Bioteknologi Farmasi

(1)

Bioteknologi Farmasi

Penanggung jawab: Dr Amarila Malik

Departemen Farmasi FMIPA-Universitas Indonesia

FAR 40541 2 SKS

(2)

SASARAN PEMBELAJARAN

:

Mengetahui konsep-konsep dalam bioteknologi,

keterkaitan beberapa disiplin ilmu dalam

bioteknologi, teknologi rekayasa biologi organisme,

teknologi DNA rekombinan/rekayasa genetika,

pemanfaatan bioteknologi dalam bidang farmasi,

dan penerapan bioteknologi dalam upaya

(3)

PUSTAKA :

•Wink, M. (Ed). An introduction to Molecular Biotechnology, 2006

•Glick, B.R & Paternak, J.J, 1998. Molecular Biotechnology, Principles

and Applications of Recombinant DNA, ASM Press.

•Jognson & Manasse, 1993. Biotechnology in Pharmacy, John E. Smith, 1985. Biotechnology Principles, Van Nostrand Reinhold (UK) •Wulf Crueger and Annelies Crueger, 1984. Biotechnology A Text

Book of Industrial Microbiology. Sinaeur Association Inc. Sunderland,

MA, USA

•J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, 1989. Moleculer Cloning A

Laboratory Manual 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab. Pres, USA

•James D. Watson, John Tooze, Davit T.Kurtz, 1983. Recombinant

DNA, Scientific American Books, New York, USA

•Indra K. Vasil, 1990. Biotechnology, Science, Education, 2nd Commercialization (Editor), Elsevier Scientific Publish. Co.Inc.

(4)

•Pendahuluan

•Konsep-konsep dalam bioteknologi dan prospeknya dalam bidang farmasi,

•Disiplin ilmu yang terkait dalam bioteknologi, •Teknologi bioproses

•Pengembangan galur berpotensi dalam bidang farmasi: fermentasi dan kinetikanya, proses hilir

•Materi genetik

•Rekayasa genetika dan Teknologi DNA rekombinan •Terapi gen pada manusia,

•Pemanfaatan organisme prokariot dan eukariot dalam bidang farmasi,

(5)

• Pendahuluan - Bioteknologi Farmasi

• Dampak bioteknologi terhadap bidang

farmasi

• Rekayasa genetika-rekombinasi DNA –

kloning gen

• Aplikasi teknik molekular

• Produk komersial dari mikroorganisma

• Terapi Gen

(6)

BIOTEKNOLOGI FARMASI

Definisi: Aplikasi dari bioteknologi dalam farmasi

àDampak terhadap : obat-obatan diagnostik vaksin

BIOTEKNOLOGI:

- Pemanfaatan mikroorganisme untuk memproduksi produk-produk yang penting dan

Bermanfaat : protein dan enzim

-Rekayasa genetika hewan dan tanaman agar menghasilkan protein asing tertentu, juga senyawa kimia lainnya, spt. Vitamin

(7)

PATOFISIOLOGI PENYAKIT

DRUG ACTION

IDENTIFIKASI DAN PRODUKSI TARGET OBAT: RESEPTOR, ENZIM

(8)

TEKNIK DASAR BIOTEKNOLOGI BERBASIS BIOLOGI MOLEKULER

ORGANISME REKOMBINAN

Human insulin (1978):

produk farmasi pertama hasil rekayasa genetika Sepotong DNA penyandi hormon insulin manusia

Transfer ke mikroorganisme : E. coli

Kontrol ekspresi Human insulin di E. coli

Gene cloning

Teknik : Rekayasa Genetika

Genetically modified/genetically engineered 1994:

21 produk farmasi turunan teknologi rekombinasi DNA 150 produk dalam taraf “clinical trial”

(9)

Dampak Bioteknologi terhadap Farmasi

TUGAS:

Cari apa saja dampak bioteknologi terhadap farmasi. Diskusikan per kelompok

Cari protein-protein yang diproduksi secara teknologi DNA rekombinan

Terhadap profesi farmasis:

àisu-isu ke arah farmakoekonomi dan etika (sosial)

àMenjawab dan menjelaskan kepada pasien penanganan obat-obat dan efek/akibat penanganan yang tidak tepat

