Uji sitotosisitas ekstrak kloroform daun pacar air [Impatiens balsamina. L.] terhadap kultur sel hela - USD Repository

(1)

UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK KLOROFORM DAUN PACAR AIR (Impatiens balsaminaL.) TERHADAP KULTUR SEL HeLa

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh: Lise Natalia NIM : 058114079

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

(2)

ii

UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK KLOROFORM DAUN PACAR AIR (Impatiens balsaminaL.) TERHADAP KULTUR SEL HeLa

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh: Lise Natalia NIM : 058114079

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

(3)

(4)

(5)

v

HALAMAN PERSEMBAHAN

“If you can imagine it, you can achieve it. If you can dream it,

you can become it."

William Arthur Ward

-Kupersembahkan karya ini untuk

Papa dan mamaku tercinta, atas kasih sayang, doa dan dukungan

yang terus menyertaiku.

Adik-adikku terkasih, Victor dan Vera

(6)

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :

Nama : Lise Natalia

Nomor Mahasiswa : 058114079

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :

“Uji Sitotoksisitas Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air (Impatiens balsamina L.) terhadap Kultur Sel HeLa”

beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, me-ngalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal : 1 Juni 2009

Yang menyatakan,

(7)

vi

PRAKATA

Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala anugerah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Uji Sitotoksisitas

Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air (Impatiens balsaminaL.) terhadap Kultur Sel HeLa”. Skripsi ini dibuat untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar

Sarjana Farmasi (S.Farm.) pada Program Studi Farmasi di Universitas Sanata

Dharma.

Penulisan skripsi ini tidak mungkin terselesaikan tanpa adanya bimbingan,

bantuan dan dukungan dari berbagai pihak, maka pada kesempatan ini, penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma yang telah banyak meluangkan waktu, tenaga dan atas segala masukan serta sarannya dalam penyusunan skripsi ini.

2. Drs. A. Yuswanto S.U., Ph.D., Apt., selaku dosen pembimbing yang telah banyak meluangkan waktu, tenaga dan atas segala masukan serta sarannya

dalam penyusunan skripsi ini.

3. Drs. Mulyono, Apt., selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan memberikan banyak masukan dan saran.

(8)

vii

5. Ign. Y Kristyo B, M.Si., yang telah memberikan banyak masukan dalam identifikasi dan determinasi tumbuhan.

6. Drs. P. Sunu Hardiyanta, S.G., M.Sc., yang telah memberikan masukan dan saran dalam pengolahan statistik.

7. Segenap dosen dan karyawan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma,

terima kasih atas bantuannya selama ini.

8. Kepala Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu UGM atas ijin yang

diberikan untuk melakukan penelitian skripsi ini.

9. Mbak Yuli dan segenap karyawan Laboratorium Penelitian dan Pengujian

Terpadu UGM yang telah banyak membantu dalam penelitian skripsi ini.

10. Orang tua dan adik-adikku tercinta, atas segala dukungan dan doa yang selalu menyertaiku.

11. Suharso, atas segala dukungan dan kasih sayang yang diberikan selama penyusunan skripsi ini.

12. Anni dan Dhita, atas kerjasama, canda tawa dan keluh kesah selama

penyusunan skripsi ini.

13. Limdrawati dan Meri, terima kasih atas segala semangat dan bantuan yang

diberikan selama penyusunan skripsi ini.

14. Semua pihak yang telah banyak membantu penyusunan skripsi ini.

Atas segala bantuan yang telah diberikan selama ini, penulis mengucapkan

(9)

viii

kritik dan saran yang bersifat konstruktif demi penyempurnaan skripsi ini. Skripsi ini diharapkan dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

(10)

ix

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan bahwa sesungguhnya skripsi yang saya tulis ini tidak memuat

karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagai layaknya karya ilmiah.

Yogyakarta, 13 Mei 2009 Penulis,

(11)

x INTISARI

Pengobatan tradisional menggunakan tanaman obat di masyarakat sudah cukup luas. Tanaman Pacar air (Impatiens balsamina) secara empiris dapat digunakan untuk mengobati berbagai penyakit, antara lain kanker. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak kloroform daun pacar air memiliki efek sitotoksik terhadap sel HeLa.

Penelitian ini adalah penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak pola satu arah. Uji sitotoksisitas dilakukan pada kultur sel HeLa dan sel Vero menggunakan metode direct counting dengan perwarna trypan blue. Data yang diperoleh berupa persen kematian kultur sel HeLa dan sel Vero. Efek sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air terhadap kultur sel HeLa dan Vero dianalisis secara statistik dengan uji z dan harga LC50 akan dihitung dengan analisis probit.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak kloroform daun pacar air memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel HeLa dan sel Vero. Harga LC50 ekstrak klroform daun pacar air terhadap kultur sel HeLa sebesar 53,7 µg/ml dan sel Vero sebesar 275,4 µg/ml.

(12)

xi ABSTRACT

Traditional medication using herbs is widely spreaded in society.

Impatiens balsamina herbs can be used to cure many kinds of diseases, one of them is cancer. This research is aimed to determine whether the chloroform extract ofImpatiens balsaminaleaves have cytotoxic effect to HeLa cell cultures. The study is a pure experimental research with random complete and one way design. The cytotoxicity assay is tested to HeLa and Vero cell cultures using direct counting method with trypan blue stained. The data obtained were death percentage of HeLa and Vero cell cultures. The cytotoxicity effect of the chloroform extract of Impatiens balsamina leaves to HeLa cell cultures are analyzed using z-test and the LC50values are analyzed using probit.

The result shows that chloroform extract of Impatiens balsamina leaves have a cytotoxic effect to HeLa and Vero cell cultures. The LC50 value of chloroform extract of Impatiens balsamina leaves to HeLa cell cultures is 53,7 µg/ml and Vero cell culture is 275,4 µg/ml.

(13)

xii DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ... ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... iii

HALAMAN PENGESAHAN ... iv

HALAMAN PERSEMBAHAN ... v

PRAKATA ... vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... ix

INTISARI ... x

ABSTRACT ... xi

DAFTAR ISI ... xii

DAFTAR TABEL ... xvi

DAFTAR GAMBAR ... xviii

DAFTAR LAMPIRAN ... xx

BAB I PENGANTAR ... 1

A. Latar Belakang ... 1

1. Rumusan masalah ... 2

2. Keaslian penelitian ... 3

3. Manfaat penelitian ... 3

B. Tujuan ... 3

1. Tujuan umum ... ... 3

2. Tujuan khusus ... ... 3

(14)

xiii

A. Tanaman pacar air (Impatiens balsaminaL.)... 4

1. Keterangan botani ... 4

2. Kandungan kimia ... 4

3. Khasiat dan penggunaan ... 5

B. Kanker ... 5

1. Karsinogenesis ... 5

2. Kanker seviks ... 6

3. Sel HeLa ... 6

4. Sel vero ... 6

C. Ekstraksi ………... 7

1. Definisi ekstrak ... 7

2. Cairan pelarut ... 7

3. Ekstraksi ... 7

4. Maserasi ... 8

D. Uji Sitotoksisitas ... 8

E. Landasan teori ... 9

F. Hipotesis ... 10

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ... 11

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ... 11

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ... 11

1. Variabel utama ... 11

2. Variabel pengacau terkendali ... 11

(15)

xiv

C. Alat dan Bahan ... 12

1. Alat .... ... 12

2. Bahan ... 12

D. Tata Cara Penelitian ... 13

1. Determinasi tanaman ... 13

2. Pengumpulan bahan ... 13

3. Ekstraksi ... 13

4. Pembuatan medium pencuci dan penumbuh ... 14

5. Propagasi dan panen sel HeLa ... 15

6. Propagasi dan panen sel normal ... 16

7. Uji sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air ... 16

E. Analisis Hasil... 17

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 18

A. Determinasi tanaman... 18

B. Pengumpulan daun pacar air ... 18

C. Ekstraksi ... 19

D. Pembuatan medium pencuci dan medium penumbuh ... 19

E. Propagasi dan panen sel HeLa ... 20

F. Propagasi dan panen sel vero ... 20

G. Uji sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air ... 21

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN... 31

A. Kesimpulan ... 31

(16)

xv

DAFTAR PUSTAKA ... 32 LAMPIRAN ... 35

(17)

xvi

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Jumlah Sel yang Hidup dari Tiap Sumuran pada Berbagai Tingkat Konsentrasi Ekstrak klroform daun pacar air dengan

metode direct counting ... 23

Tabel II. % kematian sel HeLa pada berbagai konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air ... 23

