commit to user
19 BAB IIIMETODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari 2012 sampai dengan Desember 2012. Pengambilan sampel dan pengamatan karakter morfologi dilakukan di wilayah eks-karesidenan Surakarta yang meliputi wilayah Kabupaten Boyolali, Klaten, Karanganyar, Wonogiri, Sragen, Sukoharjo dan Kotamadya Surakarta. Penelitian karakter anatomi dan pola pita isozim dilakukan di Laboratorium Jurusan Biologi Fakultas MIPA Universitas Sebelas Maret Surakarta.
B. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam survei lapangan dan pengamatan morfologi adalah alat tulis, kertas label, benang, polybag, mistar, GPS (Global Positioning System), kamera digital, pH meter, luxmeter, higrometer dan termometer. Alat yang digunakan dalam pembuatan preparat anatomi adalah mikrotom, gelas benda, gelas penutup, botol flakon, kotak preparat, alumunium foil, kertas label, tissue, pinset, silet/skalpel, tusuk gigi, pipet, penggaris, oven, mikrometer, mikroskop digital, hot plate dan kamera digital. Alat yang digunakan untuk pembuatan isozim adalah satu set alat elektroforesis Thermo Scientific Owl P8DS tipe vertikal, lemari es, sumber tenaga DC Thermo Scientific, kaca pencetak, sisir atau comb, spacer, eppendorf, pH meter, erlenmeyer, gelas beker, mortar, mikropipet ukuran 2-20 µl, 20-200 µl dan 100-1000 µl, aluminium foil, plastik,
commit to user
gunting, penggaris, plastik pembungkus, pipet tip, vortex mixer, centrifuge, mika, cawan plastik, spatula dan kamera digital.
Bahan yang digunakan dalam pengamatan variasi karakter morfologi adalah tanaman talas Colocasia esculenta (L.) Schott. Bahan yang digunakan dalam pembuatan preparat anatomi adalah daun talas segar, larutan FAA (Formalin Aceto Alcohol), alkohol berseri (70 %, 80 %, 95 % dan 100 %), parafin, xilol, akuades, gliserin dan Canada Balsam. Bahan yang digunakan untuk pembuatan isozim adalah kuncup daun talas, aseton, O-dianisidin, fast blue BB salt, -naphthyl acetate, buffer phosphate (dinatrium hidrogen fosfat (Na2HPO4), buffer acetate (asam asetat glasial dan natrium asetat), hidrogen peroksida, gliserol, bromphenol blue, sistein, asam askorbat, sukrosa, asam borak, dinatrium tetraborate (borak), asam klorida (HCl), Tris-base, Sodium Dodecyl Sulphate (SDS), N-N-N- -Tetra-methyl-ethylenediamine (TEMED), Ammonium Persulphate (APS), akrilamid, dan bisakrilamid.
C. Cara Kerja 1. Pengambilan Sampel
Sampel berupa tanaman talas segar diambil dari wilayah eks-karesidenan Surakarta yang meliputi Kotamadya Surakarta, Kabupaten Wonogiri, Klaten, Boyolali, Sukoharjo, Sragen, dan Karanganyar sebanyak 20 sampel. Pada pengambilan sampel digunakan metode purposive random sampling, yaitu sampel tanaman talas diambil secara acak tanpa menentukan habitat yang sama dan dengan pertimbangan distribusi populasi tanaman talas terbanyak dan tingkat keragaman ketinggian tiap kabupaten. Kabupaten dengan tingkat
commit to user
keragaman ketinggian lebih banyak, maka sampel yang diambil juga lebih banyak.