(10)

DAMPAK BIOTEKNOLOGI

TERHADAP BIDANG FARMASI

I. Obat – obatan berupa protein dan peptide

• stabilitas, formulasi, penyimpanan, efek samping berbeda dengan obat –

obat yang berupa molekul, kecil

Contoh : suhu refrigerator ; tidak boleh terkocok

II. Pilihan produk biotek ( protein & peptida).

• Pertimbangan sistem ekspresi

(11)

III. Obat – obat kelas baru yang beredar di pasaran

• Pemahaman patofisiologi penyakit yang sebelumnya tidak dapat

diatasi .

Contoh : human insulin ( HumulinR Lilly ) ; Hep B-vaccine

(Engerix – BR _{Smith Kline Beecham)}

IV. Agents diagnostik model baru

• Contoh : ELISA à monoclonal antibody (Enzyme – Linked

immunosorbant Assay) àreaksi warna

• probe untuk Plasmodium falciparum, berupa potongan DNA spesifik

Profesi FARMASIS “

• Isu – isu ke arah farmakoekonomi & etika (ethical )

• Menjawab dan menjelaskan kepada pasien penanganan obat – obat dan efek /akibat penanganan yang tidak tepat.

(12)

R A K A Y A S A G E N E T I K A

Definisi

Adalah proses pembentukan rekombinan baru dari material genetik dengan cara penyisipan suatu molekul asam nukleat asing ( yang dihasilkan di luar sel ) ke dalam suatu vektor, sehingga

memungkinkan penggabungan dan kelanjutan berkembang / diperbanyak di dalam sel inang yang baru.

KLON adalah organisme identik yang terbentuk secara genetik dan membawa seluruh potongan DNA yang telah disisipkan, dan

memperbanyak molekul yang baru.

Kloning gen à rekayasa genetika, teknologi DNA rekombinan Contoh : domba Dolly

(13)

RAKAYASA GENETIKA

Material genetik :

adalah material yang membawa informasi genetik yang diturunkan dari tetua ke turunannya, yaitu asam nukleat

DNA : deoksi ribonucleic acid RNA : ribonucleic acid

Vektor Kloning :

adalah wahana pembawa gen target untuk mengintroduksi gen ke inang tertentu.

Gen :

(14)

- Menerobos barier alamiah suatu spesies

àInsulin manusia diproduksi oleh E. coli à E. coli sebagai pabrik biologis

-Memungkinkan memperoleh dan memanipulasi secara relatif

potongan – potongan DNA yang menyandikan fungsi spesifik terapi gen penyebab penyakit keturunan

Co : Sindrom Hurler ( KOMPAS, 02/08’97)

sel sumsum tulang belakang diekrtraksi, dimanipulasi dengan sel – sel normal, diintroduksi kembali melalui pembuluh darah.

(15)

Adanya rekayasa genetika memungkinkan kita tidak hanya

mengisolasi dan menskrining, tapi juga dapat mengkonstruksi

organisme, dalam hal ini galur – galur yang produktif. Mikroorganisme

Tanaman BIOREAKTOR

Hewan

ASPEK KLONING

Dua dasar penerapan kloning gen

1. Isolasi dan studi gen – gen tertentu

àDiperoleh pengertian yang mendalam mengenai fungsi dan mekanisme regulasi gen

(16)

TEKNIK – TEKNIK DASAR YANG BERKAITAN DENGAN KLONING GEN

•Metode isolasi DNA

•Metode memotong dan menyambung molekul – molekul asam nukleat

•Metode transformasi pada sel host/ inang ; sebagai dasar :

Escherichia coli

( E. coli )

à

why ?

Hampir semua pengembangan pertama teknik rekayasa genetika digunakan E. coli sebagai organisme inang :

• Paling banyak dipelajari

• Paling lengkap informasi material genetiknya : - sudah lengkap peta genomnya.

