Buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur. Persiapan contoh. Serbuk contoh

(1)

(2)

Lampiran 1 Bagan alir penelitian

Ekstraksi air dan etanol Serbuk contoh

Persiapan contoh

Penetapan kadar air

Buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur

pencucian perajangan pengeringan penggilingan

Ekstrak air dan etanol

Uji fitokimia _{Uji toksisitas dengan larva udang}

Uji inhibisi ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas

Uji flavonoid total ekstrak dengan daya inhibisi tertinggi (berdasarkan hasil uji fitokimia)

(3)

Lampiran 2 Bagan alir ekstraksi air

Serbuk contoh

Maserasi dengan air (1:8) 24 jam

disaring

Lampiran 3 Bagan alir ekstraksi etanol

dipekatkan Filtrat

Ekstrak air

Serbuk contoh

Maserasi dengan atanol 70% (1:8) 24 jam

disaring Filtrat

dipekatkan

(4)

Lampiran 4 Bagan alir penentuan nilai LC50 ekstrak dengan menggunakan larva udang

air laut + telur udang (ditetaskan 48 jam) 0,1000 g ekstrak

Dilarutkan dengan air laut

Ditera dengan air laut hingga 25 mL

1

2

Ekstrak 4000 ppm

10 ekor larva udang + 1500 µl air laut + 500 µl larutan ekstrak (1000 ppm, triplo)

10 ekor larva udang + 1950 µl air laut + 50 µl larutan ekstrak (100 ppm, triplo)

3 10 ekor larva udang + 1995 µl air laut + 5 µl larutan ekstrak (10 ppm, triplo)

4 10 ekor larva udang + 2000 µl air laut (kontrol, triplo)

2

Dibiarkan 24 jam

Analisis menggunakan Probit Analysis Methode Jumlah larva udang yang mati dihitung

₁ ₃ ₄

(5)

Lampiran 5 Bagan alir uji in vitro inhibisi ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas + 0,25 mL larutan Na-dietilditiokarbamat + 4 mL kloroform-heptana (1:1) dikocok + 2,5 mL pereaksi tembaga dikocok selama 3 menit disentrifusa selama 10 menit + kloroform 3 mL

dikocok

disentrifusa selama 5 menit • ekstrak contoh

• 15 µL minyak wijen • 10 µL albumin 10% (b/v) • µL lipase pankreas murni Ditera dengan buffer fosfat pH 8 hingga 1 mL

inkubasi 45 menit, T=40○_C

3,0 mL lapisan kloroform 1,0 mL lapisan kloroform

Larutan berwarna kuning

serapan diukur pada λ = 435 nm Aktivitas hidrolitik lipase

dan daya inhibisi ekstrak

Lampiran 6 Prosedur pembuatan pereaksi tembaga (250 mL)

Sebanyak 71,25 g NaCl dilarutkan dalam 150 mL akuades, kemudian ditempatkan pada labu takar 250 mL. Setelah itu, ke dalam larutan NaCl ditambahkan 6,04 g Cu(NO3)2.3H2O dan 21,25 g

trietanolamin, lalu diaduk hingga larut. Selanjutnya ditambahkan 0,7125 mL asam asetat glasial dan ditera dengan akuades.

(6)

Lampiran 7 Bagan alir penentuan kadar flavonoid total

ditampung dalam labu takar 50 mL ditera dengan etil asetat

20 mL ekstrak + 20 mL akuades + 15 mL etil asetat

Standar kuersetin

0; 0,5; 2,5; 5,0; 7,5; 10 ppm

ditimbang setara dengan 200 mg serbuk

filtrat residu + 20 mL aseton

filtrat tera dengan aseton

sistem hidrolisis (refluks) 30 menit • 1,0 mL larutan HMT 0,5% b/v • 20 mL aseton

• 2 mL HCl 25%

labu takar 100 mL dihidrolisis

ekstraksi dalam corong pisah

ekstrak dengan daya inhibisi tertinggi

10 mL fraksi etil asetat pada labu takar 25 mL + 1 mL AlCl3 2% (b/v)

ditera dengan asam asetat glasial 5% (v/v) ekstrak

fraksi etil asetat

larutan flavonoid contoh

(7)

Lampiran 8 Penentuan kadar air Kadar air asam gelugur

Bobot cawan Bobot cawan + Bobot contoh Bobot contoh Kadar air kosong (g) contoh (g) basah (g) kering (g) (%)

19,8685 22,9149 3,0464 22,3549 18,4 19,0184 22,0287 3,0103 21,4687 18,6 23,9589 26,9966 3,0377 26,4141 19,2 Rerata 18,7 Kadar air lengkuas

