan dasar, koleste

rol 3% dan vitamin C, yang dikelompokkan

atas :

IV.1. Diberi makanan dasar, kolesterol 3%

1 ml dan vitamin C dosis 1.

Kolesterol diberikan dalam bentuk suspensi

dengan 0.5% akasia sebagai bahan pensuspensi.

Vitamin C diberikan dalam bentuk larutan yang

selalu dibuat baru.

Masing-masing marmot diperlakukan selama se-

bulan sesuai dengan kelompok dengan pemberian

secara per oral. Pada awal sebelum penelitian

(44)

terle-bih dahulu marmot dipuasakan selama 12-14 jam.

Pada akhir penelitian juga diambil sampel darah.

3.2.2. Pemilihan Dosis

Dosis bahan penelitian yang digunakan merupakan

dosis untuk manusia yang dikonversikan pada bina-

tang percobaan. Nilai konversi dosis manusia terha dap marmot 400 g adalah 0,031 [31]. Pada penelitian

ini digunakan dosis 500 mg, 1 g dan 1,5 g.

Dosis setara 500 mg = (500 mg x 0,031) : 400 g

= 0,039 mg/g BB marmot

Dengan cara yang sama, untuk dosis yang setara

dengan 1 g dan 1,5 g diperoleh 0,078 mg/g BB marmot dan 0,116 mg/g BB marmot.

4. Uji Validasi

4.1. Kelurusan

Kelurusan didapatkan dari perhitungan persamaan garis regresi.

n. Zxy - (2x) (Zy)

r = ---^n.Zx2 - (Zx)a ) (n.2y2~ (SyT2 )'

di mana : r = koefisien korelasi

x = kadar zat dalam larutan y = serapan yang terbaca

Persamaan garis : Y = bX + a

(45)

n.Sxy - Zx.Zy b =

---n.Zx2 - (Zx)2

4.2. Sensitivitas [27]

Untuk analisis instrumental harga LOD ditentukan

dengan cara menganalisa sejumlah sampel blanko dan

menghitung simpangan baku dari hasil yang didapatkan.

Simpangan baku ini dikalikan dengan suatu faktor,

biasanya 2 atau 3, menghasilkan perkiraan dari LOD.

Untuk penentuan harga LOQ, simpangan baku ini

dikalikan dengan 10.

4.3. Presisi

Harga presisi didapatkan berdasarkan perban-

dingan s dengan x atau dengan prosen koefisien

variasi.

s

% KV = — — . 100

x

s = /Z(x-x )2

n-1

Keterangan : x = kadar sampel

x = kadar sampel rata-rata

n = jumlah sampel

(46)

4.4. Akurasi

Akurasi metode ini dinyatakan dalam prosen

perolehan kembali (% Recovery) dengan persamaan :

% Recovery = --- . 100

CA + CB

dimana : = kadar sampel mula-mula

Cg = kadar larutan baku yang ditambahkan

Cjr = kadar sampel setelah penambahan larutan

baku

5. Pembuatan Kurva Baku

Pada penelitian ini diperlukan larutan baku induk

dan beberapa larutan baku kerja. Larutan baku induk

dibuat dengan kadar 5000,0 ppm dengan pembuatan sebagai

berikut :

- Ditimbang dengan seksama 250,0 mg kolesterol dimasuk-

k.an ke dalam labu ukur 50 ml, kemudian ditambah

dengan asam asetat glasial sampai garis tanda dan

dikocok sampai homogen.

- Larutan baku kerja dibuat dari pengenceran larutan

baku induk, sehingga didapatkan beberapa maeam kadar

yaitu 200,0 ppm; 400,0 ppm; 500,0 ppm: 1000,0 ppm;

(47)

5.1. Pemilihan Panjang Gelombang Maksimum

Pada pemilihan panjang gelombang maksimum meng

gunakan dua macam larutan baku kerja. Pelaksanaannya

sebagai berikut :

- Dipipet 0,2 ml larutan baku kerja dimasukkan ke

dalam tabung reaksi yang berisi pereaksi warna

Liebermann-Burchard yang sebelumnya tabung direndam

dalam air es, kemudian dikocok sampai homogen dan dibiarkan 30 menit pada suhu kamar, dimasukkan ke

dalam kuvet dan dibaca serapannya, dicari panjang

gelombang maksimum dengan alat spektrofotometer.

Sebagai titik nol -digunakan blanko aquadest ditambah pereaksi warna Liebermann-Burchard yang selan-

jutnya diperlakukan sama dengan larutan baku kerja

kolesterol.

