PERBANDINGAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI ANTARA
EKSTRAK ETANOL DARI SERBUK DAN SERBUK NANO
DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav.)
TERHADAP BAKTERI Staphylococcus aureus
DAN Escherichia coli
SKRIPSI
Diajukan untuk melengkapi salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana FaadFakultas Farmasi
Suar
OLEH:
RAHMI TAMA WARDHANI
NIM 121524079
PROGRAM EKSTENSI SARJANA FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
PERBANDINGAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI ANTARA
EKSTRAK ETANOL DARI SERBUK DAN SERBUK NANO
DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav.)
TERHADAP BAKTERI Staphylococcus aureus
DAN Escherichia coli
SKRIPSI
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara
Diajukan untuk melengkapi salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana FaadFakultas Farmasi
Suar
OLEH:
RAHMI TAMA WARDHANI
NIM 121524079
PROGRAM EKSTENSI SARJANA FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
PENGESAHAN SKRIPSI
PERBANDINGAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI ANTARA
EKSTRAK ETANOL DARI SERBUK DAN SERBUK NANO
DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav.)
TERHADAP BAKTERI Staphylococcus aureus
DAN Escherichia coli
OLEH:RAHMI TAMA WARDHANI NIM 121524079
Dipertahankan di Hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara
Pada Tanggal : 11 Februari 2015
Disetujui Oleh:
Pembimbing I, Panitia penguji,
Prof. Dr. Karsono, Apt. Prof. Dr. Urip Harahap, Apt.
NIP 195409091982011001 NIP 195301011983031004
Prof. Dr. Karsono, Apt.
Pembimbing II, NIP 195409091982011001
Popi Patilaya, S.Si., M.Sc., Apt. Dr. Masfria, M.S., Apt. NIP 197812052010121004 NIP 195707231986012001
iii
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis ucapkan kepada Allah SWT atas segala limpahan
berkat, rahmat dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian
dan penyusunan skripsi ini. Skripsi ini disusun untuk melengkapi salah satu syarat
mencapai gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera
Utara, yang berjudul “Perbandingan Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol
Nano Simplisia dengan Serbuk Simplisia Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz
& Pav.) Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.
Pada kesempatan ini, penulis dengan segala kerendahan hati mengucapkan
terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Bapak Prof. Dr. Karsono, Apt., dan
Popi Patilaya, S.Si, M.Sc., Apt. selaku pembimbing yang telah membimbing dan
memberikan petunjuk serta saran-saran selama penelitian hingga selesainya
skripsi ini. Bapak Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt., selaku Dekan Fakultas
Farmasi Universitas Sumatera Utara Medan, yang telah memberikan fasilitas
sehingga penulis dapat menyelesaikan pendidikan. Bapak Prof. Dr. Urip Harahap,
Apt., Ibu Dr. Masfria, M.S., Apt., serta Bapak Drs. Awaluddin Saragih, M.Si.,
Apt., selaku dosen penguji yang telah memberikan kritik, saran dan arahan kepada
penulis dalam menyelesaikan skripsi ini. Bapak dan Ibu staf pengajar Fakultas
Farmasi USU Medan yang telah mendidik selama perkuliahan dan Popi Patilaya,
S.Si, M.Sc., Apt. selaku penasehat akademik yang selalu memberikan bimbingan
kepada penulis selama perkuliahan. Dra. Erly Sitompul, M.Si., Apt., selaku
Kepala Laboratorium Mikrobiologi USU yang telah memberikan izin
menggunakan fasilitas untuk penulis sehingga dapat mengerjakan dan
iv
Penulis juga ingin menyampaikan rasa terima kasih serta penghargaan
yang tulus dan tak terhingga kepada orangtua tersayang Ayahanda Teguh Taufik
dan Ibunda Emma Suryati atas doa dan dukungan baik moril maupun materil,
kepada kedua adik tersayang Restu Dwiadha Meitiarini dan M. Ridho Saputra,
serta kerabat-kerabat, sahabat, dan teman-teman Farmasi Ekstensi angkatan 2012
atas motivasi dan segala bantuan dalam penyelesaian skripsi ini.
Akhir kata penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi ilmu
pengetahuan khususnya di bidang Farmasi.
Medan, Maret 2015 Penulis,
v
PERBANDINGAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI ANTARA EKSTRAK ETANOL DARI SERBUK DAN SERBUK NANO
DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav.) TERHADAP BAKTERI Staphylococcus aureus
DAN Escherichia coli
ABSTRAK
Latar Belakang: Sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) merupakan salah satu tanaman yang potensial untuk dikembangkan sebagai antimikroba. Perkembangan ilmu dan teknologi seperti teknologi nanopartikel memungkinkan sampel kering diserbukkan dengan ukuran nano (< 1µm). Dengan demikian, luas kontak permukaan partikel menjadi lebih besar sehingga dapat meningkatkan kelarutan zat aktif dan aktivitas antibakteri semakin kuat.
Tujuan: Penelitian ini dilakukan untuk membandingkan aktivitas antibakteri
antara ekstrak etanol dari serbuk dan serbuk nano daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.).
Metode: Daun sirih merah dicuci bersih, ditiriskan lalu dikeringkan pada suhu 40oC. Sebagian diserbukkan dengan blender dan sebagian lain dengan teknologi nano High Energy Ballmill. Pembuatan ekstrak etanol dilakukan dengan metode maserasi. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi agar. Pencadang kertas yang mengandung ekstrak etanol daun sirih merah dengan konsentrasi 5, 6, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, dan 500 mg/ml diletakkan di atas permukaan media biakan bakteri, diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 - 24 jam. Setelah diinkubasi, diameter hambat pertumbuhan bakteri diukur dengan menggunakan jangka sorong. Analisis statistika dilakukan menggunakan perangkat lunak SPSS dengan uji T dan dilanjutkan dengan anava dua arah pada tingkat kepercayaan 95%.
Hasil: Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol dari serbuk dan serbuk nano daun sirih merah memiliki aktivitas antibakteri. Konsentrasi hambat minimum ekstrak etanol dari serbuk nano daun sirih merah terhadap bakteri
S. aureus yaitu pada konsentrasi 5 mg/ml dan bakteri E. coli pada konsentrasi 6 mg/ml. Sedangkan Konsentrasi hambat minimum ekstrak etanol dari serbuk daun sirih merah terhadap bakteri S. aureus yaitu pada konsentrasi 6 mg/ml dan bakteri E. coli pada konsentrasi 10 mg/ml. Analisis statistika menunjukkan adanya perbedaan signifikan antara nilai rata-rata diameter daya hambat pada ekstrak etanol dari serbuk dan serbuk nano daun sirih merah (p < 0,05). Amoksisilin 30 µg/ml sebagai kontrol positif menghambat pertumbuhan bakteri S.aureus dan
E. coli dengan diameter daya hambat masing-masing 15,13 mm dan 14,23 mm.
Kesimpulan: Ekstrak etanol nano daun sirih merah memiliki aktivitas antibakteri lebih besar daripada aktivitas antibakteri ekstrak etanol serbuk daun sirih merah.
vi
THE COMPARISON TEST OF ANTIBACTERIAL ACTIVITY BETWEEN ETHANOL EXTRACT OF POWDER AND NANO POWDER OF
Piper crocatum Ruiz & Pav. LEAVES AGAINST
Staphylococcus aureus AND Escherichia coli
ABSTRACT
Background: Piper crocatum Ruiz & Pav. is one of potential plant to be developed as an antimicrobial. The development of science and technology such as nanoparticle technology allows to produce the dried material of plants with nano size (< 1μm). Thus, the surface area of dried plant materials to be more large, it can increase the solubility of active compounds and the antibacterial activity is more potent.
Objective: This study was conducted to compare the antibacterial activity of ethanolic extract of nano powder and powder of Piper crocatum againts
Staphylococcus aureus and Escherichia coli.
Methods: P. crocatum leaves were washed, drained and dried at 40oC. A part of the dried plant material were reduced to powder with electrical grinder and the other part with nano technology. Some are powdered in a blender and the rest with nanotechnology High Energy Ballmill. The ethanol extract of plant was made by maceration. Antibacterial activity test was performed by agar diffusion. Paper disks contained the ethanol extract with certain concentrations of 5, 6, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, and 500 mg/ml was placed on the surface of the bacterial culture medium, and then incubated at 37°C for 18 - 24 hours. After incubation, the diameter of inhibition was measured using calipers. Statistical analysis was performed using SPSS software with T test followed by two-way anova at 95% confidence level.
