Kasus Baru Plasmodium knowlesi pada Manusia di Jambi

39

Kasus Baru Plasmodium knowlesi pada Manusia di Jambi

Ervi Salwati¹*, Sarwo Handayani¹, Rita Marleta Dewi¹, Mujiyanto²

1Puslitbang Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan Badan Litbang Kesehatan , Kementerian Kesehatan RI

2Balai Litbang P2B2 Donggala, Badan Litbang Kesehatan, Kementerian Kesehatan RI

*Email: ervisalwati@yahoo.com

Abstracts

Plasmodium knowlesi, a zoonotic malaria that initially infects monkeys, recently has been reported to infect human.

Those cases are increasing in Southeast Asia, including in Indonesia. Misdiagnosis of P.knowlesi to P.malariain large numbers in Sarawak, Malaysia in 2004 pushed a concern of the presence of monkeys in the environment. This research was conductedin Bungo District Jambi Province. This province is a malaria endemic area and intersects with forests where monkeys roam in residential areas. The aim of this study was to identify the small sub unit ribosomal RNA (ssurRNA) genesof zoonotic malaria (especially P.knowlesi) in human and monkey by using nested PCR techniques. The study was conducted in March-November 2015. Human malaria samples were collected from positive cases of malaria from hospitals / primary health care and also from the Mass Blood Survey (MBS). Human and monkey (wild and pets) blood specimens were thick blood smears and blood spots on filter paper. The results of microscopic examination both humans and monkeys then were confirmed by molecular examination (PCR). One of 34 human malaria cases was P.knowlesi by PCR, which from Rantau Pandan district. This finding has not been reported previously in Jambi Province. While in monkey, P.knowlesi was discovered on six of 38 positive zoonotic malaria samples. Confirmation of P.knowlesi by sequence analysis using BLAST pointed that all of those were P.knowlesi. The spatial distribution of malaria cases in human and monkeys tend to cluster .

Keywords: Plasmodium knowlesi, malaria zoonotic, ssurRNA gene, Jambi

Abstrak

Plasmodium knowlesi merupakan zoonotik malaria yang awalnya menginfeksi monyet, tetapi belakangan ini dilaporkan menginfeksi manusia. Kasusnya meningkat di Asia Tenggara termasuk Indonesia. Diketahuinya

‘misdiagnosis’ Plasmodium malariae yang ternyata P. knowlesi dalam jumlah banyak di Serawak, Malaysia tahun 2004 menjadikan keberadaan monyet di lingkungan menjadi perhatian. Lokasi penelitian di Kabupaten Bungo, Provinsi Jambi yang merupakan daerah endemis malaria dan bersinggungan dengan hutan dimana monyet berkeliaran di sekitar pemukiman penduduk. Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi gen small sub unit ribosomal RNA (ssurRNA) zoonotik malaria (khususnya P.knowlesi) pada manusia dan monyet dengan teknik nested Polymerase Chain Reaction (nested PCR). Penelitian dilakukan bulan Maret - November 2015. Sampel adalah kasus malaria positif yang diperoleh dari rumah sakit/ Puskesmas dan survei di masyarakat (Mass Blood Survey/ MBS).

Spesimen darah manusia dan monyet (liar dan peliharaan) berupa apusan darah tebal-tipis dan spot darah pada kertas filter. Hasil pemeriksaan mikroskopis dikonfirmasi dengan pemeriksaan molekular (PCR). Hasil PCR menunjukkan bahwa dari 34 malaria positif ditemukan satu kasus P.knowlesi yaitu dari desa Rantau Pandan dan ini belum pernah dilaporkan sebelumnya di Provinsi Jambi. Sementara pada monyet ditemukan 6 positif P.knowlesi dari 38 sampel positif zoonotik malaria. Selanjutnya, terhadap sampel P. knowlesi positif dilakukan sekuensing dan dianalisa dengan metoda Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) dan hasilnya terkonfirmasi positif P.knowlesi. Dari pohon filogenetik terlihat bahwa P.knowlesi pada manusia dan monyet mempunyai kekerabatan yang dekat dengan P.knowlesi yang ada di Sabah, Serawak atau Borneo. Distribusi spasial kasus malaria pada manusia dan monyet memperlihatkan pola distribusi yang mengelompok.

.

Kata kunci:, Plasmodium knowlesi, zoonotik malaria, gen ssurRNA, Jambi

40 Jurnal Biotek Medisiana Indonesia Vol 6.1 2017 : 39-51 Pendahuluan

Plasmodium knowlesi secara alamiah hidup pada primate non human jenis Macaca (monyet) yaitu: monyet ekor panjang (Macaca fascicularis), monyet ekor pendek (M. nemestrina), dan langur (Phylobates melalophos). Dekade belakangan ini, P.knowlesi menarik perhatian karena parasit zoonotik ini dapat menginfeksimanusia. Selain ituP. knowlesi mempunyai siklus hidup lebih cepat (24 jam) dibandingkan dengan parasit malaria lainnya (48-72 jam) dan menginfeksi semua umur eritosit sehingga cepat menyebabkan parasitemia tinggi yang mengakibatkan komplikasi bahkan kematian^1,2,3, dan risiko penyakit berat pada orang dewasa lebih tinggi daripada malaria falciparum⁴.