5.2. Pembuatan Kurva Baku

Kurva baku dibuat dari larutan baku kerja

kolesterol dalam asam asetat glasial dengan kadar

200,0 ppm; 400.0 ppm; 500,0 ppm; 1000,0 ppm; 1500,0

ppm; 2500,0 ppm; 3000,0 ppm; 4000,0 ppm dan 5000,0 ppm. Masing-masing larutan baku kerja tersebut direaksikan seperti pada (5.1) dan dibaca serapannya pada

panjang gelombang maksimum yang didapat dari perco-

baaan (5.1). Dari data akan diperoleh persamaan garis

(48)

Liebermann Burchard, yang selanjutnya diperlakukan

sama dengan larutan baku kerja kolesterol.

6. Pengambilan Sampel Darah

Sebelum dilakukan pengambilan sampel darah, marmot

yang akan diambil darahnya dipuasakan selama 12-14 jam

sebelumnya. Masing-masing marmot yang akan diambil

darahnya secara intrakardial dianestesi dengan inhalasi

eter (Aether anaestheticus) dengan diperkirakan terca-

painya irama pernapasan yang teratur. Setelah marmot

ditelentangkan dengan posisi dada di depan, kemudian

diraba bagian jantung yang memberikan denyut terkuat.

Dengan menggunakan spuit disposable darah diambil

sebanyak 3 m l , kemudian darah dipindahkan ke dalam

tabung pemusing tanpa antikoagulan. Darah yang terkum-

pul dibiarkan selama 30 menit pada suhu kamar dan

kemudian dipusingkan selama 20 menit, sehingga serumnya

terpisah. Serum yang telah terpisah ini dimasukkan ke

daiam botol yang tertutup rapat, selanjutnya dilakukan

penentuan kadar [33].

7. Penentuan Kadar

7-1. Penentuan Kadar Kolesterol Total Serum

Kadar kolesterol total serum ditentukan menurut

metode Huang dan kawan-kawan dengan menggunakan

(49)

satu pereaksi warna yang dibuat dengan cara sebagai

berikut :

Ke dalam bejana yang direndam dalam air es, di

masukkan asam asetat glasial p.a., asetat anhi

drida p.a., asam sulfat pekat p.a. dengan per-

bandingan 3:6:1, dicampur sampai homogen. Kemu

dian ditambahkan ke dalamnya 2% Natrium sulfat

anhidrat p.a., kemudian dikocok sampai

homogen.

Penentuan kadar kolesterol total serum dilakukan

dengan cara sebagai berikut :

Ke dalam tabung-tabung reaksi yang berisi 5 ml

pereaksi Liebermann-Burchard (sebelumnya tabung

direndam dalam air es), dimasukkan dengan hati-

hati masing-masing 0,2 ml serum. Untuk larutan

blanko digunakan aquadest ditambah pereaksi

Liebermann-Burchard. Campuran dikocok sampai

tercampur merata, kemudian dibiarkan 30 menit

pada suhu kamar. Serapan dari masing-masing

larutan tersebut dibaca dalam waktu tidak lebih

10 menit pada panjang gelombang maksimum yang

terpilih, dengan menggunakan alat spektrofotome-

ter [23].

Perhitungan :

Untuk menghitung kadar kolesterol total, diguna

(50)

percobaan (5.2).

Catatan :

Sebelum hewan percobaan mengalami perlakuan,

maka dilakukan dulu penentuan kadar kolesterol

total dan kolesterol HDL serum sebagai pem-

banding,

7.2. Penentuan Kadar Kolesterol HDL Serum

Untuk penentuan kadar kolesterol HDL serum,

terlebih dahulu dilakukan teknik pengendapan selektif menggunakan pereaksi heparin dan Mangan klorida.

Pengendapan selektif ini berdasarkan sifat lipopro

tein, yaitu kemampuannya untuk bereaksi dengan kation

bervalensi dua (Mn^+ ) dan polianion (heparin). Pada

proses ini lipoprotein-lipoprotein yang terdapat

dalam serum akan diendapkan, kecuali HDL, kemudian

serum yang mengandung HDL ini ditentukan kadar

kolesterol HDL-nya .