Results: The results showed that the ethanol extract of nano powder and powder of red betel leaves to have antibacterial activity againts S. aureus and E.coli. Minimum inhibitory concentration of the ethanol extract of Piper crocatumnano powder againts S. aureus is at a concentration of 5 mg/ml and E. coli at a concentration of 6 mg/ml. While minimum inhibitory concentration of the ethanol extract of P. crocatumpowder againts S. aureus is at a concentration of 6 mg/ml and E. coli at a concentration of 10 mg/ml. Statistical analysis showed a significant difference between the average value of the diameter of inhibition of the ethanol extract of nano powder and powder of P. crocatum (p < 0.05). Amoxicillin 30 µg/ml as a positive control inhibited the growth of S. aureus and
E. coli. with the inhibition zone of 15.13 mm and 14.23 mm, respectively.
Conclusion: The ethanol extract of P. crocatum nano powder have a greater antibacterial activity than the extract of P.crocatum powder.
vii
DAFTAR ISI
Halaman
JUDUL ... i
LEMBAR PENGESAHAN ... ii
KATA PENGANTAR ... iii
ABSTRAK ... v
ABSTRACT ... vi
DAFTAR ISI ... vii
DAFTAR TABEL ... xi
DAFTAR GAMBAR ... xii
DAFTAR LAMPIRAN ... xiii
BAB I PENDAHULUAN ... 1
1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Kerangka Pikir Penelitian ... 3
1.3 Perumusan Masalah ... 4
1.4 Hipotesis ... 4
1.5 Tujuan Penelitian ... 4
1.6 Manfaat Penelitian ... 5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 6
2.1 Uraian Bakteri ... 6
2.1.1 Bakteri Staphylococcus aureus ... 6
2.1.2 Bakteri Escherichia coli ... ... 7
2.1.3 Fase pertumbuhan bakteri ... 8
viii
2.2.1 Nama daerah ... 9
2.2.2 Morfologi tumbuhan ... 9
2.2.3 Taksonomi tanaman sirih merah ... 10
2.2.4 Kandungan kimia sirih merah ... 10
2.2.5 Manfaat sirih merah ... 10
2.3 Ekstraksi ... 11
2.4 Metode Isolasi Biakan Bakteri ... 13
2.5 Pengujian Aktivitas Antimikroba ... 13
2.6 Amoksisilin ... 14
2.7 Nanopartikel ... 14
2.4.1 Permukaan nanopartikel ... 15
2.4.2 Teknologi nano ... 15
BAB III METODE PENELITIAN ... 17
3.1 Alat dan Bahan ... 17
3.1.1 Alat-alat ... 17
3.1.2 Bahan ... ... 18
3.1.3 Mikroba uji ... 18
3.2 Pengambilan dan Pengolahan Sampel ... 18
3.2.1 Pengambilan sampel ... 18
3.2.2 Identifikasi sampel ... 19
3.2.3 Pengolahan sampel ... 19
3.2.4 Pemeriksaan nanopartikel daun sirih merah ... 19
ix nano simplisia dan ekstrak etanol serbuk daun sirih merah ... 21
3.7 Penyiapan Larutan Uji Ekstrak Etanol Nano Simplisia dan Serbuk Simplisia Daun Sirih Merah dengan Berbagai Konsentrasi ... 22
3.8 Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Nano Simplisia dan Serbuk Simplisia Daun Sirih Merah Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus ... 22
3.9 Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Nano Simplisia dan Serbuk Simplisia Daun Sirih Merah Terhadap Bakteri Escherichia coli ... 23
3.10 Analisis Statistika ... 24
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 25
4.1 Identifikasi Tumbuhan ... 25
x
4.3 Pemeriksaan Partikel Nano dan Serbuk Simplisia Daun
Sirih Merah ... 25
4.4 Pemeriksaan Organoleptis Ekstrak Etanol Simplisia dan Serbuk Daun Sirih Merah ... 26
4.5 Reidentifikasi Bakteri ... 27 4.6 Aktivitas Antibakteri Kontrol Positif dan Negatif Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli ... 28
4.7 Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Nano Simplisia dan Ekstrak Etanol Serbuk Simplisia Daun Sirih Merah Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli ... 29
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 35
5.1 Kesimpulan ... 35
5.2 Saran ... 35
DAFTAR PUSTAKA ... 36
xi
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 2.1 Permukaan molekul pada partikel ... 15
Tabel 4.1 Pemeriksaan organoleptis ekstrak etanol nano simplisia dan serbuk simplisia daun sirih merah ... 27
Tabel 4.2 Diameter daya hambat ekstrak etanol nano simplisia dan ekstrak etanol serbuk simplisia daun sirih merah terhadap pertumbuhan Staphylococcus aureus ... 29
xii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1.1 Kerangka pikir penelitian ... 3
Gambar 4.1 Pemeriksaan partikel daun sirih merah di bawah mikroskop
pemindai elektron (A: nano simplisia, B: serbuk simplisia) ... 26
Gambar 4.2 Koloni bakteri (A: Staphylococcus aureus,
B: Escherichia coli) ... 28
Gambar 4.3 Pengaruh konsentrasi ekstrak etanol nano simplisia dan ekstrak etanol serbuk simplisia daun sirih merah terhadap aktivitas antibakteri pada Staphylococcus aureus ... 32
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1 Hasil identifikasi tumbuhan ... 39
Lampiran 2 Tumbuhan daun sirih merah ... 40
Lampiran 3 Simplisia daun sirih merah ... 41
Lampiran 4 Rendemen dan susut pengeringan . ... 42
Lampiran 5 Bagan kerja pengolahan serbuk simplisia daun sirih merah ... 43
Lampiran 6 Bagan kerja pengolahan nano simplisia daun sirih merah .. 44
Lampiran 7 Bagan pengujian aktivitas antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus ... 45
Lampiran 8 Bagan pengujian aktivitas antibakteri terhadap bakteri Escherichia coli ... 46
Lampiran 9 Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol nano simplisia daun sirih merah terhadap bakteri Staphylococcus aureus.. ... 47
Lampiran 10 Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol serbuk simplisia daun sirih merah terhadap bakteri Staphylococcus aureus ... 48
Lampiran 11 Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol nano simplisia daun sirih merah terhadap bakteri
Lampiran 14 Data analisis statistika normalitas ... 52
Lampiran 15 Data analisis statistika uji T ... 53
xiv
Lampiran 17 Diameter daya hambat ekstrak etanol nano simplisia dan
serbuk simplisia daun sirih merah terhadap bakteri
Staphylococcus aureus ... ... 56
Lampiran 18 Diameter daya hambat ekstrak etanol nano simplisia dan serbuk simplisia daun sirih merah terhadap bakteri
Escherichia coli ... 57
v
PERBANDINGAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI ANTARA EKSTRAK ETANOL DARI SERBUK DAN SERBUK NANO
DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav.) TERHADAP BAKTERI Staphylococcus aureus
DAN Escherichia coli
ABSTRAK
Latar Belakang: Sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) merupakan salah satu tanaman yang potensial untuk dikembangkan sebagai antimikroba. Perkembangan ilmu dan teknologi seperti teknologi nanopartikel memungkinkan sampel kering diserbukkan dengan ukuran nano (< 1µm). Dengan demikian, luas kontak permukaan partikel menjadi lebih besar sehingga dapat meningkatkan kelarutan zat aktif dan aktivitas antibakteri semakin kuat.
Tujuan: Penelitian ini dilakukan untuk membandingkan aktivitas antibakteri
antara ekstrak etanol dari serbuk dan serbuk nano daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.).
Metode: Daun sirih merah dicuci bersih, ditiriskan lalu dikeringkan pada suhu 40oC. Sebagian diserbukkan dengan blender dan sebagian lain dengan teknologi nano High Energy Ballmill. Pembuatan ekstrak etanol dilakukan dengan metode maserasi. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi agar. Pencadang kertas yang mengandung ekstrak etanol daun sirih merah dengan konsentrasi 5, 6, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, dan 500 mg/ml diletakkan di atas permukaan media biakan bakteri, diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 - 24 jam. Setelah diinkubasi, diameter hambat pertumbuhan bakteri diukur dengan menggunakan jangka sorong. Analisis statistika dilakukan menggunakan perangkat lunak SPSS dengan uji T dan dilanjutkan dengan anava dua arah pada tingkat kepercayaan 95%.
