APLIKASI METODE RASIO ABSORBANSI TERHADAP PENETAPAN KADAR SIMULTAN SULFAMETOKSAZOL DAN TRIMETOPRIM DALAM SEDIAAN SUSPENSI SECARA
SPEKTROFOTOMETRI ULTRAVIOLET SKRIPSI
OLEH:
RAESA EMA SARI BARUS NIM 151501162
PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN
2019
APLIKASI METODE RASIO ABSORBANSI TERHADAP PENETAPAN KADAR SIMULTAN SULFAMETOKSAZOL DAN TRIMETOPRIM DALAM SEDIAAN SUSPENSI SECARA
SPEKTROFOTOMETRI ULTRAVIOLET SKRIPSI
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara
OLEH:
RAESA EMA SARI BARUS NIM 151501162
PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN
OLEH:
RAESA EMA SARI BARUS NIM 151501162
PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN
2019
KATA PENGANTAR
Segala puji bagi Allah SWT, shalawat dan salam semoga selalu tercurah kepada Rasulullah Shallallahu ‘alaihi wa sallam yang telah melimpahkan rahmat, karunia dan ridhoNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Aplikasi Metode Rasio Absorbansi terhadap Penetapan Kadar Simultan Sulfametoksazol dan Trimetoprim dalam Sediaan Suspensi Secara Spektrofotometri Ultraviolet”. Skripsi ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
Rasio absorbansi merupakan salah satu metode spektrofotometri yang dapat digunakan untuk penetapan kadar obat dalam campuran. Dan diperoleh bahwa metode ini dapat menentukan kadar kedua zat dalam campuran tanpa pemisahan serta memenuhi persyaratan uji validasi yang dilakukan.
Dalam proses penyelesaian tugas ini banyak hambatan yang penulis jumpai, namun dengan ketabahan dan kebesaran hati serta berkat bimbinganNya, maka penyelesaian ini dapat terpenuhi. Dorongan dan bantuan baik berupa moril maupun materiil banyak penulis terima guna kelancaran tugas ini. Maka perkenankanlah pada kesempatan ini penulis menyatakan rasa terimakasih saya yang sebesar-besarnya kepada :
Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara sekaligus ketua penguji yang telah memberikansaran, masukan dalam penyusunan tugas ini serta fasilitas yang diberikan selama masa pendidikan. Prof. Dr. Muchlisyam, M.Si., Apt., selaku bapak pembimbing yang telah bersusah payah membimbing penulis dengan penuh kesabaran dan keikhlasan hati demi terselesaikannya tugas ini. Ibu Sri Yuliasmi, S.Farm., M.Si.,
Apt., selaku dosen penguji yang telah memberikan saran dan masukan dalam penyusunan tugas ini. Kepala Laboratorium Penelitian berikut staf dosen yang telah memberikan izin kepada penulis menggunakan fasilitas laboratorium sehingga dapat menyelesaikan tugas ini. Bapak dan Ibu Seluruh Staf Pengajar Fakultas Farmasi Universtas Sumatera Utara yang telah mendidik selama masa perkuliahan.
Tak lupa pula penulis ucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya dan penghargaan yang tulus kepada kedua orang tua, Ayahanda Edi Suranta Barus dan Ibunda Maskita br Tarigan, adik serta seluruh keluarga besar tercinta atas do’a, dorongan dan pengorbanandalam penyelesaian tugas ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih terkhusus kepada Tanoto Foundation yang telah banyak memberikan fasilitas berupa moril dan materil sejak awal sebagai penerima beasiswa sampai akhir masa perkuliahan. Terakhir, penulis ingin menyampaikan banyak terimakasih kepada seluruh teman seperjuangan, sahabat Danty R Amalia, Annisa U Nasution, Kak Dian Ramadhina, Kak Fira Hartika dan seluruh staf Laboratorium Kimia Farmasi Kualitatif serta seluruh pihak yang terkait yang tidak bisa penulis tuliskan satu persatu.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih banyak memiliki kekurangan dan oleh sebab itu, dengan segala kerendahan hati penulis bersedia menerima kritik dan saran yang membangun untuk kesempurnaan skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat dan dapat menjadi sumber informasi bagi kita semua khususnya mahasiswa farmasi.
Medan, 13 Februari 2019 Penulis
Raesa Ema Sari Barus
SURAT PERNYATAAN ORISINALITAS
iAPLIKASI METODE RASIO ABSORBANSI TERHADAP PENETAPAN KADAR SIMULTAN SULFAMETOKSAZOL DAN TRIMETOPRIM
DALAM SEDIAAN SUSPENSI SECARA SPEKTROFOTOMETRI ULTRAVIOLET
ABSTRAK
Latar Belakang:Sulfametoksazol (SM) dan Trimetoprim (TM) memiliki perbedaan panjang gelombang maksimum yang cukup jauh 258 nm dan 288 nm secara berurutan, namun tumpang tindih spektrum kedua zat yang saling mempengaruhi menyebabkan analisis kadar kedua zat ini tidak bisa dilakukan dengan metode multikomponen biasa.
Tujuan: Rasio absorbansi merupakan suatu metode analisis paling sederhana untuk penetapan kadar campuran obat yang memiliki panjang gelombang maksimum yang saling tumpang tindih tanpa proses pemisahan terlebih dahulu.
Metode ini diterapkan untuk menetapkan kadar Sulfametoksazol dan Trimetoprim dalam sediaan suspensi.
Metode:Metode ini didasarkan padadua panjang gelombang analisis yaitu titik isoabsorptif dan lainnya sebagai λmax salah satu obat dari dua komponen obat dan analisis dilakukan dengan menggunakan pelarut metanol:air (1:1).
Hasil: Berdasarkan tumpang tindih spektrum campuran obat, diperoleh bahwa Sulfametoksazol dan Trimetoprim memiliki titik isoabsorptif pada panjang gelombang 249 nm. Dan diperolehkadar Sulfametoksazol 99,64 ± 0,28% dan Trimetoprim 96,80 ± 0,74% untuk merk S dan kadar Sulfametoksazol 97,25 ± 0,33% dan Trimetoprim 97,02 ± 1,13% untuk merk K. Dengan simpangan baku relatif 0,17% untuk Sulfametoksazol dan 0,46 % untuk Trimetoprim.
Kesimpulan: Metode ini dapat menetapkan kadar Sulfametoksazol dan Trimetoprim dalam sediaan suspensi dan memenuhi persyaratan validasi.
Kata kunci: Sulfametoksazol, Trimetoprim, Rasio Absorbansi
Q-ABSORBANCE RATIO SPECTROPHOTOMETRIC METHOD FOR THE SIMULTANEOUS ESTIMATION OF SULFAMETOKSAZOL AND
TRIMETOPRIM IN SUSPENSION DOSAGE FORM
ABSTRACT
Background:Sulfamethoxazole (SM) and Trimetoprim (TM) have difference in maximum wavelengths that are quite far 258 nm and 288 nm, respectively. But overlapping the spectrum of both substances that influence each other causes analysis of these two substances cannot be done with ordinary/classic multicomponent methods.
Objective:The absorbance ratio is the simplest method of analysis for the level of drug mixtures which have maximum wavelengths that overlap without the separation process first. This method is applied to determine the levels of Sulfamethoxazole and Trimethoprim in suspension preparations.
Method:This method is based on two analysis wavelengths, namely the isoabsorptive point and the other as λmax of one of the two drug components and the analysis is carried out using methanol:water (1:1) solvent.
Results:Based on the overlapping spectrum of the drug mixture, it was found that Sulfamethoxazole and Trimetoprim had an isoabsorptive point at a wavelength of 249 nm. And obtained levels of Sulfamethoxazole 99.64 ± 0.28% and Trimetoprim 96.80 ± 0.74% for the S brand and Sulfamethoxazole levels 97.25 ± 0.33% and Trimetoprim 97.02 ± 1.13% for the K brand. With relative standard deviation of 0.17% for Sulfamethoxazole and 0.46% for Trimetoprim.
Conclusion: This method can determine the levels of Sulfamethoxazole and Trimethoprim in suspension preparations and meet the validation requirements.