Tabel III. Jumlah Sel Vero yang Hidup dari Tiap Sumuran pada Berbagai Tingkat Konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar

air dengan MetodeDirect Counting ... 27

Tabel IV. % kematian sel vero pada berbagai konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air ... 28

Tabel V. Data perhitungan jumlah sel HeLa dengan perhitungan Langsung ... 36

Tabel VI. Data perhitungan jumlah sel Vero dengan perhitungan

Langsung ... 37 Tabel VII. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit sel HeLa

pada replikasi I... 46 Tabel VIII. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit sel HeLa

pada replikasi II ... 47

(18)

xvii

Tabel X. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit sel vero pada replikasi I... 49

Tabel XI. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit sel vero pada replikasi II... 50

Tabel XII. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit sel vero

pada replikasi III ... 51 Tabel XIII. Nilai r (koefisien korelasi) pada level signifikansi 5% dan

(19)

xviii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Foto kultur sel HeLa di haemocytometer setelah diberi

trypan blue... 22

Gambar 2. Kultur sel HeLa di sumuran ... 22

Gambar 3. Kultur sel Vero di sumuran ... 22 Gambar 4. Grafik konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air (µg/ml)

terhadap % kematian sel HeLa... 24 Gambar 5. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada

replikasi I ... 25

Gambar 6. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada

replikasi II ... 25

Gambar 7. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada

replikasi III ... 26

Gambar 8. Grafik konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air (µg/ml)

terhadap % kematian sel vero ... 28 Gambar 9. Kurva log konsentrasi terhadap harga probit sel vero pada

replikasi I... 29 Gambar 10. Kurva log konsentrasi terhadap harga probit sel vero pada

replikasi II ... 29

Gambar 11. Kurva log konsentrasi terhadap harga probit sel vero pada replikasi III ... 30

(20)

xix

(21)

xx

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Foto tanaman dan daun pacar air (Impatiens balsaminaL.) .... 35

Lampiran 2. Perhitungan jumlah sel yang hidup ... 36

Lampiran 3. Perhitungan persentase kematian sel HeLa dan sel Vero ... 42 Lampiran 4. Perhitungan LC50dengan analisis probit dan

uji linearistas ... 46 Lampiran 5. Analisis statistik uji z pada kelompok kontrol dan

perlakuan ... 54

(22)

1 BAB I PENGANTAR A. Latar belakang

Kanker dapat menyerang siapa saja tanpa mengenal umur dan jenis

kelamin. Kanker merupakan salah satu penyebab kematian di dunia dan sebagian

besar terjadi di negara berkembang. Menurut data WHO yang diterbitkan pada tahun 2008, pada tahun 2005 sebanyak 7,6 juta kematian di dunia terjadi akibat

kanker (Anonim, 2008a). Di Indonesia sekitar 800.000 orang terserang kanker tiap tahunnya (Anonim, 2007).

Kanker serviks adalah kanker yang menyerang bagian ujung bawah rahim

yang menonjol ke vagina (liang senggama). Menurut data dari WHO, setiap tahun di seluruh dunia sebanyak 490 ribu perempuan didiagnosa menderita kanker

serviks (Anonim, 2008b). Hingga saat ini kanker serviks masih menduduki urutan pertama penyakit yang paling banyak menyerang wanita di Indonesia. Sementara

di dunia, penyakit kanker serviks ini terbanyak kedua setelah kanker payudara

(Mardiana, 2008).

Berbagai cara pengobatan telah dilakukan untuk mengobati penyakit

kanker, antara lain dengan menggunakan radiasi, kemoterapi, dan pembedahan (Diananda, 2008). Akan tetapi, pengobatan-pengobatan tersebut memiliki banyak

efek yang tidak menyenangkan dan biaya juga relatif mahal. Oleh karena itu,

(23)

2

Pengobatan tradisional menggunakan tanaman obat di masyarakat sudah cukup luas, salah satunya yaitu menggunakan tanaman pacar air. Tanaman pacar

air memiliki beberapa khasiat, antara lain untuk kanker pencernaan, bengkak, rematik, bisul, radang kulit, antiinflamasi (Arisandi dan Andriani, 2006).

Penelitian di Cina menunjukkan bahwa ekstrak kloroform daun pacar air

memiliki aktivitas antitumor terhadaphepatocelluler carcinoma cell line HepG2. Senyawa yang aktif telah diidentifikasi sebagai 2-methoxy-1,4-naphthoquinone

(Zhi-Shan, 2008). Sel HeLa memiliki persamaan dengan sel Hep G2 dimana kedua sel ini berasal dari suatu carcinoma dan penyebabnya adalah virus

(Anonim, 2008c dan Anonim, 2008d).

Untuk mengetahui apakah tanaman pacar air mempunyai khasiat sebagai antikanker terhadap sel HeLa, perlu dilakukan penelitian. Penelitian dilakukan

dengan menggunakan ekstrak kloroform dari daun pacar air dan diuji efek sitotoksiknya terhadap kultur sel HeLa dengan metode direct counting

menggunakan alat haemocytometer. Hasil penelitian diharapkan dapat menjadi

dasar untuk mengembangkan tanaman pacar air sebagai senyawa antikanker terutama terhadap sel HeLa.

1. Rumusan masalah

Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan, maka dapat

dirumuskan permasalahan sebagai berikut:

(24)

3

b. seberapa besar harga LC50 dari ekstrak daun pacar air terhadap kultur sel HeLa dan sel Vero?

2. Keaslian penelitian

Belum pernah dilakukan penelitian mengenai sitotoksisitas ekstrak

kloroform daun pacar air terhadap kultur sel HeLa.

3. Manfaat penelitian a. manfaat teoritis

Penelitian ini dapat memberikan informasi tentang efek sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air terhadap sel HeLa dan melengkapi serta

memperkaya teori yang telah ada mengenai khasiat dari tanaman pacar air.

b. manfaat praktis

Penelitian ini diharapkan dapat membuktikan efek daun pacar air sebagai

antikanker.

B. Tujuan 1. Tujuan umum

Untuk mengetahui apakah ekstrak kloroform daun pacar air bersifat sitotoksik.

2. Tujuan khusus

a. untuk mengetahui apakah ekstrak kloroform daun pacar air memiliki efek

sitotoksik terhadap kultur sel HeLa dan sel Vero.

(25)

4 BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA A. Tanaman Pacar Air 1. Keterangan Botani

Tanaman pacar air (Impatiens balsamina) termasuk dalam familia

Balsaminaceae (Backer dan Brink, 1965). Tanaman ini merupakan terna berbatang basah, bercabang, dengan daun tunggal, bentuk lanset memanjang

pinggir bergerigi warna hijau muda tanpa daun penumpu. Bunga berwarna cerah, ada beberapa macam warna, seperti merah, orange, ungu, putih. Ada yang

“engkel” dan yang “dobel”. Buahnya buah kendaga, bila masak akan membuka

menjadi 5 bagian yang terpilin. Biasanya ditanam sebagai tanaman hias dengan tinggi 30-80 cm (Arisandi dan Andriani, 2006).