Hasil: Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol dari serbuk dan serbuk nano daun sirih merah memiliki aktivitas antibakteri. Konsentrasi hambat minimum ekstrak etanol dari serbuk nano daun sirih merah terhadap bakteri
S. aureus yaitu pada konsentrasi 5 mg/ml dan bakteri E. coli pada konsentrasi 6 mg/ml. Sedangkan Konsentrasi hambat minimum ekstrak etanol dari serbuk daun sirih merah terhadap bakteri S. aureus yaitu pada konsentrasi 6 mg/ml dan bakteri E. coli pada konsentrasi 10 mg/ml. Analisis statistika menunjukkan adanya perbedaan signifikan antara nilai rata-rata diameter daya hambat pada ekstrak etanol dari serbuk dan serbuk nano daun sirih merah (p < 0,05). Amoksisilin 30 µg/ml sebagai kontrol positif menghambat pertumbuhan bakteri S.aureus dan
E. coli dengan diameter daya hambat masing-masing 15,13 mm dan 14,23 mm.
Kesimpulan: Ekstrak etanol nano daun sirih merah memiliki aktivitas antibakteri lebih besar daripada aktivitas antibakteri ekstrak etanol serbuk daun sirih merah.
vi
THE COMPARISON TEST OF ANTIBACTERIAL ACTIVITY BETWEEN ETHANOL EXTRACT OF POWDER AND NANO POWDER OF
Piper crocatum Ruiz & Pav. LEAVES AGAINST
Staphylococcus aureus AND Escherichia coli
ABSTRACT
Background: Piper crocatum Ruiz & Pav. is one of potential plant to be developed as an antimicrobial. The development of science and technology such as nanoparticle technology allows to produce the dried material of plants with nano size (< 1μm). Thus, the surface area of dried plant materials to be more large, it can increase the solubility of active compounds and the antibacterial activity is more potent.
Objective: This study was conducted to compare the antibacterial activity of ethanolic extract of nano powder and powder of Piper crocatum againts
Staphylococcus aureus and Escherichia coli.
Methods: P. crocatum leaves were washed, drained and dried at 40oC. A part of the dried plant material were reduced to powder with electrical grinder and the other part with nano technology. Some are powdered in a blender and the rest with nanotechnology High Energy Ballmill. The ethanol extract of plant was made by maceration. Antibacterial activity test was performed by agar diffusion. Paper disks contained the ethanol extract with certain concentrations of 5, 6, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, and 500 mg/ml was placed on the surface of the bacterial culture medium, and then incubated at 37°C for 18 - 24 hours. After incubation, the diameter of inhibition was measured using calipers. Statistical analysis was performed using SPSS software with T test followed by two-way anova at 95% confidence level.
Results: The results showed that the ethanol extract of nano powder and powder of red betel leaves to have antibacterial activity againts S. aureus and E.coli. Minimum inhibitory concentration of the ethanol extract of Piper crocatumnano powder againts S. aureus is at a concentration of 5 mg/ml and E. coli at a concentration of 6 mg/ml. While minimum inhibitory concentration of the ethanol extract of P. crocatumpowder againts S. aureus is at a concentration of 6 mg/ml and E. coli at a concentration of 10 mg/ml. Statistical analysis showed a significant difference between the average value of the diameter of inhibition of the ethanol extract of nano powder and powder of P. crocatum (p < 0.05). Amoxicillin 30 µg/ml as a positive control inhibited the growth of S. aureus and
E. coli. with the inhibition zone of 15.13 mm and 14.23 mm, respectively.
Conclusion: The ethanol extract of P. crocatum nano powder have a greater antibacterial activity than the extract of P.crocatum powder.
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Penyakit akibat infeksi bakteri masih merupakan masalah serius bagi
negara-negara di dunia termasuk Indonesia. Selama beberapa tahun terakhir,
terjadi peningkatan kasus penyakit infeksi seiring dengan bertambahnya populasi
manusia. Penyakit infeksi bakteri pada manusia umumnya disebabkan oleh bakteri
Gram positif dan Gram negatif contohnya bakteri Staphylococcus aureus dan
Escherichia coli.(Nwinyi, et al., 2009).
Staphylococcus aureus adalah penyebab infeksi pada kulit yang paling
sering seperti jerawat dan bisul. Pada saluran pernapasan, bakteri ini dapat
menyebabkan pneumonia. Jika bakteri ini menyebar luas dalam darah dapat
mengakibatkan endokarditis, osteomielitis hematogen akut, meningitis, atau
infeksi paru (Todd, 1999).
Selain bakteri Staphylococcus aureus, Escherichia coli juga dapat
menyebabkan berbagai penyakit infeksi. Escherichia coli adalah bakteri yang
banyak ditemukan di usus besar manusia sebagai flora normal. Bakteri ini dapat
menyebabkan penyakit diare dan infeksi saluran kemih (Karsinah, et al., 1994).
Penyakit infeksi karena bakteri diobati menggunakan antibiotik, seperti
amoksisilin. Namun dikarenakan memiliki efek samping, maka diperlukan obat
alternatif yang lebih aman dan berkhasiat.
Sejak ratusan tahun yang lalu, nenek moyang kita telah memanfaatkan
2
sekarang ada. Merebaknya kecenderungan kembali ke alam (back to nature)
semakin mendorong penelitian-penelitian tentang khasiat tanaman obat, salah
satunya adalah sirih (Sudewo, 2005). Sirih memiliki beberapa varietas yaitu sirih
berdaun hijau, hitam, merah, kuning, dan perak. Diantara kelima varietas tersebut,
sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) merupakan salah satu varietas yang
potensial untuk dikembangkan sebagai antimikroba (Sudewo, 2005).
Secara tradisional sirih diolah dengan merebus bagian daun dalam air,
kemudian air rebusan digunakan untuk kumur, mencegah bau mulut,
menyembuhkan sariawan dan sakit gigi, dan membersihkan bagian tubuh lain.
Daun sirih dapat juga dilumatkan kemudian ditempelkan pada luka (Damayanti,
2006). Kandungan kimia yang terdapat dalam daun sirih merah adalah flavonoid,
alkaloid, tannin, triterpenoid/steroid, saponin dan minyak atsiri. Senyawa kimia
tersebut memiliki efek antibakteri (Utami dan Desty, 2013).
Menurut penelitian Juliantina, et al., (2009) uji antibakterial ekstrak etanol
sirih merah terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dengan metode
dilusi, memberikan nilai KHM yaitu 25% terhadap bakteri Staphylococcus aureus
dan 6,25% terhadap bakteri Escherichia coli. Minyak atsiri daun sirih merah
mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Bacillus cereus dengan KHM 1% dan
Pseudomonas aeruginosa 0,75% (Ngaisah, 2010). Oleh karena itu, potensi sirih
merah perlu terus dikembangkan untuk menanggulangi penyakit infeksi.
Pemanfaatan tanaman obat untuk mengobati penyakit infeksi umumnya
masih dilakukan secara konvensional. Masyarakat biasanya menggunakan bahan
kering (simplisia) dengan cara diserbukkan lalu diseduh. Perkembangan ilmu dan
3
dengan ukuran lebih kecil (< 1 µm) (Buzea, et al., 2007). Penerapan teknologi
nano ini dimaksudkan untuk meningkatkan kemampuan aktivitas dari
senyawa-senyawa fitokimia sirih merah. Dalam ukuran nano, luas kontak permukaan
partikel menjadi lebih besar yang dapat meningkatkan jumlah zat aktif yang
terisolasi lebih banyak sehingga aktivitas antibakteri semakin kuat (Kammona dan
Costas, 2012).
Berdasarkan uraian di atas maka peneliti melakukan penelitian
perbandingan uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol nano simplisia dengan serbuk
simplisia daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) terhadap bakteri
Staphylococcus aureus dan Escherichia coli secara mikrobiologi menggunakan
metode difusi agar dengan pelarut etanol 70%.
1.2 Kerangka Pikir Penelitian
Kerangka pikir penelitian dideskripsikan pada Gambar 1.1.
Gambar 1.1 Kerangka pikir penelitian
Variabel Bebas Variabel Terikat Parameter
Konsentrasi hambat
minimum (KHM) Diameter daya
hambat Ekstrak etanol
4
1.3 Perumusan Masalah
Berdasarkan uraian di atas, maka rumusan masalah dalam penelitian ini
adalah sebagai berikut:
a. apakah ekstrak etanol nano simplisia dan ekstrak etanol serbuk simplisia daun
sirih merah memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus
aureus dan Escherichia coli?
b. Bagaimana perbandingan aktivitas antibakteri ekstrak etanol nano
simplisiadengan ekstrak etanol serbuk simplisia daun sirih merah terhadap
bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli?
