Aktivitas Antiplasmodium Ekstrak Etanol Daun Kembang Bulan (Tithonia diversifolia (Hemsley) A. Gray) dan Fraksinya secara In Vivo
Nuri1, Wiwien S Utami2, Yunita Armiyanti2
1Fakultas Farmasi Universitas Jember, 2Fakultas Kedokteran Universitas Jember Korespondensi : Nuri ([email protected])
Kembang bulan telah digunakan dalam pengobatan tradisional untuk mengobati malaria. Hasil penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa ekstrak kloroform dan metanol memiliki aktivitas antiplasmodium secara in vitro. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antiplasmodium ekstrak etanol daun kembang bulan dan fraksinya pada mencit yang diinfeksi Plasmodium berghei secara in vivo. Fraksinasi dilakukan dengan metode kromatografi kolom vakum menggunakan fase diam silika gel 60 dan fase gerak n-heksana, kloroform, metanol secara gradien. Fraksinasi menghasilkan 5 fraksi, fraksi kedua dan ketiga mengandung senyawa terpenoid. Hasil uji aktivitas antiplasmodium menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun kembang bulan dapat menghambat pertumbuhan P. berghei dengan IC50 sebesar 113,39 mg/kgbb. Sedangkan fraksi kesatu sampai kelima, pada dosis 2 mg/kgbb dapat menghambat pertumbuhan P. berghei berturut-turut sebesar 52,3 ± 1.36%, 83,5 ± 1.41%, 74,6 ± 1.21%, 70,3 ± 2.19%, dan 44.8 ± 0.29%. Pada dosis tersebut, fraksi kedua yang mengandung senyawa terpenoid memiliki hambatan paling besar.
Kata-kata kunci : kembang bulan, antiplasmodium, invivo, fraksinasi, terpenoid
PENDAHULUAN
Malaria merupakan salah satu penyakit yang menjadi fokus perhatian dunia secara global, mengingat penderita malaria di dunia mencapai 300-500 juta orang (Chowdurry & Bagasra, 2007) dengan tingkat kematian 2-3 juta orang pertahun (Dua et al., 2004). Di Indonesia diperkirakan terdapat 30 juta kasus malaria setiap tahunnya dan kurang lebih hanya 10% saja yang mendapat pengobatan di fasilitas kesehatan. Malaria adalah penyakit yang disebabkan oleh parasit bersel tunggal yang tergolong protozoa obligat intraseluler dari Plasmodium. Plasmodium falciparum merupakan spesies yang paling berbahaya terhadap manusia karena dapat menyebabkan infeksi akut.
senyawa baru antiplasmodium. Salah satu sumber senyawa baru tersebut adalah tanaman obat.
Kembang Bulan (Tithonia diversifolia (Hemsley) A. Gray) merupakan spesies tumbuhan yang termasuk dalam famili Asteraceae. Tumbuhan ini secara empirik telah lama digunakan oleh masyarakat Guatemala, Taiwan, Meksiko dan Nigeria untuk pengobatan malaria (Calzada & Ciccio, 1995). Afiyah (2007) menyatakan bahwa fraksi eter ekstrak metanol daun kembang bulan mempunyai aktivitas antiplasmodium pada P. falciparum strain FCR-3 secara in vitro dengan cara menghambat polimerisasi heme. Goffin et al. (2002) melaporkan bahwa ekstrak kembang bulan secara in vitro mampu melawan tiga strain P. falcifarum dimana dari hasil fraksinasi ekstrak eternya, ditemukan adanya seskuiterpen lakton tagitinin C yang merupakan komponen aktif dalam melawan Plasmodium (IC50= 0,33 µg/mL).
Hasil uji aktivitas antiplasmodium secara in vitro tersebut perlu ditindaklanjuti dengan uji aktivitas in vivo. Hal ini didasarkan kepada kenyataan bahwa tidak semua bahan yang memilki aktivitas antiplasmodium secara in vitro menunjukkan hal yang sama jika diuji secara in vivo. Pada penelitian ini dilakukan uji aktivitas antiplasmodium in vivo ekstrak etanol daun Kembang Bulan beserta fraksi-fraksinya terhadap mencit yang diinfeksi P. berghei.