Keywords: Sulfamethoxazole, Trimethoprim, Absorbance Ratio
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ... i
HALAMAN SAMPUL ... ii
LEMBAR PENGESAHAN ... iii
KATA PENGANTAR ... iv
SURAT PERNYATAAN ORISINALITAS ... vi
ABSTRAK ... vii
ABSTRACT ... viii
DAFTAR ISI ... ix
DAFTAR TABEL ... xi
DAFTAR GAMBAR ... xii
DAFTAR GAMBAR DALAM LAMPIRAN ... xiii
DAFTAR LAMPIRAN ... xiv
BAB IPENDAHULUAN ... 1
1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 PerumusanMasalah ... 4
1.3 Hipotesis ... 4
1.4 Tujuan Penelitian ... 5
1.5 Manfaat Penelitian ... 5
1.6 Kerangka Penelitian ... 5
BAB IITINJAUAN PUSTAKA ... 7
2.1 Suspensi Kotrimoksazol ... 7
2.2 Uraian Bahan ... 7
2.2.1Sulfametoksazol ... 7
2.2.2Trimetoprim ... 8
2.3 Analisis Simultan Sulfametoksazol & Trimetoprim ... 9
2.4 Spektrofotometri Ultraviolet-Visibel (UV-Vis) ... 11
2.4.1Metode rasio absorbansi& Aplikasinya dalam Bidang Farmasi ... 16
2.5 Metode Penambahan Standar ... 19
2.6 Validasi Metode ... 20
2.6.1Akurasi ... 21
2.6.2Presisi ... 22
2.6.3Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ) ... 22
2.6.4Linearitas ... 22
BAB III METODE PENELITIAN... 24
3.1 Jenis Penelitian ... 24
3.2 Tempat dan Waktu Penelitian ... 24
3.3 Alat ... 24
3.4 Bahan... 24
3.5 Pengambilan Sampel ... 24
3.6 Prosedur Penelitian... 25
3.6.1Pembuatan Larutan Induk Baku Sulfametoksazol ... 25
3.6.2Pembuatan Larutan Induk Baku Trimetoprim ... 25
3.6.3Pembuatan Spektrum Serapan Maksimum Sulfametoksazol ... 25
3.6.4Pembuatan Spektrum Serapan Maksimum Trimetoprim ... 25
3.6.5Pembuatan Spektrum Serapan Baku Sulfametoksazol ... 26
3.6.6Pembuatan Spektrum Serapan Baku Trimetoprim ... 26 3.6.7Penentuan Panjang Gelombang Isoabsorptif dan Panjang Gelombang
3.6.8 Pembuatan kurva kalibrasi Sulfametoksazol pada Titik Isoabsorptif .. 27
3.6.9 Pembuatan kurva kalibrasi Trimetoprim pada Titik Isoabsorptif ... 27
3.6.10Pembuatan Spektrum Serapan Campuran Baku Sulfametoksazol & Trimetoprim ... 27
3.7 Penetapan Kadar Sulfametoksazol & Trimetoprim dalam Sediaan Suspensi ... 28
3.8 Analisis Data Secara Statistik ... 28
3.9 Validasi Metode ... 29
3.9.1 Uji Akurasi ... 29
3.9.2 Uji Presisi ... 29
3.9.3 Linearitas, batas deteksi (Limit of Detection, LOD) dan batas deteksi (Limit of Quantification, LOQ) ... 30
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 31
4.1 Optimasi Pelarut ... 31
4.2 Penentuan Spektrum Serapan Maksimum ... 32
4.3 Metode Rasio Absorbansi ... 34
4.3.1Penentuan Titik Isoabsorptif ... 35
4.3.2Hasil Penetapan Kadar Sulfametoksazol dan Trimetoprim dalam Sediaan Suspensi ... 36
4.4 Hasil Validasi Metode ... 39
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 43
5.1 Kesimpulan ... 43
5.2 Saran ... 43
DAFTAR PUSTAKA ... 44
LAMPIRAN ... 47
DAFTAR TABEL
2.1 Penelitian yang pernah dilakukan untuk analisis Sulfametoksazol &
Trimetoprim ... 11
2.2 Aplikasi Spektrofotometri UV secara Rasio Absorbansi pada berbagai zat ... 18
2.3 Kriteria daerah recovery yang dapat diterima ... 21
4.1 Absorbansi dan % Transmitan Sulfametoksazol dan Trimetoprim ... 31
4.2 Kesalahan Fotometrik ... 31
4.3 Data kadar Sulfametoksazol dan Trimetoprim dalam suspensi K ... 38
4.4 Data kadar Sulfametoksazol dan Trimetoprim dalam suspensi S ... 38
4.5 Kadar Sulfametoksazol dan Trimetoprim dalam Suspensi K secara statistik ... 39
4.6 Kadar Sulfametoksazol dan Trimetoprim dalam Suspensi S secara statistik ... 39
4.7 Data hasil analisis & rangkuman validasi dari Sulfametoksazol dan Trimetoprim ... 42
DAFTAR GAMBAR
1.1 Diagram Tulang Penelitian ... 6
2.1 Struktur Sulfametoksazol ... 7
2.2 Struktur Trimetoprim ... 8
2.3 Kurva Serapan terhadap Panjang Gelombang dari Zat X dan Zat Y . ... 10
2.4 Diagram Tingkat Energi Elektronik... 14
2.5 Kurva Serapan Terhadap Panjang Gelombang Zat X (- - -), Zat Y (+++ ) dan Campuran Zat X dan Y (-+-+-) ... 16
4.1 Spektrum Serapan Maksimum Sulfametoksazol 6,1 μg/mL ... 32
4.2 Spektrum Serapan Maksimum Trimetoprim 17,2 μg/mL ... 33
4.3 Spektrum Serapan Campuran Baku Sulfametoksazol dan Trimetoprim ... 33
4.4 Spektrum Tumpang Tindih Campuran Baku Obat dengan Sampel. 34 4.5 Spektrum Tumpang Tindih Serapan Tunggal Sulfametoksazol & Trimetoprim ... 35
4.6 Spektrum Serapan Suspensi K ... 37
4.7 Spektrum Serapan Suspensi S ... 37
4.8 Kurva kalibrasi Sulfametoksazol pada 258 nm & 249 nm ... 40
4.9 Kurva kalibrasi Trimetoprim pada 288 nm & 249 nm ... 41
DAFTAR GAMBAR DALAM LAMPIRAN
1 Spektrum Serapan Sulfametoksazol Konsentrasi 3,3μg/mL... 48
2 Spektrum Serapan Sulfametoksazol Konsentrasi 4,7 μg/mL... 48
3 Spektrum Serapan Sulfametoksazol Konsentrasi 6,1 μg/mL... 49
4 Spektrum Serapan Sulfametoksazol Konsentrasi 7,5 μg/mL... 49
5 Spektrum Serapan Sulfametoksazol Konsentrasi 8,9 μg/mL... 50
6 TumpangTindihSpektrum Baku Sulfametoksazol ( 3,3 μg/mL, 4,7 μg/mL, 6,1 μg/mL, 7,5 μg/mL, 8,9 μg/mL ) ... 50
7 Spektrum Serapan Trimetoprim Konsentrasi 9,2 μg/mL ... 51
8 Spektrum Serapan Trimetoprim Konsentrasi 13,2 μg/mL ... 51
9 Spektrum Serapan Trimetoprim Konsentrasi 17,2 μg/mL ... 52
10 Spektrum Serapan Trimetoprim Konsentrasi 21,2 μg/mL ... 52
11 Spektrum Serapan Trimetoprim Konsentrasi 25,2 μg/mL ... 53
12 TumpangTindihSpektrum Baku Trimetoprim ( 9,2 μg/mL, 13,2 μg/mL, 17,3 μg/mL, 21,2 μg/mL, 25,2 μg/mL ) ... 53
13 Gambar Suspensi Kotrimoksazol ... 91
14 Gambar Suspensi Sanprima ... 91
15 Gambar Spektrofotometer UV-Vis Shimadzu ... 92
16 Gambar Neraca Analitik (Boeco Germany) ... 92
17 Gambar Sonikator (Branson 1510) ... 92
DAFTAR LAMPIRAN
1 Contoh Perhitungan % Transmitan dan Kesalahan Fotometrik .... 47 2 SpektrumSerapan Baku Sulfametoksazol Pada Berbagai
Konsentrasi ... 48 3 Spektrum Serapan Baku Trimetoprim Pada Berbagai
Konsentrasi ... 51 4 Bagan Alir Prosedur Penelitian ... 54
a. Bagan Alir Pembuatan Larutan Induk Baku (LIB) dan Serapan Maksimum Sulfametoksazol secara Kuantitatif ... 54 b. Bagan Alir Pembuatan Larutan Induk Baku (LIB) dan
Serapan Maksimum Trimetoprim secara Kuantitatif ... 55 c. Bagan Alir Pembuatan dan Pengukuran Serapan Larutan
Standar Sulfametoksazol ... 56 d. Bagan Alir Pembuatan dan Pengukuran Serapan Larutan
Standar Trimetoprim ... 57 e. Bagan Alir Pembuatan Larutan Baku Campuran
Sulfametoksazol dan Trimetoprim ... 58 f. Bagan Alir Penentuan Kadar Sulfametoksazol dan
Trimetoprim dalam Suspensi S ... 59 g. Bagan Alir Penentuan Kadar Sulfametoksazol dan
Trimetoprim dalam Suspensi K ... 60 h. Bagan Alir Penentuan Kadar Sulfametoksazol dan
Trimetoprim dalam Suspensi K ... 61 5 Perhitungan Penentuan Konsentrasi Serapan Baku
Sulfametoksazol dan Trimetoprim Berdasarkan Hukum Lambert-Beer ... 62 6 Data Kalibrasi Baku Sulfametoksazol, Persamaan Regresi dan
Koefisien Korelasi ... 65 7 Data Kalibrasi Baku Trimetoprim, Persamaan Regresi dan
Koefisien Korelasi ... 67 8 Perhitungan Kadar Teoritis Sulfametoksazol Dan Trimetoprim
Dalam Sediaan Suspensi ... 69 9 Contoh Perhitungan Konsentraasi dengan Menggunakan Metode
Rasio Absorbansi dari Sulfametoksazol & Trimetoprim dalam Suspensi K dan S ... 71 10 Data Kadar Sulfametoksazol & Trimetoprim dalam Sediaan
Suspensi K ... 73 11 Data Kadar Sulfametoksazol & Trimetoprim dalam Sediaan
Suspensi K ... 74 12 Perhitungan Kadar Sulfametoksazol Dan Trimetoprim Secara
Statistik Pada Suspensi K ... 75 13 Perhitungan Kadar Sulfametoksazol Dan Trimetoprim Secara
Statistik Pada Suspensi S ... 79 14 Contoh Perhitungan Persentase Perolehan Kembali (%
recovery) ... 83 15 Data Hasil Persen Perolehan Kembali Trimetoprim pada sediaan
Suspensi K dengan Metode Penambahan Baku (Standart Addition Method) ... 85
16 Perhitungan Kadar Perolehan Kembali Sulfametoksazol secara
Statistik ... 86
17 Perhitungan Simpangan Baku, Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ) Sulfametoksazol dan Trimetoprim ... 87
18 Data Hasil Persen Perolehan Kembali Trimetoprim pada sediaan Suspensi K dengan Metode Penambahan Baku (Standart Addition Method) ... 88
19 Perhitungan Kadar Perolehan Kembali Trimetoprim secara Statistik ... 89
20 Perhitungan Simpangan Baku, Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ) Trimetoprim ... 90
21 Gambar Suspensi K dan S ... 91
22 Gambar Alat-alat ... 92
23 Tabel distribusi t ... 93
24 Sertifikat Analisis Baku Sulfametoksazol ... 94
25 Sertifikat Analisis Baku Trimetoprim ... 95
BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang
Produk obat multikomponen semakin banyak beredar dan berkaitan dengan penetapan kadar maka penetapan kadar zat berkhasiat dalam campuran komponen obat menjadi tantangan untuk mencari metode yang sederhana, cepat dan tervalidasi dan aman bagi peneliti (Muchlisyam dan Pardede, 2017).
