ELEKTROFORESIS HASIL ISOLAT DNA GENOM DARI BAKTERI Escherichia coli DAN DARAH KAMBING PERANAKAN ETAWA
Nikman Azmin1, Erni Suryani2
Dosen Program Studi Pendidikan Biologi, Sekolah Tinggi Keguruan dan Ilmu Pendidikan (STKIP) Bima, Nusa Tengara Barat, Indonesia
( e-mail: biologinikman@gmail.com ) Abstrak
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan tehnik pemisahan senyawa dengan metode elektroforesis horizontal gel agarose pada DNA genom dari bakteri Escherichia coli dan darah kambing peranakan Etawa. Penelitian ini dilakukan mulai bulan Juni 2016 sampai dengan Agustus 2016. Hasil penelitian menunjukan bahwa Visualisasi GelDoc elektroforesis isolat DNA genom Eschericia coli dan darah kambing peranakan Etawa menunjukkan adanya pita-pita DNA yang terbentuk. Dari hasil isolasi DNA genom darah kambing Etawa dan genom Eschericia coli diperoleh isolasi sebanyak 0,12 ml yang ditandai dengan terlihatnya pita-pita halus yang terdapat pada DNA serta faktor-faktor yang mempengaruhi laju migrasi DNA pada gel elektroforesis antara lain: ukuran dan muatan DNA, konsentrasi gel agarose, arus listrik dan arah medan listrik.
Kata-Kata Kunci: Isolasi DNA, Escherichia coli, Darah Peranakan Kambing Etawa PENDAHULUAN
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon (Kullkarni, et al, 2011). Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis induk. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua induk. Di lihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon (Bruyn, 2011). DNA memiliki struktur salinan utas ganda yang anti paralel dengan komponen-komponennya yaitu gula pentosa, gugus fosfat, dan pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki struktur cincin-ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan Sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika Adenin berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen (Lewis, 2003)
Ekstraksi DNA merupakan salah satu cara untuk memisahkan DNA kromososm atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA dapat berasal dari tanaman, kultur mikroorganisme, maupun sel manusia. Pada dasarnya isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai sumber, antara lain adalah organ manusia, darah, daun, daging buah, serangga, kalus, akar batang, daging dan sisik ikan. Pada individu yang sama DNA yang diperoleh dari berbagai sumber yang akan memiliki jenis, jumlah dan ukuran yang sama. DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan
metabolisme sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid sehingga menyulitkan proses isolasi DNA. Sedangkan DNA dari hewan lebih banyak mengandung protein. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tingkat tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel, hal ini disebabkan karena tanaman tingkat tinggi memiliki dinding sel yang kuat dan sering kali pada beberapa jenis tanaman, kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi di atas dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitif oleh enzim restriksi dan menggangu proses amplifikasi DNA dengan PCR
Pada penelitian ini akan mecoba melakukan isolasi DNA genom bakteri Escherichia coli dari darah kambing Etawa. Pada saat proses destruksi jaringan hewan maupun bakteri dapat menyebabkan degradasi pada DNA dengan adanya aktivitas enzim endonuklease, karena itu digunakanlah buffer ekstraksi yang mengandung senyawa Tris, EDTA, CTAB dan buffer lisis yang mengandung potassium asetat dan SDS. Proteinase digunakan untuk membantu mendenaturasi protein pada jaringan. Senyawa CTAB dan SDS merupakan detergen yang dapat melisis dinding sel dan juga mendenaturasi protein. Selain itu CTAB dan EDTA adalah senyawa inhibitor yang dapat menghambat aktivitas enzim nuklease. Potasium asetat adalah senyawa yang dapat berikatan dengan debris sel dan protein sehingga membentuk senyawa kompleks dengan CTAB Potasium asetat protein-debris sel. Selanjutnya pada tahap berikutnya digunakan klorofom: isoamil alcohol yang membantu mendenaturasi protein yang masih menempel pada kromosom, sedangkan untuk mempresipitasi asam nukleat digunakan alkohol 96%-100%.