2. Kandungan Kimia

Kandungan kimia pada tanaman pacar air , bunga:Anthocyanins,cyanidin,

delphinidin,pelargonidin, malvidin,kaempherol, quercetin; akar:cyanidin mono

-glycoside (Arisandi dan Andriani, 2006); Daun: 2-methoxy-1,4-naphthoquinone

yang diisolasi dalam suatu penelitian di Thailand (Thongnopnua et al, 1991).

Beberapa derivat dari naphthoquinone memiliki efek sitotoksik terhadap sel kanker, salah satunya yaitu plumbagin. Menurut penelitian yang dilakukan,

plumbaginmemiliki efek anti tumor terhadap sel kanker payudara (Ahmad et al,

(26)

5

3. Khasiat dan Penggunaan

Tanaman pacar air memiliki beberapa khasiat, antara lain untuk peluruh

haid, kanker pencernaan, bengkak, rematik, bisul, radang kulit, keputihan, tulang patah atau retak, antiinflamasi dan keputihan (Arisandi dan Andriani, 2006).

B. Kanker

Kanker adalah sekelompok penyakit yang ditandai dengan pertumbuhan sel yang tidak terkendali, invasi jaringan lokal dan migrasi sel ke tempat yang

jauh (metastasis). Tumor dapat berupa benign dan malignant. Tumor benign

bukan merupakan kanker, biasanya berkapsul dan terlokalisasi. Tumor ini jarang

mengalami metastasis dan ketika dihilangkan, jarang muncul lagi. Sebaliknya,

tumor malignant menginvasi dan merusak jaringan sekitarnya. Pada tumor

malignant cenderung terjadi metastasis sehingga kekambuhan biasanya terjadi

setelah penghilangan atau pengrusakan tumor primer (Balmer, Valley dan Iannucci, 2005).

1. Karsinogenesis

Karsinogenesis, proses terjadinya kanker, merupakan serangkaian mekanisme yang dihasilkan dari akumulasi kesalahan pada jalur pengaturan vital.

Hal ini dimulai ketika sel tunggal kemudian membelah dan mengalami perubahan sehingga dapat lebih bertahan daripada sel-sel sekitarnya. Sel yang telah berubah

ini menghasilkan jutaan sel yang pada akhirnya menimbulkan kanker (King,

(27)

6

2. Kanker serviks

Kanker serviks terjadi ketika sel pada serviks mengalami pertumbuhan

yang tidak terkontrol dan kemudian dapat menginvasi jaringan sekitarnya atau menyebar ke seluruh tubuh (Dolinsky dan Christine, 2008).

Kanker serviks kebanyakan terjadi sebagai suatu squamous carcinoma

sebanyak 95 % dan sedikit terjadi pada selendocervical columnal sebagai suatu

adenocarcinoma (5%). Faktor resiko terjadinya kanker serviks antara lain

berhubungan seks pada usia dini, pasangan seks berganti-ganti, perokok dan terpapar olehHuman Papilloma Virus(HPV) (King, 2000).

3. Sel HeLa

Sel HeLa adalah sel yang ditemukan pada kanker serviks yang menyebabkan kematian yang tinggi pada wanita. Sel ini diisolasi pertama kali

pada Februari 1951 dari seorang wanita yang bernama Henrietta Lacks di Baltimore. Sel HeLa merupakan sel epithelial dari carcinoma cervix yang

ditransformasi olehHuman Papilloma Virus (HPV)18 (Anonim, 2008c).

4. Sel Vero

Sel Vero diinisiasikan pada tahun 1962 terdapat dalam ginjal kera dewasa

(28)

7

C. Ekstraksi 1. Definisi ekstrak

Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang

sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dari massa atau

serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Anonim, 1995).

2. Cairan pelarut

Cairan pelarut dalam proses pembuatan ekstrak adalah pelarut yang baik

(optimal) untuk senyawa kandungan yang berkhasiat atau yang aktif, dengan

demikian senyawa tersebut dapat terpisahkan dari bahan dan dari senyawa kandungan lainnya, serta ekstrak hanya mengandung sebagian besar senyawa

kandungan yang diinginkan. Faktor utama untuk pertimbangan pada pemilihan cairan penyari adalah sebagai berikut : selektivitas, kemudahan bekerja dan proses

dengan cairan tersebut, ekonomis, ramah lingkungan, dan keamanan (Anonim, 2000).

3. Ekstraksi

Ekstraksi merupakan kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat

larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak larut dengan pelarut cair. Simplisia yang diekstrak mengandung senyawa aktif yang dapat larut dan senyawa tidak

dapat larut seperti serat, karbohidrat, protein dan lain-lain. Senyawa aktif yang

(29)

8

4. Maserasi

Maserasi adalah proses pengekstraksian simplisia dengan menggunakan

pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan (kamar) (Anonim, 2000). Cairan penyari akan menembus dinding sel dan

masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif., zat aktif akan larut dan

karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang ada di luar sel, maka larutan yang terpekat didesak ke luar. Peristiwa tersebut

berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Keuntungan maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang

digunakan sederhana dan mudah diusahakan, kerugiannya adalah pengerjaannya

lama dan penyariannya kurang sempurna (Anonim, 1986).

D. Uji Sitotoksisitas

Sitotoksisitas adalah sifat toksik atau beracun suatu senyawa terhadap sel yang hidup. Uji sitotoksisitas adalah uji in vitro dengan menggunakan kultur sel

yang digunakan dalam evaluasi keamanan obat, kosmetika, zat tambahan

makanan, pestisida, dan digunakan juga untuk mendeteksi adanya aktivitas sitotoksik dari suatu senyawa. Sistem ini merupakan uji kualitatif dan kuantitatif

dengan cara menetapkan kematian sel (Freshney, 2000).

Metodedirect counting

Metode yang umum dan sering dipakai dalam penghitungan sel adalah

menggunakanhaemocytometerkarena keefisienan dan keakuratannya. Digunakan suatu chamber hitung yang kaku berbentuk kotak dan memiliki kedalaman 0,1

(30)

9

mikroskop dan sel dihitung pada sejumlah bilik yang dipilih. Dari perhitungan yang dilakukan, dapat ditentukan jumlah sel per ml dari suspensi. Untuk

mengetahui sel yang hidup dan yang mati dapat digunakan zat penanda seperti

trypan blue. Trypan blue hanya masuk ke membran sel mati sehingga sel yang

mati akan berwarna biru gelap (Doyle and Griffiths, 2000).

Suatu uji sitotoksisitas menggunakan metode BST menyatakan jika suatu uji sitotoksisitas menghasilkan harga LC50kurang dari 1000μg/ml maka senyawa

tersebut dinyatakan bersifat toksik dan bila lebih besar dari 1000 μg/ml maka senyawa tersebut dinyatakan tidak toksik terhadap senyawa uji Suatu senyawa

berpotensi sebagai antikanker bila memiliki harga LC50 ≤30 μg/ml (Meyer et al,

1982). National Cancer Institute (NCI) menyatakan jika uji sitotoksik suatu senyawa menghasilkan nilai LC50≤ 20 μg/ml, maka senyawa tersebut memiliki

potensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker (Suffness and Pezzuto, 1991 cit., Rahmawati, Katno dan Triyono, 2008).

E. Landasan Teori

Saat ini banyak tanaman yang dapat digunakan untuk mengobati kanker, salah satunya adalah daun pacar air. Berdasarkan penelitian di Thailand, suatu

senyawa yang diisolasi dari ekstrak daun pacar air mengandung 2-methoxy

-1,4-naphthoquinone (Thongnopnua et al, 1991). Senyawa ini merupakan derivat dari

naphthoquinone. Beberapa derivat dari naphthoquinone memiliki berbagai

aktivitas, antara lain adalah sebagai anti tumor.

