TAMBAHAN TEORY DAN SOAL JAWAB

TAMBAHAN

TEORY DAN SOAL JAWAB

MATERI SDS-PAGE

ALMAWATI SITUMORANG

1

Apa yang dimaksud elektroforesis ?



Elektroforesis adalah sebuah metode untuk separasi atau pemisahan sebuah molekul besar (seperti protein, fragmen DNA, RNA dll) dari campuran molekul yang serupa.



Elektroforesis digunakan untuk memisahkan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.



Sebuah arus listrik dilewatkan melalui medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan.

2

ALMAWATI SITUMORANG

Apa yang dimaksud elektroforesis ?



Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada padamakromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif.



Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium (misal agarosa), maka molekul tersebut akan bergerak dari muatan negatif menuju muatan positif.



Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada rasio muatan terhadap massanya dan

ALMAWATI SITUMORANG

Ada berapa jenis elektroforesis ? Jelaskan masing- masing!

Ada 2 jenis elektroforesis yaitu Elektroforesis Kertas dan Elektroforesis Gel.

1. Elektroforesis Kertas:

 merupakan jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut (terutama ion-ion kompleks)

sebagai fase gerak.

 Pemisahan tersebut terjadi karena adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan.

Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan daya absopsi zat terlarut (Boyer,

2004). ⁴

ALMAWATI SITUMORANG

Ada berapa jenis elektroforesis ? Jelaskan masing- masing! Ada 2 jenis elektroforesis yaitu Elektroforesis Kertas dan Elektroforesis Gel.

2. Elektroforesis Gel:

 merupakan elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fasediam untuk memisahkan molekul- molekul seperti DNA dan protein menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul-molekul dengan panjang yang sama.

Elektroforesis gel merupakan teknik memisahkan suatu makro molekul dengan cara memberi gaya pada makromolekul tersebut untuk melewati medium berisi gel yang dibantu dengan tenaga listrik.

ALMAWATI SITUMORANG

Ada berapa jenis elektroforesis ? Jelaskan masing- masing! Ada 2 jenis elektroforesis yaitu Elektroforesis Kertas dan Elektroforesis Gel.

2. Elektroforesis Gel………..

 Elektroforesis gel memisahkan berdasarkan laju perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik.

 Media atau gelyang dapat digunakan yaitu agarose gel (elektroforesis DNA) dan poliakrilamid gel (elektroforesis protein).

 Laju pergerakan molekul dipengaruhi oleh ukuran molekul,konsentrasi gel, bentuk molekul, densitas muatan, pori-pori gel, voltase, dan larutan buffer elektroforesis (Martin, 2006).

6

ALMAWATI SITUMORANG

Apa fungsi SDS pada metode SDS-PAGE?

• SDS (sodium dodecyl sulfat) merupakan detergen anionik, yang apabila dilarutkan molekulnya memiliki muatan negatif dalam range pH yang luas.

• Fungsi utama SDS pada metode SDS-PAGE (SDS- Polyacrylamide gel electrophoresis) yaitu untuk memberikan muatan negatif pada protein yang akan dianalisis, selain itu SDS dapat mendenaturasi protein, mempermudah menyamakan kondisi, dan menyederhanakan protein (bentuk, ukuran, dan muatan).

• Muatan negatif SDS akan menghancurkan sebagian stuktur kompleks protein dan secara kuat tertarik ke arah anoda bila ditempatkan pada suatu medan listrik (Anam, 2009).

ALMAWATI SITUMORANG

Apa fungsi akrilamid pada metode SDS- PAGE?

 Fungsi akrilamid pada metode SDS-PAGE yaitu untuk mencegah difusi akibat timbulnya panas pada arus listrik.

 Selain itu gel akrilamid sering dimanfaatkan untuk memisahkan molekul protein yang kecil.

 Konsentrasi akrilamid total dalam gel dapat mempengaruhi migrasi protein.

 Pada proses pembuatan gel, akrilamid akan berpolimerisasi secara spontan bila tidak ada oksigen (Prihanto, 2011).