Terdapat berbagai macam metode penentuan kadar, salah satunya adalah spektrofotometri. Spektrofotometri merupakan metode yang sederhana,efektif, cepat dan relatif lebih murah bila dibandingkan dengan metode lainnya. Namun demikian, masih dibutuhkan pengembangan metode spektrofotometri agar lebih akurat dan fleksibel untuk analisis pengawasan mutu sediaan farmasi (Prasad dkk., 2012).
Metode spektrofotomeri UV dapat digunakan untuk penetapan kadar Sulfametoksazol dan Trimetoprim karena struktur Sulfametoksazol dan Trimetoprim memiliki ikatan rangkap terkonjugasi, gugus kromofor dan gugus auksokrom yang merupakan persyaratan bahan yang dapat dianalisis dengan Spektrofotometri UV (Gandjar dan Rohman, 2017).
Rasio absorbansi atau sering disebut dengan Q-ratio Method merupakan salah satu metode spektrofotometri yang dapat digunakan untuk menentukan kadar obat dalam bentuk campuran. Metode ini menggunakan rasio dari absorbansi pada dua panjang gelombang yang dipilih, yang merupakan isoabsorptive point dan lainnya sebagai λmaks salah satu dari dua komponen obat (Singh dkk., 2012).
Metode spektrofotometri secara rasio absorbansi adalah salah satu metode spektrofotometri yang dapat digunakan untuk analisis campuran beberapa zat secara langsung tanpa harus melakukan pemisahan dan derivatisasi terlebih dahulu walaupun dengan panjang gelombang yang berdekatan, serta dapat menganalisa sediaan obat yang mengandung tiga campuran zat aktif obat yang berbeda memberikan hasil yang baik dan akurat (Pallavi dkk., 2013;Modak dkk., 2010). Metode spektrofotometri secara rasio absorbansi relatif lebih sederhana, alat dan biaya operasionalnya lebih murah, waktu analisisnya lebih cepat, serta pengembangan metode spektrofotometri pada saat ini dapat melakukan pengukuran pada campuran zat aktif pada sediaan obat menggunakan lima metode spektrofotometri secara bersamaan (Attia dkk., 2016).
Pengukuran menggunakan alat Spektrofotometer UV didasarkan pada penyerapan dari energi radiasi elektromagnetik oleh suatu media yang dilakukan pada daerah ultraviolet yaitu pada panjang gelombang 200 – 400 nm (Armin dkk., 2012).
Persyaratan kadar menurut USP XXII NF XVII (1990) Sulfametoksazol dan Trimetoprim dalam sediaan suspensi oral tidak kurang dari 90,0 % dan tidak lebih dari 110,0 % dari jumlah yang tertera pada etiket.
Penetapan kadar kombinasi Sulfametoksazol dan Trimetoprim dalam sediaan tablet dapat dilakukan dengan cara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) (Ditjen POM RI, 1995).
Penelitian yang telah dilakukan Akbar (2013), menetapkan kadar campuran Sulfametoksazol dan Trimetoprim dengan menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).Namun metode ini memerlukan waktu yang cukup
lama untuk proses preparasi sampel karena adanya tahap ektraksi pelarut, pemanasan, degassing dan memerlukan biaya yang cukup mahal.
Penelitian yang dilakukan Rohman dkk., (2015), menetapkan kadar campuran Sulfametoksazol dan Trimetoprim secara Spektrofotometri Ultraviolet dengan perhitungan kalibrasi multivariat berdasarkan Partial Least Square Regression Method. Metode ini tidak memerlukan waktu preparasi sampel yang lama, sederhana dan tidak mahal tetapi memerlukan proses perhitungan matematika yang rumit pada tahap analisisnya.
Beberapa penelitian telah menggunakan metode Rasio Absorbansi pada penetapan kadar campuran obat seperti penetapan kadar simultan Lamivudine dan Isoniazid (Pandey dan Mishra, 2013), simultan Ciprofloxacin dan Metronidazole (Patel dan Prajapati, 2012) serta simultan Atorvastatin dan Niacin (Ramesh dkk.,2012) memberikan hasil yang akurat, presisi dan selektif. Metode spektrofotometri secara rasio absorbansiini tidak memerlukan waktu preparasi sampel yang lama, pelarut yang banyak, perhitungan matematika yang rumit dan proses derivatisasi untuk penentuan nilai zero crossing (Chaudary dkk., 2011).
Berdasarkan uraian diatas, maka dalam penelitian ini akan dilakukan analisis secara simultan kandungan sulfametoksazol dan trimetoprim dalam sediaan suspensi dengan metode rasio absorbansi secara spektrofotometri ultraviolet.
1.2 Perumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang diatas, maka perumusan masalah dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:
1. Apakah metode Spektrofotometri Ultraviolet secaraRasio Absorbansi dapat digunakan untuk menetapkan kandungan Sulfametoksazol dan Trimetoprim secara simultan?
2. Apakah metode Spektrofotometri Ultraviolet secara Rasio Absorbansi dapat digunakan untuk menetapkan secara simultan kandungan Sulfametoksazol dan Trimetoprim dalam sediaan suspensi di pasaran?
3. Apakah uji validasi terhadap Spektrofotometri Ultraviolet secara Rasio Absorbansi untuk menganalisa secara simultan kandungan Sulfametoksazol dan Trimetoprim pada sediaan suspensi memenuhi syarat pengujian validasi?
1.3 Hipotesis
Berdasarkan perumusan masalah diatas, maka dibuat hipotesis sebagai berikut:
1. Metode Rasio Absorbansi secara Spektrofotometri Ultraviolet dapat digunakan untuk menetapkan kadar Sulfametoksazol dan Trimetoprim secara simultan.
2. Metode Spektrofotometri Ultraviolet secara Rasio Absorbansi dapat digunakan untuk menetapkan secara simultan kandungan Sulfametoksazol dan Trimetoprim dalam sediaan suspensi di pasaran.
3. Hasil uji validasi terhadap metode Spektrofotometri Ultraviolet secara Rasio Absorbansi untuk menganalisa secara simultan kandungan
Sulfametoksazol dan Trimetoprim pada sediaan suspensi memenuhi syarat pengujian validasi.
1.4 Tujuan Penelitian
Adapun tujuan dari penelitian ini adalah :
1. Untuk mengaplikasikan metode Spektrofotometri Ultraviolet secara Rasio Absorbansi pada penetapan kandungan Sulfametoksazol dan Trimetoprim secara simultan.
2. Untuk mengaplikasikan metode Spektrofotometri Ultraviolet secara Rasio Absorbansi kandungan Sulfametoksazol dan Trimetoprim secara simultan dalam sediaan suspensi di pasaran.
3. Untuk mengetahui hasil uji validasi terhadap Spektrofotometri Ultraviolet secara Rasio Absorbansi kandungan Sulfametoksazol dan Trimetoprim secara simultan dalam sediaan suspensi.
1.5 Manfaat Peneltian
Diharapkan metode hasil pengembangan dari penelitian ini dapat menjadi salah satu metode yang dapat diaplikasikan oleh instansi terkait dalam menentukan secara simultan kandungan Sulfametoksazol dan Trimetoprim pada sediaan suspensi.