Tahun 2004, adalah awal diketahui endemik zoonotik malaria yang disebabkan oleh P.knowlesi. Penelitian di Serawak, Malaysia dilaporkan adanya P.knowlesi yang menginfeksi manusia dalam jumlah yang sangat banyak. Namun kejadian tersebut bukan suatu kejadian luar biasa (KLB) tetapi dihubungkan dengan ‘misdiagnosis’ parasit penginfeksi yang morfologinya seperti P.malariae⁵. Hiper-parasetemia yang ditemukan bersifat atipikal dan manifestasi klinisnya jauh lebih berat⁶. Analisis molekuler menemukan bahwa mayoritas (58% dari 208) kasus malaria di Serawak disebabkan oleh P knowlesi⁵. Negara bagian Serawak dan Sabah, Malaysia, merupakan daerah fokus penularan P. knowlesi paling tinggi di AsiaTenggara⁷ . Sejak saat itu, WHO menyatakan bahwa P.knowlesi adalah spesies parasit malaria kelima yang dapat menginfeksi manusia ⁸.

Berbagai penelitian telah melaporkan bahwa P.knowlesi tidak hanya ditemukan

di Malaysia tetapi juga menyebar kebagian lain Asia Tenggara seperti Singapura^9,10, Thailand1^11,12, Myanmar¹³, Filipina¹⁴, Vietnam¹⁵, Kamboja¹⁶, dan termasuk Indonesia¹⁷. Sejumlah negara juga melaporkan adanya kasus impor malaria P. knowlesi yang ternyata terinfeksi di Asia Tenggara. Negara-negara tersebut antara lain Swedia¹⁹, Amerika Serikat²⁰, Australia¹⁷, Belanda²¹, Jepang²², Spanyol²³, Perancis²⁴, Jerman²⁵, dan Finlandia²⁶. Seiring dengan terjadinya penurunan prevalensi malaria pada manusia (P.falciparum dan P.vivax) terjadi peningkatan yang signifikan pada diagnosis P.knowlesi secara mikroskopis^4,27.

Di Indonesia, kasus P.knowlesi pertama kali dilaporkan pada tahun 2010, yaitu warga negara Australia yang bekerja di daerah hutan Kalimantan Selatan selama 18 bulan¹⁷. Setelah kembali ke negaranya mengalami demam tinggi dengan gejala klinis malaria lainnya. Morfologi parasit mirip dengan P.malariae dan P.

falciparum tetapi hasil diagnosis cepat (RDT) untuk HRP-2 negatif. Hasil pemeriksaan dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan primer yang spesifik untuk P. knowlesi ternyata positif. Kasus kedua dilaporkan juga dari Kalimantan Selatan pada seorang penambang emas²⁸. Berikutnya, pada tahun 2015 ditemukan tiga (1,05%) sampel positif Pk dari 287 sampel yang diperiksa. Dua dari tiga kasus tersebut berasal dari Provinsi Kalimantan Selatan dan satu dari Kalimantan Tengah. Kasus malaria knowlesi dari Kalimantan Tengah yang berikutnya adalah seorang seorang pekerja di pertambangan batubara²⁹.

Sulitnya diagnosa malaria knowlesi secara mikroskopis, maka dipandang perlu adanya konfirmasi secara molekuler

41 dengan teknik PCR. Deteksi molekular

pada tingkat spesies dibedakan dengan urutan (sekuens) yang spesifik pada gen small sub unit ribosomal RNA (ssurRNA)³⁰.

Metode

Lokasi dan Waktu Penelitian:

Penelitian ini dilakukan di Pulau Sumatera yaitu Kabupaten Bungo, Provinsi Jambi, dengan pertimbangan adanya indikasi infeksi zoonotic malariayang ditandai dengan adanya hospes reservoar (monyet ekor panjang atau monyet ekor babi) dan lokasi bersinggungan dengan hutan.Penelitian dilakukan pada bulan Maret-Desember 2015.

Pengumpulan sampel

Pengumpulan sampel diperoleh melalui passive case detection (PCD) yaitu pasien yang berobat ke sarana pelayanan kesehatan (RS dan Puskesmas). Pasien yang diduga penderita malaria dengan gejala seperti demam dan menggigil dilakukan pemeriksaan darah mikroskopis secara rutin. Apabila ditemukan parasit malaria, maka dibuat spot darah kering pada kertas filter. Sampel (spot darah dan slide) selanjutnya dikumpulkan dan dikirim ke laboratorium Badan Litbang Kesehatan, Jakarta. Pengumpulan sampel juga diperoleh secara aktif (MBS) di beberapa desa, wilayah puskesmas yang melaporkan adanya kasus malaria beberapa bulan terakhir. Survei dilakukan dengan pengambilan darah jari pada semua penduduk dan dibuat sediaan apus darah tebal dan tipis. Pembuatan dan pemeriksaan darah apus dilakukan oleh tenaga laboratorium yang berpengalaman dan sudah dilatih

Pengumpulan sampel monyet (liar dan peliharaan) dilakukan dengan bantuan penduduk setempat menggunakan perangkap. Sediaan darah apus darah

tebal-tipis dan spot darah pada kertas filter Whatman no.3. Apusan darah tebal- tipis diwarnai di lapangan dan pemeriksaan mikroskopis dilakukan di Jakarta oleh tim peneliti yang telah tersertifikasi.