2. Pengamatan Karakter Morfologi
Tanaman talas diamati dan dicatat karakter morfologinya meliputi warna akar, panjang akar, diameter akar, tinggi tanaman, panjang tangkai daun (petiole), diameter tangkai daun, warna tangkai daun, warna permukaan atas daun, warna permukaan bawah daun, bentuk daun, panjang dan lebar daun, ujung dan pangkal daun, pertulangan daun, tepi daun, keadaan permukaan atas dan bawah daun, warna pelepah daun, diameter pelepah daun dan panjang pelepah daun
3. Pengamatan Karakter Anatomi
Parameter struktur anatomi talas meliputi permukaan bawah/abaksial daun (indeks stomata, densitas stomata, panjang stomata, lebar stomata, panjang epidermis dan lebar epidermis) dan penampang lintang daun (tebal mesofil, panjang epidermis, tebal epidermis, panjang palisade, rasio palisade).
a. Pembuatan Preparat
Pengamatan terhadap struktur anatomi daun talas dilakukan dengan pembuatan preparat awetan. Pembuatan preparat daun talas dilakukan dengan menggunakan metode paraffin (embedding) menurut Sass (1961).
Kemudian preparat diamati di bawah mikroskop.
commit to user
1) PemotonganDaun talas dipotong secara melintang, mengenai vena daun sepanjang 1cm (bagian kiri vena daun ± 0,5 cm dan bagian kanan vena daun ± 0,5 cm).
2) Fiksasi
Potongan daun talas difiksasi selama 24 jam dengan menggunakan larutan FAA (Formalin Aceto Alcohol) yang terdiri dari:
90 bagian
Asam asetat glas 5 bagian
5 bagian 3) Pencucian dan Dehidrasi
Larutan FAA dibuang dan berturut-turut diganti dengan : selama 0,5 jam selama 0,5 jam selama 0,5 jam selama 0,5 jam selama 0,5 jam 4) Dealkoholisasi
Alkohol dibuang dan berturut-turut diganti dengan:
Campuran alkohol/xi . selama 0,5 jam Campuran alkohol/xi selama 0,5 jam Campuran alkohol/xi selama 0,5 jam
Xi selama 0,5 jam
commit to user
Xi selama 0,5 jam
Kemudian sampel dimasukkan ke dalam campuran xilol dan parafin (dengan perbandingan 1:9) dengan suhu 57oC selama 24 jam.
5) Infiltrasi
Campuran xilol/parafin dibuang dan selanjutnya diganti dengan parafin murni. Suhu tetap 57oC selama 24 jam.
6) Penyelubungan
Parafin murni dibuang dan diganti dengan parafin murni yang baru.
Setelah ± 1 jam dibuat blok parafin yang berisi sampel daun talas.
Kemudian blok parafin dilekatkan pada holder dan dibiarkan memadat selama 1 jam.
7) Pengirisan
Dibuat irisan dari blok-blok parafin dengan menggunakan mikrotom dengan tingkat ketebalan tertentu.
8) Perekatan
Irisan direkatkan pada gelas benda dengan campuran gliserin/albumin yang dibubuhi air. Kemudian gelas benda ditaruh dalam thermostat/hotplate dengan suhu 45oC, sampai pita parafin meregang.
9) Pewarnaan
Pewarnaan dengan safranin 1% dalam alkohol 70% dan fast green 1% dalam alkohol 95%. Berturut-turut gelas benda dimasukkan ke dalam larutan: xilol I, xilol II, campuran alkohol/xilol 1:3, campuran alkohol/xilol 1:1, alkohol/xilol 3:1, alkohol absolut I, alkohol absolut II,
commit to user
alkohol 95%, alkohol 80%, alkohol 70% masing-masing dicelupkan selama 3 menit. Kemudian dicelupkan dalam safranin 1% dalam alkohol 70% selama 1 jam. Setelah itu dilanjutkan dalam alkohol 70%, alkohol 80% dan alkohol 95% dicelupkan masing-masing selama 1 menit.
Kemudian dipindah dalam larutan fast geen 1% dalam alkohol 95%
selama 30 detik. Selanjutnya dilanjutkan pada alkohol absolut I, alkohol absolut II, alkohol/xilol 3:1, alkohol/xilol 1:1, alkohol 1:3, xilol I, xilol II masing-masing dicelupkan selama 1 menit.
10) Penutupan
Irisan pada gelas benda ditutup dengan gelas penutup dan diberi Canada Balsam terlebih dahulu. Preparat dikeringkan di atas hot plate dengan suhu 45oC hingga Canada Balsam cukup kering.