METODE
Isolasi DNA genom Bakteri Escherichia coli Alat
Mikropipet ukuran 200 μl 2 buah, Frezer 1 set, Gelas beker 1 set, Hot plate dan autoclave 1 set, Stopwatch1 buah, Mikropipet ukuran 1000 μl 2 buah, Tipt ukuran 20 μl 2 buah, Tipt ukuran 200 μl 2 buah, Tipt ukuran 1000 μl 2 buah, Colection tube 1,5 ml 2 buah, Sentrifuge 1 set Vortex 1 set, Incubator shaker 1 set, Gene JETTM genomic DNA purification column 2 buah
Bahan
Trypton 1% Secukup, Proteinase K 200 μl, Etanol 50% 400 μl,Wash buffer I 500 μl, Wash buffer II 500 μl, Elution buffer 200 μl, Kertas tisu Secukup, Yeast extract 0,5% Secukup, NaCl 0,5% Secukup, Akuades sebanyak 20 ml
Isolasi DNA genom darah kambing peranakan Etawa Alat
Mikropipet ukuran 20 μl, Gene JETTM
genomic DNA purification column, Freezer, Gelas beker, Hot plate dan autoclave, Stopwatch, Mikropipet ukuran 200 μl, Mikropipet ukuran 1000 μl, Tipt ukuran 20 μl, Tipt ukuran 200 μl, Tipt ukuran 1000 μl, Colection tube 1,5 ml, Colection tube 2 ml, Sentrifuge, Vortex, Incubator shaker
Bahan
Darah kambing peranakan Etawa, Lysis solution, Proteinase K, Etanol 96%, Wash buffer I, sebanyak 500 μl Wash buffer II sebanyak 500 μl, Elution buffer sebanyak 200 μl Cara Kerja
Pembuatan Media.Bahan yang digunakan untuk pemmbuatan media disiapkan, antara lain: trypton 1%, yeast extract 0,5% dan NaCl 0,5%
1. Semua bahan dicampur dan ditambahkan 20 ml akuades 2. Campuran bahan panaskan sambil diaduk agar rata
3. Campuran bahan disterilisasi
4. Pada campuran tersebut ditambahkan koloni bakteri Escherichia coli 5. Koloni bakteri Escherichia coli dalam media dishaker pada suhu 370C Isolassi DNA genom bakteri Escherichia coli
1. Pembiakan Escherichia coli sebanyak 1,5 ml diambil dan dimasukan ke dalam collection tube 1,5 ml, kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 6000 rpm
2. Bagian supernatan dibuang dan ditambahkan 180 μl digestion solution dan 20 μl proteinase K ke dalam collection tube. Campuran divortex hingga homogen, kemudian diinkubasi dalam shaker pada suhu 560C selama 30 menit dan 200 μl lisis solution ditambahkan ke dalam collection tube, kemudian divortex selama 15 detik dan 400 μl etanol 50% ditambahkan ke dalam collection tube, kemudian divortex selama 15 detik hingga terbentuk lisat (campuran dari semua larutan)
3. Lisat diambil dan dipindahkan ke Gene JETTM genomic DNA purifcation collumn, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 6.000 rpm selama 1 menit. Cairan yang ada di bagian bawah dibuang dan Collum dipindahkan ke collection tube 2 ml
4. 500 ml wash buffer I ditambahkan ke dalam collection tube, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8.000 rpm selama 1 menit. Cairan yang ada di bagian bawah dibuang, tetapi tubenya tidak dan 500 μl wash buffer II dipindahkan ke collection tube, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 3 menit
5. Cairan yang ada di bagian bawah dibuang. Tube disentrifugasi dalam keadaan kosong dengan kecepatan 12.000 rpm selama 1 menit. Cairan yang ada di bagian bawah dibuang. Kemudian dipindahkan ke collumn 1,5 ml microcentrifuge tube serta 200 μl collection buffer ditambahkan tepat di bagian tengah membran
6. Campuran diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit. Campuran disentrifugasi dengan kecepatan 8.000 rpm selama 1 menit. Collumn dibuang, sedangkan isolat disimpan pada suhu -20oC
Isolasi DNA genom darah kambing peranakan Etawa
1. 200 μl darah kambing peranakan Etawa dimasukkan ke dalam colection tube 1,5 ml. Kemudian 400 μl lisis solution ditambahkan ke dalam collection tube. Selanjutnya 20 μl proteinase K ditambahkan ke dalam collection tube