1.6 Kerangka Pikir Penelitian
Penelitian ini meliputi orientasi panjang gelombang maksimum, titik isoabsorptif dan nilai Rasio Absorbansi yang digunakan untuk mendapatkan kadar kemudian kondisi diaplikasikan terhadap sampel yang beredar dipasaran, selanjutnya metode divalidasi. Secara ringkasnya kerangka pikir penelitian dapat dilihat pada Gambar 1.1
Gambar 1.1Diagram Tulang
Kadar
2) Uji Kelarutan
3)Spektrum Absorpsi Maksimum
4) Kurva Kalibrasi
5) Tumpang Tindih Spektrum
1) Pembuatan Pelarut Metanol:Air
(1:1)
6) Penentuan Titik Isoabsorptif
7) Pengukuran pada Titik Isoabsorptif
dan λmax
8) Penentuan Rasio Absorbansi
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Suspensi Kotrimoksazol
Suspensi adalah sediaan cair yang mengandung partikel padat tidak larutyang terdispersi dalam fase cair (Ditjen POM RI, 1995). Kotrimoksazol merupakan kombinasi sulfametoksazol dan trimetoprim yang bersifat sinergis.
Bekerja sebagai antibakteri yang banyak digunakan dalam infeksi saluran kemih, saluran pernapasan dan saluran pencernaan (Rohman dkk., 2015).Suspensi Kotrimoksazol mengandung Sulfametoksazol C10H11N3O3S dan Trimetoprim C14H18N4O3, tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket (USP XXII NF XVII, 1990).
2.2 Uraian Bahan 2.2.1 Sulfametoksazol
Ditjen POM RI, (1995) menguraikan tentang Sulfametoksazol sebagai berikut :
Rumus struktur:
Gambar 2.1 Struktur Sulfametoksazol
Nama IUPAC : N1-(5-metil-3-isoksazolil)sulfanilamida Rumus molekul : C10H11N3O3S
Berat molekul : 253,28
Pemerian : Serbuk hablur, putih sampai hampir putih, praktis tidak fsberbau.
Kelarutan : Praktis tidak larut dalam air, dalam eter dan dalam arikloroform; mudah larut dalam aseton dan dalam larutan diinatrium hidroksida encer; agak sukar larut dalam etanol.
Wadah : tDalam wadah tertutup rapat dan terlindung cahaya.
2.2.2Trimetoprim
Ditjen POM RI, (1995) menguraikan tentang Trimetoprim sebagai berikut:
Rumus struktur:
Gambar 2.2 Struktur Trimetoprim
Nama IUPAC : 2,4-Diamino-5-(3,4,5-trimetoksibenzil)pirimidina Rumus molekul : C14H18N4O3
Berat molekul : 290,32
Pemerian : Hablur atau serbuk hablur, putih sampai krem, tidak hjberbau.
Kelarutan : Sangat sukar larut dalam air,larut dalam benzil alkohol;
njagak sukar larut dalam kloroform dan metanol; sangat msukar larut dalam etanol dan dalam aseton; praktis tidak sklarut dalam eter dan dalam karbon tetraklorida.
Wadah : Dalam wadah tertutup rapat, tidak tembus cahaya.
2.3 Analisis Simultan Sulfametoksazol dan Trimetoprim
Penetapan kadar Sulfametoksazol dapat dilakukan secara kromatografi, yaitu Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Penetapan kadar dapat juga dilakukan secara spektrofotometri infra merah dan spektrofotometri ultraviolet pada panjang gelombang 257 nm (Ditjen POM RI, 1995).
Penetapan kadar Trimetoprim bentuk tunggal dapat ditentukan dengan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (Ditjen POM RI, 1995), titrasi Nitrimetri (Ditjen POM RI, 1979) dan dalam bentuk tunggal juga dapat ditetapkan dengan spektrofotometri ultraviolet dalam pelarut basa pada panjang gelombang 287 nm (Ditjen POM RI, 1995).
Menurut Irianto(1987), dasar analisis secara simultan ialah hukum Lambert- Beer, dimana serapan suatu campuran merupakan jumlah total serapan masing- masing komponen penyusunnya (ditandai dengan i).
A = ΣAi =
ԑ
i . bi . ciDengan mengetahui nilai koefisien ekstingsi (
ԑ
i) dari masing-masing komponen campuran, maka dengan menggunakan rumus diatas dapat ditentukan kadar dari masing-masing komponen campuran tersebut.Untuk penetapan kadar dengan cara simultan, maka syarat utama kurva spektra dari masing-masing komponen harus saling tumpang tindih (overlap) satu sama lain dan jarak panjang gelombang ±10 nm. Pada pelaksanaannya dilakukan pada 2 panjang gelombang yaitu panjang gelombang maksimum dari kedua senyawa.
Misal suatu campuran terdiri dari zat X dan zat Y, dengan koefisien ekstingsi
ԑ
x danԑ
y pada panjang gelombang λ,ԑ
’x,ԑ
’y, λ’ dengan medium setebal bdengan kadar yang belum diketahui dinyatakan sebagai cx dan cy, maka sesuai dengan hukum Lambert-Beer dihasilkan persamaan sebagai berikut :
A =
ԑ
x . b . cx +ԑ
y . b . cy A’ =ԑ
’x . b . cx +ԑ
’y . b . cyDengan menggabungkan kedua persamaan diatas pada harga b = 1, diperoleh persamaan :
Cx =
Cy =
Gambar 2.3 Kurva serapan terhadap panjang gelombang dari zat X ( ) dan zat Y (- - -)
Penelitian yang telah dilakukan Akbar (2013), menetapkan kadar campuran sulfametoksazol dan trimetoprim dengan menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Namun metode ini memerlukan waktu yang cukup lama untuk proses preparasi sampel karena adanya tahap ektraksi pelarut, pemanasan, degassing dan memerlukan biaya yang cukup mahal.
Penelitian yang dilakukan Rohman dkk., (2015), menetapkan kadar campuran sulfametoksazol dan trimetoprim secara spektrofotometri ultraviolet dengan perhitungan kalibrasi multivariat berdasarkan Partial Least Square Regression Method. Metode ini tidak memerlukan waktu preparasi sampel yang lama, sederhana dan tidak mahal tetapi memerlukan proses perhitungan matematika yang rumit pada tahap analisisnya.
Beberapa penelitian lain yang telah dilakukan untuk analisis Sulfametoksazol dan Trimetoprimdapat dilihat pada tabel berikut:
Tabel 2.1 Penelitian yang telah dilakukan untuk analisis Sulfametoksazol dan Trimetoprim
Senyawa Metode Pelarut Referensi
Sulfametoksazol dan Trimetoprim
High Performance Liquid Chromatography
Acetonitril dan
Trietilamin Akbar (2013) Sulfametoksazol
dan Trimetoprim
Spectrophotometric UV
(Mean Centering Ratio) NaOH 0,1 N Setiawan (2015) Sulfametoksazol
dan Trimetoprim
Spectrophotometric UV (Partial Least Square)
Metanol:Aquades (8:2)
Rohman dkk., (2015)
2.4 Spektrofotometri Ultraviolet-Visibel (UV-Vis)
Teknik analisis spektroskopi berasaskan interaksi radiasi elektromagenetik dengan komponen atom atau molekul yang menghasilkan fenomena bermakna sebagai parameter analisis. Pada spektroskopi pembangkit sinyal adalah hasil interaksi energi radiasi elektromagnetik dengan elektron dalam atom/molekul
analit yang menyebabkan transisi elektron valensi atom/molekul dari tingkat energi elektron dasarnya ke tingkat energi elektron tertentu yang lebih tinggi atau meningkatkan energi vibrasi-rotasi ikatan antar atom dalam molekul (Satiadarma dkk., 2004).
Dasar analisis kuantitatif senyawa obat dengan spektrofotometri UV-Vis adalah Hukum Lambert-Beer (Gandjar dan Rohman, 2017). Menurut Hukum Lambert, serapan berbanding lurus terhadap ketebalan sel yang disinari, sedangkan menurut Beer, serapan berbanding lurus dengan konsentrasi. Kedua pernyataan ini dapat dijadikan satu dalam Hukum Lambert-Beer, sehingga diperoleh bahwa serapan berbanding lurus terhadap konsentrasi dan ketebalan sel, yang dapat ditulis dengan persamaan:
A = A (1%,1cm).b.c (g/100 mL)
A adalah serapan pada panjang gelombang; A (1% 1cm) adalah serapan jenis pada panjang gelombang; b adalah ketebalan lapisan yang menyerap dalam cm; c adalah kadar zat terlarut yang menyerap, dinyatakan dalam persen b/v (Ditjen POM RI, 1995). Umumnya zat yang akan dianalisis dibuat absorbansinya mendekati 0,4343 atau dibuat absorbansi berada pada daerah 0,2-0,8. Hal ini dikarenakan jika analit diukur pada daerah tersebut nilai kesalahan fotometriknya kecil atau lebih kecil jika absorbansi analit diukur diluar daerah 0,2-0,8.
Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal. Untuk memilih panjang gelombang maksimal, dilakukan dengan membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu larutan baku pada konsentrasi tertentu (Gandjar dan Rohman, 2017).