(17)

DEFINISI

§Isolasi DNA

mengekstraksi molekul DNA dari sel §Memotong DNA ( digestion )

memutus ikatan molekul DNA pada antara basa nt pada sekuens tertentu oleh suatu endonuklease restriksi

§Menyambung DNA ( Ligation )

Potongan DNA / gen asing disambungkan dengan DNA vector yang terpotong linier oleh enzim Ligase

§Transformasi

§Mengintroduksi DNA ke dalam sel inang

DEFINISI

§Isolasi DNA

mengekstraksi molekul DNA dari sel §Memotong DNA ( digestion )

memutus ikatan molekul DNA pada antara basa nt pada sekuens tertentu oleh suatu endonuklease restriksi

§Menyambung DNA ( Ligation )

Potongan DNA / gen asing disambungkan dengan DNA vector yang terpotong linier oleh enzim Ligase

§Transformasi

(18)

ISOLASI DNA

1.Penghancuran dinding sel : - mekanik

- enzimatis

2. Lisis sel : - S D S : sodium dodesil sulfat

- Triton X – 100

3. Membersihkan debris sel

- sentrifugasi dilanjutkan dengan depresipitasi dengan solven

organik

Contoh : fenol, CHCl3 kemudian disentrifugasi ;

atau proteinase-K

4. Presipitasi

- + alkohol à sentrifugasi gradien CsCl ;

elektro-- + alcohol + NH

₄

asetat

ISOLASI DNA

1.Penghancuran dinding sel : - mekanik

- enzimatis

2. Lisis sel : - S D S : sodium dodesil sulfat

- Triton X – 100

3. Membersihkan debris sel

- sentrifugasi dilanjutkan dengan depresipitasi dengan solven

organik

Contoh : fenol, CHCl3 kemudian disentrifugasi ;

atau proteinase-K

4. Presipitasi

- + alkohol à sentrifugasi gradien CsCl ;

elektro-- + alcohol + NH

₄

asetat

(19)

Memisahkan DNA plasmid dan DNA kromosom/genom 1. Beda struktur tersier :

DNA plasmid : supercoiled à Covalently Closed Circular ( CCC ) DNA kromosom/genom : linier

2. Sifat denaturasi

- dengan alkali, pemanasan

- DNA plasmid lebih mudah renaturasi

3. Ultrasentrifugasi :

CsCl gradien à DNA plasmid berada di bawah

4. Mobilitas di elektroforesis gel agarose

àDNA plasmid lebih diskret /tajam pitanya CsCl / EtBr : DNA linier (kromosom)

DNA Supercoiled (plasmid)

Memisahkan DNA plasmid dan DNA kromosom/genom 1. Beda struktur tersier :

DNA plasmid : supercoiled à Covalently Closed Circular ( CCC ) DNA kromosom/genom : linier

2. Sifat denaturasi

- dengan alkali, pemanasan

- DNA plasmid lebih mudah renaturasi

3. Ultrasentrifugasi :

CsCl gradien à DNA plasmid berada di bawah

4. Mobilitas di elektroforesis gel agarose

àDNA plasmid lebih diskret /tajam pitanya CsCl / EtBr : DNA linier (kromosom)

(20)

Agarose gel electrophoresis

DNA size

lamda lamda plasmid plasmid +RE +RE

(21)

ANALISIS KUALITAS DAN KUANTITAS DNA

•Elektroforesis

- DNA diwarnai dengan Etidium bromida

- dilarikan pada gel agarose dari kutub (–) ke (+) - dapat diketahui adanya degradasi

Degradasi :

Ik. Fosfodiester putus Penyimpanan :

> - 200_{C - DNAse tidak aktif}

- mencegah degradasi oleh DNAse > TE buffer : mencegah degradasi oleh DNAse

(22)

METODE – METODE ISOLASI PLASMID

broad hostrange à dapat bereplikasi pada sejumlah spesies

bakteri

narrow hostrange à hanya dapat bereplikasi pada spesies khusus

Beberapa ciri khas plasmid untuk vektor cloning : §Ukuran kecil

§Mempunyai situs – situs pengenalan ER yang unik ( tunggal ), tempat insert disisipkan / diklon.

§Satu atau lebih penanda seleksi genetic, untuk mengindentifikasi sel resipien yang membawa kontruksi DNA vektor - insert.

§Plasmid cloning vector harus di-genetically engineered Contoh : pBR 322, pUC 19

(25)

PLASMID

-Molekul DNA ekstrakromosom yang bereplikasi mandiri, berbentuk sirkular, utas ganda.