27,2390 29,2443 2,0053 29,0480 9,79

34,5572 36,5686 2,0114 36,3759 9,58

24,6942 26,7002 2,0060 26,5115 9,41

Rerata 9,59

Kadar air kencur

30,2507 32,2531 2,0024 32,0797 8,66 34,5716 36,5724 2,0008 36,4007 8,58 28,6343 30,6352 2,0009 30,4642 8,55 Rerata 8,60 Perhitungan: Kadar air (%) = 100% basah sampel Bobot kering sampel bobot basah sampel Bobot × −

(8)

Lampiran 9 Rendemen berbagai ekstrak contoh dan perhitungan

Contoh Ekstrak Bobot awal (g) Bobot ekstrak (g) Rendemen (%) Air 100,0570 19,2366 23,7 Asam gelugur Etanol 100,0174 21,3037 26,2 Air 100,0086 9,1294 10,1 Lengkuas Etanol 100,0134 19,0875 21,1 Air 100,0129 4,3682 4,78 Kencur Etanol 100,0251 6,9090 7,56 Perhitungan: Rendemen ekstrak =

(g)

contoh

bobot

(g)

ekstrak

bobot

× 100% × faktor koreksi =

(g)

contoh

bobot

(g)

ekstrak

bobot

× 100% × _⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ −kadar air 100 100

Contoh perhitungan (ekstrak air asam gelugur ): Rendemen ekstrak =

(g)

contoh

bobot

(g)

ekstrak

bobot

× 100% × ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ −kadar air 100 100 =

g

0570

100,

g

19,2366

× 100% × ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ −18,7 100 100 = 23,7 %

(9)

Lampiran 10 Aktivitas ekstrak terhadap larva A. Salina setelah 24 jam

Jumlah larva udang yang mati Contoh Ekstrak Konsentrasi _(ppm)

Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3

Blanko 0 0 0 0 Asam Air 10 0 0 0 gelugur 100 3 3 2 1000 10 10 10 Etanol 10 2 2 4 100 4 5 5 1000 10 10 10 Lengkuas Air 10 0 0 0 100 3 3 3 1000 9 9 8 Etanol 10 1 1 2 100 1 1 3 1000 3 4 3 Kencur Air 10 0 0 0 100 2 1 1 1000 5 4 3 Etanol 10 1 1 2 100 9 10 10 1000 10 10 10

(10)

Lampiran 11 Data dan perhitungan daya inhibisi ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas

Konsentrasi Absorbans Aktivitas enzim Daya inhibisi

Contoh Ekstrak (ppm) 1 2 3 Rerata (µmol/L.menit) (%) Kontrol (-) 0 1,548 1,587 1,573 1,569 4,82 × 104 _0,0 Asam Air 100 0,819 1,055 0,889 0,921 2,83 × 104 _41,3 gelugur 150 0,993 0,979 0,765 0,912 2,80 × 104 _41,9 200 1,255 1,255 1,260 1,257 3,86 × 104 _19,9 250 1,175 1,389 1,313 1,292 3,97 × 104 _17,6 300 1,190 1,167 0,923 1,093 3,36 × 104 _30,3 Etanol 100 1,051 0,849 0,854 0,918 2,82 × 104 _41,5 150 0,123 0,265 0,257 0,215 6,60 × 103 _86,3 200 1,130 1,063 1,370 1,188 3,35 × 104 _24,3 250 0,758 0,673 1,075 0,835 2,57 × 104 _46,7 300 0,812 1,161 1,278 1,084 3,33 × 104 _30,9 Lengkuas Air 100 1,210 1,221 0,951 1,127 3,46 × 104 _28,2 150 1,102 0,920 1,169 1,064 3,27 × 104 _32,2 200 1,367 1,437 1,404 1,403 4,31 × 104 _10,6 250 1,156 1,154 1,001 1,104 3,39 × 104 _29,7 300 1,345 1,181 1,143 1,223 3,76 × 104 _22,0 Etanol 100 0,633 0,845 0,945 0,808 2,48 × 104 _48,5 150 1,425 1,090 1,087 1,201 3,69 × 104 _23,4 200 0,473 0,768 0,820 0,687 2,11 × 104 _56,2 250 1,851 1,602 1,407 1,620 4,98 × 104 _-3,3 300 1,580 1,839 1,813 1,744 5,36 × 104 _-11,2 Kencur Air 100 1,086 1,410 1,012 1,169 3,59 × 104 _25,5 150 1,602 1,565 1,757 1,641 5,04 × 104 _-4,6 200 1,341 1,407 1,253 1,334 4,10 × 104 _14,9 250 1,053 0,953 1,010 1,005 3,09 × 104 _35,9 300 1,374 1,073 0,957 1,135 3,48 × 104 _27,8 Etanol 100 1,319 1,160 1,125 1,201 3,69 × 104 _23,4 150 1,616 1,750 1,593 1,653 5,08 × 104 _-5,4 200 1,460 1,218 1,313 1,330 4,09 × 104 _15,1 250 1,188 1,318 0,970 1,159 3,56 × 104 _26,1 300 1,132 0,779 1,025 0,979 3,01 × 104 _37,6 Kontrol (+) 100 1,397 1,413 1,399 1,403 4,31 × 104 _10,6 150 1,821 1,783 1,959 1,854 5,70 × 104 _-18,3 200 2,009 1,951 1,987 1,982 6,09 × 104 _-26,3 250 1,900 2,036 1,876 1,937 5,95 × 104 _-23,4 300 1,757 1,818 1,577 1,717 5,27 × 104 _-9,3