Parameter yang menentukan panjang gelombang absorpsi maksimum yang tepat pada suatu transisi elektron bukan hanya kromofornya saja, tetapi juga pelarut, gugus substituen pada kromofor dan geometri kromofor. Efek pelarut disebabkan karena efek solvatasi molekul dapat mengubah tingkat energi elektron kromofor dan derajat solvatasi molekul pada tingkat dasar dan tereksitasi yang sering kali berbeda. Jika molekul tingkat dasar tersolvatasi lebih kuat dari pada molekul tereksitasi, perbedaan energi diantara kedua tingkat itu bertambah yang dapat diamati dengan adanya pergeseran panjang gelombang yang lebih pendek disebut efek hipsokrom atau geseran biru. Tetapi sebaliknya jika tingkat tereksitasi tersolvatasi lebih kuat, perbedaan energi dari kedua tingkat jadi lebih kecil dan terjadi pergeseran panjang gelombang yang diabsorpsi ke panjang gelombang yang lebih besar disebut efek batokrom atau geseran merah (Satiadarma dkk., 2004).
Radiasi ultraviolet dan sinar tampak diabsorpsi oleh molekul organik aromatik, molekul yang mengandung elektron-π terkonjugasi dan/atau atom yang mengandung elektron-n, menyebabkan transisi elektron di orbit terluarnya dari tingkat enegi elektron dasar ke tingkat energi elektron tereksitasi lebih tinggi.
Besarnya absorban radiasi tersebut sebanding dengan banyaknya molekul analit yang mengabsorpsi dan dapat digunakan untuk analisis kuntitatif (Satiadarma dkk., 2004).
Gandjar dan Rohman, (2017) menyatakan apabila pada suatu molekul dikenakan radiasi elektromagnetik maka akan terjadi eksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi yang dikenal sebagai orbital elektron “anti-bonding”. Diagram tingkat elektron pada keadaan dasar dan keadaan tereksitasi ditunjukkan pada Gambar2.4:
Gambar 2.4 Diagram tingkat energi elektronik
Penggunaan utama spektroskopi ultraviolet-sinar tampak adalah dalam analisis kuantitatif. Apabila dalam alur radiasi spektrofotometer terdapat senyawa yang mengabsorpsi radiasi, akan terjadi pengurangan kekuatan radiasi yang mencapai detektor. Parameter kekuatan energi radiasi khas yang diabsorpsi oleh molekul adalah absorban (A) yang dalam batas konsentrasi rendah nilainya sebanding dengan banyaknya molekul yang mengabsorpsi radiasi dan merupakan dasar analisis kuantitatif (Satiadarma dkk, 2014)
Menurut Gandjar dan Rohman (2017), absorpsi sinar ultraviolet oleh suatu atom atau molekul M dapat dianggap melalui dua proses. Proses pertama adalah eksitasi yang ditunjukkan oleh persamaan: M + hv M*. Ketika suatu radiasi foton melewati molekul, absorpsi dapat terjadi jika energi foton tersebut sesuai dengan perbedaan energi di antara dan satu tingkat energi yang lebih tinggi dari molekul tersebut. Pada keadaan ini energi dari foton ditransfer kepada molekul tersebut dan mengubahnya ke tingkat energi yang lebih tinggi yang disebut excited state M*, proses terakhir adalah relaksasi. Setelah suatu periode singkat, molekul berelaksasi ke tempat aslinya atau ground state dengan mentransfer kelebihan energinya ke atom atau molekul lain pada medium tersebut. Proses ini menyebabkan peningkatan temperatur lingkungan sementara, seperti yang ditunjukkan pada persamaan berikut: M*
M + panas.
Kurva absorpsi di daerah ultraviolet pada umumnya lebih sempit daripada kurva absorpsi di daerah sinar tampak. Penentuan kadar dilakukan dengan mengukur absorban pada panjang gelombang absorpsi maksimum (puncak kurva), agar dapat memberikan absorban tertinggi untuk setiap konsentrasi. Bila suatu senyawa mempunyai lebih dari satu puncak absorpsi maksimum, lebih diutamakan panjang gelombang absorpsi maksimum yang absorptivitasnya terbesar dan memberikan kurva kalibrasi linier dalam rentang konsentrasi yang relatif lebar (Satiadarma dkk, 2014). Sifat-sifat spektra serapan seperti intensitas serapan/mol (daya serap molar), posisi spektra serta lebar pita serapan juga berkaitan dengan struktur molekuler dan lingkungannya. Semua itu dapat digunakan untuk analisis kualitatif (Munson,1984).
Transisi n atau π ke π*, untuk memungkinkan terjadinya jenis transisi ini, maka molekul organik harus mempunyai gugus fungsional yang tidak jenuh sehingga ikatan rangkap dalam gugus tersebut memberikan orbital phi yang diperlukan. Jenis transisi ini merupakan transisi yang paling cocok untuk analisis sebab sesuai dengan panjang gelombang antara 200-700 nm dan panjang gelombang ini secara teknis dapat diaplikasikan pada spektrofotometer (Gandjar dan Rohman, 2017).
Senyawa organik pada umumnya mempunyai gugusan atom yang dapat mengabsorpsi radiasi UV dan sinar tampak disebut sebagai kromofor. Penting untuk mengetahui berbagai macam kromofor dan perkiraan panjang gelombang maksimalnya, hal ini disebabkan karena panjang gelombang maksimal juga dipengaruhi oleh pelarut dan struktur molekul kimia yang mengandung kromofor.
Pada molekul organik dikenal pula istilah auksokrom yang merupakan gugus fungsional yang mempunya elektron bebas, seperti: OH; -NH2; dan -OCH3 yang
memberikan transisi n keπ*. Terikatnya gugus auksokrom pada gugus kromofor akan mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke panjang gelombang yang lebih besar (pergeseran merah = pergeseran batokromik) disertai dengan peningkatan intensitas (efek hiperkromik) (Gandjar dan Rohman, 2017).
2.4.1 Metode Rasio Absorbansi dan aplikasinyadalam bidang farmasi
Untuk menjabarkan perhitungan kadar dari cara ini Irianto, (1987) menggunakan suatu model campuran biner zat X dan zat Y, dimana kurva spektranya seperti yang terlihat pada Gambar 2.5.
Gambar 2.5Kurva serapan terhadap panjang gelombang zat X (- - -), zat Y ( ) dan campuran zat X dan Y (-+-+-)
λiso = panjang gelombang dimana daya serap zat X dan Y sama.
λ1 = panjang gelombang maksimum tertinggi.
A5 =,daya serap campuran zat X dan Y pada panjang gelombang ,,,,isoabsorpsi.
A4 =,daya serap campuran zat X dan Y pada panjang gelombang ,,,,maksimum terpilih.
a1 = daya serap zat Y pada panjang gelombang maksimum terpilih.
a2 = daya serap zat X dan Y pada panjang gelombang isoabsorpsi.
a3 = daya serap zat X panjang gelombang maksimum terpilih.
Metode ini melibatkan pengukuran absorbansi pada dua panjang gelombang, satu adalah λmax dari salah satu komponen (λ2) dan yang lainnya adalah panjang gelombang absorptivitas yang sama dari dua komponen (λ 1) yang disebut titik isoabsorpsi (Muchliyam dan Pardede, 2017)
Konsentrasi masing – masing komponen dapat dihitung dengan persamaan matematis berikut:
Cx =
Cy =
Keterangan :
A1 = Absorbansi larutan sampel pada isoabsorptive point Cx = Konsentrasi Sulfametoksazol
Cy = Konsentrasi Trimetoprim
ax1 = Absorptivitas sampel x pada panjang gelombang isoabsorptif ay1 = Absorptivitas sampel y pada panjang gelombang isoabsorptif
Qm = A2A1 Keterangan :
A2 = Absorbansi dari larutan sampel pada panjang gelombang maksimum dari suatu komponen (λ 2)
A1 = Absorbansi dari larutan sampel pada panjang gelombang isoabsorpsi dua komponen (λ 1)
Qx = ax2
ax1
Keterangan :
ax2 = Absorbansi dari baku x pada panjang gelombang maksimum dari satu komponen (λ 2)
ax1 = Absorbansi dari baku x pada panjang gelombang maksimum isoabsorpsi dua komponen (λ 1)
Qy = ay2
ay1
Keterangan :
ay2 = Absorbansi dari baku y pada panjang gelombang maksimum dari satu komponen (λ 2)
ay1 = Absorbansi dari baku y pada panjang gelombang maksimum isoabsorpsi dua komponen (λ 1).
Beberapa penelitian yang telah dilakukan Gaurang dkk., (2013) telah mengembangkan metode spektrofotometri secara Rasio Absorbansi untuk
penetapan kadar secara simultan loteprednol etabonat dan moxifloxacin HCl, memberikan hasil yang baik dan akurat tanpa langkah pemisahan maupun derivatisasi terlebih dahulu.