11) Pemberian Nama
Di sebelah kiri gelas penutup dilekatkan etiket dengan diberi keterangan : nama dan organ penampang.
12) Pengamatan
Preparat yang sudah jadi, kemudian diamati di bawah mikroskop digital. Kemudian gambar tersebut diberi skala ukur sesuai perbesaran yang digunakan, difoto dan disimpan.
b. Perhitungan dan Pengukuran
Pengukuran tebal dan panjang epidermis, panjang palisade serta tebal mesofil dilakukan berdasarkan skala ukur yang telah dibuat.
Penghitungan rasio palisade dilakukan dengan cara menentukan 4 sel
commit to user
epidermis yang berdekatan dan diamati jumlah sel-sel palisade yang ada di bawahnya pada tiap bidang pandang mikroskop (Prawoto, 1991).
Pengukuran dan penghitungan pada tiap parameter diulang 3 kali pada preparat yang berbeda untuk tiap sampel. Hasil dari 3 kali ulangan tersebut kemudian dirata-rata dan hasil rata-rata tersebut digunakan untuk menentukan keragaman dan hubungan kekerabatan talas.
c. Tipe, Indeks Stomata, Panjang dan Tebal Epidermis
Pengamatan terhadap struktur anatomi stomata dilakukan dengan pembuatan preparat segar dengan menggunakan permukaan daun sisi abaksial. Daun talas yang digunakan adalah daun talas yang paling muncul terakhir serta mekar sempurna. Untuk melihat stomata, ambil daun kemudian potong memanjang dengan lebar ± 1 cm tanpa melewati anak tulang daun, lalu bagian tersebut disayat tipis dengan silet. Hasil sayatan direndam dalam kloralhidrat 30% hingga warna daun berubah menjadi bening. Lalu sayatan diletakkan pada gelas benda dan ditetesi dengan akuades secukupnya ± 2 tetes dan diberi label nama sampel. Sayatan ditutup dengan gelas penutup dan diusahakan agar tidak ada gelembung udara di dalamnya. Preparat yang sudah jadi, kemudian diamati di bawah mikroskop digital. Tiga daerah berbeda pada permukaan daun diamati dan dihitung jumlah epidermis (E) dan jumlah stomata (S). Dalam penelitian ini tiap daerah dilakukan 3 kali ulangan. Indeks stomata dihitung dengan menggunakan rumus :
commit to user
Indeks stomata = Jumlah stomata (S)Jumlah stomata (S) + sel epidermis (E)
(Miller, 1938 dalam Prawoto, 1991).
Setelah dilakukan pengamatan dari hasil 3 daerah yang berbeda tersebut kemudian masing-masing dihitung menggunakan rumus indeks stomata kemudian dirata-rata. Sel-sel epidermis yang terbesar diukur lebar dan panjangnya. Untuk ukuran epidermis tersebut dlakukan 3 kali ulangan tiap sampel tanaman kemudian dirata-rata dan dari hasi rata-rata tersebut kemudian dapat digunakan untuk menentukan keragaman dan hubungan kekerabatan talas.
4. Analisis Pola Pita Isozim a. Pembuatan buffer
Pembuatan buffer yang digunakan dalam elektroforesis ini dibuat berdasarkan Suranto (2000, 2002) dan Ausubel dkk., (1987). Adapun cara pembuatan buffer adalah sebagai berikut:
1) Tank Buffer (buffer boraks), pH 8,4 dibuat dengan melarutkan asam boraks 7,2 gram dan disodium tetraboraks 15,75 gram dalam akuades hingga mencapai volume 1 l.
2) Buffer ekstraksi, dibuat dengan melarutkan 0,018 gram sistein, 0,021 gram asam askorbat dan 5 gram sukrosa dalam 20 ml tank buffer pH 8,4.
b. Pembuatan larutan stok
Untuk menyiapkan gel akrilamid, terlebih dahulu dibuat larutan stok yaitu:
x 100
commit to user
1) 9 M Tris HCl pH 8,8) : 27,2 gram Tris-base dilarutkan dalam 120 ml akuades, diatur sampai pH 8,8 dengan ditambahkan HCl dan ditambahkan akuades hingga volumenya 150 ml.