Pada penentuan kadar kolesterol HDL ini, serum

yang digunakan adalah serum yang diambil dari hewan percobaan yang telah dipuasakan sebelumnya selama 12 14 jam. Pelaksanaan penentuan kadar kolesterol HDL

serum adalah sebagai berikut :

Sebanyak 1 ml serum dimasukkan ke dalam tabung

pemusing, kemudian ditambahkan berturut-turut larutan heparin 5000 unit/ml sebanyak 40 nl, dan

(51)

50 nl. Campuran dikocok sampai homogen dan di-

diamkan 30 menit pada suhu kamar. Setelah 30 menit, larutan disentrifugasi selama 20 menit,

kemudian supernatannya dipisahkan. Bila superna-

tan masih kelihatan keruh berarti pengendapan

kurang sempurna, maka harus direaksikan lagi

sampai pengendapan sempurna. Supernatan dipipet 0,2 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang

berisi 5 ml pereaksi warna Liebermann-Burchard,

yang sebelumnya tabung direndam dulu dalam air

es. Selanjutnya kadar kolesterol HDL ditentukan

sama seperti pada penentuan kadar kolesterol total serum [23].

8. Analisis data

(52)

I II III IV

X Y X Y X Y X Y

X 11 Y 11 X 12 Y 12 X 13 Y 13 X 14 Y 14

X21 Y21 X22 Y22 X23 Y23 X24 Y24

X31 Y31 X32 Y32 X33 Y33 X34 Y 34

X41 Y41 X42 Y42 X43 Y43 X44 Y 44

X 51 Y51 X52 Y52 X53 Y53 X54 Y54

Total 2X ZY ZX 2Y 2X ZY SX 2Y

Rata^ X Y X Y X Y X Y

I, II, III, IV = kelompok

X = kadar kolesterol total atau kolesterol

sebelum perlakuan

Y = kadar kolesterol total atau kolesterol

* setelah perlakuan

i = kolom 1, 2, ..., t

j = baris 1. 2, ..., n

HDL

(53)

Tabel Anakova Pro CRD

kelompok t-1 Txx Txy Tyy

Dalam

kelompok N-t Exx Exy Eyy SE N-t-1

SE

db = derajat bebas

JK = Jumlah kuadrat

JKS = Jumlah kuadrat sisa

(54)

Sxx = koreksi jumlah total kuadrat dari X

Sxy = koreksi jumlah total hasil dari X dan Y

t n t n

Syy = koreksi jumlah total kuadrat dari Y

t n

Txx = perlakuan jumlah kuadrat dari X

(55)

Txy = perlakuan jumlah hasil dari X dan Y

Tyy = perlakuan jumlah kuadrat dari Y

t n t n

mengetahui apakah perbedaan yang terjadi itu bermakna

atau tidak. dilakukan uji HSD (Honestly Significant

Difference).

HSD “ q a,k,N - k.\ /RJiT

(56)

Jika beda mean > HSD, berarti ada beda yang ber-

makna dan jika beda mean < HSD, berarti tidak ada beda

(57)

BAB IV

HASIL PERCOBAAN

1. Analisis sifat fisika kimia vitamin C

Hasil pemeriksaan sifat fisika kimia dan data

pustaka vitamin C dapat dilihat pada tabel II.

Tabel II. Hasil pemeriksaan sifat fisika kimia

dan data pustaka vitamin C

T T

T No. j

1 Pemeriksaan ij Data pustaka j Hasil pengamatan j

t

1. jOrganoleptis: t1

1 a. warna putih [14] j putih j

I b. bentuk serbuk kristalin j serbuk kristalin j

1 . | [14] j

1 c. ban tidak berbau [14]j tidak berbau j

1

t H2S04 encer | warna hilang [28]j warna hilang j

t c. dengan Na. nitro-j 1

1

prussid + NaOH + |

HC1 encer j biru [29] j biru

1 d. dengan Fehling | endapan merah endapan merah 1

1

(58)

2. Penentuan panjang gelombang maksimum

Dari pengamatan serapan larutan baku kolesterol

dengan kadar 461,8 mg/100 ml dan 236,2 mg/100 ml dida-

patkan panjang gelombang maksimum 620,5 nm. Hasil

pengamatan dapat dilihat pada gambar 1.

> panjang gelombang (nm)

Gambar 1. Penentuan panjang gelombang maksimum

larutan baku kolesterol dengan kadar

(59)

3. UJI VALIDASI

3.1. Kelurusan

Kelurusan ditentukan untuk mengetahui adanya

korelasi linier antara kadar zat yang dianalisis

dengan serapan yang diberikan.