- Terutama ditemukan pada bakteria, juga : Kapang

Eukariotik ( beberapa ) - Plasmid alami menyandikan :

1. Resistensi AB

2. Colicin = Bakteriosin 3. Virulensi

4. Aktivitas metabolit

PLASMID

-Molekul DNA ekstrakromosom yang bereplikasi mandiri, berbentuk sirkular, utas ganda.

- Terutama ditemukan pada bakteria, juga : Kapang

Eukariotik ( beberapa ) - Plasmid alami menyandikan :

1. Resistensi AB

2. Colicin = Bakteriosin 3. Virulensi

(26)

STABILITAS PLASMID

kondisi optimum, stabil medium tumbuh - Mandiri à tidak tergantung kromosom

ada gen ORI : untuk replikasi mandiri - Plasmid rekayasa

Untuk teknologi DNA rekombinan

STABILITAS PLASMID

kondisi optimum, stabil medium tumbuh - Mandiri à tidak tergantung kromosom

ada gen ORI : untuk replikasi mandiri - Plasmid rekayasa

(27)

•

Diperoleh dari bakteri sbg mekanisme pertahanan

terhadap infeksi virus DNA

•

Endonucleases = memotong (cleave) di dalam utasan

•

Why incubate at 37

°

C?

Body temperature is optimal for these and most other

enzymes

•

What happens if temperature is too hot or cool?

G

Too hot = enzyme may be denatured, killed

J

Too cool= enzyme activity lowered, requiring longer

(33)

(34)

(35)

Agarose Electrophoresis

•

Arus listrik yang membawa DNA bermuatan

negatif ke elektroda muatan (warna

merah)positif melalui suatu gel agaros

•

Gel agarose memisahkan fragmen DNA

berdasarkan ukuran

–

Fragmen kecil bergerak lebih di depan (front) di

(36)

- Penyambungan gugus 3’OH dan DNA insert. ( Gb. )

- Ligasi lebih mudah pada ujung – ujung sticky ( dengan ER sama / isoschizomer / isocaudomer).

- Reaksi Ligasi

DNA vektor 3 1 : 2 ( s/d 1: 10 )

DNA insert 6

Buter T4 DNA ligase 5x 4

T4 DNA ligase 1

dH2O ( destilata bebas ion ) 6

Total 20

•Inkubasi : 40 _{– 15}0 _{C semalam ( 18 – 24 jam )}

- Ujung blunt end : dapat diligasi, walaupun didigesti dengan ER berbeda. Pada reaksi Ligasi, selalu sertakan pula control – control :

k. Transformasi : vector utuh

(37)

(38)

à Pengambilan DNA rekombinan oleh E.coli dengan cara

mengintroduksi DNA murni (purified) ke dalam sel yang sudah kompeten.

TRANSFORMASI

(39)

E.coli sebagai sel inang :

> sudah dimodifikasi genetik, antara lain :

> Rec A- : tidak mempunyai gen untuk endonuklease restriksi

sehingga DNA rekombinan yang diintroduksi tidak didegradasi contoh : E.coli DH5α, E.coli HB101

(40)

• Electroporation

–

Electrical shock yang menyebabkan membran

menjadi permeabel terhadap DNA

• Calcium Chloride/Heat Shock

–

Chemically-competent cells mengambil DNA

setelah heat shock

E.coli dibuat kompeten dengan cara kimia:

-Peningkatan suhu dan CaCl₂ à heat shock pada 370 _{C – 42}0 _C,

dalam larutan CaCl₂

- Setelah ditransformasi, disebar pada medium seleksi

(41)

Electroporation

Electric shock

Membuat pori-pori kecil pada membran sel

(42)

SELEKSI

E.coli ( plasmid DNA rekombinan ) di seleksi terhadap E.coli yang tidak membawa rekombinan

Macam seleksi : ( 4 )

1.Seleksi langsung : contoh: ABR _{= AB}S _{(inaktivasi penyisipan )}

à perlu teknik cawan replika (replica plating)

2. seleksi warna koloni : X – gal ®, memanfaatkan gen lacZ yang menghasilkan enz. β – galactosidase.