Pemeriksaan mikroskopis dan cek ulang mikroskopi

Pemeriksaaan mikroskopis (sampel monyet), uji silang mikroskopis (sampel manusia dari RS/Puskesmas) dan pemeriksaan molekuler (PCR) dilakukan di Laboratorium Parasitologi, Puslitbang Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan, Badan Litbangkes.

Pemeriksaan nested PCR untuk identifikasi spesies

a. Identifikasi Plasmodium spp.

Sebelum dilakukan amplifikasi, DNA yang berasal dari spot darah kering diisolasi menggunakan kit ekstraksi (QIAamp® DNA Mini Kit) sesuai dengan petunjuk brosur. Selanjutnya dilakukan amplifikasi DNA menggunakan metode nested PCR³⁰ yang terdiri dari 2 tahap, dengan target gen ssurRNA. Pada amplifikasi DNA tahap pertama menggunakan primer rPLU1 dan rPLU5 dilanjutkan dengan tahap kedua (nested PCR) menggunakan primer rPLU3 dan rPLU4.

b. Identifikasi spesies.

Sampel dengan genus positif selanjutnya diamplifikasi kembali untuk penentuan spesies parasit dengan menggunakan primer yang sesuai untuk masing-masing spesies. Template DNA yang digunakan adalah hasil amplifikasi tahap pertama dengan primer rPLU1 dan rPLU5. Pada sampel manusia identifikasi spesies parasit dilakukan terhadap spesies P. falciparum, P. vivax, P.malariae dan P.knowlesi.

42 Jurnal Biotek Medisiana Indonesia Vol 6.1 2017 : 39-51 Sedangkan pada sampel monyet

identifikasi spesies parasit dilakukan terhadap P. knowlesi, P. inui, P.

cynomolgy dan P. coatney. Komponen reagen amplifikasi dan program amplifikasi menggunakan metode Singh B et.al (30) yang telah dimodifikasi sesuai optimasi di laboratorium Badan Litbangkes. Amplifikasi PCR untuk setiap sampel dilakukan dalam 20 µl volume akhir dengan campuran reaksi yang terdiri dari GoTaq®Green Master Mix (M7122) 12,5 ul, setiap primer 0,1µM dan 2 μL DNA template. Kondisi dalam mengamplifikasi PCR adalah : 94°C selama 4 menit, 35 siklus pada 94°C untuk 30 detik, 62°C selama 1 menit dan 72°C selama 30 detik , diikuti oleh ekstensi final selama 5 menit ^pada 72°C. Produk PCR kemudian divisualisasikan melewati elektroforesis pada agarose 2% selama 40 menit. Hasil elektroforesis produk PCR nested pada gel agarose akan menunjukkan pita pada panjang 240 pasang basa (bp) untuk Plasmodium spp, 205 bp (P. falciparum), 121 bp (P. vivax), 295 bp (P. knowlesi), 470 bp ( P. inui), 135 bp (P. cynomolgy) dan 505 bp (P.

coatneyi).

Sekuensing

Hasil nested PCR yang teridentifikasi sebagai P.knowlesi baik pada manusia maupun pada monyetdipurifikasi dengan menggunakan Illustra ExoProStar 1-Step (GE Healthcare, ,cara kerja sesuai dengan brosur yang dikeluarkan perusahaan).

Selanjutnya dilakukan sekuensing menggunakan Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit dan dijalankan pada 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Hasil sekuensing di BLAST untuk mencari sekuen-sekuen yang memiliki kemiripan atau similaritas

dengan sekuen query (sekuen yang dipilih dari gene bank)

Pemetaan dan analisis spasial

Pemetaan P. knowlesi dilakukan dengan melakukan perekaman koordinat geografis kasus pada manusia dan monyet.

Kooordinat geografis untuk kasus P.knowlesi manusia diambil dari lokasi rumah penderita sedangkan untuk monyet dilakukan pada lokasi penangkapan atau kandangnya. Pemetaan dilakukan menggunakan Global Positioning Systems (GPS) receiver dengan merk Garmin Montera. Data koordinat dari GPS kemudian dimasukan ke komputer.

Selanjutnya dianalisis dengan aplikasi perangkat lunak GIS untuk melihat pola distribusi spasial kasus malaria yang ada apakah mengelompok atau menyebar.

Hasil Penelitian

Hasil rekruitmen sampel positif malaria pada manusia berjumlah 45 subjek yang diperoleh baik secara pasif (dari puskesmas dan rumah sakit) maupun secara aktif (MBS). Hasil cek silang mikroskopis pusat menunjukkan bahwa 11 dari 45 yang sebelumnya positif ternyata negatif, dan setelah dikonfirmasi dengan nested PCR juga menunjukkan hasil negatif. Selanjutnya, 34 sampel yang positif PCR teridentifikasi sebagai spesies P.vivax sebanyak 76,5%, (26/34), P.falciparum 14,7% (5/34), dan tiga sampel sisanya berupa infeksi campuran di mana salah satunya terinfeksi P.knowlesi dengan P.vivax dan dua yang lain terinfeksi campuran antara P.vivax dan P.falciparum. Hasil amplifikasi DNA dari masing-masing spesies divisualisasikan lewat elektroforesis seperti terlihat pada Gambar 1.