Kelurusan ditentukan dengan mengukur beberapa

macam kadar larutan kolesterol dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 620,5 nm dan ditentukan

persamaan garis regresi serta koefisien korelasinya

(r).

Hasil pengamatan yang diperoleh dapat dilihat

pada tabel III dan kurva dapat dilihat pada gambar 2.

Tabel III. Serapan larutan kolesterol pada panjang gelombang 620,5 nm dengan 10 macam kadar

No. Kadar(mg/lOOml) Serapan

1- 20,01 0,038

2. 40,02 0,079

3. 50,02 0.096

4. 100,04 0,191

5. 150,06 0,282

6. 200,08 0,381

7. 250,10 0,473

8. 300,12 0,571

9. 400,16 0,759

(60)

,9J

/

t/

serapan .6-J

.5.

.4j

1

•

■'+-.2^

X /

.1

---,---,--- ,--- ,--- ---!---- 1---- ;---- 1---- 1---- f

0 50 100 150 230 250 300 350 400 450 500 550

--- > kadar larutan kolesterol (mg/100 ml)

Gambar 2. Kurva serapan terhadap kadar larutan kolesterol

(61)

Dari hasil perhitungan didapatkan persamaan

garis y = 1,9264.10~^x - 2,9612.10“^, dengan harga

koefisien korelasi (r) = 0,9998. Dari tabel koefisien

korelasi diketahui bahwa pada derajat kebebasan (f)

10 dengan derajat kepercayaan 0,05, diperoleh harga r

tabel = 0,632 berarti harga r hitung lebih besar dari

harga r tabel yang menunjukkan adanya korelasi linier

antara' kadar dengan serapan yang diberikan. Hasil

perhitungan dapat dilihat pada lampiran 1.

3.2. Sensitivitas

Harga LOD dan LOQ ditentukan dengan cara mengu-

kur serapan blanko sebanyak 10 kali, kemudian diukur

simpangan bakunya. Untuk penentuan LOD simpangan baku

ini dikalikan dengan 3 , kemudian hasilnya dimasukkan

pada persamaan kurva baku, sehingga didapatkan kadar

terkecil yang dapat terdeteksi. Untuk penentuan LOQ,

simpangan baku dikalikan dengan 10. Cara perhi-

tungannya sama dengan penentuan LOD.

Hasil pengamatan serapan blanko dapat dilihat

(62)

Tabel IV

Hasil pengamatan serapan blanko

No Serapan

1. 0,007

2. 0,010

3. 0,006

4. 0,008

5. 0,006

6. 0,009

7. 0,011

8. 0,010

9. 0,018

10. 0,006

Dari hasil perhitungan didapatkan harga LOD

adalah 2,44 mg/100 ml, dan harga LOQ adalah

4,55 mg/100 ml.

3.3. Presisi

Presisi ditentukan untuk mengetahui derajat

kinerulangan dari metode analisis pada kondisi pelaksanaan yang normal. Harga presisi didapatkan berda-

sarkan perbandingan s dan x atau dengan prosen koefi-

sien variasi. Harga presisi ini didapatkan dengan

inengamati serapan larutan kolesterol pada kadar

358,08 mg/lOOml sebanyak 10 kali. Hasil pengamatan

(63)

-Tabel V. Penentuan presisi

No. Kadar(mg/lOOml) ( x - x ) ( x - x ) 2

1 . 354,53 -2,80 7,8400

2. 356,60 -0,73 0,5329

3. 358,68 1,35 1,8225

4. 360,24 2,91 8,4681

5. 358,68 1,35 1,8225

6. 355,57 -1,76 3,0976

7. 358,68 1,35 1,8225

8. 357,64 0,31 0,0961

9. 357,64 0,31 0,0961

10. 355,05 -2,28 5,1984

M II O x = 357,33 2=30,7967

Perhitungan :

= 1,8498

s

% KV = --- x 100% x

1,8498

= --- x 100% 357,33

(64)

3.4. Akurasi

Akurasi diperoleh berdasarkan perbandingan

antara kadar sampel terhitung dengan kadar sampel

yang sebenarnya atau dinyatakan dengan prosen perole-

han kembali (% Recovery) dengan persamaan :

Cx

% Recovery = --- x 100% Ca + Cb

di mana : Cx = kadar terukur

Ca = kadar sampel mula-mula

Cb = kadar larutan baku yang ditambahkan

Hasil pengamatan dapat dilihat pada tabel VI

Tabel VI. Penentuan akurasi

Ca Cb Ca+Cb Cx % Recovery

62.27

Rata-rata = 99,88%

Dari hasil pengamatan didapatkan prosen recovery

rata-rata 99,88%. Prosen recovery yang memenuhi

syarat adalah 90-110% [37]. Berarti metode yang

(65)

4. Hasil pemeriksaan kadar kolesterol total serum

Pemeriksaan kadar kolesterol total serum marmot

dibagi menjadi 8 kelompok, yaitu : .