(30% akrilamid/0,8% bisakrilamid) : 11,68 gram akrilamid dan 0,32 gram bisakrilamid dilarutkan dalam 40 ml akuades.
3) SDS 10% : 0,1 gram SDS dilarutkan dalam 1 ml akuades.
4) APS (ammonium persulphate) 10% : 0,1 gram APS dilarutkan dalam 1 ml akuades
c. Penyiapan gel
Penyiapan gel dimulai dengan merangkai cetakan gel, yaitu cetakan kaca yang terdiri dari offset glass dan notched glass yang dilengkapi spacer set (pemisah) dan spacer palcer. Spacer set yang diletakkan diantara offset glass dan notched glass kemudian ditempatkan pada caster dan direkatkan dengan menggunakan blocking plate.
Gel yang digunakan dalam elektroforesis adalah continuous gel, yaitu berupa gel pemisah (separating gel) 10%. Untuk membuat 10 ml separating gel, bahan yang dicampur berupa 2,5 ml l (1,49 M Tris HCl pH 8,8); 3,3 ml l (30% akrilamid/0,8% bisakrilamid); 50 µl SDS 10%, 4,2 ml aquades; 110 µl APS 10%; 10 µl TEMED. Resep tersebut dapat digunakan untuk membuat satu separating gel.
Gel pemisah dituang pada cetakan lalu comb (sisir) dipasang. Setelah terbentuk gel yaitu kurang lebih 15 menit, sisir dilepas dari cetakan. Gel yang terbentuk dipasang ke upper buffer chamber lalu diisi dengan running
commit to user
buffer. Upper buffer chamber dimasukkan ke dalam lower buffer chamber lalu diisi dengan running buffer sampai batas yang ada pada lower buffer chamber.
d. Ekstraksi dan penyiapan sampel
Sampel yang digunakan adalah kuncup daun talas. Masing-masing kuncup daun muda talas ditimbang sebanyak 2 gram kemudian ditumbuk hingga halus dengan menggunakan mortar lalu ditambahkan dengan buffer ekstraksi sebanyak 600 µl untuk pewarnaan peroksidase dan pewarnaan esterase kemudian dimasukkan ke dalam tabung eppendorf dan disentrifuse dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Larutan supernatan digunakan untuk proses elektroforesis.
e. Elektroforesis
Elektroforesis dalam penelitian ini mengacu pada metode yang dilakukan oleh Suranto (2000, 2002). Dalam penelitian ini alat yang digunakan untuk elektroforesis adalah satu set alat elektroforesis Thermo Scientific OWL P8DS tipe vertikal made in USA.
Supernatan diambil dengan menggunakan mikropipet sebanyak 20 untuk pewarnaan peroksidase dengan dan pewarnaan esterase, sampel tersebut ditempatkan pada gel yang telah tercetak. Kemudian sampel dielektroforesis dengan tegangan listrik konstan 110 volt selama kurang lebih 70 menit. Elektroforesis diakhiri apabila penanda sampel mencapai 0,5 cm dari batas kaca cetakan gel. Gel yang telah selesai running dipindahkan ke cawan pewarnaan untuk diwarnai dengan enzim pewarna.
commit to user
f. PewarnaanPewarnaan pada penelitian ini menggunakan dua sistem enzim, yaitu esterase dan peroksidase. Untuk membuat larutan pewarna, komposisi larutan yang digunakan disiapkan menurut Suranto (2000, 2002), yaitu sebagai berikut:
1) Pewarnaan esterase
Pembuatan buffer fosfat 0,2 M pH 6,5 : 1,825 gram Na2HPO4
(dinatrium hydrogen phosphate) dilarutkan dalam 50 ml akuades dicampur dengan 1,560 gram NaH2PO4 (natrium dihidrogen phosphate) yang dilarutkan dalam 50 ml akuades dengan perbandingan 1 : 1. Setelah itu, pH diatur hingga 6,5 dengan menambahkan HCl.