1.4 Hipotesis
Berdasarkan rumusan masalah di atas, maka hipotesis penelitian adalah
sebagai berikut:
a. ekstrak etanol nano simplisia dan ekstrak etanol serbuk simplisia daun sirih
merah memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus
dan Escherichia coli.
b. aktivitas antibakteri ekstrak etanol nano simplisia daun sirih merah lebih
tinggi daripada ekstrak etanol serbuk simplisianya terhadap bakteri
Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.
1.5 Tujuan Penelitian
Adapun tujuan dari penelitian ini adalah:
a. mengetahui aktivitas antibakteri dari ekstrak etanol nano simplisia dan ekstrak
etanol serbuk simplisia daun sirih merah terhadap pertumbuhan bakteri
5
b. mengetahui perbandingan aktivitas antibakteri antara ekstrak etanol nano
simplisia dengan ekstrak etanol serbuk simplisia daun sirih merah terhadap
pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.
1.6 Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat dimanfaatkan sebagai rujukan dan sumber
informasi bagi masyarakat tentang aktivitas antibakteri simplisia daun sirih merah
yang dibuat dengan teknologi nano terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan
6
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Uraian Bakteri
Bakteri berasal dari kata “bakterion” (bahasa Yunani) yang berarti tongkat
atau batang. Sekarang nama itu dipakai untuk menyebut mikroorganisme yang
bersel satu, berkembang biak dengan pembelahan diri, dan berukuran kecil
sehingga hanya dapat dilihat dengan mikroskop.
Berdasarkan bentuknya bakteri dapat dibagi atas tiga golongan yitu
golongan coccus (berbentuk bola), basil (berbentuk tongkat pendek), dan
golongan spiral.
Berdasarkan perbedaannya dalam menyerap warna, bakteri dibagi atas dua
golongan yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif. Bakteri Gram positif
menyerap zat warna pertama yaitu kristal violet yang menyebabkannya berwarna
ungu, sedangkan bakteri Gram negatif menyerap zat warna kedua yaitu safranin
dan menyebabkan warna merah muda (Dwidjoseputro, 1978).
Bakteri Gram positif memiliki kandungan peptidoglikan yang tinggi (dapat
mencapai 50%) dibandingkan bakteri Gram negatif (sekitar 10%). Sebaliknya
kandungan lipida pada dinding sel bakteri Gram negatif yaitu sekitar 11 - 12%,
kandungan ini lebih tinggi daripada dinding sel bakteri Gram positif
(Jawetz, et al., 2007).
2.1.1 Bakteri Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus adalah bakteri Gram positif, berbentuk bulat atau
7
bergerombol seperti buah anggur, bersifat aerob atau anaerob fakultatif, tahan
hidup dalam lingkungan yang mengandung garam dengan konsentrasi tinggi,
tidak membentuk spora. Tumbuh optimal pada suhu 28 - 38oC atau sekitar 35oC
dan pH 7,4. Staphylococcus aureus tergolong flora normal kulit dn selaput lendir
manusia. Setiap jaringan dapat diinfeksi oleh Staphylococcus aureus dan
menyebabkan timbulnya penyakit dengan tanda yang khas, yaitu produksi nanah,
peradangan, nekrosis, dan pembentukan abses (Jawetz, et al., 2007).
Menurut Dwidjoseputro (1978), taksonomi bakteri Staphylococcus aureus
sebagai berikut:
Divisi : Protophyta
Kelas : Schizomycetes
Bangsa : Eubacteriales
Suku : Micrococcaceae
Marga : Staphylococcus
Jenis : Staphylococcus aureus
2.1.2 Bakteri Escherichia coli
Bakteri Escherichia coli adalah bakteri Gram negatif, berbentuk batang
(basil), dan termasuk golongan Enterobacteriaceae. Bakteri ini merupakan flora
yang paling banyak pada usus manusia dan hewan, hidup aerob atau anaerob
fakultatif. Bakteri ini dapat berubah menjadi patogen bila hidup di luar usus.
Escherichia coli tumbuh pada suhu antara 10 - 40oC, dengan suhu optimum 37oC.
Bakteri ini relatif sangat sensitif terhadap panas dan dapat diinaktifkan pada suhu
8
Menurut Dwidjoseputro (1978), taksonomi bakteri Escherichia coli
sebagai berikut:
Divisi : Protophyta
Kelas : Schizomycetes
Bangsa : Eubacteriales
Suku : Enterobacteriaceae
Marga : Escherichia
Jenis : Escherichia coli
Pada umumnya bakteri ini hidup pada tinja, dapat menyebabkan masalah
kesehatan pada manusia seperti diare, muntaber dan masalah pencernaan lainnya.
2.1.3 Fase pertumbuhan bakteri
Bakteri mengalami pertumbuhan yang dapat dibagi dalam 4 fase menurut
(Pratiwi, 2008) yaitu:
a. fase lag
Merupakan fase adaptasi, yaitu fase penyesuaian mikroorganisme pada
suatu lingkungan baru. Ciri fase lag adalah tidak adanyapeningkatan jumlah sel,
yang ada hanyalah peningkatan ukuran sel. Lama fase lag tergantung pada kondisi
dan jumlah awal mikroorganisme serta medi pertumbuhan.
b. fase log (ekponensial)
Fase log merupakan fase dimana mikroorganisme tumbuh dan membelah
pada kecepatan maksimum, tergantung pad genetika mikroorganisme, sifat media,
dan kondisi pertumbuhan. Sel-sel terbentuk dengan laju konstan dan massa yang
bertambah secara eksponensial. Hal yang dapat menghambat laju
9 c. fase tetap
Pada fase ini terjadi kompetisi antara bakteri untuk memperoleh nutrisi
dari media untuk tetap hidup. Sebagian bakteri mati sedangkan yang lain tumbuh
dan membelah sehingga jumlah sel bakteri yang hidup menjadi tetap.
d. fase kematian
Pada fase ini, sel bakteri akan mati lebih cepat daripada terbentuknya sel
baru. Laju kematian mengalami percepatan yang eksponensial.
2.2 Uraian Tumbuhan
2.2.1 Nama daerah
Nama daerah: sirih talan (Maluku), jahe sunti (Jawa), sereh, sireh, canbei,
seureuh, sedah, ganjang, bolu, ani-ani, amu atau reman (Sudewo, 2005).
2.2.2 Morfologi tumbuhan
Tanaman sirih biasanya mencapai tinggi 15 m. Batang sirih berwarna
coklat kehijauan, berbentuk bulat, beruas dan merupakan tempat keluarnya akar.
Tanaman sirih mempunyai banyak jenis yang beragam, seperti sirih jingga, sirih
hitam, sirih kuning, sirih hijau dan sirih merah (Damayanti dan Mulyono, 2006).
Tanaman sirih merah (Piper crocatum) termasuk dalam famili Piperaceae,
tumbuh merambat dengan bentuk daun menyerupai hati dan bertangkai serta
tumbuh berselang-seling dari batangnya. Daunnya berwarna merah keperakan dan
mengkilap saat terkena cahaya. Bagian ujung dari daun sirih merah meruncing.
Permukaan daunnya tidak merata. Sirih merah tumbuh merambat di pagar atau di
10
memiliki daun yang berwarna merah keperakan, bila daunnya sobek maka akan
berlendir serta aromanya lebih wangi (Manoi, 2007).
Tanaman sirih merah menyukai tempat teduh, berhawa sejuk dengan sinar
matahari 60 - 75%, dapat tumbuh subur dan bagus pada daerah pengunungan. Bila
tumbuh pada daerah panas dan sinar matahari langsung, batangnya akan cepat
mengering, selain itu warna merah daunnya cepat pudar (Manoi, 2007).
2.2.3 Taksonomi tanaman sirih merah
Menurut Hidayat (2013), taksonomi tanaman sirih merah adalah sebagai
berikut:
Divisi : Spermatophyta (tumbuhan berbunga)
Sub divisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledonae (berkeping dua/dikotil)
Bangsa : Piperales
Suku : Piperaceae (suku sirih-sirihan)
Marga : Piper
Jenis : Piper crocatum Ruiz & Pav
2.2.4 Kandungan kimia sirih merah
Sirih merah mengandung flavonoid, alkaloid, tannin, saponin dan minyak
atsiri. Senyawa-senyawa tersebut diketahui memiliki aktivitas antibakteri (Utami
dan Desty, 2013).
2.2.5 Manfaat sirih merah
Tanaman sirih merah mempunyai banyak manfaat dalam pengobatan
tradisional, mempunyai potensi menyembuhkan berbagai penyakit seperti diabetes
11
radang mata, keputihan, maagh, kelelahan, nyeri sendi, dan menghaluskan kulit.
Selain itu sirih merah dapat berfungsi sebagai antibakteri (Damayanti dan
Mulyono, 2006).