Kelompok I : makanan dasar rkontrol normal)

Kelompok II. 1 : makanan dasar + vitamin C dosis■ 1

Kelompok II. 2 : makanan dasar + vitamin C dosis 2

Kelompok II. 3 : makanan dasar + vitamin C dosis. 3

Kelompok Ill : makanan dasar + kolesterol 3% 1 ml

Kelompok IV. 1 : makanan dasar + kolesterol 3% 1 ml

Hasil pemeriksaan kadar kolesterol total serum

marmot dapat dilihat pada tabel VII.

Tabel VII

Hasil pemeriksaan kadar kolesterol total serum marmot

(66)

Keterangan :

X = kadar kolesterol total serum marmot sebelum

perlakuan (mg/lOOml)

Y = . kadar kolesterol total serum marmot setelah

Hasil pengamatan tersebut diolah secara statistik

dengan uji analisis kovarians (Anakova) yang tertera

pada lampiran 3, dengan a = 0,05.

* Uji Anakova untuk mengetahui apakah ada perbedaan di

antara kelompok I, II.1, II.2, II.3, dalam hal kole

sterol total [34, 38].

Dari hasil perhitungan dengan Anakova didapatkan :

Fhitung = 4,56 ; derajat bebas v-^ = 3

v2 = 15

Ftabel (a = 05) = 3,29

Fhitung > Ftabel’ Pada a = °'05

4.56 > 3,29

Maka H^ diterima dan Hq ditolak, hal ini berarti

bahwa ada perbedaan efek di antara kelompok-kelompok

tersebut dalam hal kadar kolesterol total. Untuk

mengetahui apakah perbedaan tersebut bermakna atau

tidak, maka dilakukan uji HSD. Hasil uji HSD dapat

(67)

Tabel VIII

Hasil uji HSD pemeriksaan kadar kolesterol total

serum marmot kelompok I, II.l, II.2 dan II.3

XI XII. 1 XI1.2 XII .3

XI - 4,36 6,02 7,27

xII.l - - 1,66 2,91

XII .2 - - - 1,25

XI1.3 - - -

-Keterangan :

X = selisih kadar kolesterol rata-rata setelah

dan sebelum perlakuan (mg/lOOml)

q = harga tabel pada a = 0,05, dengan derajat

bebas k dan N-k

RJK = rata-rata jumlah kuadrat (dalam perlakuan)

Harga HSD yang didapat 2,28 ; hal ini berarti :

- terdapat perbedaan bermakna antara kelompok II.l, II.2 dan II.3 bila dibandingkan dengan kelompok I (kontrol)

(68)

- tidak ada perbedaan bermakna antara kelompok

11.2 bila dibandingkan dengan kelompok II. 1, juga

antara kelompok II.3 bila dibandingkan dengan

kelompok II.2

* Uji Anakova untuk mengetahui apakah efek yang terjadi

setelah perlakuan dipengaruhi oleh kadar kolesterol

total sebelum perlakuan [34, 38].

Dari hasil perhitungan dengan anakova didapatkan :

^hitung = 2866,40; deraj at bebas = 1

v2 = 15

Ftabel = ° ’05 ) = 4 >54

^hitung ^ Ftabel’ Pa(^a a - 0,05 2866,40 > 4,54

Maka diterima dan Hq ditolak, hal ini berarti ada

pengaruh kadar kolesterol total sebelum perlakuan

dengan efek yang ditimbulkan setelah perlakuan.

* LJj i Anakova untuk mengetahui apakah ada perbedaan di

antara kelompok III, IV.1, IV.2, IV.3, dalam hal

kolesterol total [34, 38].

Fhitung = 8 >92 ; deraj at bebas = 3

v2 = 15

Ftabel (a = °?05) = 3>29

(69)

perbedaan efek di antara kelompok-kelompok tersebut

dalam hal kadar kolesterol total.

