Pemetaan DNA Plasmid I. Tujuan
Memahami pemetaan DNA plasmid dengan pemotongan/restriksi menggunakan beberapa enzim restriksi.
II. Prinsip
DNA yang telah dipurifikasi di inkubasi pada suhu 37o C dengan enzim restriksi (endonuklease restriksi) menghasilkan DNA yang terpotong pada posisi yang sesuai dengan sisi restriksi. Kontrol negatif, yaitu sampel yang diinkubasi tanpa penambahan enzim restriksi, akan tetap utuh.
III. Teori Dasar
Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti, 2006).
Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai wahana (vektor) kloning, antara lain adalah : a). plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi; b). DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia; c). mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi; d). mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi; e). mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap antibiotik
tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu (Brock, et al., 1994)
Teknologi DNA rekombinan memanfaatkan pemotongan dan penyambungan DNA. Salah satu yang menyebabkan perkembangan teknologi DNA menjadi cepat adalah penemuan berbagai macam enzim yang dapat mengkatalisis pembelahan DNA di beberapa tempat yang dapat di produksi. Enzim-enzim tersebut dikenal sebagai enzim restriksi yang ditemukan pertama kali pada bakteri pada akhir tahun 1960-an. Kerja enzim endonuklease (enzim restriksi) mengenali urutan nukleotida spesifik dan memotong DNA pada posisi di antara atau di luar sekuen yang dikenalinya tersebut. Selain itu dikenal juga istilah ruas restriksi, yaitu ruas-ruas DNA tempat pemotongan oleh enzim. Pemotongan DNA dilakukan pada lokasi-lokasi yang spesifik, mengenali daerah atau urutan DNA pendek dalam molekul DNA, dimana urutan DNA yang dikenali tersebut bersifat palindrome. Selanjutnya, enzim akan memotong DNA pada titik tertentu di dalam urutan DNA tersebut. Enzim restriksi yang berhasil dimurnikan pertama kali adalah EcoRI dan EcoRII dari Escherichia coli, dan HindII dan HindIII dari Haemophilis influenza. Enzim-enzim tersebut diketahui memotong DNA pada urutan basa tertentu yang spesifik, yang menghasilkan fragmen-fragmen seukuran gen yang dapat disambungkan kembali (Muladno 2002).
Secara umum, enzim restriksi dapat dibedakan ke dalam 3 tipe, berdasarkan pada komposisi sub unit, posisi pemotongan, spesifisitas sekuen DNA, dan perlu tidaknya kofaktor. Beberapa faktor yang harus diperhatikan untuk melakukan pemotongan dengan enzim restriksi (enzyme digestion). Di antaranya, gunakan jumlah DNA, enzim, dan buffer yang benar dalam volume reaksi total yang sesuai. DNA harus terbebas dari kontaminan seperti fenol, kloroform, alkohol, EDTA, deterjen (SDS) atau garam yang berlebih. Metilasi DNA dapat mengakibatkan penghambatan digesti dengan enzim tertentu. DNA plasmid superkoil dan DNA yang terikat gel agarose pada umumnya
memerlukan lebih dari 1 unit/ug untuk dapat terpotong sempurna. (Muladno 2002).
Enzim restriksi memotong DNA double strands dengan memutus ikatan kovalen di antara fosfat dari satu deoksiribonukleotida dengan gula dari deoksiribonukleotida yang berbatasan dengannya. Terdapat dua tipe hasil pemotongan, ujung rata (blunt end) dan ujung kohesif (sticky end). Ujung rata (blunt end) dihasilkan ketika dua utas molekul dipotong pada posisi yang sama, bagian akhirnya rata dan tidak ada nukleotida yang tidak berpasangan. Ujung kohesif (sticky end) dihasilkan ketika setiap molekul DNA dipotong pada posisi yang tidak sama sehingga salah satu utas (5’ atau 3’) menggantung dengan beberapa nukleotida. Akhiran single strand yang tidak rata ini dapat berpasangan secara spontan dengan basa pasangannya sehingga disebut sticky (mudah lengket) atau kohesif (Suharsono & Widyastuti, 2006).