2.3 Ekstraksi
Ekstraksi merupakan suatu proses penarikan senyawa kimia dari jaringan
tumbuhan dengan menggunakan penyari tertentu. Terdapat beberapa macam
metode ekstraksi, diantaranya adalah maserasi, perkolasi dan sokletasi (Depkes
RI, 1979).
Ekstraksi dapat dilakukan dengan beberapa metode, yaitu:
a. Maserasi
Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan
pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur
ruangan (kamar). Secara teknologi termasuk ekstraksi dengan prinsip metode
pencapaian konsentrasi pada keseimbangan. Maserasi kinetik berarti dilakukan
pengadukan yang kontinu (terus-menerus). Remaserasi berarti dilakukan
pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat pertama
dan seterusnya (Ditjen POM, 2000).
b. Perkolasi
Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai
sempurna yang umum dilakukan pada temperatur ruangan. Prosesnya terdiri dari
tahapan pengembangan bahan, tahap maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya
(penetasan/penampungan ekstrak), terus-menerus sampai diperoleh perkolat yang
12 c. Refluks
Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya,
selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan
adanya pendingin balik. Umumnya dilakukan pengulangan proses pada residu
pertama sampai 3 - 5 kali sehingga dapat termasuk proses ekstraksi sempurna
(Ditjen POM, 2000).
d. Sokletasi
Sokletasi adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang
umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan
jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik (Ditjen POM,
2000).
e. Digesti
Digesti adalah maserasi kinetik (dengan adanya pengadukan kontinu pada
temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan (kamar), yaitu secara umum
dilakukan pada temperatur 40 - 50o C (Ditjen POM, 2000).
f. Infus
Infus adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur penangas air
(bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih), temperatur terukur pada
suhu 96 - 98oC selama waktu tertentu (15 - 20 menit) (Ditjen POM, 2000).
g. Dekok
Dekok adalah infus pada waktu yang lebih lama (≥ 30 menit) dan
13
2.4 Metode Isolasi Biakan Bakteri
Menurut Jawetz, et al., (2013), isolasi biakan bakteri terbagi tiga metode
yaitu:
a. Cara gores
Ose yang telah steril dicelupkan ke dalam suspensi mikroorganisme yang
diencerkan, lalu dibuat serangkaian goresan sejajar yang tidak saling menutupi di
atas permukaan agar yang telah padat.
b. Cara sebar
Suspensi mikroorganisme yang telah diencerkan dipindahkan ke bagian
lempeng agar, kemudian disebarkan secara merata pada permukaan agar dengan
menggukan batang kaca bengok yang steril.
c. Cara tuang
Pengenceran inokulum diletakkan pada cawan petri steril dan dicampurkan
dengan medium agar cair, lalu dibiarkan memadat. Koloni yang berkembang akan
tertanam di dalam media tersebut.
2.5 Pengujian Aktivitas Antimikroba
Penentuan kepekaan bakteri terhadap antimikroba pada dasarnya dapat
dilakukan melalui dua cara, yaitu:
a. Metode dilusi
Metode ini mengukur kadar hambat minimum (KHM) dan kadar bunuh
minimum (KBM). Metode ini menggunakan antimikroba dengan kadar yang
menurun secara bertahap, dengan media cair dan padat. Bakteri ini diinokulasi ke
14
dengan kadar yang menghambat atau mematikan. Uji kepekaan cara dilusi
menggunakan 2 cara yaitu dengan menggunakan tabung reaksi dan microdilution
plate (Pratiwi, 2008).
b. Metode difusi
Metode yang paling sering digunakan dan biasanya menggunakan cakram.
Ada beberapa jenis cakram yaitu cakram kertas, cakram silinder dan punch hole.
Cakram tersebut yang berisi sejumlah tertentu obat ditempatkan pada permukaan
medium padat yang sebelumnya telah diinokulasi bakteri uji pada
permukaannnya. Setelah diinkubasi, diameter zona hambatan sekitar cakram
dipergunakan untuk mengukur kekuatan hambatan obat terhadap mikroorganisme
yang uji (Pratiwi, 2008).
2.6 Amoksisilin
Amoksisilin merupakan antibiotik golongan β – laktam (turunan penisilin).
Amoksisilin adalah antibiotik dengan spektrum luas, digunakan untuk pengobatan
infeksi pada saluran napas, saluran empedu, dan saluran seni, gastroenteritis,
meningitis dan infeksi, seperti demam tipoid (Siswandono dan Soekardjo, 2000).
Mekanisme kerja amoksisilin sebagai antibiotik yaitu sebagai inhibitor sintesis
dinding sel bakteri dengan cara memecah enzim dinding sel dan menghambat
enzim dalam sintesis dinding sel (Stringer, 2006).
2.7 Nanopartikel
Nanopartikel didefinisikan sebagai disepersi partikulat atau
15
merancang nanopartikel sebagai sistem pemberian adalah untuk mengontrol
ukuran partikel dan pelepasan bahan aktif secara farmakologik untuk mencapai
tempat tindakan spesifik obat pada laju (Gupta, 2006).
2.7.1 Permukaan nanopartikel
Pelepasan zat aktif dipengaruhi oleh ukuran partikel. Partikel yang lebih
kecil mempunyai luas permukaan yang lebih besar, karenanya sebagian besar zat
aktif terkait akan berada di dekat permukaan partikel, yang menghasilkan
pelepasan zat aktif dengan cepat (Mohanraj dan Chen, 2006).
Dengan ukuran kecilnya, nanopartikel memperlihatkan sifat-sifat yang
menarik, menjadikannya sesuai dengan berbagai aplikasi pemberian sediaan obat.
Jumlah molekul yang ada pada permukaan partikel meningkat seiring dengan
berkurangnya ukuran partikel yang dapat dilihat pada tabel 2.1 (Gupta, 2006).
Tabel 2.1 Permukaan molekul pada partikel
No Ukuran partikel (nm) Molekul permukaan (%)
1 1 100,00
2 10 27,10
3 100 2,97
4 1000 0,30
5 10000 0,03
2.7.2 Teknologi nano
Nanoteknologi adalah bidang ilmu terapan dan teknologi yang bertujuan
untuk mengembangkan perangkat dan bentuk sedian dalam kisaran 1 sampai 100
nm (Yadav, et al., 2011). Nanoteknologi berkembang semakin pesat seiring
dengan meningkatnya kebutuhan industri akan ukuran partikel yang semakin
kecil. Dalam industri farmasi dan bioteknologi, teknologi nano telah
16
Pemanfaatan teknologi nano tidak luput juga dalam dunia pengobatan
herbal. Obat herbal yang berkhasiat biasanya diproduksi dengan menggunakan
teknologi modern dan salah satunya adalah teknologi nano. Banyak negara di
dunia yang telah mengenal teknologi nano sejak 1990-an, seperti Amerika Serikat
dan Jepang. Di Indonesia teknologi nano baru populer sejak beberapa tahun yang
lalu. Pemanfaatannya masih terbatas dan belum maksimal. Meskipun tergolong
baru berkembang di Indonesia, namun teknologi nano kini telah merambah
berbagai bidang, termasuk bidang produksi makanan dan minuman kesehatan
17
BAB III
METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan menggunakan metode eksperimental untuk
membandingkan aktivitas antibakteri ekstrak etanol nano dan ekstrak etanol
serbuk simplisia daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) terhadap
pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Pengujian
aktivitas antibakteri tersebut dilakukan melalui beberapa tahapan meliputi:
pengumpulan bahan, pengolahan sampel, penyiapan nano, pembuatan ekstrak
etanol nano dan serbuk simplisia daun sirih merah, serta pengujian aktivitas
antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.
3.1 Alat dan Bahan
3.1.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas
(pyrex), kertas saring, kertas perkamen, batang pengaduk, spatula, kapas, kain
kassa, benang, aluminium foil, blender (Neowa), oven (Memmert), inkubator
(Fischer Scientific), jarum ose, cawan petri, jangka sorong, pinset, pencadang
kertas (Merck), pipet mikro (Eppendrof), autoklaf (Webeco), neraca analitik
(Vibra AJ), Laminar Air Flow Cabinet (Astec HLF 1200 L), mikroskop
(Olympus), lemari pendingin (Toshiba), mikroskop pemindai elektron (Tm 300
18
3.1.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun sirih merah,
Mueller Hinton Agar (Merck), natrium klorida (Merck), etanol 70%, amoksisilin,
dan air suling.