43 Gambar 1. Hasil amplifikasi gen ssurRNA pada P falciparum (Pf), P vivax

(Pv) dan P knowlesi (Pk) dengan nested PCR yang masing-masing menunjukkan pita pada panjang 205 bp, 121 bp dan 295 bp

Sementara itu, pengumpulan sampel monyet, secara keseluruhan berjumlah 53 ekor. Berdasarkan jenis monyet, M. fascilularis (monyet ekor panjang) mendominasi perolehan monyet secara keseluruhan (75,5%). Diantara 53 ekor tersebut, terdapat 15 ekor (28,3%) yang tidak terinfeksi dengan parasit baik

setelah dicek dengan pemeriksaan mikroskopis maupun dengan pemeriksaan nested PCR. Hasil identifikasi spesies dengan PCR memperlihatkan bahwa enam dari 38(15,8%) sampel monyet yang positif terinfeksi dengan P.knowlesi di mana tiga diantaranya terinfeksi lebih dari satu parasit (Tabel 1).

Tabel 1. Distribusi spesies zoonotik malaria positif menurut jenis monyet(n= 38).

Keterangan : Pk : P. knowlesi Pcy : P. cynomolgy

Pin : P. inui Pco : P. coatney

Jenis monyet

Spesies parasit zoonotik (jumlah)

Pk Pin Pcy Pco Pin+

Pco

Pin+

Pcy

Pcy+

Pco

Pin+Pcy +Pco

Pk+Pin +Pcy

Total

M.fascicularis 3 6 7 2 4 5 1 2 2 32

M.nemestrina 0 0 3 0 0 0 0 0 1 4

Presbytis spp 0 0 1 0 0 1 0 0 0 2

Total 3 6 11 2 4 6 1 2 3 38

44 Jurnal Biotek Medisiana Indonesia Vol 6.1 2017 : 39-51

Hasil amplifikasi PCR menunjukkan positif Plasmodium spp pada panjang pita 240 bp, P. knowlesi (295 bp), P. inui (470

bp), P. cynomolgy (135 bp) dan P.

coatney (505 bp), seperti tampak pada gambar 2 berikut.

Gambar 2. Visualisasi hasil amplifikasi DNA pada sampel monyet dengan primer Plasmodium spp, P.knowlesi, P. inui, P. cynomolgy dan P.

Coatney

Hasil sekuensing

Sekuens P.knowlesi baik pada manusia maupun pada monyet disejajarkan dengan sekuens yang sudah dipublikasi (referensi) menggunakan program BioEdit dan CLUSTAL W. Neighbor Joining (NJ).

Pohon filogenetik dibuat menggunakan

software MEGA 6 dengan metoda bootstrap. Hasil menunjukkan bahwa P knowlesi yang ditemukan pada manusia dan monyet mempunyai kekerabatan yang dekat dengan P knowlesi yang ditemukan pada manusia dan monyet di Sabah dan Serawak Malaysia.(Gambar 3)

45

KU693334 Laos Macaca

KR40 Jambi Macaca fascicularis JF714686 Malaysia Sabah Human KC662440 Malaysia Serawak Macaca DQ350258 Malaysia Borneo Human DQ350259 Malaysia Borneo Human DQ350260 Malaysia Borneo Human KR23 Jambi Macaca fascicularis MB001 Jambi Human DQ350257 Malaysia Borneo Human DQ350255 Malaysia Borneo Human DQ350262 Malaysia Borneo Human JF714675 Malaysia Sabah Human JF714672 Malaysia Sabah Human DQ350263 Malaysia Serawak Human

DQ350263 Malaysia Borneo Human

DQ350261 Malaysia Borneo Human DQ350256 Malaysia Borneo Human 99

75

65

61 53 86

56 41

0.01

Gambar 3.Pohon filogenetik berdasarkan gen ssurRNA sekuens isolat P.knowlesi dari Jambi, manusia (MB001) dan monyet (KR23 dan KR 40) yang disertakan dengan

referensi. Pohon dibangun menggunakan metoda Neighbor-Joining (bootstrap = 1000) yang tersedia di software MEGA 6.

Hasil pemetaan dan analisis spasial Pemetaan dilakukan pada rumah kasus positif malaria dan juga pada lokasi penangkapan monyet baik di rumah (hewan peliharaan) atau kandang tempat

pemasangan perangkap di Kabupaten Bungo. Hasil analisis GIS berdasarkan lokasi koordinat yang diambil di sumber infeksi pada kasus manusia dapat dilihat pada Gambar 4 di bawah ini:

Gambar 4. Peta distribusi kasus malaria positif pada manusia di Kab. Bungo (Jambi) dan dot merah adalah P.knowlesi

46 Jurnal Biotek Medisiana Indonesia Vol 6.1 2017 : 39-51 Pola sebaran kasus malaria manusia

yang terjadi di Kabupaten Bungo memiliki pola spasial mengelompok. Analisis yang dilakukan menggunakan nearest neighbor index (NNI) pada software Arc GIS 10.3 , didapatkan hasil NNI 0,29. NNI dengan nilai kurang dari 1 pola spasial cenderung

mengelompok, sedangkan jika nilai NNI lebih besar dari satu maka pola spasial cenderung menyebar. Sedangkan hasil analisis pola sebaran kasus pada zoonotik malaria didapatkan nilai NNI 0,73, berarti masih cenderung mengelompok pada suatu wilayah (Gambar 5)

Gambar 5. Peta distribusi zoonotik malaria positif pada monyet Kabupaten Bungo (Provinsi Jambi) dan dot merah adalah P. knowlesi

Pembahasan

Sampai saat ini belum banyak publikasi tentang P.knowlesi yang ditemukan di daerah-daerah di Indonesia.