(11)

Lanjutan Lampiran 11

Perhitungan aktivitas enzim lipase

Aktivitas enzim lipase pankreas (µmol/l,menit) = t) waktu(meni 1 diukur yang zat volume k pengekstra zat volume (L) enzim volume 1 dar tan s μmol B A_× _× _× _× Keterangan: A = absorbans sampel

B = absorbans standar (asam oleat) = 0,041

µmol standar = jumlah standar oleat yang digunakan (4,25 µmol) Bobot standar = 0,0155 g [standar] = mL 1,25 g 0,0155 _× 1L mL 103 ×

g

1 mg

10

3 = 1,24 × 103_ppm

[standar] setelah pengenceran ke dalam 1,00 mL V1M1 = V2M2 1,24 × 103_{ppm × 97,0 µL = 1,00 mL × M} 2 M2 = 1,20 × 103 ppm µmol standar = L 1 mg 10 1,20_× 3 × 1mL × mL 10 1L 3 × _282,4614_g mol 1 _× mg 10 g 1 3 × ₁_mol mol 106

_μ

= 4,25 µmol Volume enzim = 100 µL = 100 µL × L 10 L 1 6

μ

_{= 1,00 × 10}-4_L

Volume zat pengekstrak = volume kloroform-heptana (1:1) = 4,0 mL Volume zat yang diukur = 3,0 mL

Waktu = waktu inkubasi = 45 menit

Perhitungan daya inhibisi ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas Daya inhibisi = blanko enzim Aktivitas ekstrak enzim Aktivitas -blanko enzim Aktivitas _{× 100%}

(12)

Lampiran 12 Perhitungan statistik ekstrak buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur a. Ekstrak air

Daya inhibisi (%) ekstrak air asam gelugur dan lengkuas terhadap aktivitas lipase pankreas Ekstrak air

Ulangan

Asam Gelugur Lengkuas Kencur ∑Yj

1 36,8 29,8 33,0 99,6

2 37,6 41,4 39,3 118,3

3 51,3 25,6 35,9 112,8

∑Yi 125,7 96,8 108,2 330,7

Analisis sidik ragam daya inhibisi ekstrak air terhadap aktivitas xantin oksidase Sumber keragaman db JK KT F-hitung F-tabel

Perlakuan 2 141,27 70,64 1,478 5,143

Galat 6 286,69 47,78

Total 8 427,96

H0 : μ1 = μ2 = μ3 (semua perlakuan memberikan daya inhibisi yang sama terhadap aktivitas lipase

pankreas)

H1 : μi ≠ μj (paling sedikit ada satu pasang perlakuan yang memberikan daya inhibisi yang berbeda

terhadap aktivitas lipase pankreas) FK = r p Y..2 ⋅ = (3 3) ) 7 , 330 ( 2 × = 12151,39 JKP = FK r 2 Yi − Σ ₌

⎟⎟

⎠

⎞

⎜⎜

⎝

⎛

+

3

2 ,

108

8 ,

96

7 ,

125

2 2 2 – 12151,39 = 141,27 JKT =

ΣΣ

Yij2 – FK = (36,82 + … + 35,92) – 12151,39 = 427,96 JKG = JKT – JKP = 416 – 138,67 = 286,69 KTP = dbp JKP₌ 2 27 , 141 _{= 70,64} KTG = dbg JKG₌ 6 69 , 286 _{= 47,78} F hitung = KTG KTP ₌ 78 , 47 64 , 70 _{= 1,478} F0,05(2,6) = 5,143