2. Campuran diinkubasi dengan waterbath pada suhu 56oC selama 10 menit. Kemudian tambahkan 200 μl etanol 96% ditambahkan ke dalam campuran tersebut, kemudian divortex
3. Lisat dipindahkan ke Gene JETTM genom DNA purification. Lisat disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 4.200 rpm (cairan yang ada di bagian bawah dibuang)
4. Collumn dimasukkan kembali. Kemudian tambahkan 500 μl wash buffer I ditambahkan ke dalamnya, kemudian disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 5.600 rpm (cairan yang ada di bagian bawah dibuang). Dan tambahkan 500 μl wash buffer II ditambahkan ke dalamnya (cairan yang ada di bagian bawah dibuang). Selanjutnya, tube disentrifugasi lagi dalam keadaan kosong (tanpa penambahan larutan) selama 1 menit dengan kecepatan 8.400 rpm
5. Collumn dipindahkan ke collumn 1,5 ml microsentrifuge tube, masukan 200 μl elution buffer ditambahkan ke dalam microsentrifuge tube. Kemudian campuran diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang
6. Selanjutnya, campuran disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 5.600 rpm. Larutan yang yang digunakan adalah bagian bawah dan Larutan disimpan pada suhu -20oC
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi DNA genom bakteri Escherichia coli
DNA genom yang diisolasi berasal dari bakteri Escherichia coli. DNA genom yang diisolasi dari Escherichia coli adalah 16S rRNA pada bakteri memiliki bagian yang stabil dalam sekuens dan satu sel bakteri memiliki ribuan kopi RNA. Gen 16S RNA berupa polinukleotida berukuran besar (1500-2000 basa) dan merupakan bagian dari sub unit kecil dari ribososm prokariotik. Bakteri Escherichia coli merupakan salah satu spesies utama dari bakteri Gram negatif Escherichia coli
Pada proses tahapan-tahapan yang dilakukan dalam isolasi DNA genom bakteri Gram negatif Escherichia coli, antara lain: bakteri Escherichia coli dibiakkan dalam media yang mengandung trypton 1%, yeast extract 0,5%, dan NaCl 0,5% (Wayan et al, 2014). Bahan-bahan tersebut dicampur dan ditambahkan akuades sebanyak 20 ml sebagai pelarut. Bahan-bahan tersebut didihkan sambil diaduk. Proses pengadukan bertujuan untuk mempercepat proses pelarutan. Selanjutnya, media disterilisasi agar nantinya hanya Escherichia coli saja yang tumbuh dalam media. Tahapan berikutnya yaitu media ditambahkan koloni Escherichia coli dishaker pada suhu 37oC. Bakteri diinkubasi dan ishaker pada suhu 37oC bertujuan untuk mengoptimalisasikan pertumbuhan koloni bakteri Escherichia coli. Koloni bakteri dishaker dengan kecepatan 100 rpm selama overnight atau semalam (Gambar 1)
Dari proses perbanyakan bakteri Escherichia coli akan diperoleh jumlah koloni bakteri yang mencukupi untuk proses isolasi DNA genom. Selanjutnya, sebanyak 1,5 ml untuk pembiakan bakteri Escherichia coli dari hasil perbanyakan diambil dan dimasukkan ke dalam collection tube, kemudian bakteri disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 10 menit. Sentrifugasi awal ini dilakukan bertujuan untuk memisahkan bakteri dengan pengotor yang berupa senyawa lain yang tercampur dengan bakteri. Supernatan yang dihasilkan dibuang, sedangkan bagian pellet ditambahkan dengan 100 µl digestion solution dan 20 µl proteinase K lalu divortex. Larutan digenstion solution berfungsi untuk melisiskan membrane atau dinding sel sebagai bagian terluar dari bakteri. Priteinase K digunakan sebagai reagen pelisis agar komponen DNA di dalam sitoplasma sel dapat keluar untuk diisolasi. Vortex dilakukan untuk mencampur semua komponen agar homogen, sehingga proses dari tahapan isolasi yang berupa pelisisan dinding sel dan membran sel dapat berjalan secara optimal.
