ABSTRAK'
AMPLIFIKASI in vitro GEN PENGKODE PEMSILIN V ASILASE dari Bacillus sp. strain BACS
Di dalam materi genetiK Bacillus sp. strain diketahui - - ' terdapat gen Penisilin V Asilase. Hal ini terbukti dengan dihasilkannya Penisilin V Asilase secara ekstraseluler oleh Bacillus sp. strain BACS.
Penelitian ini bertujuan untuk mengamplifikasi fragmen gen Penisilin V Asilase dari Bacillus sp. strain BAC5 menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan menggunakan primer-primer Bacillus subtilis.
Penelitian ini dimulai dengan mengisolasi DNA kromosom Bacillus sp. strain BACS, dilanjutkan dengan mengamplifikasi fragmen gen Penisilin V Asilase dengan metode PCR dengan kondisi denaturasi pada suhu selama 1 menit, selanjutnya masuk ke tahap annealing, yang dilakukan dengan mengkombinasikan suhu dan waktu (1-1,5 menit). Tahap extension dilakukan pada suhu waktu yang dipakai selama tahap ini dikombinasikan antara I- 1,5 menit. Hasil dari amplifikasi tersebut kemudian dielektroforesis menggunakan gel agarosa 1,5%. Setelah 1 jam hasilnya dilihat dengan menggunakan transluminator UV.
Pada penelitian ini diharapkan menghasilkan pita DNA yang berukuran sekitar 2,5 kilobasa, namun dari hasil penelitian tidak didapatkan pita spesifik yang diinginkan, pita yang didapatkan selalu smear. Hal ini dapat disebabkan oleh kondisi amplifikasi yang belum optimum atau karena primer yang digunakan kurang spesifik.
ABSTRACT
Amplification in vitro Gene Coding Penicillin V Acylase from Bacillus sp. strain BACS
Felicia, 2001. Tutors : Sylvia Soeng,dr; Philips Onggowidjaja, S.Si.,M.Si.
In genetic material of Bacillus sp. strain BAC5 known there is gene of Penicillin V Acylase. This is evidence with resulted Penicillin V Acylase extracellular by Bacillus sp. strain BAC.
This research is aimed to amplificate fragmen gene of Penicillin V Acylase from Bacillus sp. strain BACS with using method of PolymeraseChain Reaction (PCR) eith using primery Bacillus subtilis.
This research is started with isolated DNA chromosome of Bacillus sp. strain BAC5, then continued with amplificating fragmen gene of Penicillin V Acylase by PCR technique with denaturation condition at temperature for 1 minute, furthermore into the annealing step that implementing with temperature combined and time (1-1,5 minutes). The extension step implementing at temperature applied time for this step combined about 1-1,5 minutes. The result of this amplification must be electroforesis by using agarosa gel 1,5%. After
I hour the result can be founded eith using transluminator UV.s
This research is expected to result DNA strain that measured around 2,5 kilobasa, but this result of research not obtained spesific band to be wished, the obtained result were always smear. This problem can be caused by amplicifation condition not yet optimal or this is caused by used prymary lack specifik.
DAFTAR ISI
BAB I1 TINJAUAN PUSTAKA
2,1. Penisilin
2.2. Peranan Penisilin V Asilase dalam Pembuatan Antibiotik Semisintetik Turunan Penisilin
2.3. Amplifikasi Molekul DNA dengan Metode PCR 2.3.1. Metode PCR
2.3.2. Komponen-Komponen PCR 2.3.2.1. Primer
2.3.2.2. Enzim DNA Polimerase 2.3.2.3. Deoksiribonukleosidatrifosfat
(dNTP),Bufer PCR 2.4. Elektroforesis
BAB III METODE PENELITIAN
3.1.
3.2.
Isolasi DNA Kromosom Bacillus sp. strain BACS Amplifikasi Fragmen Gen Penisilin V Asilase Bacillus sp.strain BACS dengan Metode PCR
i
BAB IV HASlL DAN PEMBAHASAN 4.1.