Fhitung < Ftabel Æ Kesimpulan : TerimaH0 (berarti ekstrak air asam gelugur, lengkuas, dan

kencur memberikan pengaruh daya inhibisi yang tidak berbeda nyata terhadap aktivitas lipase pankreas)

b. Ekstrak etanol (1 faktor daya inhibisi tertinggi)

Daya inhibisi (%) ekstrak etanol terhadap aktivitas lipase pankreas Ekstrak etanol

Ulangan

Asam Gelugur Lengkuas Kencur ∑Yj

1 92,1 69,5 26,9 188,5

2 82,9 50,4 49,8 183,1

3 83,4 47,1 33,8 164,3

(13)

Analisis sidik ragam daya inhibisi ekstrak etanol terhadap aktivitas lipase pankreas Sumber keragaman db JK KT F-hitung F-tabel

Perlakuan 2 3713,4 1856,7 17,910 5,143

Galat 6 622,02 103,67

Total 8 4335,42

Fhitung > Ftabel Æ Kesimpulan : TolakH0 (berarti ekstrak etanol asam gelugur, lengkuas, dan

kencur memberikan pengaruh daya inhibisi yang berbeda nyata terhadap aktivitas lipase pankreas)

c. Uji statistika daya inhibisi maksimum dari ekstrak asam gelugur, lengkuas, dan kencur terhadap kontrol negatif dan positif

Perlakuan:

I : tanpa penambahan ekstrak (kontrol negatif)

II : penambahan ekstrak etanol buah asam gelugur 150 ppm III : penambahan ekstrak etanol lengkuas 200 ppm

IV : penambahan ekstrak etanol kencur 300 ppm V : penambahan Xenical®_{100 ppm (kontrol positif)}

Daya inhibisi (%) sample terhadap aktivitas lipase pankreas Perlakuan Ulangan I II III IV V ΣYj 1 0,00 92,1 69,5 26,9 9,9 198,4 2 0,00 82,9 50,4 49,8 8,8 191,9 3 0,00 83,4 47,1 33,8 9,7 174,0 ΣYi 0,00 258,4 167,0 110,5 28,4 564,3 µ 0,00 86,1 55,7 36,8 9,5 188,2

Analisis sidik ragam daya inhibisi sampel terhadap aktivitas lipase pankreas Sumber keragaman db JK KT F-hitung F-tabel

Perlakuan 4 14663,15 3665,79 58,868 3,478

Galat 10 622,71 62,271

Total 14 15285,86

H0 : μ1 = μ2 = μ3 = μ4 = µ5 (semua perlakuan memberikan daya inhibisi yang sama terhadap

aktivitas lipase pankreas)

H1 : μi ≠ μj (paling sedikit ada satu pasang perlakuan yang memberikan daya inhibisi yang berbeda

terhadap aktivitas lipase pankreas) FK = r p Y..2 ⋅ = (5 3) ) 3 , 564 ( 2 × = 21228,97 F hitung = KTG KTP ₌ 271 , 62 79 , 3665 _{= 58,868} F0,05(4,10) = 3,478

Fhitung > Ftabel Æ Kesimpulan : Tolak H0 (berarti perlakuan memberikan pengaruh daya

inhibisi yang berbeda nyata terhadap aktivitas lipase pankreas)

(14)

Untuk melihat perlakuan mana yang memberikan pengaruh yang berbeda, dilakukan uji Duncan. Uji Duncan

Rp = r0,05 (p,dbg)

r KTG Tolak Ho jika |ýi - ýj| > Rp R2 = 3,15 × 4,94 = 15,57

R3 = 3,30 × 4,94 = 16,30

R4 = 3,37 × 4,94 = 16,65

R5 =3,43 × 4,94 = 16,94

Urutan perlakuan: ý1 = 0 (kontrol negatif)

ý2 = 10,6 (kontrol positif)

ý3 = 37,6 (etanol kencur)

ý4 = 56,2 (etanol lengkuas)

ý5 = 86,3 (etanol asam gelugur)

|ý1 – ý2| = 10,6 < R2 Æ Terima Ho* |ý1 – ý3| = 37,6 > R3 Æ Tolak Ho |ý1 – ý4| = 56,2 > R4 Æ Tolak Ho |ý1 – ý5| = 86,3 > R5 Æ Tolak Ho |ý2 – ý3| = 27,0 > R3 Æ Tolak Ho |ý2 – ý4| = 45,6 > R4 Æ Tolak Ho |ý2 – ý5| = 75,7 > R5 Æ Tolak Ho |ý3 – ý4| = 18,6 > R4 Æ Tolak Ho |ý3 – ý5| = 48,7 > R5 Æ Tolak Ho |ý4 – ý5| = 30,1 > R4 Æ Tolak Ho