Tahapan selanjutnya yaitu bahan isolasi yang ada di dalam tube diinkubasi pada shaker dengan suhu 56oC selama 30 menit. Proses inkubasi pada shaker bertujuan untuk meningkatkan kerja enzim proteinase K dalam melisiskan protein dalam sel untuk mengeluarkan DNA. Suhu dalam inkubasi adalah 56 oC karena enzim proteinase K bekerja spesifik dan optimal pada suhu tersebut (Wayan et al, 2014).
Campuran komponen isolasi DNA (sampel) ditambahkan 400 µl etanol 50% lalu divortex. Etanol digunakan untuk melarutkan bahan-bahan selain DNA, sehingga saat disentrifugasi DNA bisa mengendap di bawah. Etanol 50% juga berfungsi untuk menarik molekul air dari DNA dan membersihkan lysis solution. Vortex dilakukan bertujuan untuk
menghomogenisasi komponen-komponen sehingga proses pelarutan bahan selain DNA dapat berlangsung secara optimal. Dari proses vortex akan dihasilkan lisat. Lisat merupakan hasil dari proses lisis. Lisat yang diperoleh dipindahkan ke Gene JETTM genomic DNA purification column yang merupakan collection tube khusus dimana tube mempunyai membrane yang digunakan dalam isolasi atau purifikasi DNA. Tube Gene JETTM mempunyai 2 lapisan dimana 1 lapisan untuk menampung cairan yang jatuh dan lapisan yang lain untuk menampung DNA. Lisat yang terdapat di dalam Gene JET disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 1 menit. Sentrifugasi akan menghasilkan pellet pada lapisan atas dan supernatan yang terkumpul pada lapisan bawah.
Bagian supernatan dibuang, kemudian column dipindahkan ke collection tube 2 ml dan sampel ditambah dengan 500 µl wash buffer I. Wash buffer I digunakan untuk mencuci atau membersihkan DNA dari pengotor pada tahapan awal. Selanjutnya, sampel disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit untuk mengoptimalkan pencucian yang pertama. Bagian supernatant dibuang dan bagian pellet ditambahkan 500 µl wash buffer II lalu disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 3 menit. Penambahan wash buffer II berfungsi untuk membersihkan sisa-sisa dari DNA yang masih ada setelah proses pencucian yang pertama. Dari hasil pemisahan oleh sentrifugasi, supernatan (caitran yang ada di bagian bawah) dibuang lalu tube dan column dalam keadaan kosong disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 1 menit. Proses sentrifugasi dalam keadaan kosong bertujuan untuk memastikan bahwa tidak ada pengotor pada DNA yang akan dipakai. Bagian supernatan dibuang dan ditambah collection tube nya. Sampel dipindahkan ke column 1,5 ml microsentrifuge tube dan ditambah 200 µl elution buffer tepat di bagian tengah. Elution buffer ditambahkan tepat di bagian tengah bertujuan untuk mengikat kotoran lain selain DNA, sehingga yang ada pada microsentrifuge tube hanya DNA saja.
Tahapan berikutnya, sampel diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit. Hal ini bertujuan untuk mengoptimalkan proses elution buffer dalam mengikat kotoran. Sampel disentrifuge dengan kecepatan8000 rpm selama 1 menit. Hal ini bertujuan untuk memisahkan DNA dari pengotor untuk diperoleh hasil isolate murni dari DNA. Hasil dari proses isolasi DNA akan diperoleh isolate DNA. Column dibuang dan isolate DNA disimpan pada suhu -20oC. Penyimpanan isolate pada suhu 20oC bertujuan untuk menjaga agar sampel isolate DNA tidak mengalami kerusakan.