3.1.3 Mikroba uji
Mikroba uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri
Staphylococcus aureus dan Escherichia coli yang diperoleh dari PT. Biofarma
(Persero) Bandung, Jawa Barat. Identifikasi bakteri dilakukan dengan metode
pewarnaan Gram. Gelas objek dicuci dengan alkohol lalu difiksasi di atas api
bunsen. Diteteskan satu tetes akuades pada objek glass lalu satu ose biakan koloni
dihomogenkan atau disuspensikan, ratakan dan keringkan dengan fiksasi.
Ditambahkan satu tetes kristal violet dibiarkan selama 1 menit, kemudian
dibersihkan kristal violet yang tidak terikat dengan bilasan air dan keringkan.
Diteteskan satu tetes iodin dibiarkan beberapa menit, lalu dibilas dengan alkohol.
Kemudian dicuci dengan air mengalir. Diteteskan satu tetes safranin, dibiarkan
selama 15 - 30 detik, dicuci larutan safranin dengan akuades steril, dikeringkan.
Dilihat di bawah mikroskop (Pratiwi, 2008).
3.2 Pengambilan dan Pengolahan Sampel
3.2.1 Pengambilan sampel
Daun sirih merah diperoleh dari Desa Namoriam, Kecamatan Pancur Batu,
Kabupaten Deli Serdang, Sumatera Utara. Pengambilan sampel dilakukan secara
19
3.2.2 Identifikasi sampel
Identifikasi sampel dilakukan di Herbarium “Bogoriense” Bidang Botani
Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi LIPI, Bogor.
3.2.3 Pengolahan sampel
Daun sirih merah dicuci bersih dengan air mengalir, ditiriskan kemudian
dikeringkan dalam oven pada suhu 40oC. Bahan kering sebagian diserbukkan
dengan menggunakan blender dan sebagian lainnya diserbukkan dengan teknologi
nano menggunakan alat High Energy Ballmill.
3.2.4 Pembuatan nanopartikel daun sirih merah
Pembuatan nanopartikel daun sirih merah dilakukan di Pusat Penelitian
Fisika-LIPI PUSPITEK Serpong. Prosedur pembuatan nanopartikel daun sirih
merah sebagai berikut:
a. bola-bola yang akan digunakan sebagai media penghancur dimasukkan ke
dalam jar/vial HEM.
b. bola-bola dengan ukuran diameter lebih besar dimasukkan terlebih dahulu,
kemudian bola-bola dengan ukuran diameter lebih kecil, dan terakhir sampel
dimasukkan.
c. volume total dari bola-bola dan sampel yang bisa dimasukkan dalam jar/vial
tidak boleh melebihi 2/3 volume jar/vial.
d. sampel yang bisa digiling adalah material logam, simplisia, biji-bijian, dan
mineral alam, ukuran hasil penggilingan tergantung material yang digiling.
e. BPR (Ball to Powder Ratio) yang biasa digunakan adalah 20:1, 10:1, dan 8:1,
contoh BPR 20:1 dimana setiap 20 g berat bola yang digunakan maka 1 g
20
f. jar/vial yang telah berisi bola dan sampel ditutup dengan rapat.
g. jar/vial dipasangkan pada dudukan jar/vial yang terdapat dalam HEM.
h. HEM dinyalakan dengan mengoperasikan tombol-tombol elektronik.
3.3 Pembuatan Ekstrak Etanol Nano Simplisia dan Ekstrak Etanol Serbuk Simplisia Daun Sirih Merah
Sebanyak 100 g nano simplisia daun sirih merah dimaserasi dengan
750 ml etanol 70% dalam wadah tertutup rapat dan dibiarkan pada suhu kamar
selama 5 hari sambil sesekali diaduk. Setelah 5 hari maserat dipisahkan dan
ampas dimaserasi kembali dengan etanol 70%, dimasukkan dalam wadah dan
disimpan di tempat yang terlindung dari cahaya, kemudian dienap tuangkan.
Maserat pertama dan kedua digabungkan, biarkan di tempat sejuk, terlindung dari
cahaya selama 2 hari, enap tuangkan (Depkes RI, 1979). Perlakuan ekstraksi yang
sama juga dilakukan pada serbuk simplisia daun sirih merah.
3.4 Pemeriksaan Simplisia dan Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah
3.4.1 Pemeriksaan organoleptis simplisia daun sirih merah
Pemeriksaan simplisia daun sirih merah secara organoleptis dengan
mengamati bentuk, warna, rasa dan bau serta rendemennya.
3.4.2 Pemeriksaan partikel nano dan serbuk simplisia daun sirih merah
Pemeriksaan partikel nano dan serbuk simplisia daun sirih merah
menggunakan mikroskop pemindai elektron (SEM). Mikroskop ini terdiri dari
sebuah senapan elektron yang memproduksi berkas elektron pada tegangan
21
lensa elektromagnetik untuk menghasilkan gambar berukuran kecil yang
ditampilkan dalam bentuk film fotografi atau ke dalam layar (Anggraeni, 2008).
3.4.3 Pemeriksaan organoleptis ekstrak etanol nano simplisia dan ekstrak etanol serbuk daun sirih merah
Pemeriksaan ekstrak etanol daun sirih merah secara organoleptis dengan
mengamati bentuk, warna, rasa dan bau serta rendemennya.
3.5 Pembuatan Media dan Reagensia
3.5.1 Media mueller hinton agar (MHA)
Media MHA mengandung komposisi : kaldu daging 2,0 gram, kasein
hidrolisat 17,5 gram, amidon 1,5 gram, dan agar-agar 13,0 gram
Cara Pembuatan:
Sebanyak 34 g sediaan MHA ke dalam 1 liter air suling, lalu dipanaskan
sambil hingga media larut sempurna. Media kemudian disterilkan di dalam
autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit (Merck, 2014).
3.5.2 Pembuatan media agar miring
Ke dalam tabung reaksi dimasukkan 10 ml media MHA cair, tabung
diletakkan sedemikian rupa sehingga kemiringan permukaan media lebih kurang
45o. Mulut tabung ditutup dengan kapas dan dibiarkan memadat pada suhu kamar.
3.5.3 Larutan NaCl 0,9%
Sebanyak 0,9 g NaCl dilarutkan dalam air suling dan dicukupkan hingga
100 ml. Larutan disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit
22
3.6 Pembiakan Bakteri
3.6.1 Pembuatan stok kultur
Biakan bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dari strain
utama masing-masing diinokulasikan pada permukaan media MHA miring secara
terpisah. Biakan bakteri tersebut diinkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam.
3.6.2 Penyiapan inokulum
Koloni bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dari stok
kultur masing-masing dipindahkan secara aseptik ke dalam 10 ml larutan
NaCl 0,9%, dihomogenkan, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama
2 - 3 jam. Kekeruhan suspensi bakteri diukur menggunakan spektrofotometri pada
panjang gelombang 580 nm hingga diperoleh transmitan 25% (Depkes RI, 1995).
3.7 Penyiapan Larutan Uji Ekstrak Etanol Nano Simplisia dan Serbuk Simplisia Daun Sirih Merah dengan Berbagai Konsentrasi
Sebanyak 5 g ekstrak etanol daun sirih merah dilarutkan dalam 5 ml etanol
70% dan diencerkan dengan air suling steril hingga 10 ml (konsentrasi ekstrak
adalah 500 mg/ml). Larutan tersebut diencerkan kembali hingga diperoleh
konsentrasi 4, 5, 6, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300 dan 400 mg/ml.
3.8 Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Nano Simplisia dan Serbuk Simplisia Daun Sirih Merah Terhadap Bakteri
Staphylococcus aureus
Pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol nano simplisia dan ekstrak
etanol serbuk simplisia daun sirih merah dilakukan menggunakan metode difusi
agar. Sebanyak 0,1 ml inokulum bakteri Staphylococcus aureus dimasukkan
23
cair, campuran dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Setelah itu ditanamkan
pencadang kertas yang telah direndam ekstrak etanol daun sirih merah dengan
berbagai konsentasi, dibiarkan selama 15 menit. Lalu cawan petri ditutup dan
dibungkus. Kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 - 24 jam. Selanjutnya
diameter daerah hambat di sekitar pencadang kertas diukur dengan menggunakan
jangka sorong. Pengujian dilakukan sebanyak 3 kali (Depkes RI, 1995). Hal yang
sama juga dilakukan pada ekstrak etanol serbuk simplisia daun sirih merah,
kontrol positif (Amoksisilin 30 µg/ml), dan kontrol negatif (etanol 35%).