8

ALMAWATI SITUMORANG

APA TUJUAN ANALISIS PROTEIN DENGAN METODE ELEKTROFORESIS?

 Tujuan analisis protein dengan metode elektroforesis yaitu untuk memisahkan protein berdasarkan berat molekul dengan menggunakan matriks penyangga akrilamid.

 Selain itu dengan elektroforesis akan diketahui jenis protein dalam bahan atau sampel yang akan dianalisis.

 Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan digunakan sebagai metode pemisahan untuk menentukan komponen dari protein (Wibowo, 2010).

ALMAWATI SITUMORANG

Mengapa protein-protein tersebut dapat terpisah?



Protein-protein tersebut dapat terpisah karena adanya proses separasi pada protein memisahkan molekul-molekul protein menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul protein dengan panjang yang sama.



Protein dapat terpisah dengan cara memberi gaya pada protein tersebut untuk melewati medium berisi gel (poliakrilamid) yang dibantu dengan adanya listrik. Protein yang bermuatan listrik ditempatkan pada medium

berisi tenaga listrik.

¹⁰

ALMAWATI SITUMORANG

Mengapa protein-protein tersebut dapat terpisah?



Molekul-molekul dari protein akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya.



Pemisahan molekulprotein berdasarkan pada tingkat migrasi dan berat molekulnya dalam sebuah medanlistrik (Wibowo, 2010).

ALMAWATI SITUMORANG

BAGAIMANA CARA MENGATUR UKURAN PORI GEL?

 Cara mengatur ukuran pori gel yaitu bergantung pada konsentrasi gel akrilamid yang akan digunakan dan cros-linker (bis).

 Semakin tinggi konsentrasi akrilamid maka diameter pori-pori di dalam gel akan semakin kecil, sebaliknya jika konsentrasi akrilamid rendah maka diameter pori-pori di dalam gel akan semakin besar.

 Apabila protein berukuran besar atau memiliki berat molekul yang besar, maka memerlukan gel dengan konsentrasi akrilamid yang kecil, dengan demikian ukuran pori di dalam gel akan

besar(Prihanto, 2011). ₁₂

ALMAWATI SITUMORANG

APA YANG DIMAKSUD DENGAN STACKING GEL ?

MENGAPA STACKING GEL DIPERLUKAN?

 Stacking gel merupakan salah satu gel yang digunakan dalam SDS-PAGE.

 Stacking gel merupakan gel pengumpul atau gel penimbun yang terletak pada bagian atas.

 Stacking gel dibuat dengan campuran antara

akrilamid 30%, Tris HCl 1 M pH 6,8, steril aquades, SDS 10%, Ammonium Phosphate (APS) 10%, dan temed (Utami, 2007).

 Stacking gel diperlukan dalam elektroforesis protein karena digunakan untuk mencetak sumuran (well ), selain itu digunakan untuk menimbun atau

memekatkan protein menjadi satu jalur yang sempit

ALMAWATI SITUMORANG

APA YANG DIMAKSUD DENGAN STACKING GEL? MENGAPA STACKING GEL

DIPERLUKAN?



Stacking gel juga digunakan untuk menahan sementara agar sampel bermigrasi pada

waktu yang bersamaan.



Pada saat elekroforesis protein, protein akan tertarik ke bagian bawah arus listrik.



Protein yang memiliki berat molekul paling kecil bergerak cepat sehingga tertarik

sampai bagian bawah gel, sedangkan protein yang memiliki berat molekul paling besar

akan berada pada bagian atas dari gel (Utami, 2007).

14

ALMAWATI SITUMORANG

APA FUNGSI PEWARNAAN GEL PADA METODE ELEKTROFORESIS?

 Pewarnaan atau staining pada gel merupakan bagian dari metode SDS-PAGE.

 Fungsi pewarnaan gel pada elektroforesis yaitu untuk membantu memonitor jalannya elektroforesis.

 Pewarnaan gel pada metode elektroforesis protein terdiri dari commasie blue staining dan silver salt staining.

 Pada pengecatan dengan menggunakan perak nitrat dianalisa jarak migrasi pita-pita protein terbentuk pada gel pemisah.