Keterangan: * = tidak berbeda nyata

Kesimpulan: perlakuan yang berbeda nyata terdapat pada interaksi antara 1 kontrol negatif dengan ekstrak etanol kencur

2 kontrol negatif dengan ekstrak etanol lengkuas 3 kontrol negatif dengan ekstrak etanol asam gelugur 4 kontrol positif dengan ekstrak etanol kencur 5 kontrol positif dengan ekstrak etanol lengkuas 6 kontrol positif dengan ekstrak etanol asam gelugur 7 ekstrak etanol kencur dengan ekstrak etanol lengkuas 8 ekstrak etanol kencur dengan ekstrak etanol asam gelugur 9 ekstrak etanol lengkuas dengan ekstrak etanol asam gelugur

(15)

Lampiran 13 Kurva estimasi berbagai ekstrak contoh dan kontrol positif

Contoh Ekstrak Kurva Persamaan garis R²

Asam gelugur Air Logaritma y = -18,36 ln(x) + 126,19 0,4845 Linier y = -0,0925 + 48,714 0,4088 Kuadratik y = 0,0013x² - 0,5928x + 92,49 0,6702 Power y = 654,31x--0,6002_0,4181 Exponensial y = 51,401e-0,003x_0,3401 Etanol Logaritma y = -19,215ln(x) + 146,39 0,1185 Linier y = -0,1216x + 70,249 0,1576 Kuadratik y = - 0,001x² + 0,2981x + 33,527 0,1986 Power y = 340,34x-0,4018_0,1314 Exponensial y = 67,411e-0,0024x_0,1567

Lengkuas Air Logaritma y = --6,1578 ln(x) + 56,715 0,0954 Linier y = -0,0299x + 30,498 0,0746 Kuadratik y = 0,0005x² - 0,229x + 47,925 0,1471 Power y = 92,654x-0,2676_0,0654 Exponensial y = 28,837e-0,0012x_0,0407 Etanol Logaritma y = -50,053 ln(x) + 284,41 0,5210 Linier y = -0,2925x + 81,245 0,5912 Kuadratik y = - 0,0017x² + 0,369x + 23,361 0,6573 Kencur Air Logaritma y = 13,183 ln(x) – 49,002 0,1344 Linier y = 0,09x + 1,9087 0,2083 Kuadratik y = 0,0013x² - 0,4292x + 47,344 0,3599 Etanol Logaritma y = 17,521 ln(x) - 72,219 0,2256 Linier y = 0,1195x - 4,5228 0,3486 Kuadratik y = - 0,002x² - 0,6914x + 66,432 0,6997 Kontrol (+) Logaritma y = -21 ln(x) + 96,425 0,3756 Linier y = -0,09x + 4,6473 0,2294 Kuadratik y = 0,0628x² - 1,1973x + 101,54 0,9881

(16)

Lampiran 14 Data dan perhitungan penentuan kadar flavonoid total Larutan Konsentrasi _(ppm) Absorbans

Blanko 0,00 0,000 Standar 1 0,00 0,003 Standar 2 0,50 0,055 Standar 3 2,50 0,334 Standar 4 5,00 0,557 Standar 5 7,50 0,863 Standar 6 10,00 1,048

Ekstrak etanol lengkuas 0,24 0,050 Ekstrak etanol kencur 0,13 0,038

y = 0.1064x + 0.0245 R2 = 0.9932 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 2 4 6 8 10 [Kuersetin] (ppm) Ab so r b a n s 12

Kurva standar kuersetin. Perhitungan kadar flavonoid total

Persamaan regresi linear y = 0,0245 + 0,1064 x, R² = 99,32% [Flavonoid] etanol lengkuas =

0,1064 0,0245

-0,050 _{= 0,24 ppm}

Kadar flavonoid total ekstrak etanol lengkuas = mL 3 10 1L mg 38,20 21,1% mL 20 mL 100 mL 10 mL 50 mL 25 L 1 mg 0,24 × × × × × = 0,08 %

[Flavonoid] etanol kencur =

0,1064 0,0245

-0,038 _{= 0,13 ppm}

Kadar flavonoid total ekstrak etanol kencur = mL 3 10 1L mg 13,82 7,56% mL 20 mL 100 mL 10 mL 50 mL 25 L 1 mg 0,13 × × × × × = 0,04 %