METODOLOGI Bahan Penelitian
Daun Kembang Bulan dikumpulkan dari tanaman di sekitar kampus Universitas Jember. Proses ekstraksi dan fraksinasi menggunakan etanol redistilasi, n-heksna p.a, kloroform p.a., dan metanol p.a. Hewan coba yang digunakan adalah mencit jantan galur Balb-C yang didapat dari Laboratorium Hewan Fakultas Farmasi Universitas Airlangga Surabaya dengan berat badan 20-30 g. P. berghei yang digunakan adalah strain ANKA yang didapat dari Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.
Alat Penelitian
Rotavapor (Heidolph), timbangan analitik (Ohaus 2140), kolom kromamtografi vakum diameter 5 cm, pipet ukur dan pipet volume, mikroskop (olympus CH 20), spuit disposibel, dan sonde.
Cara Kerja
Daun Kembang Bulan disortasi, dicuci dengan air bersih kemudian ditiriskan selama 1 hari, selanjunya dikeringkan dengan oven pada suhu 40 0C sampai diperoleh simplisia kering. Simplisia kering digiling sampai halus, ditimbang dan dimaserasi dengan etanol selama 24 jam kemudian disaring. Filtrat ditampung kemudian dipekatkan menggunakan rotary evaporator sampai diperoleh ekstrak kental.
Selanjutnya ekstrak kental difraksinasi dengan kromatogafi kolom vakum menggunakan fase diam silika gel 60G dan fase gerak n-heksana, kloroform metanol dengan gradien konsetrasi 5%. Silika gel dimasukkan ke dalam kolom sedikit demi sedikit sambil dihisap dengan pompa sampai setinggi kurang lebih 5 cm. (Coll dan Bowden, 1986). Ekstrak daun Kembang Bulan dimasukkan ke dalam kolom di atas fase diam. Kemudian dilakukan proses fraksinasi.
2. Uji Aktivitas Antiplasmodium
Uji aktivitas antiplasmodium dilakukan dengan tes Peter (Philipson, 1991). Sebelum dilakukan uji semua mencit diinokulasi dengan 0,2 ml darah terinfeksi P. berghei secara intraperitonial. Pada hari berikutnya dilakukan pengambilan darah melalui vena ekor dan diperiksa apakah sudah terinfeksi. Mencit yang telah terinfeksi P. berghei digunakan untuk uji aktivitas antiplasmodium.
Uji aktivitas ekstrak daun Kembang Bulan menggunakan 15 ekor mencit yang dikelompokkan menjadi 5 kelompok. Kelompok I sampai IV diberi ekstrak daun Kembang Bulan dengan dosis berturut-turut 40, 80, 160, dan 320 mg/kgbb secara oral sehari sekali selama 4 hari berturut-turut. Sedangkan kelompok V merupakan kelompok kontrol.
Uji aktivitas fraksi menggunakan 18 ekor mencit yang dikelompokkan menjadi 6 kelompok. Kelompok I sampai V diberi fraksi-fraksi yang berasal dari ekstrak daun Kembang Bulan dengan dosis 2 mg/kgbb secara intraperitonial sehari sekali selama 4 hari berturut-turut. Sedangkan kelompok VI merupakan kelompok kontrol.
Pada hari pertama sampai keempat dilakukan pengambilan darah untuk dibuat hapusan dan diwarnai dengan giemsa 30%, selanjutnya dihitung derajat parasitemianya. parasitemia H4). Pemeriksaan parasitemia dilakukan dengan mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000 kali dan dilakukan per 4000 eritrosit (Fidock et.al, tanpa tahun).
3. Evaluasi Hasil
Evaluasi dilakukan dengan cara menghitung persen penghambatan terhadap pertumbuhan P. berghei tiap-tiap dosis. Persen pertumbuhan dihitung dengan rumus (1).