4.2
Isolasi DNA Kromosom Bacillus sp.strain BAC5 Amplifikasi Fragmen Gen Penisilin V Asilase Bacillus sp.strain BAC5 dengan Metode PCR dan Analisis Hasil
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
5.1. Kesimpulan 5.2. Saran
DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN 1
RIWAYAT HIDUP
LAMPIRAN
221 21
21
23 23 23
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
2.1. Jenis-jenis penisilin alami yang diproduksi
dari Penicillium sp
62.2. Beberapa antibiotik semisintetis turunan penisilin dan
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
2.1. Struktur kimia penisilin 6
2.2. Reaksi hidrolisis benzilpenisilin oleh Penisilin G Asilase 8
2.3. Tahap-tahap reaksi dalam siklus PCR 11
2.4. (A) Struktur molekul etidiumbromida (EtBr), (B) Penguraian parsial heliks ganda molekul DNA akibat penyisipan molekul
etidiumbromida di antara pasangan basa yang berdekatan 15 2.5. Perkiraan ukuran fragmen molekul DNA dalam gel agarosa 16 4.1. Hasil amplifikasi fragmen gen Penisilin V Asilase Bacillus sp.
Lampiran
Lampiran 1
Lampiran 2
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
27
BAB I PENDANULUAN
1.1. Latar Belakang
Mikroorganisme mempunyai pengaruh yang sangat besar dalam kehidupan
manusia. Kerugian paling besar yang ditimbulkan oleh mikroorganisme adalah
penyaki t infeksi. Pengobatan penyakit ini dapat dilakukan dengan pemberian
antibiotik, tetapi belakangan ini makin banyak ditemukan kuman penyebab
penyakit infeksi yang resisten terhadap antibiotik. Hal ini disebabkan oleh
pemberian obat antibiotika yang tidak rasional, sehingga kuman semakin cepat
menemukan bentuk baru yang kebal terhadap antibiotik akibat perubahan genetik
yang terjadi. Untuk mengatasi masalah resistensi tersebut diperlukan antibiotik
jenis baru yang lebih efektif.
Penisilin merupakan antibiotik yang pertama kali ditemukan oleh
Alexander Fleming pada tahun 1929. Substansi antibakteri ini dihasilkan oleh
jamur Penicillium notatum (Crueger & Crueger, 1982). Antibiotik ini merupakan antibiotik golongan yang pertama kali ditemukan dan sanggup melawan
bakteri Gram positif, tetapi memiliki keterbatasan untuk melawan bakteri Gram
negatif dan sangat rentan terhadap bakteri penghasil
yaitu enzim yang menghidrolisis cincin menjadi senyawa yang tidak
aktif secara biologis.
Penisilin memiliki toksisitas yang rendah pada manusia dan aktivitas
antibakteri yang sangat efektif. Karena sifatnya tersebut maka penisilin dipakai
secara luas di seluruh dunia untuk pengobatan penyakit infeksi (Gale, et al., 198 1). Penggunaan penisilin juga menimbulkan dampak yang cukup serius, yaitu
adanya gejala resistensi beberapa mikroorganisme tertentu.
Salah satu usaha untuk mengatasi masalah resistensi ini adalah mencari
varian-varian penisilin baru dengan cara membuat antibiotik semisintetis turunan
stabil dan lebih mudah diabsorbsi, serta lebih sedikit efek sampingnya
dibandingkan dengan Penisilin G . (Valle, et al., 1991)
Penisilin Asilase merupakan enzim yang menghidrolisis Penisilin G
menjadi senyawa 6-aminopenisilanat (6-APA) yang merupakan senyawa
intermediet untuk menghasilkan senyawa penisilin semisintetis. Dari senyawa 6-
APA tersebut dapat disintesis senyawa turunan penisilin (Valle, et al., 1986;
Meevootisom & Saunders, 1987; Martin, et al., 1995). Kebutuhan senyawa 6- APA yang digunakan untuk memproduksi penisilin semisintetis diperkirakan akan
meningkat sampai 7.000 ton pada tahun 2000 (Shewale & Sivaraman, 1989;
Ospina, et al., 1991). Saat ini lebih dari 15 penisilin semisintetis yang dijual
merupakan turunan dari senyawa 6-APA (Illanes, et al., 1994) dan lebih dari 60% diproduksi secara enzimatik.