Hasil pemotongan enzim restriksi endonuklease ada dua macam yaitu ujung blunt atau flush dan ujung sticky atau cohesive :
(A) ujung blunt dan ujung sticky. (B) Tipe ujung sticky berbeda. (C) Tipe ujung sticky sama dihasilkan oleh dua enzim restriksi endonuklease berbeda. Ujung blunt atau flush menghasilkan fragmen yang
double-stranded, sedangkan ujung sticky atau cohesive menunjukkan
enzim restriksi endonuklease pada posisi yang berbeda dari dua untai DNA yang komplementer. Beberapa pemotong ujung sticky menghasilkan ujung 5’ atau ujung 3’ yang menggantung (Brown, 2002).
Enzim restriksi mampu memotong DNA pada situs pengenal dengan sekuensi DNA yang sangat spesifik (recognition site). Dengan demikian enzim ini mampu memproses DNA menjadi potongan-potongan yang lebih pendek asal DNA tersebut memiliki situs pengenal untuk enzim restriksi tertentu. Pada umumnya situs pengenalan enzim restriksi terdiri atas empat atau enam basa, selain itu enzim restriksi yang berbeda akan memiliki situs pengenalan yang berbeda juga. Akan tetapi, terdapat beberapa beberapa enzim yang diisolasi dari sumber yang berbeda
memiliki situs pengenalan yang sama. Enzim-enzim seperti ini disebut isoschizomer, contohnya adalah enzim MboI dan Sau3AI. Walaupun situs pengenalannya sama, aktivitas pemotongannya mungkin akan berbeda. Situs pengenalan enzim restriksi ini adalah daerah simetri atau palindrom, yaitu situs atau sekuen pengenalan yang memiliki urutan basa yang sama pada kedua utas DNA bila dibaca dari arah kiri dan kanan (Saputra, 2008).
Enzim restriksi merupakan enzim yang tidak stabil. Oleh karena itu, sebaiknya disimpan pada suhu -20°C untuk sebagian besar enzim. Beberapa enzim perlu disimpan pada -70°C. Enzim ini harus tetap disimpan di dalam es ketika dikeluarkan dari freezer dan harus selalu menjadi komponen yang ditambahkan terakhir pada campuran reaksi. Selain stabilitas, harga enzim restriksi pun mahal. Campur reaksi dengan baik dengan cara pemipetan atau menggoyang tabung reaksi. Sentrifus dengan cepat selama beberapa detik jika ada cairan yang menempel di dinding tabung. Untuk menghentikan reaksi enzim, dapat dilakukan penambahan stopper reagent yang mengandung SDS-EDTA (Suharsono & Widyastuti, 2006).
Enzim restriksi memiliki 3 tipe, tipe I memotong DNA secara acak dan jauh dari sekuens pengenalannya, tipe II memotong DNA dekat atau pada situs pengenalan, enzim tipe II yang umum digunakan adalah HhaI, HindIII, EcoRI, dan NotI. Tipe III tidak digunakan dalam laboratorium. Hal ini dikarenakan enzim ini memotong di luar situs pengenalan dan membutuhkan dua sekuen dengan orientasi berlawanan pada DNA yang sama untuk menyelesaikan pemotongan sehingga enzim ini jarang menghasilkan potongan sempurna. Enzim restriksi EcoRI mendeskripsikan bakteri Escherichia coli strain RY13 dan Urutan I enzim yang ditemukan pada bakteri ini. Enzim ini termasuk subtipe ortodoks, yang memotong pada situs pengenalan urutan heksanukleotida 5’- GAATTC-3’ (Pingoud & Jeltsch, 2001).
Dalam menyusun peta restriksi harus dilakukan suatu rangkaian digesti restriksi. Jumlah dan ukuran fragmen yang dihasilkan oleh tiap-tiap endonuklease restriksi harus ditentukan dengan elektroforesis gel, kemudian dibandingkan dengan ukuran marka. Hasil yang didapat harus didukung oleh hasil rangkaian digesti ganda, yaitu DNA dipotong dengan dua enzim restriksi secara bersamaan. Pembandingan hasil digesti tunggal dan digesti ganda akan memungkinkan pemetaan banyak tempat restriksi (Glick & Pasternak, 1994).