 Jarak migrasi diukur dan dibandingkan dengan jarak yang ditempuh oleh pewarna biru bromofenol.

 Sedangkan pewarna biru bromofenol untuk mengamati migrasi molekul protein selama elektroforesis (Anam, 2009).

ALMAWATI SITUMORANG

P

^RINSIP

E

LEKTROFORESIS

 Prinsip yang digunakan pada elektroforesis yaitu memisahkan protein berdasarkan berat molekul dengan menggunakan matriks penyangga

akrilamid.

 Protein terseparasi dalam medan listrik

dilanjutkan dengan pewarnaan, penghilangan warna dan pembilasan gel.

 Pembacaan berat molekul dapat dilakukan dengan melihat pita yang terbentuk oleh marker.

16

ALMAWATI SITUMORANG

FAKTOR-FAKTOR YANG BERPENGARUH PADA PERCOBAAN ELEKTROFORESIS KALI INI

YAITU UKURAN DAN BENTUK MOLEKUL,

KONSENTRASI GEL, PH, SUHU, DAN VOLTAGE.

 Ukuran dan Bentuk Molekul : Semakin besar ukuran molekul maka pergerakan akan semakin lambat, bentuk molekul sekunder atau tersier

mempunyai pergerakan yang lebih lambat dari pada protein primer.

 Konsentrasi Gel : Pada konsentrasi gel yang rendah maka pergerakan protein lebih cepat dan sebaliknya pada konsentrasi gel yang lebih tinggi maka

pergerakan protein akan lebih lambat.

ALMAWATI SITUMORANG

Faktor-faktor yang berpengaruh pada percobaan Elektroforesis kali ini yaitu ukuran dan bentuk molekul, konsentrasi gel, pH, suhu, dan voltage.

 pH : Besarnya pH sangat berpengaruh pada metode elektroforesis protein karena akan mempengaruhi titik isoelektrik protein sehingga dapat mempengaruhi

tingkat dan arah pergerakan protein.

 Suhu : suhu akan mempengaruhi denaturasi protein dimana pada Elektroforesis digunakan suhu 90-95^oC untuk mendenaturasi protein.

 Voltage : voltage yang digunakan juga mempengaruhi pergerakan protein dimana dengan voltage yang tinggi maka pergerakan protein dalam gel elektroforesis akan lebih cepat, sebaliknya jika voltage yang digunakan

rendah maka pergerakan protein dalam gel akan lambat.

18

ALMAWATI SITUMORANG

JELASKAN PROSES TERBENTUKNYA PITA!



Pita terbentuk karena adanya perbedaan berat molekul.



Selain itu pita-pita bisa terbentuk atau

nampak disebabkan karena adanya sejumlah partikel sampel yang tersangkut pada titik-

titik tertentu dalam gel akibat adanya muatan listrik pada sampel yang bergerak menuju

katoda.



Partikel yang memiliki berat molekul sama akan terakumulasi di titik yang sama,

sehingga membentuk beberapa pita dengan panjang berbeda yang terpisah berdasarkan

ALMAWATI SITUMORANG

Apakah kepekatan warna pita berkaitan dengan konsentrasi protein ?

 Iya, kepekatan warna pita berkaitan dengan konsentrasi protein.

 Tebal tipisnya pita yang terbentuk dari pita protein menunjukkan konsentrasi atau banyaknya protein yang memiliki berat molekul sama yang berada pada posisi pita yang sama.

 Semakin tinggi konsentrasi sampel semakin tebal pita yang terbentuk.

 Hal ini sejalan dengan prinsip pergerakan molekul bermuatan, yakni molekul bermuatan dapat bergerak bebas di bawah pengaruh medan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau berdekatan.

20

ALMAWATI SITUMORANG

BAGAIMANA CARA MENGIDENTIFIKASI JENIS PROTEIN YANG MEMBENTUK PITA PADA GEL ELEKTROFORESIS ?