3.9 Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Nano Simplisia dan Serbuk Simplisia Daun Sirih Merah Terhadap Bakteri Escherichia coli
Pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol nano simplisia dan ekstrak
etanol serbuk simplisia daun sirih merah dilakukan menggunakan metode difusi
agar. Sebanyak 0,1 ml inokulum bakteri Escherichia coli dimasukkan secara
aseptis ke dalam cawan petri steril, dicampurkan dengan 15 ml media agar cair,
campuran dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Setelah itu ditanamkan
pencadang kertas yang telah direndam ekstrak etanol daun sirih merah dengan
berbagai konsentasi, dibiarkan selama 15 menit. Lalu cawan petri ditutup dan
dibungkus. Kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 - 24 jam. Selanjutnya
diameter daerah hambat di sekitar pencadang kertas diukur dengan menggunakan
jangka sorong. Pengujian dilakukan sebanyak 3 kali (Depkes RI, 1995). Hal yang
sama juga dilakukan pada ekstrak etanol serbuk simplisia daun sirih merah,
24
3.10 Analisis Statistika
Data diameter daya hambat ekstrak etanol daun sirih merah
terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli
disajikan sebagai nilai rata-rata dari tiga kali pengujian. Analisis statistik
dilakukan menggunakan program perangkat lunak SPSS versi 17 dengan metode
analisis uji T dengan tingkat kepercayaan 95% dan dilanjutkan dengan variansi
25
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi tumbuhan menunjukkan bahwa tumbuhan yang digunakan
dalam penelitian ini adalah daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.). Hasil
identifikasi dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 39.
4.2 Pemeriksaan Organoleptis Simplisia Daun Sirih Merah
Secara makroskopis simplisia daun sirih merah berwarna coklat
kemerahan dengan bau harum khas sirih yang menyengat, rasa sangat pahit dan
pedas, bentuk bulat memanjang membentuk jantung dengan bagian atas
meruncing, bertepi rata dan keriput, panjang daun 12,3 cm dan lebar daun 7,2 cm.
Rendemen simplisia daun sirih merah mencapai 20%.
4.3 Pemeriksaan Partikel Nano Simplisia dan Serbuk Simplisia Daun Sirih Merah
Pemeriksaan partikel nano simplisia dan serbuk simplisia daun sirih merah
dilakukan menggunakan mikroskop pemindai elektron. Mikroskop ini merupakan
jenis mikroskop elektron yang menggunakan berkas elektron untuk
menggambarkan bentuk permukaan dari material yang dianalisis yang
ditampilkan dalam bentuk film fotografi.
Ukuran dan bentuk partikel nano simplisia dan serbuk simplisia daun sirih
merah di bawah mikroskop pemindai elektron dapat dilihat pada Gambar 4.1.
26
644 nm, sedangkan serbuk simplisia berpermukaan kasar dan berkerut dan
berukuran 164 µm.
A B
Gambar 4.1 Pemeriksaan partikel simplisia daun sirih merah di bawah mikroskop pemindai elektron (A: Nano simplisia, B: Serbuk simplisia)
4.4 Pemeriksaan Organoleptis Ekstrak Etanol Nano Simplisia dan Ekstrak Etanol Serbuk Simplisia Daun Sirih Merah
Pemeriksaan ekstrak etanol nano simplisia dan ekstrak etanol serbuk
simplisia daun sirih merah dilakukan secara organoleptis dengan mengamati
konsistensi, bau, rasa, dan warna. Hasil pemeriksaan organoleptis ekstrak etanol
daun sirih merah dapat dilihat pada Tabel 4.1. Warna ekstrak etanol nano
simplisia daun sirih merah lebih pekat dengan rendemen lebih tinggi
dibandingkan ekstrak etanol serbuknya. Hal ini dapat terjadi karena perbedaan
ukuran partikel antara nano dan serbuk simplisianya. Menurut Aiache, dkk.,
(1982), pengurangan ukuran partikel dapat meningkatkan luas permukaan kontak
zat aktif dan pelarut sehingga meningkatkan kelarutan komponen kimia yang
27
Tabel 4.1 Pemeriksaan Organoleptis Ekstrak Etanol Nano Simplisia dan Ekstrak Etanol Serbuk Simplisia Daun Sirih Merah
Sampel Konsistensi Warna Bau Rendemen
Ekstrak
4.5 Reidentifikasi Bakteri
Reidentifikasi bakteri uji Staphylococcus aureus dan Escherichia coli
dilakukan dengan menggunakan metode pewarnaan Gram untuk mengetahui
bentuk koloni dan golongan Gram bakteri yang diamati di bawah mikroskop.
Hasil reidentifikasi bakteri uji Staphylococcus aureus dan Escherichia coli
ditunjukkan pada Gambar 4.2.
Sel bakteri Staphylococcus aureus berwarna ungu karena menyerap warna
dari kristal violet (pewarna primer) dengan bentuk sel kokus atau bulat dan
susunan sel bergerombol seperti buah anggur. Sedangkan bakteri Escherichia coli
berwarna merah muda karena menyerap warna dari safranin (pewarna tandingan)
dengan bentuk sel batang dan susunan sel monobasil. Hasil pewarnaan
menunjukkan bahwa Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif dan
Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif.
Perbedaan warna antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif
disebabkan oleh adanya perbedaan struktur pada dinding sel bakteri. Dinding sel
bakteri Gram positif banyak mengandung peptidoglikan, sedangkan dinding
bakteri Gram negatif banyak mengandung lipopolisakarida. Kompleks kristal
28
oleh alkohol karena adanya lapisan peptidoglikan yang kokoh atau tebal pada
dinding selnya. Sedangkan pada bakteri Gram negatif, alkohol akan merusak
lapisan lipopolisakarida dengan cara melarutkan lipid. Kompleks kristal violet -
iodin pada bakteri Gram negatif dapat tercuci dan menyebabkan sel bakteri
tampak transparan, yang akan berwarna merah muda setelah diberi safranin
(Pratiwi, 2008).
A B
Gambar 4.2 Koloni bakteri (A: Staphylococcus aureus, B: Escherichia coli)
4.6 Aktivitas Antibakteri Kontrol Positif dan Negatif Terhadap Bakteri
Staphylococcus aureus dan Escherichia coli
Pengujian aktivitas antibakteri terhadap amoksisilin (kontrol positif) pada
konsentrasi 30 µg/ml memberikan daya hambat sebesar 15,13 mm untuk bakteri
Staphylococcus aureus dan 14,23 mm untuk bakteri Escherichia coli. Pemilihan
amoksisilin ini dikarenakan amoksisilin merupakan antibiotik yang berspektrum
penghambatan yang luas sehingga dapat digunakan untuk semua bakteri uji (Tan
dan Rahardja, 2008).Sedangkan kontrol negatif yang digunakan yaitu etanol 35%
29
4.7 Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Nano Simplisia dan Ekstra Etanol Serbuk Simplisia Daun Sirih Merah Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli
Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol nano simplisia dan ekstrak
etanol serbuk simplisia daun sirih merah terhadap bakteri Staphylococcus aureus
yang ditentukan berdasarkan diameter daya hambat dapat dilihat pada Tabel 4.2.
Tabel 4.2 Diameter daya hambat ekstrak etanol nano simplisia dan ekstrak etanol serbuk simplisia terhadap pertumbuhan Staphylococcus aureus
Konsentrasi (mg/ml)
Diameter daya hambat (mm)*
Ekstrak etanol nano Ekstrak etanol serbuk
500 21,50 19,05
KP = amoksisilin 30 µg/ml
Menurut Farmakope Indonesia (1995), suatu antibakteri dikatakan efektif
jika diameter daya hambat terhadap pertumbuhan bakteri uji adalah 14 - 16 mm.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol nano simplisia daun sirih
30
konsentrasi 40 mg/ml dengan daya hambat 14,54 mm dan KHM 5 mg/ml yaitu
7,05 mm. Sedangkan aktivitas antibakteri ekstrak etanol serbuk simplisia daun
sirih merah efektif pada konsentrasi 100 mg/ml dengan daya hambat 14,5 mm dan
KHM 6 mg/ml yaitu 7,06 mm.
Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol nano simplisia dan ekstrak
etanol serbuk simplisia daun sirih merah terhadap bakteri Escherichia coli yang
ditentukan berdasarkan diameter daya hambat dapat dilihat pada Tabel 4.3.
Tabel 4.3 Diameter daya hambat ekstrak etanol nano simplisia dan ekstrak etanol serbuk simplisia terhadap pertumbuhan Escherichia coli
Konsentrasi (mg/ml)
Diameter daya hambat (mm)*
Ekstrak etanol nano Ekstrak etanol serbuk
500 20,23 18,07
KP = amoksisilin 30 µg/ml
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol serbuk simplisia daun
sirih merah efektif menghambat pertumbuhan bakteri Escherichia coli pada
31
7,03 mm. Sedangkan ekstrak etanol serbuk simplisia daun sirih merah efektif pada
konsentrasi 200 mg/ml dengan daya hambat 15,07 mm dan KHM 10 mg/ml yaitu
7,16 mm.