Laporan P.knowlesi baru ditemukan di Kalimantan Selatan^17,18 dan di Kalimantan Tengah¹⁸. Namun dari Aceh Besar terdapat laporan kasus P.knowlesi yang ditemukan secara kebetulan. Infeksi

malaria oleh P.knowlesi ini dihubungkan dengan keterpaparan di hutan saat bekerja³¹.

Kasus yang ditemukan di Jambi pada penelitian ini didapatkan dari hasil survey (MBS) dan subjek adalah partisipan yang menderita demam. Pada pemeriksaan

47 apusan darah tebal dan tipis ternyata hasil

positif infeksi campuran antara P.vivax dan dan spesies lain yang morfologinya dicurigai kearah P.knowlesi. Keesokan harinya dilakukan pengambilan darah vena, pemeriksaan anamnesis /fisik, wawancara dan pengobatan sesuai dengan obat program yang dilakukan oleh dokter setempat. Penderita adalah seorang laki- laki (kode MB001) dan dari hasil wawancara diketahui bahwa yang bersangkutan tidak pernah bermalam atau melakukan perjalanan ke kota lain sebelumnya. Dari hasil pemeriksaan anamnesis/fisik, penderita demam tetapi tidak menunjukkan gejala kearah berat.

Kemungkinan penderita mendapat infeksi secara local (kasus indigenous).Setelah dilakukan pemeriksaan lanjut di laboratorium Puslitbang Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan (PBTDK), Lab Parasitologi, Badan Litbangkes, Jakarta, dengan teknik molekular (nested PCR), ternyata hasilnya P.knowlesi.

Selanjutnya, dari hasil sekuensing dengan menggunakan beberapa referensi hasil terkonfirmasi P.knowlesi. Dengan terkonfirmasinya P.knowlesi ini, berarti di Jambi merupakan kasus pertama P.knowlesi ditemukan karena belum ada laporan sebelumnya.Kasus P.knowlesi yang ditemukan di Jambi ini tergolong malaria sedang, tidak seperti kebanyakan P.knowlesi yang ditemukan di tempat lain karena penderita diperoleh dari rumah sakit tempat pasien dirawat¹⁸. Kondisi seperti ini justru perlu lebih diwaspadai karena kemungkinan kasus-kasus positif P.knowlesi masih ada, tetapi secara kebetulan tidak ditemukan pada penelitian ini.

Infeksi manusia dengan P.knowlesi bervariasi karena lokasi geografis (prevalensi tertinggi pada Malaysia Borneo) tetapi kasus individu telah teridentifikasi meningkat di Asia

Tenggara³². Pada penelitian ini, prevalensi P.knowlesipositif adalah 2,9% (1/34 kasus malaria positif), lebih tinggi dibandingkan dengan yang ditemukan di Kalimantan¹⁸ dan Thailand yang hanya 0,5%³³. Tetapi masih jauh lebih rendah dibandingkan dengan yang dilaporkan di daerah Kapit, Malaysia Borneo yang mencapai 58 %⁵. Penelitian lain juga dari Malaysia Borneo tetapi dari daerah yang berbeda (Sabah), menemukan prevalensi P.knowlesi hampir sama 58,9% (63/107 Plasmodium sp positif)³⁴.

Secara mikroskopis, morfologi spesies P.knowlei pada stadium tertentu sulit dibedakan dengan P.malariae atau P.vivax. Oleh karena itu perlu dipastikan secara molecular, meskipun dengan cara ini bisa juga didapatkan hasil positif palsu seperti yang dilaporkan oleh Sulistyaningsih et.al²⁸. Dari empat sampel positif secara PCR dengan ukuran pita yang diharapkan, analisa sekuensing menunjukkan hanya satu yang memperlihatkan kecocokan dengan sekuens P.knowlesi dan tiga sampel lainnya sesuai dengan P.vivax. Begitu juga yang terjadi dengan sampel dari Vietnam¹⁵ yang menemukan dua positif palsu dari lima hasil PCR positif. Pengalaman yang sama tersebut kemungkinan karena primer yang digunakan kurang spesifik (pmk 8 and pmkr 9). Terkait dengan itu, Imwong et.al³⁵ melaporkan bahwa primer (pmk 8 and pmkr 9) P.knowlesi terjadi kros reaksi dengan genom DNA P.vivax.

Pada penelitian ini, dari 38 monyet positif zoonotik malaria, ternyata didapatkan enam (15,8%) terinfeksi P.knowlesi baik secara tunggal (monoinfeksi) ataupun campuran (masing-masing tiga sampel). Lima (5) diantara 6(83,3%) monyet yang terinfeksi P.knowlesi, adalah monyet ekor panjang (M.fascicularuis). Hal ini sesuai dengan yang ditemukan di Thailand³³ bahwa

48 Jurnal Biotek Medisiana Indonesia Vol 6.1 2017 : 39-51 monyet ekor panjang merupakan reservoir

P.knowlesi yang paling utama. Pada penelitian ini, ternyata pada monyet ekor panjang parasit zoonotik yang menginfeksi juga paling banyak yaitu sebanyak 84,2 % (32/38). Perlu ditingkatkan kewaspadaan terhadap lingkungan di mana monyet masih berkeliaran, karena beberapa parasit malaria yang secara alami menginfeksi monyet (di luar P.knowlesi) secara eksperimen berpotensi untuk menginfeksi manusiabahkan baru-baru ini sudah ada laporan bahwa P.cynomolgi yang juga dapat menginfeksi manusia³⁶. Transmisi P.knowlesi telah dilaporkan terbatas pada vector kelompok Anopheles lateens di mana monyet dan manusia yang hidup disekitar hutan mempunyai daya tarik yang sama oleh nyamuk tersebut³⁷.