Penelitian di Cina juga menunjukkan bahwa ekstrak kloroform daun pacar

(31)

10

HepG2. Senyawa yang aktif diisolasi dan diidentifikasi sebagai 2-methoxy

-1,4-napthoquinone(Zhi-Shan, 2008).

Berdasarkan penelitian tersebut, maka dilakukan penelitian dengan mengekstraksi daun pacar air menggunakan kloroform untuk melihat apakah

ekstrak tersebut memiliki efek sitotoksisitas terhadap sel HeLa, dimana sel HeLa

merupakan selepithelialdaricarcinoma cervix.

F. Hipotesis

(32)

11 BAB III

METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian uji sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air terhadap

kultur sel HeLa ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan

acak lengkap pola satu arah. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu UGM.

B. Variabel penelitian dan Definisi operasional 1. Variabel utama

a. Variabel Bebas

Kadar ekstrak kloroform daun pacar air yaitu 800 g/ml, 700 g/ml, 600

g/ml, 500 g/ml, 400 g/ml, 300 g/ml, 200 g/ml, 175 g/ml, 150 g/ml,

125g/ml, 100g/ml, 75g/ml, 50g/ml dan 25g/ml.

b. Variabel Tergantung

Persentase kematian kultur sel HeLa dan sel Vero.

2. Variabel pengacau terkendali

a. Medium tumbuh sel HeLa dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI-1640 serum dan medium sel normal dengan medium M199 serum.

b. Tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun pacar air dikendalikan dengan memanen daun pada tempat dan waktu yang sama.

3. Definisi operasional

(33)

12

b. Ekstrak kloroform daun pacar air adalah ektrak yang diperoleh dengan mengekstraksi secara maserasi serbuk kering daun pacar air dengan

menggunakan pelarut kloroform.

C. Alat dan Bahan 1. Alat

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri atas : alat-alat gelas, oven, mesin serbuk, filter, timbangan analitik (Mettler Toledo), alumunium

foil, autoklaf, tissue culture flask, tabung conical (Nunc), swing rotor sentrifuge

(PLC), inkubator (Memmert), mikropipet, lemari pendingin (Sharp), 96-well plate

(NunclonTM), laminar air flow (LabconcoR), mikroskop (Olympus),

haemocytometer (Neubauer Improved), yellowtip, bluetip, tabung effendorf, tissue, sarung tangan dan masker.

2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah :

a. Daun pacar air segar

b. Kultur sel HeLa yang diambil dari stok di LPPT Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

c. Kultur sel Vero yang diambil dari stok LPPT Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta

d. Larutan penyari yang digunakan dalam preparasi ekstrak kloroform daun

pacar air (Impatiens balsamina)

(34)

13

f. Medium penumbuh : RPMI-1640, Natrium Bikarbonat, HEPES, FBS (Foetal Bovine Serum) 10%, Penisilin-Streptomisin 1%, dan Fungison 0,5%.

g. Tripsin 0,25%

h. Reagen Pewarna :Trypan Blue

i. Aquabidest

j. Dimethyl Sulfoxide (DMSO) 0,25%

D. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman

Determinasi daun pacar air dilakukan di Laboratorium Farmakognosi

Fitokimia, Fakultas Sanata Dharma, Yogyakarta menggunakan acuan baku

(Backer dan Brink, 1965).

2. Pengumpulan bahan

Daun pacar air yang digunakan untuk penelitian diambil pada daerah Tajem, Sleman. Daun segar pacar air diseleksi, dicuci dengan air mengalir untuk

menghilangkan kotoran-kotoran yang melekat, kemudian ditiriskan hingga

kandungan air hilang. Daun dijemur di bawah sinar matahari yang ditutupi oleh kain berwarna gelap kemudian dimasukkan ke dalam oven pada suhu 45oC selama

12 jam. Setelah benar-benar kering, daun kemudian diserbuk menggunakan mesin hingga diperoleh serbuk dengan ukuran 65 mesh.

3. Ekstraksi

Serbuk kering daun pacar air ditimbang, dibungkus dalam kertas dan dimasukkan ke dalam tabung erlenmeyer dan ditambahkan dengan penyari ke

(35)

14

digunakan yaitu kloroform dan proses ekstraksi yang digunakan pada penelitian ini adalah maserasi. Ekstrak yang didapat selanjutnya dilakukan penguapan

dengan vacum rotary evaporator hingga didapat ekstrak kental. Ekstrak kental yang didapat dilanjutkan dengan penguapan di atas oven hingga kloroform

menguap semua.

4. Pembuatan medium pencuci dan medium penumbuh a. Pembuatan medium pencuci

RPMI 1640 dilarutkan dalam aquabidest kurang lebih 80 ml, ditambah 2,3 g natrium bikarbonat, 2 g HEPES [4-(2-Hidroxyethyl)-1-piperazine ethane

sulphonic acid], diencerkan sampai 100 ml, pH dibuat 7,2, lalu disterilkan dengan

filter berdiameter 0,22 μm. Medium disimpan dalam almari es pada suhu 4oC (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979).

b. Pembuatan medium kultur (RPMI 1640-serum)

Untuk medium RPMI 1640-serum, RPMI 1640 dilarutkan dalam

aquabidest kurang lebih 80 ml, ditambah 2,3 g natrium bikarbonat, 2 g HEPES

[4-(2-Hidroxyethyl)-1-piperazine ethane sulphonic acid], diencerkan sampai 100 ml, pH dibuat 7,2, ditambahkan FBS (Foetal Bovine Serum) 10%,

penisilin-streptomisin 1% dan fungison 0,5% dalam medium RPMI 1640 dan disterilkan dengan filter berdiameter 0,22 μm. Media disimpan dalam almari es pada suhu

(36)

15

5. Propagasi dan panen sel HeLa a. Propagasi sel HeLa

Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam penangas air 37oC, kemudian ampul disemprot dengan etanol 70%. Ampul dibuka

dan sel HeLa dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI

1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian disuspensikan perlahan. Suspensi sel

lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang

mengandung 10% FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai homogen,

kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37oC dengan aliran 5% CO2. Setelah 24 jam,

medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979).

b. Panen sel HeLa

Setelah jumlah sel cukup (kurang lebih setelah berumur 7 hari), medium diganti dengan RPMI-1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel dilepaskan dari

dinding flask dengan cara diberi tripsin. Sel dipindahkan dalam tabung conical

steril dan ditambahkan medium RPMI-1640 sampai volume 10 ml dan

disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang

(37)

16

sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2 x104/100 μl dan siap dipakai untuk penelitian (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979).

6. Propagasi dan panen sel normal

Sel normal yang digunakan dalam penelitian ini adalah sel Vero.

Propagasi dan panen sel Vero menggunakan langkah yang sama dengan propagasi

dan panen sel HeLa. Perbedaannya hanya terletak pada medium yang digunakan. Sel Vero menggunakan medium M199.