Sedangkan penelitian yang dilakukan oleh Sravanthi dkk., (2017) telah menentukan kadar dua obat yaitu metoprolol suksinat dan hidroklortiazid dengan menggunakan tiga metode spektrofotometri sekaligus yaitu berdasarkan Simultaneous Equation Method, Area Under Curve Method dan Q-Absorbance Ratio Method. Hasil menunjukkan bahwa ketiga metode tersebut dapat digunakan untuk analisis metoprolol suksinat dan hidroklortiazid secara simultan dan tidak ada perbedaan yang signifikan terhadap ketiga metode tersebut.
Attiadkk., (2016) melakukan penetapan kadar campuran Etilefrin HCl dengan CTM menggunakan lima metode spektrofotometri sekaligus yaitu dengan Ratio Derivative Method, Ratio Difference Method, Mean Centering Method, Dual Wavelength Method dan Area Under Curve Method. Hasil yang diperoleh dari gabungan kelima metode tersebut tidak memberikan perbedaan hasil yang signifikan dan akurat. Aplikasi beberapa metode Rasio Absorbansi dapat dilihat pada Tabel 2.2.
Tabel 2.2 Aplikasi spektrofotometri UV secara Rasio Absorbansi pada berbagai zat
Senyawa/sediaan Metode Pelarut Referensi
Eperison dan Parasetamol
SpectrophotometryUV Q-
Absorbance ratio method Metanol Khanage dkk., (2013) Valacyclovir
hidroklorida monohidrat dan
Ritonavir
Spectrophotometry UV Q- Absorbance ratio method
HCl 0,1 M
Dinakaran dkk., (2013) Ketoprofen, Metil
paraben dan Propil paraben
SpectrophotometryUV Q- Absorption ratio and Area under
curve method
Metanol Pallavi dkk., (2013) Atorvastatin dan
Niacin
SpectrophotometryUV simultanepus equation and Q-
Absorbance ratio method
Metanol Ramesh dkk., (2012)
2.5 Metode Penambahan Standar
Menurut Day dan Underwood (1986), metode penambahan standar adalah suatu metode dimana pada jumlah sampel yang sama ditambahkan larutan standar dengan konsentrasi yang berbeda, ada tiga teknik yang dapat digunakan:
1. Metode Standar Tunggal
Metode ini menggunakan satu larutan standar yang telah diketahui konsentrasinya. Selanjutnya absorpsi larutan standar dan absorbansi larutan sampel diukur dengan spektrofotometri.
2. Metode Kurva Kalibrasi
Metode ini membuat suatu seri larutan standar dengan berbagai kosentrasi dan absorbansi kemudian dibuat kedalam grafik yang merupakan suatu garis lurus melewati titik nol. Konsentrasi larutan sampel dapat dicari setelah absorbansi larutan sampel diukur dan diintrapolasi kedalam kurva kalibrasi atau di masukkan kedalam persamaan garis lurus yang diperoleh dengan persamaan regresi linear.
3. Metode Adisi Standar
Metode ini digunakan secara luas karena mampu meminimalkan kesalahan yang disebabkan oleh perbedaan kondisi lingkungan (matriks) sampel dan standar. Dalam metode ini dua atau lebih sejumlah volume tertentu dari sampel dipindahkan kedalam labu tentukur. Satu larutan diukur diencerkan sampai volume tertentu kemudian diukur absorbansinya tanpa ditambahkan dengan zat standar, sedangkan larutan yang lain sebelum diukur absorbansinya ditambah terlebih dahulu dengan sejumlah tertentu larutan standar dan diencerkan seperti pada larutan pertama.
2.6 Validasi Metode
Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004).
Menurut Satiadarma dkk., (2004), prosedur analisis yang dimodifikasi atau prosedur analisis yang baru, sebelum dapat diusulkan untuk menggantikan prosedur analisis lama atau digunakan sebagai prosedur analisis standar, harus dibuktikan kesahihannya. Tujuan pensahihan (validasi) adalah agar prosedur analisis tersebut diketahui akurasi dan variabilitasnya (bias metodenya), gangguan yang mungkin ada teridentifikasi dan diketahui pula kespesifikan, presisi serta kepekaannya (limit deteksi).
Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi masalah analisis, karenanya suatu metode harus divalidasi, ketika:
- Metode baru dikembangkan untuk mengatasi masalah analisis tertentu - Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan - Penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah
berubah seiring dengan berjalannya waktu
- Metode baku digunakan di laboratorium yang berbeda, dikerjakan dengan analis dan alat yang berbeda
- Untuk mendemonstrasikan kesetaraan antar 2 metode, seperti antara metode baru dan metode baku.
Menurut United States Pharmacopeia (USP), ada 8 langkah dalam validasi metode analisis yaitu : Presisi, Akurasi, Batas Deteksi, Batas Kuantifikasi, Spesifisitas, Linieritas, Kekasaran (Rudggedness) dan Ketahanan (Robutness) (Gandjar dan Rohman, 2017).
Sementara itu International Conference on Harmanization (ICH) membagi karakteristik validasi metode yang sedikit berbeda dengan USP yaitu : Akurasi, Presisi, Batas Deteksi, Batas Kuantifikasi, Spesifisitas, Linieritas, Kisaran (Range), Ketahanan (Robustness) dan Kesesuaian Sistem (Gandjar dan Rohman, 2017).
2.6.1 Akurasi
Akurasi atau ketepatan merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan antara nilai terukur dengan nilai yang diterima baik nilai konvensi, nilai sebenarnya, atau nilai rujukan. Akurasi diukur sebagai banyaknya analit yang diperoleh kembali pada suatu pengukuran dengan melakukan spiking pada suatu sampel. Untuk pengujian senyawa obat, akurasi diperoleh dengan membandingkan hasil pengukuran dengan bahan rujukan standar. Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) (Gandjar dan Rohman, 2017).
Tabel 2.3 Kriteria daerahrecovery yang dapat diterima (Harmita, 2004) Analit pada matriks sampel (%) Daerah recovery yang diperoleh
100
>10
>1
>0,1 0,01 0,001 0,0001 (1ppm) 0,00001 (100ppb) 0,000001 (10 ppb) 0,0000001 (1 ppb)
98 – 102 % 98 – 102 % 97 – 103 % 95 – 105 % 90 – 107 % 90 – 107 % 80 – 110 % 80 – 110 % 60 – 115 % 40 – 120 %
2.6.2 Presisi
Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya diekspresikan sebagai simpangan baku relatif dari sejumlah sampel yang berbeda signifikan secara statistik. Sesuai dengan ICH, presisi harus dilakukan pada 3 tingkatan yang berbeda yaitu: keterulangan (repeatibility), presisi antara (intermediate precision) dan ketertiruan (reproducibility).
Dokumentasi presisi seharusnya mencakup: simpangan baku, simpangan baku relatif (RSD) atau koefisien variasi (CV) dan kisaran kepercayaan. Presisi seringkali diekspresikan dengan SD atau standar deviasi relatif (RSD) dari serangkaian data (Gandjar dan Rohman, 2017).
2.6.3 Limit of Detection (LOD) dan Limit of Quantification (LOQ)
Limit deteksi dari suatu metode analisis adalah nilai parameter uji batas, yaitu konsentrasi analit terendah yang dapat dideteksi, tetapi tidak dikuantitasi pada kondisi percobaan yang dilakukan. Limit deteksi dinyatakan dalam konsentrasi analit (persen, bagian per milyar) dalam sampel. Sedangkan LOQ dari suatu metode analisis adalah nilai parameter penentuan kuantitatif senyawa yang terdapat dalam konsentrasi rendah dalam matriks, seperti pencemar dalam baku obat, hasil degradasi senyawa aktif dalam sediaan obat dan lain-lain. Limit kuantitasi adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi ekperimen yang ditentukan.Limit kuantitasi dinyatakan dalam konsentrasi analit (persen, bagian per milyar) dalam sampel (Gandjar dan Rohman, 2017).
2.6.4 Linieritas
Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil – hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran
yang diberikan. Kelinieran suatu metode analisis adalah kemampuan untuk menunjukkan bahwa nilai hasil uji langsung atau setelah diolah secara matematika, proporsional dengan konsentrasi analit dalam sampel dalam batas rentang konsentrasi tertentu (Gandjar dan Rohman, 2017; Satiadarma dkk., 2004).
Linieritas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi (x).Linieritas dapat diukur dengan melakukan pengukuran tunggal pada konsentrasi yang berbeda- beda. Data yang diperoleh selanjutnya diproses dengan metode kuadrat terkecil, untuk selanjutnya dapat ditentukan nilai kemiringan (slope), intersep dan koefisien korelasinya (Gandjar dan Rohman, 2017).
Penentuan linieritas suatu prosedur analisis dilakukan dengan perlakuan matematika dari hasil uji yang diperoleh pada analisis sampel yang mengandung analit dalam rentang konsentrasi yang dituntut oleh prosedur. Kelinierannya dinyatakan sebagai varians di sekitar landaian garis regresi yang dihitung menurut hubungan matematika yang mapan dari hasil uji sampel yang mengandung analit dengan konsentrasi yang bervariasi (Satiadarma dkk., 2004).
BAB III
METODE PENELITIAN 3.1 Jenis Penelitian
Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental metode Spektrofotometri Ultraviolet secara Rasio Absorbansi terhadap analisis simultanSulfametoksazol dan Trimetoprim yang terkandung dalam sediaan suspensi K dan S.