Jongwutiwes et.al³³ melaporkan bahwa analisa sekuens dari gen merozoite surface protein 1 (MSP1) P.knowlesi dari 10 sampel darah manusia dan lima sampel darah monyet memperlihatkan keragaman genetik diantara isolat. Satu sampel darah manusiamempunyai sekuens identik dengan P.knowlesi dari monyet ekor babi (M.nemesterina) yang hidup pada lokasi yang sama. Hal ini, menunjukkan kemungkinan adanya transmsi silang antara P.knowlesi dari monyet yang terinfeksi secara alami ke manusia. Dari beberapa laporan terkonfirmasi bahwa transmisi P.knowlesi terbatas secara luas pada hutan di Asia Tenggara karena habitat disini lebih disukai Anopheline tertentu yang merupakan vector P.knowlesi ^37,38. Orang-orang yang bergerak di bidang pertanian, kehutanan, perburuan atau kegiatan rekreasi di lingkungan hutan lebih beresiko terinfeksi P.knowlesi. Parasitologis pada abad 20 an ini menemukan bahwa inang simian utama dari P.knowlesi adalah M. fascicularis (longtailed macaques) and Macaca nemestrina (pig-tailedmacaques) yang

bersifat local (indigenous) di Asia Tenggara³⁹.

Pada penelitian ini juga dilakukan pemetaan dan analisis spatial. Secara epidemiologi spasial, kasus malaria yang terjadi di wilayah Kabupaten Bungo harus diwaspadai. Pengelompokan kasus pada manusia dan kera/monyet masih dalam cluster wilayah yang sama. Kedekatan lokasi antara kasus malaria dan manusia dalam lingkup satu wilayah. Lokasi penelitian yang dekat dengan kawasan berupa penggunaan hutan harus diwaspadai karena berpotensi sebagai habitat monyet yang lebih banyak. Peta prediksi distribusi P. knowlesi pada pada zoonotik di Asia Tenggara menggambar- kan bahwa lokasi berisiko salah satunya berada di kawasan Pulau Sumatera dan hal ini menjadi kewaspadaan untuk menuju Indonesia eliminasi malaria⁴⁰. Wilayah- wilayah tersebut harus senantiasa diwaspadai dan dilakukan upaya pencegahan terkait potensi penularan yang terjadi⁴¹. Penularan dapat dilakukan oleh nyamuk spesies tertentu, sehingga perlu diketahui jenis nyamuk tular P. knowlesi di Kabupaten Bungo, apalagi di kawasan ini merupakan wilayah dengan penggunaan lahan hutan dan non hutan yang berdekatan yang memungkinkan spesies nyamuk yang lebih beragam⁴² . Kesimpulan

Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa selain satu kasus baru P.knowlesi pada manusia, juga ditemukan enam kasus P.knowlesi pada monyet di Jambi.

KasusP.knowlesi pertama pada manusia ini, didapat secara lokal (kasus indigenous) dan ini merupakan kasus pertama yang dilaporkan dari provinsi tersebut. Meskipun dilaporkan kasus positif malaria pada manusia secara umum menurun, tetapi dengan ditemukannya

49 kasus P.knowlesi ini maka perlu

kewaspadaan terutama terhadap monyet yang berkeliaran disekitar pemukiman.

Perlu dipikirkan upaya pengendalian malaria mengingat saat ini sumber penularan malaria berasal dari dua inang yaitu manusia dan monyet, dan Jambi ditargetkan mencapai eliminasi malaria pada tahun 2020.

Dari hasil pohon filogenetik terlihat bahwa P.knowlesi pada manusia dan monyet mempunyai kekerabatan yang dekat dengan P.knowlesi yang ada di Sabah, Serawak atau Borneo. Pemanfaatan alat analisis modern seperti GIS penting dalam memperkirakan daerah ‘hotspot’

sebagai target strategi pengawasan dan pengendalian malaria, khususnya pada daerah di mana ada angka kejadian malaria tinggi. Pemetaaan dan analisis spasial untuk kasus malaria manusia dan monyet memperlihatkan pola distribusi yang mengelompok (membentuk cluster).

Ucapan Terima Kasih

Ucapan terima kasih kami tujukan pada DIPA Badan Litbangkes yang telah mendanai penelitian ini; Pretty Multihartina, PhD, Kepala Puslitbang Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan, Badan Litbangkes Kemenkes RI yang mendukung dan mengijinkan penelitian ini dilaksanakan; Kepala dan staf Dinas Kesehatan Provinsi dan Kabupaten Bungo (Jambi);Tim peneliti Daerah dari RSUD Hanafi, Puskesmas Rantau Pandan, Puskesmas Muarobuat, Puskesmas Rantau Ikil dan BKSDA Jambi yang telah banyak membantu kelancaran penelitian ini. Terima kasih juga kami ucapkan pada seluruh tim penelitian yang terlibat dalam penelitan ini untuk kerjasama dan bantuannya, begitu juga untuk Dr.dr. Reni Herman M.Biomed yang telah membantu dalam menganalisis hasil sekuensing. Tak

lupa kami ucapkan terima kasih kepada Prof.dr.Emiliana Tjitra PhD, atas bantuan dan masukannya.