Enzim tsb mengubah substrat X- gal menjadi β-gal biru

3.Komplementasi = gen Lacz pada vector vs pada E. coli DHS α ( inang )

(43)

REPLICA PLATING

• Pertama sebar sel pada cawan agar mengandung AMPICILLIN

– Semua TRANSFORMAN menghasilkan koloni (tumbuh)

= Transforman AMPR

• Replika pada cawan mengandung Tetrasiklin

– Hanya NON-REKOMBINAN yang tumbuh

Kain Beludru

AMP LATE BLOCK

(44)

AMP LATE BLOCK

REPLICA PLATING

– Hanya NON-REKOMBINAN yang tumbuh

Kain Beludru AMP LATE BLOCK PRESS AMP LATE BLOCK TET PLATE BLOCK

(45)

TETRES

NON-RECOMBINANTS

TET PLATE

GROW

• Cawan TET dan cawan AMP dibandingkan

– Ambil REKOMBINAN dari TETSENS _AMPRES dari cawan AMP

TETRES

NON-RECOMBINANTS

AMP LATE

TET PLATE

REPLICA PLATING

(46)

VERIFIKASI DAN PEMETAAN DNA REKOMBINAN

Dilakukan menggunakan Enzim endonuklease restriksi (ER). Vertifikasi :

àMemastikan adanya DNA insert / asing yang di klon pada vektor, menggunakan satu dan dua (ganda) ER (single digest dan double

digest), berdasarkan ukuran DNA dengan di larikan (running) di

elektroforesis gel agarose.

Pemetaan :

Manfaat ER dalam biologi molekuler.

Untuk mengetahui ukuran DNA rekombinan berdasarkan situs – situs Enzim restriksi.

à Disebut Physical mapping ( pemetaan fisik ):

(47)

KLONING SEKUENS DNA PENYANDI PROTEIN EUKARIOT

Perlu teknik khusus

àProkariot tidak dapat melakukan intron splicing

àDNA eukariot besar karena mengandung banyak intron àEkspresi akan kacau oleh prokariot

Oleh karena itu :

-menggunakan MRNA mature

- Enzim Reverse transcriptase yang mensintesis satu utas DNA dari RNA kmd dilanjutkan dengan kerja Klenow fragment yang

mensintesis utas kedua DNA dari template DNA

Sehingga akan diperoleh dua macam c DNA ( complementary DNA ) : yang utuh & parsial

(48)

PRODUK BIOTEKNOLOGI MOLEKULER SEKTOR : Medicinal : -Human Therapeutic -Human Diagnostic Non medical : -Agriculture -Specialities -Non-medical Diagnostic

(49)

INDIGO

-diekstraksi dari tanaman -batubara

-rekombinan DNA

Lintasan Indigo : banyak dipakai untuk industri Blue Jeans

Genencor International : green route to blue dye

Indol diubah menjadi cis – indole 2,3 – dehydrodiol dengan gen dari Pseudomonas putida yang disisipkan pada E. coli

(50)

DIAGNOSTIK MOLEKULER

Kemajuan bidang pengobatan karena berhasil didapatkannya virus – virus spesifik, bakteri, fungi dll, juga molekul – molekul kecil.

Untuk kepentingan pencegahan, control, pengobatan dari penyakit – penyakit infeksi maka perlu identifikasi dini dan akurat terhadap

organisme pathogen penyebab penyakit

à ditumbuhkan/dikultur à amati sifat – sifat fisiologis

KENDALA : lama mahal

à ada yang tidak dapat ditumbuhkan/dikulturkan

(51)

Untuk mengatasi kendala – kendala tersebut maka

dikembangkan prosedur – prosedur diagnostik molekular:

1. Metode immunologi detection

Co : ELISA monoclonal antibody yang diproduksi di E. coli ( Enzyme – linked immunosorbent assay )

2. Metode deteksi DNA

yaitu deteksi menggunakan pelacak DNA Prinsip hibridisasi asam. Nukleat Essei ini : cepat

reliable

spesifisitas tinggi : hanya berhibridisasi dengan sekuens nukleotida target

(52)