7. Uji sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air

Pada uji sitotoksisitas, sebanyak 100 µl suspensi sel HeLa dengan

kepadatan 2x104 sel/100 µl dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well plate

yang telah berisi 100 µl ekstrak kloroform daun pacar air dengan kadar 200

g/ml, 175g/ml, 150 g/ml, 125 g/ml, 100g/ml, 75g/ml, 50g/ml dan 25

g/ml dan untuk sel vero, kadar ekstrak kloroform daun pacar air yang digunakan

yaitu 800 g/ml, 700 g/ml, 600 g/ml, 500 g/ml, 400 g/ml, 300 g/ml, 200

g/ml dan 100 g/ml. Untuk kontrol, digunakan 100 μl suspensi sel dan

ditambahkan medium. Selanjutnya plate diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37oC, dalam incubator dengan aliran 5% CO2(Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan,

1979). Pada akhir masa inkubasi, tiap sumuran sel diresuspensi, kemudian

ditambahkan 100 l trypan blue. Pipet 10 μl tiap sumuran dan masukkan dalam

haemocytometer. Hitung jumlah sel hidup dan mati pada tiap konsentrasi dan

kontrol di bawah mikroskop. Sel yang hidup akan tampak relatif bulat transparan. Sedangkan sel yang mati akan tampak gelap dan tidak cemerlang (Doyle and

(38)

17

E. Analisis Hasil

Analisis hasil dilakukan dengan perhitungan persentase kematian sel

dengan rumus :

% kematian =

A B

A )

( 

x 100%

Keterangan:

A : jumlah sel yang hidup pada sumuran kontrol media

B : jumlah sel yang hidup pada sumuran yang telah diberi perlakuan ekstrak

kloroform daun pacar air

Untuk menghitung harga LC50 dilakukan perhitungan menggunakan analisis probit sedangkan untuk menganalisis signifikansi antara perlakuan dan

kontrol dilakukan pengolahan data statistik uji z. Untuk menganalisis signifikansi antara LC50 sel HeLa dan sel Vero digunakan analisis statistik uji t sampel

(39)

18 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN A. Determinasi Tanaman

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian adalah daun pacar air.

Untuk memastikan identitas tanaman uji dan menghindari terjadinya kesalahan

dalam pengambilan tanaman uji maka dilakukan determinasi tanaman. Determinasi dilakukan dengan mencocokkan tanaman dengan kunci determinasi

(Backer dan Brink, 1965).

Determinasi dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas

Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Hasil determinasi menyatakan

bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah benar Impatiens balsamina(Lampiran 7).

B. Pengumpulan Daun Pacar Air

Daun pacar air yang digunakan diambil dari tanaman pacar air yang

tumbuh di daerah Tajem, Sleman pada bulan Agustus 2008. Daun pacar air yang

akan digunakan perlu dicuci dengan air mengalir untuk membersihkan kotoran dan debu yang menempel pada permukaan daun.

Pembuatan simplisia daun pacar air dilakukan dengan pengeringan menggunakan oven pada suhu 450C selama 12 jam. Pengeringan dilakukan untuk

mencegah kerusakan simplisia karena air merupakan media pertumbuhan kapang

(40)

19

ini bertujuan untuk memperkecil ukuran partikel sehingga memperluas area kontak daun terhadap pelarut pada proses ekstraksi.

C. Ekstraksi

Bahan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak kloroform

daun pacar air. Ekstraksi dilakukan secara maserasi dengan larutan penyari

klorofom. Pada metode ini sampel direndam dalam larutan penyari pada suhu ruangan. Perendaman menyebabkan cairan penyari menembus dinding sel

sehingga dapat melarutkan zat aktif. Adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang ada di luar sel menyebabkan zat aktif yang ada

di dalam sel akan terdesak ke luar sel. Peristiwa ini akan terjadi terus menerus

hingga terjadi keseimbangan antara konsentrasi larutan di dalam sel dan luar sel. Pemilihan larutan penyari dilakukan berdasarkan kelarutan dari senyawa

aktif yang diinginkan. Dalam penelitian ini, senyawa yang akan diuji adalah naftokuinon dimana senyawa tersebut larut dalam kloroform, sehingga larutan

penyari yang digunakan adalah kloroform. Metode maserasi tidak menggunakan

panas sehingga zat aktif yang termolabil tidak rusak.

D. Pembuatan Medium Pencuci dan Medium Penumbuh

Dalam penelitian digunakan 2 macam medium yaitu : medium pencuci dan medium penumbuh. Medium pencuci untuk sel HeLa adalah RPMI-1640

ditambah HEPES dan natrium bikarbonat.

Medium penumbuh mengandung RPMI-1640, natrium bikarbonat, HEPES, FBS (Foetal Bovine Serum) 10%, penisilin-streptomisin 0,5%, dan

(41)

20

karena mampu mendukung nutrisi pertumbuhan pada kultur sel HeLa. Medium pencuci dan penumbuh untuk sel Vero juga sama, namun yang berbeda adalah

mediumnya yaitu M199.

Dalam medium, kombinasi antibiotik penisilin-streptomisin digunakan

untuk menghindari kontaminan bakteri, baik gram positif maupun negatif. Selain

itu, fungison dalam medium digunakan untuk menjaga agar medium bebas dari kontaminan jamur. Medium kultur yang digunakan harus bebas dari kontaminan

agar pertumbuhan kultur sel tidak terhambat akibat adanya persaingan mendapatkan nutrisi.

E. Propagasi dan Panen Sel HeLa

Sel HeLa yang akan digunakan disimpan dan dibekukan dalam tangki nitrogen cair agar kondisi sel tetap normal. Medium sel juga harus diganti secara

rutin. Medium diganti pada saat medium yang berwarna merah berubah menjadi oranye hingga kuning.

Sel HeLa dipanen pada saat konfluen dan jumlahnya telah mencukupi

untuk digunakan dalam penelitian. Sel HeLa diresuspensikan dengan medium dan medium dibuang. Setelah itu, sel diberi tripsin agar terlepas dari dinding flask dan

disentrifugasi, supernatan dibuang. Sel yang diperoleh, dihitung jumlahnya menggunakanhaemocytometer.

F. Propagasi dan Panen Sel Vero

(42)

21

menggunakan langkah yang sama dengan sel HeLa, namun yang berbeda adalah mediumnya. Medium untuk sel Vero adalah M199.

G. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air

Uji sitotoksisitas dilakukan untuk mengetahui potensi ketoksikan ekstrak

kloroform daun pacar air terhadap kultur sel HeLa. Hasil dari uji sitotoksisitas

dapat digunakan untuk menentukan LC50, yaitu konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air yang mampu mematikan 50% populasi kultur sel HeLa.

Uji sitotoksisitas dilakukan menggunakan metode perhitungan langsung dengan haemocytometer. Dalam metode ini pengamatan dilakukan langsung di

bawah mikroskop. Untuk membedakan sel mati dan hidup maka sel akan diberi

pewarna trypan blue dimana trypan blue masuk ke membran sel yang mati sehingga sel yang mati akan tampak lebih gelap sedangkan sel yang hidup relatif

bulat dan transparan (gambar 1).

Sebelum sel diberi trypan blue, terlebih dahulu dilakukan pengamatan

morfologi sel di bawah mikroskop. Sel yang hidup akan tampak bulat, bening,

(43)

22

i

ii

Gambar 1. Kultur sel HeLa dihaemocytometer setelah diberitrypan blueKet. : i = sel HeLa hidup dan ii = sel HeLa mati

i

ii

A B

Gambar 2. Kultur sel HeLa di sumuran (perbesaran 100x). A : sel HeLa tanpa perlakuan (kontrol), B : sel HeLa diberi ekstrak kloroform daun pacar air konsentrasi 100 µg/ml

Ket. i = sel hidup dan ii = sel mati

i ii

i

A B

Gambar 3. Kultur sel Vero di sumuran (perbesaran 100x). A : sel Vero tanpa perlakuan (kontrol), B : sel Vero diberi ekstrak kloroform daun pacar air konsentrasi 100 µg/ml

(44)

23

Tabel I. Jumlah Sel yang Hidup dari Tiap Sumuran pada Berbagai Tingkat Konsentrasi Ekstrak klroform daun pacar air dengan Metode Direct Counting

Konsentrasi Replikasi

I II III

kontrol 39000 39000 39000

200 µg/ml 4000 4000 4000

175 µg/ml 7500 7500 7500

150 µg/ml 10000 10500 10500

125 µg/ml 12500 12500 12500

100 µg/ml 15500 15000 15500

75 µg/ml 18500 18000 18500

50 µg/ml 21000 21500 21500

25 µg/ml 24000 24500 24000

Dari hasil yang diperoleh (tabel I), maka dapat dihitung persentase kematian sel

HeLa dengan pengurangan jumlah sel HeLa hidup pada kelompok kontrol dengan jumlah sel HeLa hidup pada kelompok perlakuan dibagi jumlah sel HeLa hidup

pada kelompok kontrol. Persentase kematian sel HeLa semakin meningkat dengan

meningkatnya konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air (gambar 4).