Untuk mengetahui apakah perbedaan tersebut bermakna

atau tidak, maka dilakukan uji HSD. Hasil uji HSD

dapat dilihat pada tabel IX.

j RJK '

HSD = q a,k,N-k\ /----V n

= 7 , 1 4

Tabel IX

Hasil uji HSD pemeriksaan kadar kolesterol total

serum marmot kelompok III, IV.1, IV.2 dan IV.3

X I 1 1 i—i > i—1

X

X I V . 2 X I V . 3

X I 1 1 - 7,88 9 , 5 5 12,04

XIV.l - - 1,67 4,16

X IV.2 - - - 2 , 4 9

X I V . 3 - - -

-Keterangan :

X = selisih kadar kolesterol rata-rata setelah

(70)

<3 = harga tabel pada a = 0,05, dengan derajat

bebas k dan N-k

RJK = rata-rata jumlah kuadrat (dalam perlakuan)

Harga HSD yang didapat 7,14 ; hal ini berarti :

- terdapat perbedaan bermakna antara kelompok IV.1,

IV.2 dan IV.3 bila dibandingkan dengan kelompok

III (kontrol).

- tidak ada perbedaan bermakna antara kelompok IV.1,

IV.2 dan IV.3 bila saling dibandingkan.

total sebelum perlakuan [34, 38]

FhitUng = 621,18 ; derajat bebas v^ = 1

' v2 = 15

F t a bel “ 0,05 ) = 4,54

^hitung Ftabel’ Pac^a a = 0,05

621,18 >4,54

pengaruh kadar kolesterol total sebelum perlakuan

5. Hasil pemeriksaan kolesterol HDL serum

Pemeriksaan kadar kolesterol HDL serum marmot

(71)

Hasil pemeriksaan kadar kolesterol HDL serum

marmot dapat dilihat pada tabel X.

Tabel X

Hasil pemeriksaan kadar kolesterol HDL serum marmot

i I I . 1 I I . 2 I I . 3 I l l I V . l I V . 2 I V .3

X T K Y K r X r >! r X r X r X f

5 7 ,6 0 58,12 52,41 54 ,4 ? ( 4 , 4 3 70,58 50 ,3 3 5 5 ,0 0 9 7 ,5 7 9 3 ,9 4 ? ? ,6 5 101,72 9 1 ,8 6 9 9 ,6 5 7 5 ,2 5 8 9 , 7B B l , 4 8 8 0 ,4 4 73,4? 70,06 2 3 ,3 4 25,94 25 ,4 2 3 1 ,1 3 9 2 ,9 0 87 ,7 1 22 ,3 0 27 ,4 9 8 0 ,9 6 ? 1 ,3 4 74,21 85,63 58 ,1 2 41,75 51,37 50,33 59,68 43,83 4 7 ,9 8 80,96 21,26 29 ,0 5 19,71 23 ,8 6 86,67 ? 3 ,4 2 45,66 51,37 3 3 ,7 2 29 ,0 5 2 7 ,4 ? 3 1 ,4 5 38 , ?1 41,51 67 ,4 4 7 1 ,1 0 3 0 ,0 ? 2B,53 72 ,4 5 7 9 ,9 2 69 ,5 4 7 5 ,7 7 7 9 ,4 0 9 3 ,4 2 2 1 ,2 4 23 ,3 4 8 1 ,4 8 85,11 52, ?3 57 ,0 8 3 3 ,2 0 3 5 ,2 8 5 ? ,1 6 40 ,7 1 96 ,5 3 10 6,40 2 7 ,4 9 3 4 ,2 4 8 1 ,4 8 8 9 ,2 7

1= 2 5 2 ,1 8 252,70 286,44 291,44 2 4 1,2? 2 5 8 ,?4 244,3? 273,47 3 0 0,98 299,94 310,84 33? ,39 3 5 6,52 394,42 354,00 409,47

r = 5 0 ,4 4 50,54 57,29 58 ,3 3 4 8 ,2 4 51 ,7 ? 4 8 ,8 8 5 4 ,4 ? 4 0 ,2 0 5 9 ,9 ? 42 ,1 7 4 7 ,8 8 7 1 ,3 0 7 8 ,8 8 7 1 ,2 0 8 1 ,8 9

Keterangan :

X = kadar kolesterol HDL serum marmot sebelum

Y = kadar kolesterol HDL serum marmot setelah

Hasil pengamatan tersebut diolah secara statistik

dengan uji analisis kovarians (Anakova) yang tertera

pada lampiran 4, dengan a = 0,05.

antara kelompok I, II.1, II.2, II.3, dalam hal kole

(72)

Fhitung “ 3,26 ; derajat bebas v^ = 3

v2 = 15