Persen penghambatan dapat dihitung dengan cara membandingkan pertumbuhan parasit masing-masing kelompok uji dengan kelompok kontrol negatif, sesuai dengan rumus (2).
Pu
% penghambatan = 100% - x 100% ...(2) Pk
Keterangan Pu = % pertumbuhan rata-rata parasit pada tiap dosis kelompok uji Pk = % pertumbuhan rata-rata parasit pada kontrol negatif
Nilai IC50 (hambatan terhadap pertumbuhan 50% parasit) ditentukan menggunakan analisis probit dengan membuat kurva hubungan antara persen penghambatan dengan log dosis.
Hasil dan Pembahasan Hasil Ekstraksi dan Fraksinasi
Serbuk simplisia daun Kembang Bulan sebanyak 270 g dimaserasi dengan etanol 96% redistilasi menghasilkan ekstrak kental sebanyak 44 g atau persentase rendemen sebesar 16,3%. Secara organoleptis ekstrak tersebut berwarna coklat tua, rasanya pahit, dan berbau aromatis. Selanjutnya sebagian ekstrak diuji aktivitasnya sebagai antiplasmodium.
Ekstrak sebanyak 2 g difraksinasi secara kromatografi kolom vakum dengan fase diam silika gel 60 dan fase diam n-heksana, kloroform dan metanol dengan gradiean konsentrasi 5% menghasilkan lima fraksi. Berat masing-masing fraksi disajikan pada Tabel 1 berikut ini.
Tabel 1. Hasil Fraksinasi Ekstrak Daun Kembang Bulan No
.
Fraksi Berat (mg)
1 Fraksi I 21
2 Fraksi II 24
3 Fraksi III 196.2
4 Fraksi IV 676.7
5 Fraksi V 195.6
Total Berat 1113.5
hanya1,1135 g. Hal ini disebabkan ada sebagian kandungan kimia ekstrak yang terikat kuat pada fase diam silika gel.
Pengelompokan fraksi-fraksi menjadi lima fraksi berdasarkan pada kesamaan profil kromatografi lapis tipis (KLT). Profil KLT kelima fraksi tersebut, pada lempeng KLT silika gel GF254 dan eluen n-heksana, etilasetat (2 : 1) dapat dilihat pada Gambar 1 berikut ini.
Gambar 1. Profil KLT Fraksi I – V menggunakan fase diam silika gel GF254 dan eluen n-heksana, etilasetat (2 : 1). Fraksi II dan III mengandung terpenoid (1 dan 2), fraksi IV mengandung flavonoid (3, 4, dan 5).
Hasil Uji Aktivitas Antiplasmodium
Hasil uji aktivitas ekstrak etanol daun Kembang Bulan dengan dosis 40, 80, 160 dan 320 mg/kgbb pada mencit yang diinfeksi P. berghei menunjukkan bahwa pertumbuhan parasit dapat dihambat sebagaimana tersaji pada gambar 2 berikut ini.
F.I F.II F.III F.IV F.V 1
3
4
Ho H1 H2 H3 H4
Pengaruh Pemberian Ekstrak terhadap Pertumbuhan P. berghei
40 mg/kgbb
Gambar 2. Pengaruh pemberian ekstrak etanol daun Kembang Bulan dengan dosis 40, 80, 160 dan 320 mg/kgbb pada mencit yang diinfeksi P. berghei
Pada Gambar 2 di atas dapat dilihat bahwa pertumbuhan P. berghei pada mencit yang diberi perlakuan ekstrak daun Kembang Bulan dosis 40, 80, 160 dan 320 mg/kgbb lebih rendah dibandingkan dengan kontrol. Dengan demikian dapat dikatakan ekstrak daun Kembang Bulan dapat menghambat pertumbuhan P. berghei. Persentase penghambatan masing-masing dosis disajikan pada Tabel 2 berikut ini.