Daftar Rujukan

1. Cox-singh J, Hiu J, Lucas SB, Divis PC, Zulkarnaen M, Chandran P, et al. Severe malaria - a case of fatal Plasmodium knowlesi infection with post-mortem findings : a case report. 2010;1–7.

2. William T, Menon J, Rajahram G, Chan L, Ma G, Donaldson S, et al. Malaria in a Tertiary Care Hospital ,. 2011;17(7).

3. Rajahram GS, Barber BE, William T, Menon J, Anstey NM, Yeo TW. Deaths due to Plasmodium knowlesi malaria in Sabah , Malaysia : association with reporting as Plasmodium malariae and delayed parenteral artesunate. Malar J [Internet]. 2012;11(1):1. Available from:

Malaria Journal

4. Barber BE, William T, Grigg MJ, Menon J, Auburn S, Marfurt J, et al. A prospective comparative study of Knowlesi, falciparum, and vivax malaria in sabah, Malaysia: High proportion with severe disease from plasmodium knowlesi and plasmodium vivax but No mortality with early Referral and artesunate therapy. Clin Infect Dis. 2013;56(3):383–97.

5. Singh B, Lee KS, Matusop A R, A, Shamsul SSG, Cox-Singh J et al. A large focus of naturally acquired Plasmodium knowlesi infections in human beings.

Lancet. 2004;63(9414):1017–24.

6. Lee WC, Chin PW, Lau YL, Chin LC, Fong MY, Yap CJ, et al.

Hyperparasitaemic human Plasmodium knowlesi infection with atypical morphology in peninsular Malaysia. Malar J. 2013;12:88.

7. Singh B. Human Infections and Detection of Plasmodium knowlesi. 2013;26(2):165–

84.

8. White NJ. Plasmodium knowlesi : The Fifth Human Malaria Parasite.

2008;46:172–3.

9. Ng OT, Eng EO, Cheng CL, Piao JL, Lee CN, Pei SW, et al. Naturally acquired human Plasmodium knowlesi infection, Singapore. Emerg Infect Dis.

2008;14(5):814–6.

10. Jeslyn WPS, Huat TC, Vernon L, Irene LMZ, Sung LK, Jarrod LP, et al. Molecular

50 Jurnal Biotek Medisiana Indonesia Vol 6.1 2017 : 39-51 Epidemiological Investigation of

Plasmodium knowlesi in Humans and Macaques in Singapore. Vector-Borne Zoonotic Dis [Internet]. 2011;11(2):131–5.

Available from:

http://www.liebertonline.com/doi/abs/10.1 089/vbz.2010.0024

11. Jongwutiwes S, Putaporntip C, Iwasaki T, Sata T, Kanbara H. Naturally acquired Plasmodium knowlesi malaria in human, Thailand. Emerg Infect Dis.

2004;10(12):2211–3.

12. Sermwittayawong N, Singh B, Nishibuchi M, Sawangjaroen N, Vuddhakul V. Human Plasmodium knowlesi infection in Ranong province, southwestern border of Thailand.

Malar J. 2012;11(Figure 1):1–6.

13. Jiang Jiang N, Chang Q, Sun X, Lu H, Yin J et al. Co-infections with Plasmodium knowlesi and other malaria parasites, Myanmar. Emerg Infect Dis.

2010;16(9):1476.

14. Luchavez J, Espino F, Curameng P, Espina R, Bell D, Chiodini P, et al. Human infections with Plasmodium knowlesi, the Philippines. Emerg Infect Dis.

2008;14(5):811–3.

15. Eede P Van Den, Van HN, Van Overmeir C, Vythilingam I, Duc TN, Hung LX, et al.

Human Plasmodium knowlesi infections in young children in central Vietnam. Malar J.

2009;8(1):1–5.

16. Khim N, Siv S, Kim S, Mueller T, Fleischmann E, Singh B, et al. Plasmodium Knowlesi infection in humans, Cambodia, 2007-2010. Emerg Infect Dis.

2011;17(10):1900–2.

17. Figtree M, Lee R, Bain L, Kennedy T, Mackertich S, Urban M, et al. Plasmodium knowlesi in human, Indonesia Borneo.

EmergInfectDis. 2010;16(4):672–4.

18. Ompusunggu S, Dewi RM, Yuliawaty R, Sihite BA ER dkk. Penemuan Baru Plasmodium knowlesi pada manusia di Kalimantan Tengah. Bul Penelit Kesehat.

2015;43(2):63–76.

19. Bronner U, Divis PCS, Färnert A, Singh B.

Swedish traveller with Plasmodium knowlesi malaria after visiting Malaysian Borneo. Malar J. 2009;8(1):1–5.

20. Ennis JG, Teal AE, Habura A, Madison- Antenucci S, Keithly JS, Arguin PM et al.

Simian Malaria in a U.S traveller-New York. MMWR. 2009;58(9):229–32.

21. Link L, Bart A, Verhaar N, Van Gool T, Pronk M, Scharnhorst V. Molecular

detection of Plasmodium knowlesi in a Dutch traveler by real-time PCR. J Clin Microbiol. 2012;50(7):2523–4.