Hasil isolasi DNA genom bakteri Escherichia coli diperoleh isolate DNA genom sebanyak 0,1 ml dan terlihat pita-pita halus DNA genom bakteri Escherichia coli (gambar 1). Hasil isolate DNA yang diperoleh sebanyak 0,12 ml. Hal ini didukung dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh (Beermann et al, 2011), menyetakan bahwa pada isolasi DNA genom, hal yang dilakukan adalah memisahkan DNA genom dari komponen-komponen yang lainnya. Kemudian DNA genom yang diisolasi dari Escherichia coli adalah 16S rRNA dan akan mendapatkan isolat bakteri yang sangat bagus
Isolasi DNA genom darah kambing peranakan Etawa
Isolasi DNA dilakukan untuk mendapatkan DNA murni dari suatu sel. Darah kambing peranakan Etawa digunakan karena lebih mudah diekstraksi, prosedurnya lebih mudah, lebih murah dan hasil yang didapatkan lebih banyak. Hasil isolasi DNA genom darah kambing peranakan Etawa menunjukan bahwa pada proses isolat didapatkan isolat DNA berbentuk cairan bening yang secara kasat mata akan terlihat pita-pita DNA seperti benang-benang halus . Hasil isolat DNA yang diperoleh sebanyak 0,12 ml
Gambar 1. Hasil Hasil isolat DNA
Dari kedua sampel yang digunakan, keduanya menghasilkan isolate DNA yang ditandai dengan terlihatnya pita-pita halus yang ditunjukan pada garis panah 1 sampai 4 pada (Gambar 5) DNA yang dapat dilihat secara kasat mata. Hal ini mengindikasikan bahwa tahapan isolasi DNA yang dilakukan cukup berhasil. Menurut Zunaedi (2013), faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan isolasi DNA genom, antara lain:
1. Karakter sampel dari sel atau jaringan organism. Setiap organisme memiliki tipe sel dan jaringan yang berfariasi, sehingga metode isolasi atau ekstraksi yang digunakan harus sesuai dengan jenis karakter sampel.
2. Metode ekstraksi dan isolasi yang tepat. Metode yang ideal, akan beragam tergantung dari jenis sel atau jaringan sampel, bagaimana sampel diperoleh dari sumbernya, bagaimana sampel diperlakukan, dan bagaimana sampel disimpan sebelum diekstrak DNA. Hal-hal tersebut akan menetukan keberhasilan isolasi DNA.
3. Metode isolasi harus meminimalisasi degradasi DNA.
Upaya untuk meminimalisasikan degradasi DNA dapat dilakukan dengan cara menghindari ekspor terhadap panas, cahaya, freeze-thow yang berulang-ulang, dan vortex.
4. Kondisis laboratorium. Laboratorium harus dikondisikan dan diatur sedemikian rupa untuk menghindarkan kemungkinan kontaminasi silang pada sampel.
5. Reagen atau senyawa yang digunakan. Dalam 5 tahapan utama isolasi DNA, reagen memegang peranan penting yang akan menentukan keberhasilan isolasi DNA genom. Kesesuaian reagen dengan karakter sel DNA genom harus menjadi dasar pertimbangan dalam memilih metode ektraksi atau isolasi DNA genom.
KESIMPULAN
1. Dari hasil isolasi DNA genom bakteri Escherichia coli diperoleh isolasi sebanyak 0,1 ml yang ditandai dengan terlihatnya pita-pita halus DNA.
2. Dari hasil isolasi DNA genom darah kambing Etawa diperoleh isolasi sebanyak 0,12 ml yang ditandai dengan terlihatnya pita-pita halus DNA.
DAFTAR PUSTAKA
Beermann, A., Ghanjati, Santurludis, S. 2011. Methods for Separate Isolation of Cell Free DNA and Celluler DNA from Urine-Aplication of Methylation Specific PCR on both DNA Fraction. The Open Biomarker Journal 4(2): 15-27
Bruyn, M. D.., Darenti, L. R.., Cravalho, G. R. 2011. Succesful Extraction of DNA from Archieved Alkohol Fixed White-Eye Fish Specimens Using an Ancient DNA Protocol. Journal of Fish Biology 78 (1): 2074-2079
Kullkarni, K. K., Oswal, R. J., Antre, R, V., Panjwani, D. T. 2011. A Biotechnological Significance: Isolation of DNA from onion. International Journal of Pharma Research and Development 2(2): 42-45
Wayan, S dan Dyah A,W., Komang J, P,P. 2014. Penentuan Marka Genetik Escherichia
coli O157:H7 Asal Hewan dan Manusia dengan Metode Random Amplified
Polymorphic DNA. Jurnal Veteriner. Vol. 15 No. 3 : 323-329