 Cara mengidentifikasi jenis protein yang membentuk pita pada gel elektroforesis yaitu dengan membandingkan posisi pita sampel dengan pita pada jalur marker/standar yang telah diketahui berat molekulnya.

 Marker atau penanda merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda yang dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel.

 Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya.

 Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul.

ALMAWATI SITUMORANG

Apakah fungsi penambahan

merkaptoetanol pada persiapan sampel ?



Fungsi penambahan merkaptoetanol pada persiapan sampel yaitu untuk mereduksi

ikatan disulfida yang terdapat pada protein sehingga protein tidak memiliki struktur

tersier maupun sekunder dan akan lebih mudah untuk dipisahkan dalam analisis elektroforesis.

22

ALMAWATI SITUMORANG

APAKAH FUNGSI PEMANASAN SAMPEL PROTEIN?

 Fungsi pemanasan sampel protein yaitu untuk mendenaturasi protein yang akan dianalisis

sehingga protein tidak lagi memiliki struktur tersier ataupun sekunder.

 Dengan demikian ketika dilakukan proses pemisahan ukuran protein yang lebih sederhana akan memiliki pergerakan yang lebih cepat.

 Selain itu pemanasan sampel protein juga berfungsi untuk mempercepat reaksi (katalis) karena ketika sampel ditambahkan dengan sampel buffer proses

pemanasan akan mempercepat adanya interaksi dan reaksi antara keduannya.

ALMAWATI SITUMORANG

MENGAPA PH SANGAT BERPENGARUH PADA METODE ELEKTROFORESIS PROTEIN ?



Besarnya pH sangat berpengaruh pada metode elektroforesis protein karena akan mempengaruhi titik isoelektrik protein sehingga dapat mempengaruhi tingkat dan arah pergerakan protein.



Pada titik isolelektrik, protein akan terdenaturasi sehingga ikatan-ikatan protein akan terputus dan menghasilkan molekul yang lebih sederhana sehingga akan mempengaruhi tingkat dan arah pergerakan

protein.

²⁴

ALMAWATI SITUMORANG

REAGEN APA YG BERFUNGSI UNTUK MEMPOLIMERISASI GEL?

 Reagen yang berfungsi untuk mempolimerisasi gel yaitu APS (Amonium persulfat) dan TEMED (Tetra Ethyl Methyl Ethilene Diamine).

 APS berfungsi sebagai inisiator yang mengaktifkan akrilamid agar dapat bereaksi dengan poliakrilamid lain membentuk rantai polimer yang panjang.

 SedangkaN TEMED berfungsi sebagai katalisator reaksi polimerisasi akrilamid menjadi gel

poliakrilamid sehingga dapat dingunakan dalam pemisahan protein.

ALMAWATI SITUMORANG

Faktor-faktor apa yang mempengaruhi pergerakan protein dalam gel elektroforesis ?

 Faktor-faktor yang mempengaruhi pergerakan

protein dalam gel elektroforesis yaitu ukuran dan bentuk molekul, konsentrasi gel, pH, dan voltage.

Semakin besar ukuran molekul maka pergerakan akan semakin lambat, bentuk molekul sekunder atau tersier mempunyai pergerakan yang lebih lambat dari pada protein primer.

 Pada konsentrasi gel yang rendah maka pergerakan protein lebih cepat dan sebaliknya pada konsentrasi gel yang lebih tinggi maka pergerakan protein akan lebih lambat.

26

ALMAWATI SITUMORANG

Faktor-faktor apa yang mempengaruhi pergerakan protein dalam gel elektroforesis ?



Besarnya pH sangat berpengaruh pada metode elektroforesis protein karena akan mempengaruhi titik isoelektrik protein sehingga dapat mempengaruhi tingkat dan arah pergerakan protein.



Selain itu voltage yang digunakan juga mempengaruhi pergerakan protein dimana dengan voltage yang tinggi maka pergerakan protein dalam gel elektroforesis akan lebih cepat, sebaliknya jika voltage yang digunakan rendah maka pergerakan protein

²⁷

ALMAWATI SITUMORANG

TERIMAKASIH

ALMAWATI SITUMORANG

28