Penisilin V Asilase dapat diproduksi secara ekstraseluler atau intraseluler
tergantung dari bakteri yang menghasilkannya. Pada Escherichia coli Penisilin V
Asilase bersifat intraseluler, tapi pada Bacillus megaterium enzim ini bersifat
ekstraseluler (Vandamme & Voets, 1974; Rodriquez, et al., 1991). E. coli
menghasilkan Penisilin V Asilase berupa protein periplasmik sehingga sel-selnya
harus dilisis dahulu agar enzim dapat dipanen (Ospina, et al., 1992), sedangkan
Basillus megaterium mensekresikan Penisilin V Asilase ke dalam medium kultur sehingga produksi enzim akan lebih menguntungkan (Illanes, et al., 1994; Martin, et al., 1995).
Bacillus sp. strain BAC5 adalah bakteri yang termasuk ke dalam 10 strain
lokal yang diberi nama BAC, yang diketahui dapat menghasilkan Penisilin V
Asilase (PVA) di antara I60 isolat yang berhasil diisolasi dari berbagai daerah di
Indonesia. Bakteri ini termasuk Gram positif berbentuk batang. Kondisi optimum
produksi PVA adalah pada pH 7 dan suhu
Saat ini dari 10 isolat BAC yang telah diisolasi hanya ada 5 isolat yang
berhasil dipertahankan, yaitu BAC 1 sampai BAC5. Penelitian mengenai
dilakukan dan ditemukan bahwa strain BACS memiliki spesifisitas substrat Penisilin V Asilase yang paling tinggi di antara keempat strain yang lainnya. Oleh
karena itu perlu diupayakan penelitian mengenai gen pengkode enzim Penisilin V
Asilase Bacillus sp. strain BACS. Dalam penelitian ini fragmen gen PVA Bacillus sp. strain BACS akan diamplifikasi menggunakan pendekatan Polymerase Chain
React ion (PCR) dengan primer-primer yang didesain menurut urutan basa gen PGA Bacillus subtilis .
1.2. Identifikasi Masalah
Apakah gen Penisilin V Asilase dari Bacillus sp. strain BACS bisa
diamptifikasi secara in vitro dengan menggunakan metode Polymeruse Chain
Reaction (PCR) ?
1.3. Maksud dan Tujuan
Maksud dan tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengamplifikasi gen
pengkode Penisilin V Asilase dari Bacillus sp. strain BACS dengan menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR).
1.4. Kegunaan Penelitian
Usaha amplifikasi gen pengkode Penisilin V Asilase dari Bacillus sp. strain BACS dapat digunakan sebagai iangkah awal untuk menentukan urutan
nukleotida gen PVA bakteri ini sehingga manipulasi genetik terhadap gen ini bisa
dikembangkan. Tujuan akhirnya yaitu agar dapat digunakan untuk produksi enzim
Penisilin Asilase yang sudah direkayasa secara genetik sehingga dapat digunakan
untuk membuat antibiotik semisintetik turunan penisilin yang baru, yang dapat
1.5. Metodologi
Eksperimental eksploratif
1.6. Lokasi dan Waktu
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengembangan
Ilmu Kedokteran Dasar, Fakultas Kedokteran-Universitas Kristen Maranatha dan
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1. Kesimpulan
Dari hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa
fragmen gen Penisilin V Asilase dari Bacillus sp. strain BAC5 belum berhasil diampli fikasi dengan menggunakan sepasang primer memakai metode
Polymerase Chain Reaction (PCR).
5.2. Saran
Perlu dilakukan amplifikasi ulang dengan mencari kondisi yang lebih
tepat .
DAFTAR PUSTAKA
Brock, T.D., Madigan, M.T., Martinko, J.M., & Parker, J. 1994. Riologi of microorganism. 7 Edition, Prentice hall. New Jersey. th
Brown, T.A. 1995. Gene Cloning: an introduction. Chapman & Hall.