PRODUK KOMERSIAL REKAYASA MIKROBA

HUMAN PROTEIN PHARMACEUTICALS

- jumlah sangat terbatas - produksinya mahal

-biological mode of action belum dikarakterisasi jelas

+ 300 macam protein terapeutis manusia yang potensial telah diklon, dan telah melalui berbagai uji selama bertahun–tahun sebelum tersedia secara komersial. (Tabel 7.1)

(53)

Pharmaceutical biotechnology

• Diabetes

Insulin

• Haemophilia

Factor VIII

• Stroke

Tissue plasminogen activator

• Growth failure

Human growth hormone

• Anaemia

Erythropoietin

(54)

Strategi teknologi rekombinan DNA human protein pharmaceutical

Isolasi cDNA

Engineering (Rekayasa)

(55)

§Isolasi cDNA

Strategi I:

Isolasi protein target

Determinasi sekuens asam amino

Deduksi menjadi sekuens DNA penyandi

Sintesis oligonukleotida

Gunakan sebagai probe utk mengisolasi gen atau cDNA dari pustaka genom atau pustaka cDNA

(56)

Strategi II: Jika suatu protein khusus disintesis di suatu jaringan khusus

à Pustaka cDNA dapat dibuat dari mRNA ; tidak perlu dari protein.

mRNA berfungsi sebagai probe untuk sekuens DNA target. Contoh : Insulin à disintesis hanya dijaringan khusus di pancreas yaitu di pulau Langerhans.

Oleh karena itu fraksi mRNA yang diisolasi dari jaringan tersebut 70 % menyandikan insulin.

MRNA (mature)

Reverse transcribed

(57)

§Engineering

-sistem ekspresi prokariot dan eukariot beda

-jika menggunakan prokariot sebagai sel inang akan menurunkan biaya

-namun dipertanyakan apakah efektifitas sintesis bentuk fungsional protein heterogous masih tetap??

Strategi untuk mendesain protein – protein, dengan cara mengatur kombinasi domain – domain fungsional suatu protein, atau dengan cara mutagenesisis terarah, agar dapat mempelajari mode of action suatu protein.

(58)

Harus dipilih berdasarkan kriteria :

-memproduksi protein heterologus yang mirip dengan mature authentic protein, selain

-mampu tumbuh dengan densitas sel tinggi -mudah dipurifikasi

Contoh : human interleukin – 3

Produksi paling baik di Bacillus licheniformis

meskipun produksi banyak di E. coli, tapi menghasilkan protein interleukin-3 yang salah.

(59)

Sintesis L-Ascorbic Acid ( Vit. C) D-glucose

D-Sorbitol L-sorbose 2 KLG (2-keto-L-gluconic acid)

L- ascorbic Acid

à Satu tahap fermentasi mikroba à sejumlah tahap – tahap kimia

Dari penelitian – penelitian biokimia mengenai lintasan – lintasan metabolit diketahui bahwa beberapa mikroorganisme menunjukkan kemungkinan untuk mensintesis 2 - KLG

(60)

Acetobacter

Gluconobacter D. glucose 2,5 – diketo- D- glukonic acid (2,5 – DKG)

Erwinia

melalui beberapa lintas metabolisme

Corynebacterium 2,5-DKG reduktase

Brevibacterium 2,5 – DKG 2 – KLG

Arthrobacter

1 lintas metabolisme

Gen penyandi enzim 2.5 – DKG reduktase dari Corynebacterium di klon di Erwinia

(61)

•MENINGKATKAN PRODUKSI ANTIBOTIK

Produksi antibiotik dari Streptomyces spp dengan Fermentasi à lama – lama konsentrasi oksigen dalam media cair berkurang Pertumbuhan Streptomyces spp menurun dan produksi antibiotik menurun

Vitreoscilla sp adalah bakteri aerob yang dapat hidup dalam kondisi miskin O₂

Bakteri ini dapat memproduksi suatu protein hem homodimerik yang berfungsi mirip dengan hemoglobin eukariot, yaitu dapat mengikat O₂ dari medium kemudian menyalurkannya ke dalam sel.

(62)

TERAPI GEN

• Beberapa penyakit genetik manusia dapat dikaitkan

terhadap suatu

mutasi di suatu gen tunggal

, atau

mungkin juga lebih kompleks, yaitu terhadap

sejumlah gen-gen berbeda yang bermutasi

.