3.2 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara pada bulan Agustus-November 2018.
3.3 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Spektrofotometer Ultraviolet-visibel (Shimadzu 1800) serta seperangkat Personal Computer (PC) yang dilengkapi dengan software UV-Probe 2.42, kuvet 1 cm, alat-alat gelas (Oberoi), lumpang dan alu, neraca analitik (Boeco Germany) serta alat-alat lainya yang diperlukan dalam preparasi sampel.
3.4 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Metanol:
aquades(1:1), baku Sulfametoksazol, baku Trimetoprim, Suspensi K dan S.
3.5 Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan antara satu tempat dengan tempat yang lain, karena sampel dianggap homogen. Sampel yang digunakan yaitu suspensi C dan S.
3.6 Prosedur Penelitian
3.6.1Pembuatan Larutan Induk Baku Sulfametoksazol
Ditimbang dengan seksama 0,0250 g baku Sulfametoksazol kemudian dimasukkan kedalam labu tentukur 50 ml, dilarutkan dengan pelarut metanol : aquades (1:1) dan dicukupkan sampai garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 500 g/ml (LIBI). Dari LIB I dipipet 5 ml dimasukkan kedalam labu tentukur 25 ml, diencerkan dengan pelarut metanol: aquades (1:1) sampai garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi g/ml (LIB II).
3.6.2 Pembuatan Larutan Induk Baku Trimetoprim
Ditimbang dengan seksama 0,0250 g baku Trimetoprim kemudian dimasukkan kedalam labu tentukur 50 ml, dilarutkan dengan pelarut metanol : aquades (1:1) dan dicukupkan sampai garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 500 g/ml (LIB I). Dari LIB I dipipet 5 ml dimasukkan kedalam labu tentukur 25 ml, diencerkan dengan pelarut metanol: aquades (1:1) sampai garis tanda sehingga diperoleh larutan Trimetoprim dengan konsentrasi 100 g/ml (LIB II).
3.6.3 Pembuatan Spektrum Serapan Maksimum Sulfametoksazol
Dipipet 0,61 ml larutan induk baku II (LIB II) sulfametoksazol, dimasukkan kedalam labu 10 ml, diencerkan dengan metanol:aquades (1:1) hingga garis tanda, dikocok hingga homogen sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 6,1 g/ml dan diukur serapan pada panjang gelombang 200-400 nm.
3.6.4 Pembuatan Spektrum Serapan Maksimum Trimetoprim
Dipipet 1,72 ml Larutan Induk Baku II (LIB II) Trimetoprim, dimasukkan kedalam labu 10 ml, diencerkan dengan metanol:aquades (1:1) hingga garis tanda,
dikocok hingga homogen sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 17,2 g/ml, kemudian diukur serapan pada panjang gelombang 200-400 nm.
3.6.5Pembuatan Spektrum Serapan Baku Sulfametoksazol
Dipipet larutan induk baku II (LIB II) Sulfametoksazol sebanyak 0,33 ml;
0,47 ml; 0,61 ml; 0,75 ml; dan 0,89 ml. Masing-masing dimasukkan kedalam labu tentukur 10 ml, diencerkan dengan dengan metanol:aquades (1:1) hingga garis tanda. Dikocok sampai homogen sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 3,3 g/ml; 4,7 g/ml; 6,1 g/ml; 7,5 g/ml; 8,9 g/ml berturut-turut, kemudian diukur pada panjang gelombang 200-400 nm.
3.6.6Pembuatan Spektrum Serapan Baku Trimetoprim
Dipipet larutan induk baku II (LIB II) Trimetoprim sebanyak 0,92 ml; 1,32 ml; 1,72 ml; 2,12 ml; dan 2,51 ml. Masing-masing dimasukkan kedalam labu tentukur 10 ml, diencerkan dengan dengan metanol:aquades (1:1) hingga garis tanda. Dikocok sampai homogen sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 9,2 g/ml; 13,2 g/ml; 17,2 g/ml; 21,15 g/ml; 25,1 g/ml berturut-turut, kemudian diukur pada panjang gelombang 200-400 nm.
3.6.7 Penentuan Panjang Gelombang Isoabsorpsi dan Panjang Gelombang Maksimum Terpilih
Kurva ini dibuat dengancara menumpang tindihkan kurva serapan maksimum dari larutan Sulfametoksazol dan Trimetoprim diukur pada rentang panjang gelombang 200–400 nm. Dari kurva tersebut dapat ditentukan panjang gelombang isoabsorpsi (panjang gelombang dimana terjadi perpotongan kedua kurva) dan panjang gelombang maksimum terpilih (panjang gelombang dengan absorbansi tertinggi dari kedua zat).
3.6.8Pembuatan Kurva Kalibrasi Sulfametoksazol pada Titik Isoabsorptif Dipipet larutan induk baku II (LIB II) Sulfametoksazol sebanyak 0,33 ml;
0,47 ml; 0,61 ml; 0,75 ml; dan 0,89 ml. Masing-masing dimasukkan kedalam labu tentukur 10 ml, diencerkan dengan dengan Metanol:aquades (1:1) hingga garis tanda. Dikocok sampai homogen sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 3,3 g/ml; 4,7 g/ml; 6,1 g/ml; 7,5 g/ml; 8,9 g/ml diukur pada panjang gelombang 249 nm. Kemudian nilai absorbansi yang diperoleh diplot dengan konsentrasi untuk mendapatkan persamaan regresinya
.
3.6.9 Pembuatan Kurva Kalibrasi Trimetoprim pada Titik Isoabsorptif Dipipet larutan induk baku II (LIB II) Sulfametoksazol sebanyak 0,92 ml;
1,32 ml; 1,72 ml; 2,12 ml; dan 2,51 ml. Masing-masing dimasukkan kedalam labu tentukur 10 ml, diencerkan dengan dengan metanol:aquades (1:1) hingga garis tanda. Dikocok sampai homogen sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 9,2 g/ml; 13,2 g/ml; 17,2 g/ml; 21,15 g/ml; 25,1 g/ml diukur pada panjang gelombang 249 nm.Kemudian nilai absorbansi yang diperoleh diplot dengan konsentrasi untuk mendapatkan persamaan regresinya
3.6.10 Pembuatan Spektrum Serapan Campuran Baku Sulfametoksazol dan Trimetoprim
Ditimbang masing-masing10 mg baku Sulfametoksazol dan Trimetoprim dimasukkan masing-masing kedalam labu 10 ml, diencerkan dengan metanol:
aquades (1:1) sampai garis tanda dan dihomogenkan. Kemudian dipipet 0,61 ml dari larutan Sulfametoksazol dan 1,72 ml dari larutan trimetoprim. Kedua larutan ini dimasukkan kedalam labu 10 ml, dicukupkan dengan pelarut metanol:aquades (1:1) sampai garis tanda, dikocok hingga homogen. Kemudian dari campuran larutan tersebut dipipet 1 ml, dimasukkan kedalam labu 10 ml, dicukupkan hingga
garis tanda dengan pelarut metanol: aquadest (1:1) dan dikocok sampai homogen.
Diukur serapan pada panjang gelombang 200-400 nm.
3.7 Penetapan Kadar Sulfametoksazol dan Trimetoprim dalam sediaan Suspensi
Dipipet 0,62 ml sampel sirup mengandung Sulfametoksazol dan Trimetoprim (dilakukan sebanyak 6 kali) kemudian masukkan secara kuantitatif dalam labu tentukur 50 ml. Dilarutkan dengan metanol:aquades (1:1) kemudian dihomogenkan dengan sonikator selama 15 menit. Dicukupkan dengan metanol : aquades (1:1) sampai garis tanda, dikocok hingga homogen. Larutan tersebut kemudian disaring, lebih kurang 10 ml filtrat pertama dibuang dan filtrat selanjutnya ditampung. Kemudian dari filtrat ini dipipet 5 ml dan dimasukkan kedalam labu tentukur25 ml, dicukupkan dengan pelarut sampai garis tanda.
Dipipet 0,61 ml dan dimasukkan kedalam labu tentukur 10 ml kemudian ditambahkan 1,6 ml LIB II trimetoprim (metode adisi standar). Ditambahkan ditambahkan NH4OH pH 10 sebanyak 4 tetes, kemudian diencerkan denganmetanol:aquades (1:1) sampai garis tanda sehingga diperoleh larutan yang mengandung 6,1 g/ml Sulfametoksazol dan 17,2 g/mlTrimetoprim.Diukur serapan pada panjang gelombang 200-400, kemudian dicari nilai rasio absorbansi.
3.8 Analisis data secara statistik
Uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah uji t. Distribusi data dihitung dengan menggunakan rumus:
thitung= | ̅ S /√n|
Kadar sebenarnya dengan taraf kepercayaan 99%, dihitung dengan menggunakan rumus:
µ= ̅ t(1-1 2 )dk
S
√n
Keterangan:
µ = interval kadar sebenarnya ̅ = kadar rata-rata sampel X = kadar sampel
t = harga t tabel sesuai dengan dk = n-1 dk = derajat kebebasan (n-1)
= tingkat kepercayaan SD = standar deviasi n = jumlah perlakuan 3.9 Validasi Metode 3.9.1 Uji akurasi
Uji akurasi dilakukan dengan metode penambahan baku (StandardAddition Method), yaitu dengan membuat 3 konsentrasi analit sampel denganrentang spesifik 80%, 100%, 120% dimana masing-masing dilakukan sebanyak 3 kali perlakuan. Setiap rentang mengandung 70% analit dan 30%
bakupembanding, kemudian dianalisa dengan perlakuan yang sama seperti pada penetapan kadar sampel. Berikut merupakanrumus persen perolehan kembali.