Enzim restriksi dan situs restriksi pada pCambia 1380 :
(GSL Biotech, 2013)
IV. Alat dan Bahan A. Alat
1. Lemari pendinginan dan freezer 2. Mikropipet
3. Mikrosentrifuga
4. Pemanas air (water bath) 5. Tabung Eppendorf 6. Tabung sentrifuga 7. Tip mikropipet 8. Termometer
B. Bahan
1. Enzim restriksi BamH1 2. Enzim restriksi EcoR1 3. Plasmid pCAMBIA
C. Gambar Alat
Mikropipet & Tip Tabung Eppendorf Tip mikropipet
V. Prosedur
Tabung Eppendorf kosong disiapkan. Selanjutnya dengan menggunakan mikropipet, ke dalam tabung eppendorf tersebut dimasukkan ddH2O sebanyak 6 µL, lalu ditambahkan 2 µL buffer Tango dan 8 µL plasmid pJ express. Setelah itu dilakukan pipetting. Selanjutnya ditambahkan enzim restriksi XHO I 2 µL dan NDE I 2 µL, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam. Semua prosedur diatas dilakukan secara aseptis. Setelah diinkubasi kemudian dilanjutkan dengan elektroforesis.
VI. Data pengamatan Pemetaan DNA plasmid
No. Perlakuan Hasil
1 Sebanyak 8 µl ddH2O dimasukkan ke dalam tabung eppendorf, lalu ditambahkan larutan buffer 10x sebanyak 2 µl, dan 8 µl DNA plasmid yang akan dipotong-potong.
Larutan belum tercampur sempurna.
2 Isi tabung eppendorf dicampurkan.
Larutan menjadi homogen.
3 Ditambahkan enzim restriksi Eco RI dan Bam HI sebanyak 2 µl.
Enzim tercampur dengan larutan tadi.
4 Dilakukan inkubasi selama 1 jam pada suhu 37 oC.
Larutan berisi DNA plasmid yang telah terfragmentasi siap di deteksi dengan elektroforesis.
VII. Pembahasan
Pada praktikum kali ini dilakukan pemetaan DNA plasmid yang bertujuan untuk memahami pemetaan DNA plasmid dengan pemotongan atau restriksi menggunakan beberapa enzim restriksi. Prinsip percobaan pemetaan DNA plasmid adalah DNA yang telah dipurifikasi di inkubasi pada suhu 370C dengan enzim restriksi (endonuklease restriksi) menghasilkan DNA yang terpotong pada posisi yang sesuai dengan sisi restriksi. Sedangkan kontrol negatif, yaitu sampel yang diinkubasi tanpa penambahan enzim restriksi tetap utuh.
Prosedur pertama dimasukkan terlebih dahulu dd H2O atau aqua bidestillata sebanyak 6 μL ke dalam tabung eppendorf. Larutan dd H2O ini digunakan sebagai zat untuk mempermudah proses pencampuran komponen-komponen yang dimasukkan ke dalam tabung eppendorf. Selain itu, ddH2O juga berfungsi untuk meresuspensikan endapan DNA. Selanjutnya dimasukkan larutan buffer. Larutan buffer yang digunakan adalah buffer Tango yang terdiri dari 33 mM Tris-acetate (pH 7.5 at 37°C), 10 mM Mg-acetate, 66 mM K-acetate, 0.1 mg/mL BSA (Bovine Serum Albumin). BSA pada buffer ini dapat mengikat kontaminan-kontaminan yang mungkin ada pada sampel DNA. Buffer ini berfungsi sebagai zat yang dapat menstabilkan enzim restriksi sehingga enzim dapat memotong plasmid dengan sempurna. Kemudian dimasukkan plasmid p-CAMBIA 1380 hasil isolasi sebelumnya sebanyak 8 μL. Dan terakhir dimasukkan enzim-enzim restriksi yang digunakan yaitu Eco R1 dan Bam
H1 masing-masing sebanyak 2 μL. Enzim-enzim ini yang akan memotong
plasmid pada daerah restriksi tertentu. Kemudian dilakukan pengocokan menggunakan vortex. Pengocokan dengan menggunakan vortex selama 5 detik dilakukan untuk mempercepat reaksi pemotongan DNA plasmid dengan enzim restriksi. Volume akhir untuk komponen reaksi biasanya berkisar antara 10–50 µL. Hal ini disebabkan karena pada volume akhir di
bawah 10 µL terdapat kemungkinan yang besar untuk terjadinya kesalahan pipeting sehingga volume akhir yang diperoleh tidak sesuai.