Pewarnaan esterase: 0,01 gram -naphthyl acetate dimasukkan dalam erlenmeyer, dilarutkan dalam 3 ml aseton, kemudian ditambahkan 9 ml dari 0,2 M buffer phosphate pH 6,5 dan 0,01 gram fast Blue BB Salt.
Gel yang telah dielektroforesis dimasukkan dalam larutan pewarna yang telah dituang di cawan dan diinkubasi selama 10 menit sambil digoyang secara perlahan-lahan. Setelah muncul pita-pita berwarna biru kehitaman pewarna lalu dibuang dan dibilas dengan akuades.
2) Pewarnaan peroksidase
Pembuatan buffer acetate pH 4,5: 0,272 gram natrium asetat (BM 27,2) dilarutkan dalam 50 ml akuades (larutan 1). Asam asetat glasial (BM 60) 0,84 gram dilarutkan dalam 70 ml akuades (larutan 2).
commit to user
Sebanyak 37 ml larutan 1 ditambah 63 ml larutan 2, pH diatur hingga 4,5 dengan menambahkan NaOH.
Pewarna peroksidase : sebanyak 0,0125 gram O-dianisidin dilarutkan dalam erlenmeyer, dilarutkan 3 ml aseton lalu ditambahkan 6 ml buffer asetat pH 4,5 dan 3-4 tetes hidrogen peroksida. Gel yang telah dielektroforesis dimasukkan dalam cawan plastik yang telah diberi larutan pewarna dan diinkubasi selama 10 menit sambil digoyang secara perlahan-lahan. Setelah muncul pita-pita, pewarna dibuang dan dibilas dengan akuades.
g. Proses fiksasi gel
Fiksasi dilakukan segera setelah proses pewarnaan gel selesai. Gel dipindahkan dari cawan pewarna ke dalam cawan yang berisi ± 40 ml larutan fiksasi untuk menghentikan aktivitas isozim. Larutan fiksasi yang digunakan untuk isozim esterase dan peroksidase dibuat dengan cara mencampurkan 259 ml alkohol 70%; 25 ml aseton; dan 225 ml H2O.
Selanjutnya gel dibilas dengan akuades dan ditutup dengan plastik transparan, lalu didokumentasi dengan kamera digital, dan kemudian disimpan dalam suhu dingin untuk pengamatan selanjutnya.
h. Pengamatan
Pola pita isozim hasil elektroforesis kemudian diamati dan diukur jarak migrasi masing-masing pita dari jarak pita yang terbentuk dengan jarak migrasi terjauh kemudian dihitung nilai Rf masing-masing pita digambar sebagai zimogram. Zimogram atau gambaran pita-pita yang
commit to user
diperoleh melalui elektroforesis dipaparkan dalam sebuah tabel mengenai karakter yang dimiliki oleh masing-masing individu atau sampel. Data tersebut dapat berupa ada atau tidak adanya suatu jenis pita isozim.
D. Analisis Data 1. Keragaman karakter
Data yang diperoleh dari karakter morfologi, anatomi dan pola pita isozim dianalisis secara deskriptif.
2. Hubungan kekerabatan
Data karakter morfologi, anatomi dan pola pita isozim talas yang diperoleh disajikan dalam bentuk data tabel biner dengan memberikan angka 1 jika sampel yang diamati memiliki karakter yang ditentukan dan angka 0 jika tidak terdapat karakter pada sampel tersebut (Ashary, 2010).
Data biner yang telah diperoleh digunakan untuk menghitung besarnya indeks similaritas (IS) antarindividu kemudian data yang berupa IS disusun sedemikian rupa untuk dianalisis dengan analisis pengelompokan (clustering analysis) Sequantial Agglomerative Hierarchical Nonoverlapping (SAHN) kemudian digunakan untuk membuat dendogram cluster UPGMA (Unweighted Pair Group Method Arithmetic) dengan menggunakan program Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System (NTSYS) versi 2.10 hingga diperoleh dendogram hubungan kekerabatan (Rohlf, 2000).