% Perolehan Kembali = x 100%
Keterangan: :
CF = Jumlah analit yang terukur
CA = Jumlah analit dalam sampel (70% berasal dari sampel)
= Jumlah baku yang ditambahkan (30% berasal dari baku) 3.9.2 Presisi
Presisi dinyatakan dengan SD atau RSD dari serangkaian data. Untuk mencari RSD menggunakan rumus:
RSD = S x 100%
Keterangan:
RSD = Relative standard deviation SD = Standard deviation
X = Data yang telah dirata-ratakan
3.9.3 Linearitas, batas deteksi (Limit of Detection, LOD) dan batas deteksi (Limit of Quantification, LOQ)
Dipipet larutan induk baku II (LIB II) Sulfametoksazol sebanyak 0,33 ml;
0,47 ml; 0,61 ml; 0,75 ml; dan 0,89 ml. Masing-masing dimasukkan kedalam labu tentukur 10 ml, diencerkan dengan dengan metanol:aquades (1:1) hingga garis tanda. Dikocok sampai homogen sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 3,3 g/ml; 4,7 g/ml; 6,1 g/ml; 7,5 g/ml; 8,9 g/ml.
Dipipet larutan induk baku II (LIB II) Trimetoprim sebanyak 0,92 ml; 1,32 ml; 1,72 ml; 2,12 ml; dan 2,52 ml. Masing-masing dimasukkan kedalam labu tentukur 10 ml, diencerkan dengan dengan metanol:aquades (1:1) hingga garis tanda. Dikocok sampai homogen sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 9,2 g/ml; 13,2 g/ml; 17,2 g/ml; 21,2 g/ml; 25,1 g/ml.
Larutan-larutan diatas dilihat serapannya pada λ analisis masing-masing zat yang telah ditentukan.Kemudian dilakukan analisis hubungan antara konsentrasi dengan serapan untuk masing-masing zat, sehingga didapat persamaan regresi linear dan juga nilai korelasinya.
y = ax + b
Berdasarkan absorbansi pada λ analisis dilakukan pula perhitungan LOD dan LOQ.
SD =
2 2
n
Yi Y
LOD =
slope SD x 3,3
LOQ =
slope SD x 10
Keterangan:
SD = Standard Deviation (Residual Standard Deviation)
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Optimasi Pelarut
Jenis pelarut yang digunakan ialah metanol:aquades (1:1). Absorbansi dari Sulfametoksazol dan Trimetoprim diukur pada λ 200-400 nm kemudian dihitung jumlah kesalahan fotometrik dari absorbansi yang terukur pada konsentrasi tertentu dengan terlebih dahulu diselisihkan dengan nilai kesalahan fotometrik terkecil yang diperoleh ketika mengukur zat tersebut pada absorbansi 0,4343, yaitu 2,7185. Perhitungan untuk mendapatkan %transmitan dan kesalahan fotometrik dapat dilihat pada Lampiran1 halaman 47.
Tabel berikut merupakan perbandingan pelarut yang digunakan pada penelitian ini dengan pelarut yang digunakan pada penelitian sebelumnya.
Tabel 4.1 Absorbansi dan %Transmitan Sulfametoksazol (SM) dan TrimetoprimI(TM)
Jenis Pelarut
Absorbansi % Transmitan
SM TM SM TM
Metanol:Aquades
(1:1) 0,433 0,432 36,897 36,982
NaOH 0,451 0,502 35,399 31,477
Tabel 4.2Kesalahan Fotometrik
Jenis Pelarut
Kesalahan Fotometrik (%)
Selisih Kesalahan Fotometrik dengan Kesalahan Terkecil (%)
Jumlah Selisih Kesalahan Fotometrik
SM TM SM TM (%)
Metanol:Aquades
(1:1) 2,7194 2,7194 0,00097 0,00097 0,0019
NaOH 2,7211 2,7487 0,0026 0,0302 0,0328
Menurut Gandjar dan Rohman (2017), absorbansi yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya antara 0,2-0,8 atau 15%-70% jika dibaca sebagai
transmitan karena kesalahan pembacaannya adalah 0,0005 (kesalahan fotometrik).
Pernyataan diatas menunjukkan bahwa pengukuran serapan yang paling optimal untuk digunakan dalam penelitian ini dipilih bukanlah berdasarkan pada absorbansi yang paling besar dari masing-masing zat dalam pelarut tersebut, namun berdasarkan jumlah kesalahan fotometrik yang terkecil. Dari tabel diatas terlihat bahwa pelarut metanol:aquades (1:1) memberikan jumlah kesalahan fotometrik sebesar 5,4388 sedangkan NaOH sebesar 5,4698. Sehingga dapat disimpulkan bahwa pelarut metanol:aquades (1:1) paling optimal digunakan karena memiliki jumlah kesalahan fotometrik paling kecil.
4.2Penentuan Spektrum Serapan Maksimum
Spektrum serapan maksimum Sulfametoksazol dan Trimetoprim dapat dilihat pada Gambar 4.1 danGambar 4.2, sedangkan spektrum tumpang tindih serapan tunggal Sulfametoksazol dan Trimetoprim dapat dilihat pada Gambar 4.4.
Gambar 4.1 Spektrum Serapan Maksimum Sulfametoksazol (6,1 µg/ml)
Gambar 4.2 Spektrum serapan Maksimum Trimetoprim (17,2µg/ml)
Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan diperoleh spektrum serapan maksimum Sulfametoksazol pada 258 nm dan Trimetoprim pada 288 nm. Dimana pengukuran dilakukan pada konsentrasi 6,1 µg/ml untuk Sulfametoksazol dan pada konsentrasi 17,2 µg/ml untuk Trimetoprim.
Gambar 4.3 Spektrum serapan campuran baku Sulfametoksazol dan Trimetoprim Spektrum campuran baku Sulfametoksazol dan Trimetoprim menghasilkan spektrum yang berbeda dengan spektrum tunggal masing-masing, hal ini disebabkan karena spektrum campuran merupakan kombinasi dari spektrum zat yang menyusunnya.
Gambar 4.4 Spektrum Tumpang Tindih Campuran Baku Obat dengan Sampel Gambar diatas menunjukkan bahwa secara kualitatif spektrum tersebut menunjukkan benar adanya kandungan Sulfametoksazol dan Trimetoprim pada sampel, terjadi sedikit kenaikan serapan pada panjang gelombang 288 nm disebabkan karena adanya pengadisian Trimetoprim pada sampel. Pengadisian dilakukan karena serapan Trimetoprim pada sampel yang terukur tidak mencapai absorbansi maksimum (tidak memenuhi hukum Lambert-Beer.
4.3 Metode Rasio Absorbansi (Q-Ratio Method)
Metode ini diawali dengan penentuan titik isoabsorptif dengan cara menumpang tindihkan kurva serapan maksimum dari 2 zat. Hasil perpotongan dari kedua kurva disebut dengan titik isoabsorptif (panjang gelombang dimana kedua obat menunjukkan absorbansi yang sama) (Dinakaran dkk.,2013).
Serapan Sampel Serapan Campuran Baku
Gambar 4.5 Spektrum tumpang tindih serapan tunggal Sulfametoksazol (SM) dan Trimetoprim (TM)
Gambar diatas menunjukkan bahwa metode multikomponen biasa tidak dapat digunakan untuk menetapkan kandungan Sulfametoksazol maupun Trimetoprim dalam campuran, walau panjang gelombang kedua zat berbeda cukup jauh namun spektrum dari kedua zat saling tumpang tindih (saling mempengaruhi zat satu dengan yang lain), sehingga absorbansi pada λ spektrum campuran Sulfametoksazol dan Trimetoprim tidak menggambarkan besar konsentrasi dari masing-masing zat tersebut dalam campurannya. Berbeda dengan metode spektrofotometri ultraviolet secara rasio absorbansiyang memungkinkan untuk menetapkan kadar suatu zat dalam campuran zat tersebut dengan zat lainnya, sehingga penetapan kadar zat tunggal dalam campurannya dapat dilakukan.
4.3.1Penentuan Titik Isoabsorptif
Dari Gambar 4.5 dapat dilihat bahwa Sulfametoksazol dan Trimetoprim menghasilkan titik isoabsorptif pada 2 titik yaitu pada panjang gelombang 249 nm dan 271,8 nm keduanya memenuhi hukum Lambert-Beer, namun pada penelitian ini digunakan titik isoabsorptif pada panjang gelombang 249 nm karena lebih
Konsentrasi 17,2 µg/mL
Konsentrasi 6,1 µg/mL
λmax TM 288 nm λmax SM 258 nm
Isoabsorptif 249 nm