Tabel II. % kematian sel HeLa pada berbagai konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air

Konsentrasi % kematian sel HeLa

Replikasi I Replikasi II Replikasi III

25 µg/ml 38,46 37,18 38,46

50 µg/ml 46,15 44,87 44,87

75 µg/ml 52,56 53,85 52,56

100 µg/ml 60,26 61,54 60,26

125 µg/ml 67,95 67,95 67,95

150 µg/ml 74,36 73,08 73,08

175 µg/ml 80,77 80,77 80,77

(45)

24

Gambar 4. Grafik konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air (µg/ml) terhadap % kematian sel HeLa

Dalam penelitian ini digunakan kontrol normal yaitu sel HeLa ditumbuhkan dalam medium tanpa diberi perlakuan. Kontrol normal digunakan

dengan tujuan untuk mengetahui efek sitotoksik ekstrak kloroform daun pacar air

terhadap sel HeLa. Analisis dilakukan dengan membandingkan jumlah sel hidup dan mati pada kelompok kontrol terhadap kelompok perlakuan, apakah terdapat

perbedaan yang signifikan atau tidak. Hasil penelitian dianalisis secara statistik dengan uji z yang dihitung secara manual.

Analisis menggunakan uji z dengan α = 0,05 memperoleh hasil

perhitungan yang menunjukkan z hitung > z tabel sehingga H0 ditolak. Jadi, hasil perhitungan menunjukkan terdapat perbedaan yang signifikan antara jumlah sel

hidup kelompok kontrol dan perlakuan (Lampiran 5). Dengan demikian dapat dikatakan bahwa sel yang mati merupakan akibat dari perlakuan yang diberikan

dalam penelitian ini yaitu pemberian ekstrak kloroform daun pacar air ke sel.

0

konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air (ug/ml)

(46)

25

Untuk memperoleh LC50 ekstrak kloroform daun pacar air terhadap sel HeLa, maka dilakukan analisis probit. Analisis probit merupakan analisis regresi

antara log konsentrasi dengan harga probit. Pada analisis regresi perlu dilakukan uji linearitas (Lampiran 4). Hasil uji linearitas menunjukkan r hitung > r tabel

yaitu grafik replikasi I linier terhadap persamaan garis y = 1,61x + 2,22 (gambar

5) yaitu grafik replikasi II linier terhadap persamaan garis y = 1,63x + 2,18 (gambar 6) dan grafik replikasi III linier terhadap persamaan y = 1,61x + 2,21

(gambar 7)

Gambar 5. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada replikasi I

Gambar 6. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada replikasi II

0

grafik replikasi I y = 1,61x + 2,22

(47)

26

Gambar 7. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada replikasi III

Perhitungan dengan analisis probit memperoleh LC50 ekstrak kloroform

daun pacar air terhadap sel HeLa sebesar 53,7 µg/ml dimana nilai LC50 tersebut > 20 µg/ml. Semakin kecil LC50 suatu senyawa maka semakin toksik senyawa

tersebut. Penelitian sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air juga dilakukan

terhadap kultur sel lain dengan nilai LC50 sebesar 52,5 µg/ml pada sel SiHa (Adhitama, 2009) dan 33,9 µg/ml pada sel T47D (Anni, 2009).

Untuk mengetahui apakah ekstrak kloroform daun pacar air juga bersifat sitotoksik terhadap sel normal, maka ekstrak tersebut juga diujikan pada sel Vero

sebagai sel normal. 0 2 4 6 8

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

H

a

r

g

a

p

r

o

b

it

Log konsentrasi

(48)

27

Tabel III. Jumlah Sel Vero yang Hidup dari Tiap Sumuran pada Berbagai Tingkat Konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air dengan MetodeDirect Counting

Konsentrasi Replikasi

I II III

kontrol 37000 37000 37000

800 µg/ml 1500 2000 2000

700 µg/ml 8000 8500 8000

600 µg/ml 12000 12000 12000

500 µg/ml 14000 14000 14500

400 µg/ml 16500 17000 17000

300 µg/ml 20000 20000 20000

200 µg/ml 23000 23000 23000

100 µg/ml 26500 27000 27000

Dari data di atas (tabel III), dapat dihitung persentase kematian sel Vero dengan

persentase kematian sel Vero dengan pengurangan jumlah sel Vero hidup pada kelompok kontrol dengan jumlah sel Vero hidup pada kelompok perlakuan dibagi

jumlah sel Vero hidup pada kelompok kontrol. Persentase kematian sel Vero semakin meningkat dengan meningkatnya konsentrasi ekstrak kloroform daun

(49)

28

Tabel IV. % kematian sel Vero pada berbagai konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air

Konsentrasi % kematian sel Vero

Replikasi I Replikasi II Replikasi III

100 µg/ml 28,38 % 27,03 % 27,03 %

Gambar 8. Grafik konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air (µg/ml) terhadap % kematian sel Vero

Potensi ketoksikan (LC50) sel Vero dapat diperoleh dengan menggunakan analisis probit sehingga dapat dibandingkan dengan LC50 pada sel HeLa. Hasil

pengujian linearitas pada analisis probit sel Vero menunjukkan bahwa grafik

replikasi I linier terhadap persamaan garis y = 2,05x + 0,02 (gambar 9), grafik replikasi II linier terhadap persamaan garis y = 2,01x + 0,10 (gambar 10) dan

0

konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air (ug/ml)

(50)

29

grafik replikasi III linier terhadap persamaan garis y = 2,02x + 0,08 (gambar 11). Harga LC50 ekstrak kloroform daun pacar air terhadap kultur sel Vero adalah

275,4 µg/ml.

Gambar 9. Kurva log konsentrasi terhadap harga probit sel Vero pada replikasi I

Gambar 10. Kurva log konsentrasi terhadap harga probit sel Vero pada replikasi II

0

grafik replikasi I y = 2,05x + 0,02

(51)

30

Gambar 11. Kurva log konsentrasi terhadap harga probit sel Vero pada replikasi III

Untuk mengetahui apakah terdapat perbedaan antara LC50 sel Vero dan LC50 sel HeLa digunakan analisis statistik uji t sampel independen pada taraf

kepercayaan 95%. Hasil yang diperoleh dari uji t sampel independen menunjukkan bahwa terdapat perbedaan bermakna antara LC50 sel Vero dan LC50

sel HeLa (lampiran 6). Oleh karena itu, ekstrak kloroform daun pacar air

memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai agen antikanker.

0 2 4 6 8

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

H

a

rg

a

p

r

o

b

it

Log konsentrasi

(52)

31 BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan

Dari data yang diperoleh dan analisis yang dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa :

1. Ekstrak kloroform daun pacar air memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel

HeLa dan Vero.

2. Harga LC50 ekstrak kloroform daun pacar air terhadap kultur sel HeLa adalah

53,7 µg/ml dan 275,4 µg/ml terhadap kultur sel Vero sehingga esktrak ini memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai agen anti kanker.