Enzim restriksi adalah enzim yang dapat memotong DNA. Enzim restriksi yang diproduksi oleh bakteri dinamakan endonuklease yang secara tipikal mampu mengenali 4 – 8 bp urutan nukleotida yang spesifik. Urutan nukleotida yang spesifik tersebut dinamakan restriction site yang secara umum merupakan sekuens palindromic (run back) yang pendek dengan pola urutan sekuens yang sama ketika dibaca pada arah 5′ → 3’. Sisi pengenalan enzim restriksi berbeda-beda pada suatu fragmen DNA. Enzim restriksi yang digunakan pada praktikum kali ini adalah BamH1 dan EcoR1. Penggunaan dua enzim restriksi yang berbeda dilakukan supaya DNA plasmid dapat terpotong dengan sempurna. Enzim restriksi
EcoR1 diisolasi oleh Herbert Boyer pada tahun 1969 dari bakteri Eschericia coli. Enzim EcoR1 ini memutus atau memotong DNA pada bagian urutan basa GAATTC (sekuens pengenal bagi Enzim EcoR1 adalah GAATTC). Pada DNA utas ganda, sekuen GAATTC ini akan berpasangan dengan pasangan sekuen yang sama tetapi berlawanan arah. Jadi pasangan GAATTC adalah CTTAAG. Pada pasangan sekuen ini enzim EcoR1 ini memotong bagian antara A dan G. Sebagai akibatnya, potongan-potongan atau fragmen-fragmen DNA utas ganda yang dihasilkan akan memliki ujung berutas tunggal. Ujung seperti ini yang dikenal dengan istilah sticky ends atau cohesive ends.
Enzim restriksi BamH1 diisolasi dari bakteri Bacillus amylolyquefaciens. Enzim restriksi ini mengenali double strand dari DNA
dengan sekuens spesifik 5′-GGATCC-3′, yang selanjutnya memecah ikatan fosfodiester antara dua residu G. Hasilnya adalah berupa dua fragmen yang ujungnya sticky ends. Penambahan enzim restriksi sebagai komponen terakhir pada reaksi disebabkan karena enzim restriksi merupakan enzim yang tidak stabil. Oleh karena itu enzim restriksi sebaiknya disimpan pada suhu -200 C dan -700 C untuk beberapa enzim
tertentu. Enzim ini harus tetap disimpan di dalam es ketika dikeluarkan dari freezer. Selanjutnya, campuran DNA plasmid dan komponen-komponen tadi diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC. Setelah diinkubasi, dilakukan elektroforesis gel agarosa untuk melihat hasil restriksi DNA menggunakan enzim EcoR1 dan Bam H1.
Berdasarkan literatur peta plasmid p-Cambia 1380 memiliki 8861 pasang basa (bp). Enzim EcoR1 memotong pada 8786 pasang basa (bp) sedangkan enzim BamH1 memotong pada 8796 pasang basa (bp). Sehingga secara teoritis, pemotongan dengan menggunakan enzim ini menghasilkan dua fragmen DNA yaitu fragmen pertama sebesar 10 pasang basa (bp) dan fragmen kedua sebesar 8851 pasang basa (bp). Kemudian dilakukan analisis fragmen DNA untuk menentukan jumlah dan ukuran
fragmen yang dihasilkan oleh setiap endonuklease restriksi (enzim restriksi) yang digunakan dengan metode elektroforesis gel agarosa.