Penelitian yang dilakukan oleh Safihtri dan Fahma (2008) menunjukkan
bahwa ekstrak sirih merah mengandung senyawa flavonoid, alkaloid, saponin,
tanin dan minyak atsiri. Aktivitas antibakteri daun sirih merah diduga karena
kandungan senyawa tersebut (Hariana, 2007).
Mekanisme kerja flavonoid sebagai antibakteri adalah membentuk
senyawa kompleks dengan protein ekstraseluler dan terlarut sehingga dapat
merusak membran sel bakteri dan diikuti dengan keluarnya senyawa intraseluler
(Cowan, 1999; Nuria et al., 2009). Senyawa lain yang berkhasiat antibakteri
adalah tanin. Senyawa tanin merupakan senyawa metabolit sekunder pada
tumbuhan yang bersifat sebagai antibakteri dengan membentuk ikatan yang stabil
dengan protein sehingga terjadi koagulasi protoplasma bakteri (Robinson, 1995).
Alkaloid memiliki kemampuan sebagai antibakteri, mekanisme
penghambatan bakteri oleh senyawa alkaloid dengan cara mengganggu komponen
penyusun peptidoglikan pada sel bakteri sehingga lapisan dinding sel tidak
terbentuk secara utuh dan menyebabkan kematian sel tersebut (Robinson, 1995).
Mekanisme kerja saponin sebagai antibakteri adalah menurunkan tegangan
permukaan sehingga mengakibatkan naiknya permeabilitas atau kebocoran sel dan
mengakibatkan senyawa intraseluler akan keluar (Nuria et al., 2009).
Hasil penelitian juga menunjukkan bahwa aktivitas antibakteri ekstrak
etanol daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) dipengaruhi oleh
32
Gambar 4.3 Pengaruh konsentrasi ekstrak etanol nano simplisia dan ekstrak etanol serbuk simplisia daun sirih merah terhadap aktivitas antibakteri pada Staphylococcus aureus
0
Gambar 4.4 Pengaruh konsentrasi ekstrak etanol nano simplisia dan ekstrak etanol serbuk simplisia daun sirih merah terhadap aktivitas antibakteri pada Escherichia coli
Analisis statistika menunjukkan adanya pengaruh konsentrasi terhadap
aktivitas antibakteri, dimana diameter daya hambat yang semakin meningkat pada
kenaikan konsentrasi. Menurut Pelczar (1986), semakin besar konsentrasi zat
33
pada media sehingga mempermudah penetrasi zat dalam menghambat
pertumbuhan bakteri.
Dari hasil penelitian juga terlihat bahwa aktivitas antibakteri ekstrak etanol
nano simplisia lebih kuat dibandingkan ekstrak etanol serbuk simplisia. Analisis
statistika menggunakan uji T yang dilanjutkan dengan anava dua arah
menunjukkan adanya perbedaan signifikan antara nilai rata-rata diameter daya
hambat pada ekstrak etanol nano simplisia dengan ekstrak etanol serbuk simplisia
(p < 0,05). Hal ini mungkin dikarenakan komponen kimia yang terkandung dalam
ekstrak etanol nano simplisia daun sirih merah lebih banyak daripada ekstrak
etanol serbuk simplisianya. Hal ini sesuai dengan penelitian Sari (2014) yang
membandingkan jumlah komponen pada partikel yang berbeda dari daun sirih
merah yang diuji dengan GC-MS, menunjukkan bahwa ekstrak etanol nano
simplisia daun sirih merah memiliki 38 komponen sedangkan ekstrak etanol
serbuk simplisia daun sirih merah hanya memiliki 12 komponen. Dalam ukuran
nano, partikel zat aktif lebih mudah terisolasi karena luas kontak permukaan
simplisia menjadi lebih besar dan kelarutan zat aktif meningkat sehingga aktivitas
antibakterinya semakin kuat (Kammona, 2012).
Selain itu, hasil penelitian menunjukkan bahwa bakteri Staphylococcus
aureus lebih peka terhadap ekstrak etanol daun sirih merah dibandingkan
Escherichia coli pada masing-masing konsentrasi. Menurut Jawetz, et al., (2007),
perbedaan kepekaan pada bakteri Gram positif dan Gram negatif terhadap zat
antibakteri kemungkinan karena perbedaan struktur dinding sel, seperti jumlah
peptidoglikan, jumlah lipid, dan aktivitas enzim, yang menentukan penetrasi,
34
Gram positif, mempunyai struktur dinding sel yang mengandung polisakarida dan
protein, serta mempunyai kandungan lipid yang rendah (1 - 4%), sedangkan
Escherichia coli, termasuk bakteri Gram negatif, mempunyai dinding sel dengan
kandungan lipid tinggi (11 - 22%) dan struktur dinding sel yang berlapis tiga
(multi layer) yaitu lipoprotein, membran luar fosfolipid dan lipopolisakarida.
Membran luar fosfolipid dapat mengurangi masuknya zat antibakteri ke dalam sel,
sehingga dinding sel bakteri Staphylococcus aureus lebih mudah ditembus oleh
35
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan pembahasan diatas dapat disimpulkan bahwa:
a. ekstrak etanol nano simplisia memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri
Staphylococcus aureus dan Escherichia coli masing-masing pada KHM 5
mg/ml dan 6 mg/ml. Ekstrak etanol serbuk simplisia daun sirih merah
memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan
Escherichia coli masing-masing pada KHM 6 mg/ml dan 10 mg/ml.
b. aktivitas antibakteri ekstrak etanol nano simplisia daun sirih merah dan
ekstrak etanol serbuk simplisia daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz &
Pav.) terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli memiliki
perbandingan, dimana aktivitas antibakteri ekstrak etanol nano simplisia daun
sirih merah lebih besar daripada aktivitas antibakteri ekstrak etanol serbuk
simplisia daun sirih merah.
5.2 Saran
Berdasarkan pembahasan dan kesimpulan diatas, maka disarankan:
a. perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap senyawa-senyawa yang
dikandung daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) yang aktif sebagai
antibakteri.
b. pada peneliti selanjutnya dilakukan pengujian aktivitas antibakteri daun sirih
36
DAFTAR PUSTAKA
Aiache, J.M., Devissaguet, J., dan Guyot H.A.M. (1993). Farmasetika 2 Biofarmasi. Edisi II. Surabaya: Airlangga University Press. Hal. 153.
Anggraeni, N.D. (2008). Analisa SEM (Scanning Electron Microscopy) Dalam Pemantauan Proses Oksidasi Magnetite Menjadi Hematite. Seminar Nasional ke-VII. Artikel. Hal. 52.
Buzea, C., Blandino, I.I.P., dan Robbie, K. (2007). Nanomaterials And Nanoparticles: Sources and Toxicity. Biointerphases.2(4): 17-172.
Cowan, M. M., (1999). Plant Products as Antimicrobial Agents. Clinical Microbiology Review. 12 (4): 564-82.
Damayanti, R., dan Mulyono (2006). Khasiat dan Manfaat Daun Sirih Obat Mujarab dari Masa ke Masa. Jakarta: Agro Media Pustaka. Hal. 1-12.
Depkes RI. (1979). Farmakope Indonesia. Edisi III. Jakarta: Departemen Kesehatan RI. Hal. 33, 713.
Depkes RI. (1995). Farmakope Indonesia. Edisi IV. Jakarta: Departemen Kesehatan RI. Hal. 896, 898.
Ditjen POM. (2000). Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Departemen Kesehatan RI. Jakarta. Hal. 1, 10-12.
Dwidjoseputro. (1978). Dasar - Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan. Hal.17-19, 105-107
Gupta, R. B., dan Kompella, U. B. (2006). Nanoparticle Technology For Drug Delivery. Vol. 159. New York: Taylor & Francis. Hal. 14.
Hariana, A. (2007). Tumbuhan Obat dan Khasiatnya. Edisi III. Jakarta: Penebar Swadaya. Hal. 52.
Hidayat, T. (2013). Sirih Merah Sebagai Budi Daya dan Pemanfaatan Untuk Obat. Yogyakarta: Pustaka Baru Press. Hal. 22.
Jawetz, E., Melnick, J.L., dan Adelberg E.A. (2007). Mikrobiologi untuk Profesi Kesehatan. Edisi kedua puluh. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran. Hal. 256, 319.