B. Saran

Dari hasil penelitian tersebut, maka disarankan :

1. Penelitian lebih lanjut mengenai efek sitotoksisitas fraksi dari ekstrak

kloroform daun pacar air terhadap sel HeLa.

2. Penelitian lebih lanjut mengenai mekanisme kematian sel HeLa oleh ekstrak

(53)

32

DAFTAR PUSTAKA

Adhitama, W., 2009, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air (Impatiens balsamina L.) terhadap Kultur Sel SiHa, Skripsi, Fakultas Farmasi USD, Yogyakarta

Anni, 2009, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air (Impatiens balsamina L.) terhadap Kultur Sel T47D, Skripsi,Fakultas Farmasi USD, Yogyakarta

Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 10-16, Departemen Kesehatan Repubilik Indonesia, Jakarta

Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, edisi V, 7, Departemen Kesehatan Indonesia, Jakarta

Anonim, 2000,Parameter Standart Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, cetakan 1,1-61 departemen kesehatan repubilik Indonesia, Jakarta

Anonim, 2007, 800.000 Orang Indonesia Terserang Kanker Tiap Tahun, http://www.suarapembaruan.com/News/2007/05/14/Utama/ut01.htm, diakses tanggal 1 Agustus 2008

Anonim, 2008a, Cancer, http://www.who.int/cancer/en/, diakses tanggal 1 Agustus 2008

Anonim, 2008b, Angka Kematian Kanker Leher Rahim Masih Tinggi,

http://www.indofamilyhealth.com/index2.php?option=com_content&do_p df=1&id=518,diakses tanggal 20 Maret 2009

Anonim, 2008c, Cell Biology, http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalog Search/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNum=CCL2&Templ ate=cellBiology, diakses tanggal 28 Maret 2009

Anonim, 2008d, Cell Biology, http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalog Search/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNum=CRL-10741& Template=cellBiology,diakses tanggal 10 Mei 2009

Arisandi, Y., dan Andriani, Y., 2006, Khasiat Berbagai Tanaman untuk Pengobatan,Eska media, Jakarta

(54)

33

Balmer, C.M., Valley, A.W., Iannucci, A., 2005, Pharmacotherapy : A Pathophysiologic Approach, sixth edition, 2280, 2285-2286, McGraw-Hill, USA

Diananda, R, 2008, Mengenal Seluk-Beluk Kanker, 28-31, 43-46, Katahati, Yogyakarta

Dolinsky, C., and Christine Hill-Kayser , 2008, Cervical Cancer: The Basics, http://www.oncolink.org/types/article.cfm?c=6&s=17&ss=129&id=8226, diakses tanggal 7 April 2009

Doyle, A., and Griffiths, J.B., 2000, Cell and Tissue Culture For Medical Researh, 49, 155, John Willey and Sons Ltd, New York

Freshney, R.I., 1986,Animal Cell Culture A Practical Approach, second edition, 71-73, IRL Press Ltd, Washington DC.

Freshney, R. I., 2000,Culture f Animal Cells : A Manual of Basic Technique, 14th Edition, 336-338, John Wiley and Sons Inc., New York

Jacoby, W.B., and Pastan, I.H., 1979, Methods in Enzymology Cell Culture, Volume VIII, Academia Press Inc, New York

King, R.J.B., 2000, Cancer Biology, 2ndedition, School of Biological Sciences, University of Surrey, England

Mardiana, L., 2008, Kanker pada Wanita: Seri Agrisehat, 18, Penebar Swadaya, Jakarta

Meyer, B.N., Ferrigni, N.R., Putnam, J.E., Jacobsen, L.B., Nochols, D.E., Mc Laughlin, J.L., 1982, Brine Shrimp: A Convenient General Bioassay for Active Plant Concenient,Planta Medica, 45; 32-34

Rahmawati, N., Katno dan Triyono, A., 2008, Uji Efek Sitotoksik Ekstrak Etanolik Daun Bandotan (Ageratum conzoides L.) terhadap Sel HeLa,

Jurnal Tumbuhan Obat Indonesia, Vol.1, No.1, 51

(55)

34

(56)

35

Lampiran 1. Foto tanaman dan daun pacar air (Impatiens balsaminaL.)

Gambar 12. Foto tanaman pacar air

(57)

36

Lampiran 2. Perhitungan Jumlah kultur sel yang hidup

Tabel V. Data perhitungan jumlah kultur sel HeLa dengan perhitungan langsung

Konsentrasi

Replikasi

I II III

Hidup Mati Hidup Mati Hidup Mati

kontrol 78 0 78 0 78 0

200 µg/ml 8 31 8 33 8 33

175 µg/ml 15 29 15 29 15 29

150 µg/ml 20 27 21 27 21 27

125 µg/ml 25 25 25 25 25 25

100 µg/ml 31 22 30 22 31 22

75 µg/ml 37 19 36 19 37 19

50 µg/ml 42 16 43 15 43 15

(58)

37

Tabel VI . Data perhitungan jumlah kultur sel Vero dengan perhitungan langsung

Jumlah kultur sel yang hidup dan mati dari tiap sumuran dapat dihitung dengan

rumus :

Jumlah sel/sumuran = 4

x

x 10 x 200

Keterangan :

x = jumlah sel hasil perhitungan langsung padahaemocytometer

4 = jumlah bilik dalamhaemocytometer

10 = jumlah volume yang masuk dalam bilikhaemocytometer(10 µl)

200 = jumlah volume total (200 µl) Konsentrasi

Replikasi

I II III

Hidup Mati Hidup Mati Hidup Mati

kontrol 74 0 74 0 74 0

800 µg/ml 3 38 4 37 4 37

700 µg/ml 16 31 17 30 16 29

600 µg/ml 24 24 24 24 24 24

500 µg/ml 28 21 28 21 29 20

400 µg/ml 33 18 34 18 34 18

300 µg/ml 40 16 40 16 40 16

200 µg/ml 46 13 46 12 46 13

(59)

38

Perhitungan jumlah sel HeLa yang hidup pada tiap sumuran 1. Kontrol

Replikasi I = 78₄ x 10 x 200 = 39000

Replikasi II = 78₄ x 10 x 200 = 39000

Replikasi III =78

4 x 10 x 200 = 39000

2. Konsentrasi 200 µg/ml

Replikasi I = 8₄x 10 x 200 = 4000

Replikasi II = 8

4x 10 x 200 = 4000

Replikasi III =8₄x 10 x 200 = 4000

3. Konsentrasi 175 µg/ml Replikasi I = 15

4 x 10 x 200 = 7500

Replikasi II = 15₄ x 10 x 200 = 7500

Replikasi III =15₄ x 10 x 200 = 7500

Replikasi I = 20₄ x 10 x 200 = 10000

Replikasi II = 21₄ x 10 x 200 = 10500

Replikasi III =21₄ x 10 x 200 = 10500

Replikasi I = 25₄ x 10 x 200 = 12500

(60)

39

Replikasi III =25₄ x 10 x 200 = 12500

Replikasi I = 31₄ x 10 x 200 = 15500

Replikasi II = 30₄ x 10 x 200 = 15000

Replikasi III =31₄ x 10 x 200 = 15500

4 x 10 x 200 = 18500

Replikasi II = 36₄ x 10 x 200 = 18000

Replikasi III =37₄ x 10 x 200 = 18500

Replikasi I = 42₄ x 10 x 200 = 21000

Replikasi II = 43

4 x 10 x 200 = 21500

Replikasi III =43₄ x 10 x 200 = 21500

4 x 10 x 200 = 24000

Replikasi II = 49₄ x 10 x 200 = 24500

(61)