Setelah dilakukan elektroforesis gel agarosa pada DNA plasmid yang direstriksi menggunakan enzim EcoR1 dan Bam H1, didapatkan hasil sebagai berikut:
DNA marker yang digunakan pada elektroforesis ini adalah DNA ruler 1 kb (kilo basa). DNA marker ini digunakan karena diharapkan hasil dari restriksi DNA plasmid dapat terlihat. DNA ruler 1 kB ini dapat mendeteksi ukuran fragmen DNA dengan rentang 10.000 bp (terbesar) sampai dengan 250 bp (terkecil). Pada kolom well kedua, yaitu tempat meletakkan sampel DNA plasmid yang direstriksi, terlihat fluoresensi kuat dari fragmen DNA plasmid di atas ukuran 10.000 bp dan fluoresensi lemah pada rentang 8000 bp - 10.000 bp. Berdasarkan hasil pengamatan, DNA plasmid yang terdeteksi oleh DNA marker 1 kb hanya fragmen DNA plasmid yang kedua yaitu fragmen DNA pasmid dengan ukuran 8851 bp.
Fragmen DNA plasmid pertama dengan ukuran 10 bp tidak dapat terdeteksi karena batas minimal yang dapat dideteksi oleh DNA ruler 1 kb adalah fragmen dengan ukuran 250 bp. Oleh karena itu, diperlukan DNA ruler yang lebih spesifik untuk mendeteksi adanya fragmen DNA plasmid dengan ukuran 10 bp. Pada rentang 8000 bp – 10.000 bp, terlihat adanya fluoresensi yang sangat lemah sehingga diduga fragmen DNA plasmid kedua (8851 bp) terletak di daerah tersebut namun dengan jumlah yang sedikit. Dan terdapat fluorsensi kuat pada rentang di atas 10.000 bp. Hal tersebut membuktikan bahwa terdapat DNA selain DNA plasmid yang memiliki ukuran di atas 10.000 bp. DNA yang berukuran di atas 10.000 bp diduga sebagai DNA lain yang bukan merupakan DNA plasmid. Hal ini dikarenakan suatu DNA plasmid yang belum terpotong atau masih utuh hanya berukuran 8861 bp.
VIII. Kesimpulan
Pemetaan DNA plasmid pada praktikum ini dapat dipahami. Pemetaan DNA plasmid dilakukan dengan cara melakukan pemotongan plasmid p-Cambia 1380 (8861 bp) dengan enzim restriksi EcoR1 dan BamH1. Enzim EcoR1 memotong pada daerah bp 8786 dan BamH1 memotong pada bp 8796 sehingga dihasilkan 2 fragmen DNA dengan ukuran 10 bp dan 8851 bp.
Daftar Pustaka
Brock, T. D., Michael T. Madigan, John M. Martinko and Paker. 1994. Biology of
Microorganisms. 7th edition. Prentice Hall. USA.
Brown, T.A. 2002. Genome 2nd Edition. Available online at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=genomes.figgrp.6026 [diakses tanggal 29 Oktober 2013].
Glick, B.R. and J.J. Pasternak. 1994. Molekuler Biotechnology, Principles and
applications of Recombinan DNA. ASM Press. Washinton D.C
GSL Biotech. 2013. pCAMBIA1380. Available at : http://www.snapgene.com/resources/plasmid_files/plant_vectors/pCAMBIA1 380/ [diakses tanggal 30 Oktober 2013]
Muladno. 2002. Teknik Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda. Bogor.
Pingoud, A. & Jeltsch, A. 2001. Structure and function of type II restriction
endonucleases. Available online at
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC55916/ [diakses tanggal 29 Oktober 2013]
Saputra A. 2008. Analisis ukuran kromosom dan pola restriksi Bacillus
thuringiensis dengan elektroforesis medan berpulsa. Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Suharsono & Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik
Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi,