Tabel 2. Persentase Penghambatan Ekstrak Etanol Daun Kembang Bulan Dosis 40, 80, 160, dan 320 mg/kgbb pada Mencit yang Diinfeksi P. berghei Ekstrak Etanol Daun Kembang Bulan Dosis 40, 80, 160, dan 320 mg/kgbb pada Mencit yang Diinfeksi P. berghei
No. Dosis (mg/kgbb) % penghambatan
2 80 36,3
3 160 66,3
4 320 81.3
Tabel 2 menunjukkan bahwa semakin tinggi dosis yang diberikan maka semakin besar persentase penghambatan terhadap pertumbuhan P. Berghei. Berdasarkan Tabel 2 dapat dihitung dosis yang dapat menghambat pertumbuhan parasit sebesar 50% (IC50)menggunakan analisis probit. Hasil analisis probit menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun Kembang Bulan memiliki nilai IC50 sebesar 113,39 mg/kgbb. Menurut Munoz et al. (2000) aktivitas antiplasmodium ekstrak secara in vivo dapat dikategorikan menjadi moderat (IC50<500 mg/kgbb), baik (IC50<250 mg/kgbb), dan sangat baik (IC50<100 mg/kgbb). Berdasarkan kategorin tersebut maka ekstrak etanol daun Kembang Bulan memiliki aktivitas antiplasmodium dengan kategori baik. Menurut Goffin et al. (2002) senyawa dalam daun Kembang Bulan yang memiliki aktivitas antiplasmodium adalah terpenoid, yang terdapat pada fraksi II dan fraksi III (lihat Gambar 1).
Hasil uji aktivitas antiplasmodium fraksi-fraksi yang dihasilkan dari ekstrak daun Kembang Bulan menunjukkan bahwa fraksi I – V pada dosis 2 mg/kgbb dapat menghambat pertumbuhan P. berghei. Hal tersebut ditunjukkan pada Gambar 3 berikut ini.
H0 H1 H2 H3 H4
Pengaruh Pemberian Fraksi terhadap Pertumbuhan P. berghei
F-I F-II F-III F-IV F-V
Gambar 3. Pengaruh pemberian fraksi I – V dengan dosis 2 mg/kgbb pada mencit yang diinfeksi P. berghei
I II III IV V
Tabel 2. Persentase Penghambatan Fraksi I - V pada Mencit yang Diinfeksi P. berghei Ekstrak Etanol Daun Kembang
Replikasi
Persentase Penghambatan
Fraksi 1 Fraksi 2 Fraksi 3 Fraksi 4 Fraksi 5
Replikasi 1 53.7 83.7 76 69 44.5
Replikasi 2 52.1 82 73.9 69 45
Replikasi 3 51 84.8 73.9 72.8 45
Rata-rata 52.3 83.5 74.6 70.3 44.8
Standar
Deviasi 1.36 1.41 1.21 2.19 0.29
Persentase penghambatan tersebut disajikan juga dalam bentuk diagram batang sebagaimana pada Gambar 4 berikut ini.
Gambar 4. Hambatan fraksi I – V dengan dosis 2 mg/kgbb terhadap pertumbuhan P. berghei
Berdasar data pada Tabel 3 dan Gambar 4 di atas dapat dinyatakan bahwa fraksi-fraksi tersebut dengan dosis 2 mg/kgbb mampu menghambat pertumbuhan P. berghei berturut-turut dari yang paling besar fraksi II, fraksi III, fraksi IV, fraksi I, dan yang terkecil fraksi V. Fraksi II dan fraski III, dua fraksi dengan aktivitas terbesar, berdasarkan profil KLT (Gambar 1) mengandung terpenoid. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Goffin et al. (2002) bahwa senyawa yang memiliki aktivitas antiplasmodium secara in vitro adalah terpenoid. Fraksi yang memiliki aktivitas terbesar ketiga adalah fraksi IV yang mangandung flavonoid. Menurut Gunawan dkk. (2006), sikloheterofilin suatu senyawa flavonoid mampu menyebabkan penundaan perkembangan P. falciparum dari stadium cincin menjadi stadium tropozoit. Selain itu juga dapat menyebabkan perkembangan menjadi skizon menjadi abnormal.