40

Perhitungan jumlah sel Vero yang hidup pada tiap sumuran 1. Kontrol

Replikasi I = 74₄ x 10 x 200 = 37000

Replikasi II =74₄ x 10 x 200 = 37000

Replikasi III = 74

4 x 10 x 200 = 37000

Replikasi I = 3₄x 10 x 200 = 1500

Replikasi II = 4₄x 10 x 200 = 2000

Replikasi III =4₄x 10 x 200 = 2000

Replikasi I = 16₄ x 10 x 200 = 8000

Replikasi II = 17₄ x 10 x 200 = 8500

Replikasi III =16₄ x 10 x 200 = 8000

Replikasi I = 24₄ x 10 x 200 = 12000

Replikasi II = 24₄ x 10 x 200 = 12000

Replikasi III =24₄ x 10 x 200 = 12000

Replikasi I = 28₄ x 10 x 200 = 14000

(62)

41

Replikasi III =29

4 x 10 x 200 = 14500

Replikasi I = 33₄ x 10 x 200 = 16500

Replikasi II = 34

4 x 10 x 200 = 17000

Replikasi III =34₄ x 10 x 200 = 17000

4 x 10 x 200 = 20000

Replikasi II = 40₄ x 10 x 200 = 20000

Replikasi III =40

4 x 10 x 200 = 20000

Replikasi I = 46₄ x 10 x 200 = 23000

Replikasi II = 46

4 x 10 x 200 = 23000

Replikasi III =46₄ x 10 x 200 = 23000

4 x 10 x 200 = 26500

Replikasi II = 54₄ x 10 x 200 = 27000

(63)

42

Lampiran 3. Perhitungan persentase kematian kultur sel HeLa dan sel Vero Perhitungan % kematian pada sel HeLa dapat dihitung dengan rumus :

% kematian =

A : jumlah sel HeLa yang hidup pada sumuran kontrol media

B : jumlah sel HeLa yang hidup pada sumuran yang telah diberi perlakuan ekstrak kloroform daun pacar air

(64)

(65)

44

(66)

(67)

46

Lampiran 4. Perhitungan LC50dengan analisis probit dan uji linearitas Perhitungan LC50dengan analisis probit pada sel HeLa

Replikasi I

Tabel VII. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit sel HeLa pada replikasi I

Dengan Regresi linear log konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air terhadap

harga probit didapatkan nilai : a = 2,22; b = 1,61; r = 0,93 Sehingga persamaannya : y = bx + a

y = 1,61 x + 2,22 5 = 1,61 x + 2,22 x = 1,73

No Konsentrasi % kematian Harga probit Log kadar

1 200 µg/ml 89,74 6,28 2,30

2 175 µg/ml 80,77 5,88 2,24

3 150 µg/ml 74,36 5,64 2,18

4 125 µg/ml 67,95 5,47 2,10

5 100 µg/ml 60,26 5,25 2,00

6 75 µg/ml 52,56 5,08 1,88

7 50 µg/ml 46,15 4,90 1,70

(68)

47

Replikasi II

Tabel VIII. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit sel HeLa pada replikasi II

1 200 µg/ml 89,74 6,28 2,30

2 175 µg/ml 80,77 5,88 2,24

3 150 µg/ml 73,08 5,61 2,18

4 125 µg/ml 67,95 5,47 2,10

5 100 µg/ml 61,54 5,31 2,00

6 75 µg/ml 53,85 5,10 1,88

7 50 µg/ml 44,87 4,87 1,70

8 25 µg/ml 37,18 4,67 1,40

(69)

48

Replikasi III

Tabel IX. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit sel HeLa pada replikasi III

1 200 µg/ml 89,74 6,28 2,30

2 175 µg/ml 80,77 5,88 2,24

3 150 µg/ml 73,08 5,61 2,18

4 125 µg/ml 67,95 5,47 2,10

5 100 µg/ml 60,26 5,25 2,00

6 75 µg/ml 52,56 5,08 1,88

7 50 µg/ml 44,87 4,87 1,70

8 25 µg/ml 38,46 4,69 1,40

y = 1,61 x + 2,21 5 = 1,61 x + 2,21 x = 1,73

Rata-rata x =

3

73 , 1 73 , 1 73 ,

1  

= 1,73

(70)

49

Perhitungan LC50dengan analisis probit pada sel Vero Replikasi I

Tabel X. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit sel Vero pada replikasi I

Dengan Regresi linear log konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air terhadap harga probit didapatkan nilai : a = 0,02; b = 2,05 ; r = 0,86

Sehingga persamaannya : y = bx + a

y = 2,05x + 0,02 5 = 2,05x + 0,02

x = 2,43

1 800 µg/ml 95,95 % 6,75 2,90

2 700 µg/ml 78,38 % 5,77 2,85

3 600 µg/ml 67,57 % 5,47 2,78

4 500 µg/ml 62,16 % 5,31 2,70

5 400 µg/ml 55,41 % 5,13 2,60

6 300 µg/ml 45,95 % 4,90 2,48

7 200 µg/ml 37,84 % 4,69 2,30

(71)

50

Replikasi II

Tabel XI Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit sel Vero pada replikasi II

Dengan Regresi linear log konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air terhadap harga probit didapatkan nilai : a = 0,10; b = 2,01; r = 0,88

Sehingga persamaannya : y = bx + a y = 2,01x + 0,10

5 = 2,01x + 0,10

x = 2,44

1 800 µg/ml 94,60 % 6,64 2,90

2 700 µg/ml 77,03 % 5,74 2,85

3 600 µg/ml 67,57 % 5,47 2,78

4 500 µg/ml 62,16 % 5,31 2,70

5 400 µg/ml 54,05 % 5,10 2,60

6 300 µg/ml 45,95 % 4,90 2,48

7 200 µg/ml 37,84 % 4,69 2,30

(72)

51

Replikasi III

Tabel XII. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit sel Vero pada replikasi III

y = 2,02x + 0,08

5 = 2,02x + 0,08 x = 2,44

Rata-rata x =

3

44 , 2 44 , 2 43 ,

2  

=

2,44

LC50= antilog 2,44

= 275,4 µg/ml

1 800 µg/ml 94,60 % 6,64 2,90

2 700 µg/ml 78,38 % 5,77 2,85

3 600 µg/ml 67,57 % 5,47 2,78

4 500 µg/ml 60,81 % 5,28 2,70

5 400 µg/ml 54,05 % 5,10 2,60

6 300 µg/ml 45,95 % 4,90 2,48

7 200 µg/ml 37,84 % 4,69 2,30

(73)

52

Uji linearitas untuk analisis regresi

Tabel XIII. Nilai r (koefisien korelasi) pada level signifikansi 5% dan 1%

Degrees of

(De Muth, 1999)

n = 8

df = n-2 = 8-2 = 6

r tabel (df = 6,α= 0,05) = 0,707

Apabila : r hitung > r tabel, maka linear r hitung < r tabel, maka tidak linear

Uji linearitas pada sel HeLa - Replikasi I

r hitung = 0,93r hitung > r tabel (linear) - Replikasi II

r hitung = 0,94 r hitung > r tabel (linear) - Replikasi III

(74)

53

Uji linearitas pada sel Vero - Replikasi I

r hitung = 0,86r hitung > r tabel (linear) - Replikasi II

r hitung = 0,88r hitung > r tabel (linear) - Replikasi III

(75)

54

Lampiran 5. Analisis statistik uji z pada kelompok kontrol dan perlakuan

1

Kontrol dan konsentrasi 200 µg/µl

1

(76)

55

1

(77)

56

Kontrol dan konsentrasi 75µg/µl

1

(78)

57

Lampiran 6. Analisis statistik uji t sampel independen

H0 = tidak terdapat perbedaan antara LC50 sel Vero dan sel HeLa

H1 = terdapat perbedaan antara LC50 sel Vero dan sel HeLa

(79)

58

(80)

59

BIOGRAFI PENULIS