Crueger, W., dan Crueger, A. 1984. Biotechnology: a textbook of industrial microbiology. Science Tech, Inc.
Gale, E.F., Cundliffe, E., Reynolds, P.E., Richmond, M.H., dan Waring, M.J. 198 1. The molecular basic of antibiotik action. 2nd Edition. John Wiley & Sons.
Illanes, A,, Acevedo, F., Gentina, J.C.,Reyes, L., Torres, R., Cantagena, O., Ruiz, A., dan Vasque,
M.
1994. Production of penicillin acylase from Bacillusmeguterium in complex and define media. Process Biochemistry, 29: 263-270. Innis, M.A., and Gelfand, H. 1994. Optimization of PCR : PCR Protocols, A Guide
to Menthod and Applications, Academic Press, Inc., California, 3- 12.
Khiong. 1999. Hibridisasi Genom Bacillus sp. Strain BAC4 Menggunakan "Probe" Cen Pengkode Penisilin G Asilase. Tesis Magister. Bidang Khusus Genetika dan Biologi Molekuler Program Studi Biologi. Program Pascasajana. Institut Teknologi Bandung.
Martin,, L., Prieto, M.A., Cortes, E., dan Garcia, J.L. 1995. Cloning and sequencing of the PAC gene and coding the penicillin G acylase of Bacillus megaterium ATCC 14945. Fems Microbiology Letters, 125: 287-292.
Meevotisom, V., dan Saunders, J.R. 1987. Cloning and expression of penicillin acylase gene from overproducting strains of Escherichia coli and Bacillus megaterium. Applied and Microbiology Biotechnology, 25: 372-378.
Ratnaningsih, E., Moeis, R.M., Achmad, S., Liang, O.B., dan Sastramihardja, I. 1998. Characterization of penicillin G acylase enzyme and gene from lokal strain of Bacillus sp: culture enzyme, purification, and PCR experiments employing primers derived from B. megaterium pga gene. Annual report I. Graduate team Research Grant. URGE Project. Directorate General of Higher Education. Ministry of Education and Culture. Indonesia.
Riniati. 1999. Usaha amplifikasi dan kloning fiagmen gen Penisilin G Asilase Bacillus sp. BAC4 strain lokal. Tesis Magister. Bidang Kimia Organik. Program Magister Kimia. Institut Teknologi Bandung.
Rondriquez, M.E., Quintero, R., Munguia, A.L. 1994. Design and kinetic characterization of a whole cell penicillin acylase biocatalys using E.coli. Process
Biochemistry 29: 2 13-2 1 8.
Sambrook, J., Fritsch, E.F., dan Manniatis, T. 1989. Molecular cloning, A laboratorium manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratories Press. Cold Spring Harbor.
Shewale, J.G., dan Sivaraman, H. 1989. Penicillin acylase: enzyme production ans its application in the manufacture of 6-APA. Process Biochemistry August: 146- 154.
Soeng, et al., 2000. Determinasi Spesies Bacillus sp. Strain BAC Penghasil Penisilin Asilase Secara Molekuler Menggunakan PCR. Laporan Penelitiun. Bagian Biologi. Fakultas Kedokteran. Universitas Kristen Maranatha.
Sudhakaran, V.K., dan Shewale, J.G. 1995. Purification and characterization of extracellular penicillin V acylase from Fusarium sp. SKF 235. Hindustan antibiot Bull 37 (1-4): 9-15.
Taylor, G.R. 1994. Polymerase Chain Reaction: basic principles & automation. dalam PCR volume 1: A praticaI approach. IRL. Press.
Utami, et a., 2001. Spesifisitas substrat Bacillus sp. BAC, strain lokal penghasil
Penisilin Asilase. Luporun Penelitian. Bagian Biologi. Fakultas Kedokteran. Universitas Kristen Maranatha.
Valle, F., Gosset, G., Tenorio, B., Oliver, G., dan Bolivar, F. 1986. Gene (20): 119-122.
Vandamme, E.J., dan Voets, J.P. 1974. Microbial penicillin acylase. Advance Apply Microbiology I .