22. Tanizaki R, Ujiie M, Kato Y, Iwagami M, Hashimoto A, Kutsuna S, et al. First case of Plasmodium knowlesi infection in a Japanese traveller returning from Malaysia.

Malar J. 2013;12(1):128–31.

23. Ta Tang T-H, Salas A, Ali-Tammam M, Martinez M del C, Lanza M, Arroyo E, et al. First case of detection of Plasmodium knowlesi in Spain by Real Time PCR in a traveller from Southeast Asia. Malar J.

2010;

24. Berry A, Iriart X, Wilhelm N, Valentin A, Cassaing S, Witkowski B, et al. Case report: Imported Plasmodium knowlesi Malaria in a French tourist returning from Thailand. Am J Trop Med Hyg.

2011;84(4):535–8.

25. Orth H, Jensen BO, Holtfreter MC, Kocheril SJ, Mallach S, MacKenzie C, et al. Plasmodium knowlesi infection imported to Germany, January 2013.

Eurosurveillance. 2013;18(40):4–6.

26. Kantele A, Marti H, Felger I, Müller D, Jokiranta TS. Monkey malaria in a

European traveler returning from Malaysia.

Emerg Infect Dis. 2008;14(9):1434–6.

27. Yusof R, Lau YL, Mahmud R, Fong MY, Jelip J, Ngian HU, et al. High proportion of knowlesi malaria in recent malaria cases in Malaysia. Malar J. 2014;13(1).

28. Sulistyaningsih E, Fitri LE, Löscher T B-.

Diagnostic Difficulties with Plasmodium knowlesi Infection in Humans.

2010;16(6):1033–4.

29. Setiadi W, Sudoyo H, Trimarsanto H, Sihite BA, Saragih RJ, Juliawaty R, et al. A zoonotic human infection with simian malaria, Plasmodium knowlesi, in Central Kalimantan, Indonesia. Malar J.

2016;15(1):1–6.

30. Singh B, Bobogare A, Cox-Singh J, Snounou G, Abdullah MS, Rahman HA. A genus-and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies.

Am J Trop Med Hyg [Internet].

1999;60(4):687. Available from:

papers://969b285e-f901-44cf-ba20- 6b088bb3b76c/Paper/p417

31. Herdiana H, Cotter C, Coutrier FN, Zarlinda I, Zelman BW, Tirta YK, et al.

Malaria risk factor assessment using active and passive surveillance data from Aceh

51 Besar, Indonesia, a low endemic, malaria

elimination setting with Plasmodium knowlesi, Plasmodium vivax, and Plasmodium falciparum. Malar J.

2016;15(1):1–15.

32. Cox-singh J, Davis TME. Plasmodium knowlesi malaria in humans is widely distributed and potentially life-threatening.

2008;46(2):165–71.

33. Jongwutiwes S, Buppan P, Kosuvin R, Seethamchai S, Pattanawong U, Sirichaisinthop J, et al. Plasmodium knowlesi malaria in humans and macaques, Thailand. Emerg Infect Dis.

2011;17(10):1799–806.

34. Lau TY, Joveen-Neoh WF and CK. High Incidence of Plasmodium knowlesi Infection in the Interior Division of Sabah, Malaysian Borneo. Int J Biosci Biochem Bioinforma. 2011;1(2):163–7.

35. Imwong M, Tanomsing N,

Pukrittayakamee S, Day NPJ, White NJ, Snounou G. Spurious amplification of a Plasmodium vivax small-subunit RNA gene by use of primers currently used to detect P. knowlesi. J Clin Microbiol.

2009;47(12):4173–5.

36. Ta TH, Hisam S, Lanza M, Jiram AI, Ismail N, Rubio JM. First case of a naturally acquired human infection with Plasmodium cynomolgi. Malar J. 2014;

37. Tan CH, Vythilingam I, Matusop A, Chan ST, Singh B. Bionomics of Anopheles latens in Kapit, Sarawak, Malaysian Borneo in relation to the transmission of zoonotic simian malaria parasite Plasmodium knowlesi. Malar J. 2008;7:1–

8.

38. Jiram AI, Vythilingam I, Noorazian YM, Yusof YM, Azahari AH, Fong MY.

Entomologic investigation of Plasmodium knowlesi vectors in Kuala Lipis, Pahang, Malaysia. Malar J [Internet]. 2012;11(1):1.

Available from: ???

39. Millar SB, Cox-Singh J. Human infections with Plasmodium knowlesi-zoonotic malaria. Clin Microbiol Infect [Internet].

2015;21(7):640–8. Available from:

http://dx.doi.org/10.1016/j.cmi.2015.03.01 7

40. Shearer FM, Huang Z, Weiss DJ, Wiebe A, Gibson HS, Battle KE, et al. Estimating Geographical Variation in the Risk of Zoonotic Plasmodium knowlesi Infection in Countries Eliminating Malaria. PLoS Negl Trop Dis. 2016;10(8):1–17.

41. Moyes CL, Henry AJ, Golding N, Huang Z, Singh B, Baird JK, et al. Defining the Geographical Range of the Plasmodium knowlesi Reservoir. PLoS Neglected Tropical Diseases. 2014. p. 1–13.

42. Moyes CL, Shearer FM, Huang Z, Wiebe A, Gibson HS, Nijman V, et al. Predicting the geographical distributions of the macaque hosts and mosquito vectors of Plasmodium knowlesi malaria in forested and non-forested areas. Parasites and Vectors. 2016;9(1):1–12.