• TUJUAN utama riset dalam genetika molekuler

manusia à menentukan

kecacatan pada level gen

,

dan bagaimana keadaan tersebut menyebabkan

(63)

PENDEKATAN

Protein yang terlibat

Isolasi dan karakterisasi

Sekuensing asam amino

Investigasi sekuen penyandi

Buat pelacak spesifik

(64)

• Dasar pemikiran terapi gen:

–

Jika versi normal dari gen untuk penyakit manusia

telah berhasil diklon, maka sangat berbuna untuk

memperbaiki kecacatan/mutasi gen tersebut

(65)

Ex vivo gene therapy

Sel diambil dari orang penderita penyakit (pasien)

Perbaiki cacat genetik dengan cara transfer gen

Seleksi dan tumbuhkan sel-sel yang telah dikoreksi

secara genetik (remedial cell)

Infuskan atau transplantasikan kembali ke pasien

Gen remedial diintroduksi ke sel oleh suatu retrovirus mencit yang seudah direkayasa sehingga tidak mampu mengkonversi sel normal menjadi sel kanker.

Retrovirus (rekombinan) menginfeksi sel manusia sehingga gen remedial masuk

(66)

In vivo gene therapy

Menggunakan adenovirus : ds DNA

low pathogenicity in human

Gen remedial

Konstruksi pada vektor virus

di bawah promotor khusus

yang spesifik menginfeksi

sel khusus (sel target)

(67)

Antisense therapy

Dirancang untuk pencegahan;

- penurunan ekspresi gen tertentu,

- bekerja pada tahap translasi (mRNA)

Ada 2 cara:

A.Menggunakan antisense oligonukleotida (satu utas)

B.Menggunakan gen antisense yang diklon

Antisense

adalah utas asam nukleat DNA yang tidak

ditranskripsikan, merupakan utas pasangan dari utas yang

ditranskripsikan (utas sense).

(68)

A. Menggunakan antisense oligonukleotida (satu utas): DNA --- A G C T G A T ---T C G A C T A ---transcription antisense mRNA oligonukleotida A G C U G A U T C G A C T A Base pairing A G C U G A U T C G A C T A No translation

(69)

B. Menggunakan gen antisense yang diklon DNA --- A G C T G A T --- ---T G C G A C T A---T C G A C T A --- ---A C G C T G A T---transcription mRNA A G C U G A U U C G A C U A Base pairing A G C U G A U T C G A C T A No translation mRNA sense mRNA antisense

(70)

PROSEDUR – PROSEDUR DALAM RISET

MOLEKULER

I. DNA sequencing techniques

1. prosedur Dideoxynucleotide :

- Maxam – Gilbert : chemical based - Sanger : enzymatic based

2. Penggunaan Bacteriophage M13 Untuk memperoleh ss.DNA

Target DNA + 500 bp

< 2000 bp : harus dipotong – potong menjadi beberapa fragmen overlap dengan ER

• Primer Walking :

(71)

II. Polymerase Chain Reaction ( PCR ) - Amplifikasi molekul DNA

- Esensial :

1. Dua buah primer sintesis oligonukleotida (masing – masing ~ 20 nt )

2. sekuens target pada sampel DNA

3. DNA polymerase yang thermostabil à mencapai suhu 950 _C

atau lebih

4. Empat macam deoxynucleotidatriphosphat (dNTP) : dATP, dCTP, dGTP, dTTP

PROSEDUR – PROSEDUR DALAM RISET

MOLEKULER

(72)

II. Polymerase Chain Reaction ( PCR ) Tahap – tahap :

-denaturasi : - suhu 950 _{C : ds-DNA menjadi ss-DNA}

- enzim Taq DNA polymerase - primer

-renaturasi /annealing : suhu diturunkan perlahan sampai 550_C

primer berikatan dengan template DNA

-sintesis : - suhu dinaikkan sampai 750_{C, suhu optimum untuk fungsi}

katalisis enzim Taq DNA polymerase untuk mensintesis DNA.

Ketiga tahap diulangi beberapa siklus sampai diperoleh molekul DNA dalam jumlah besar.