Daun Kembang Bulan memiliki mekanisme antimalaria yang berhubungan dengan aktivitas penghambatan polimerasi heme. Ketika parasit dalam fase eritrositik, parasit akan memecah hemoglobin menjadi heme dan globin. Globin akan digunakan oleh parasit untuk sintesis protein sedangkan heme bersifat toksik bagi parasit sehingga parasit akan mengubah heme menjadi hemozoin (merupakan polimer heme) yang tidak toksik bagi parasit. Daun Kembeng Bulan akan menghambat polimerasi heme sehingga heme yang toksik akan mematikan parasit (Afiyah, 2007).
Kesimpulan
o Ekstrak etanol daun Kembang Bulan memiliki aktivitas antiplasmodial yang baik dengan IC50 sebesar 113,39 mg/kgbb
o Fraksi hasil pemisahan ekstrak etanol daun Kembang Bulan yang paling aktif sebagai antiplasmodial adalah fraksi II yang mengandung terpenoid
Ucapan Terima Kasih
Peneliti mengucapkan terimakasih kepada Badan Litbangkes Depkes RI yang telah memberikan dana penelitian melalui Dana Risbin Iptekdok 2011 sehingga penelitian ini dapat dilaksanakan.
Afiyah, R. 2007. Aktivitas Antiplasmodium Fraksi Larut Eter Ekstrak metanol Daun Kembang Bulan (Tithonia diversifolia (Hemsley) A. Gray) pada Plasmodium falciparum secara in vitro. Tesis. Prodi Kedokteran Dasar dan Biomedis. Yogyakarta: Universitas Gajah Mada.
Calzada JG & Ciccio JF. 1978. Aislamiento de Tirotundina a partir de Tithonia diversifolia (Hemsl.) Gray. Rev. Latinoamer. Quim. 9.
Chowdurry, K. & O. Bagasra. 2007. An edible vaccine for malaria using transgenic tomatoes of varying sizes, shapes and colors to carry different antigent. Medical Hypotheses 68 (1)
Coll, J. C. dan Bowden, B. F. 1986. The Application of Vacuum Liquid Chromatography to The Separation of Terpene Mixtures. Journal of Natural Products 49 (5).
Depkes RI. 2006. Pedoman Penatalaksanaan Kasus Malaria di Indonesia. Direktorat Jendral Pengendalian Penyakit dan Penyehatan lingkungan: Jakarta.
Depkes RI. 2009. Penghentian Monoterapi Artemisinin Mencegah Penyebarluasan Resistensi.
http://www.depkes.go.id/popups/newswindow .php?id=157&print=print.
Dua, V.K., V.P. Ojha, R. Roy, et al., 2004. Anti-malarial activity of some xanthones isolated from the roots of Andrographis paniculata. Journal of Ethnopharmacology 95: 247-251.
Fidock, D.A., Rosenthal, P.J., Croft, S.L., et al., tanpa tahun. Antimalarial drug discovery: efficacy models for compound screening (supplementary document).
Goffin E., Ziemons, E., De Mol, P., et al.. 2002. In Vitro Antiplasmodial Activity of Tithonia diversifolia and Identification of Its Main Active Constituent : Tagitinin C. Planta Med. 68(6).
Gunawan, A., Nuri, Arwati, H. dkk., 2006. Hambatan Perkembangan Stadium Plasmodium falciparum Akibat Pemberian Isolat Sikloheterofilin dari Kulit Batang Artocarpus champeden Spreng. Indonesian Journal of Tropoical Medicine 17(3).
Munoz, V., Souvain, M., and Bourdy, G. 2000. The Search for Natural Bioactive Compounds Through a Multidisciplinary Approach in Bolivia: Part II. Antimalarial activity of some plants used by Mosetena Indians. J. Ethnopharmacol 139-55.
