BAB III
METODE PENELITIAN
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimental yang meliputi persiapan bahan, pembuatan pereaksi, analisis asam lemak dengan kromatografi gas, proses transesterifikasi dengan variasi penambahan katalisator KOH 1, 2, 3 ,4, dan 5 g dan variasi suhu yaitu suhu 30°C, 55°C dan 65°C serta variasi waktu yaitu 30, 60, 90, 120 menit, pemisahan hasil transesterifikasi crude palm oil penentuan ester dengan kromatografi gas serta uji aktivitas antibakteri.
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Oleopangan, kelompok peneliti (KELTI) Pengolahan Hasil dan Mutu (PAHAM), Pusat Penelitian Kelapa Sawit, Medan dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara. Penelitian ini berlangsung selama 2 ( dua ) bulan yaitu dari tanggal 25 juli 2016 s.d. 26 september 2016.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Alat-alat
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat gelas (Pyrex), alumunium foil, autoklaf (Fison), cawan petri, Kromatografi Gas (Shimadzu), hot plate (crimarec), inkubator (Memmert), jangka sorong, kompor gas (Rinnai), lemari pendingin (Toshiba), magnetic stirrer, miko pipet (Eppendorf), neraca analitik (Metler AE 200) , oven (Gallenkomp), pinset, spatula dan alat refluk.
3.2.2 Bahan – Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Minyak Sawit Mentah yang diperoleh dari Pusat Penelitian Kelapa Sawit (PPKS) Medan, Sumatera Utara, bakteri Staphylococcus Aureus yang diperoleh dari Laboratorium Biologi FMIPA - USU , Nutrient agar (NA), Nutrient broth (NB), Bahan kimia lain yang digunakan dalam penelitian ini berkualitas pro-analis berasal dari Merck yaitu Etanol ,Asam Klorida (HCl) pekat, Kalium Hidroksida (KOH) anhidrat, metanol, n-hexana, Na2SO4 anhidrat dan Phenolfthalein (Sigma-Aldrich).
3.3 Pembuatan Pereaksi
3.3.1 Larutan KOH-metanolat
Metanol 70% dimasukkan ke dalam labu alas bulat sebanyak 200 ml yang berkapasitas 500 ml serta dilengkapi dengan pengaduk magnet. Kemudian ditambahkan KOH anhidrat dengan variasi 1, 2, 3, 4, dan 5 g sambil dilakukan pengadukan sampai semua KOH larut. Labu alas bulat ditutup untuk mencegah terjadinya penguapan (Kusumaningsih, dkk., 2006).
3.3.2 Larutan metanol 70%
Akuades dimasukkan ke dalam labu tentukur 250 ml secukupnya , kemudian ditambahkan metanol 96% sebanyak 182,3 ml secara perlahan - lahan. Kemudian diaduk dan dicukupkan dengan akuades sampai 250 ml (Ditjen POM RI, 1995).
3.3.3 Larutan Indikator Phenolfthalein (PP)
3.4 Prosedur Penelitian
3.4.1 Analisis asam lemak menggunakan kromatografi gas
Sebanyak 0.025 g sampel minyak sawit mentah di tambahkan dengan NaOH metanolik 0,5 N ( 2,9 g NaOH dilarutkan dalam 500 ml methanol p.a ). Lalu fortex selama 1 – 2 menit, kemudian dipanaskan dalam penangas air pada suhu 100ºC selama 5 menit. Dinginkan sampai 30ºC lalu tambah 2 ml BF3 dan fortex selama 1 – 2 menit. Tutup rapat dan panaskan pada suhu 100ºC selama 30 menit. Lalu dinginkan tabung hingga suhu 30ºC dan tambahkan 2,5 ml iso oktane kemudian difortex selama 1 menit. Tambahkan NaCl jenuh sebanyak 5 ml ( 36 g NaCl dalam 100 ml air ) lalu fortex kembali. Lapisan iso oktane dipisahakan dan dimasukan kedalam vial, diekstrak kembali dengan 1 ml iso oktane, fortex kembali dan hasil ekstraksi digabung. Sampel siap untuk di injek ke Kromatografi Gas.
3.4.2 Transesterifikasi crude palm oil
Sebanyak 200 ml larutan KOH-metanolat yang telah dibuat sebelumnya dengan berbagai variasi dimasukan ke dalam labu alas bulat 1000 ml yang telah terdapat 100 ml sampel crude palm oil sedikit demi sedikit disertai pengadukan menggunakan pengaduk magnet. Suhu reaksi divariasikan pada suhu 30ºC, 55ºC dan 65ºC selama 2 jam, reaksi dihentikan dengan penambahan THF sebanyak 4 ml. Proses selanjutnya didinginkan kemudian dilakukan pemisahan hasil (Kusumaningsih, dkk., 2006).
3.4.3 Pemisahan hasil
dua lapisan yaitu lapisan ester dan air. Lapisan ester kemudian dicuci dengan 50 ml akuades sebanyak 2 x untuk menghilangkan KOH yang tersisa ditambahkan Na2SO4 anhidrat secukupnya, disaring dan pelarut diuapkan pada penangas air. Hasil yang diperoleh dianalisis menggunakan kromatografi gas. Hasil analisis dengan kandungan ester terbanyak digunakan untuk pengujian aktivitas antibakteri (Kusumaningsih, dkk., 2006).
3.4.4 Transesterifikasi crude palm oil dengan variasi waktu
Sebanyak 200 ml larutan KOH-metanolat yang telah dibuat sebelumnya dengan jumlah KOH sebanyak 2 g dimasukan ke dalam labu alas bulat 1000 ml yang telah terdapat 100 ml sampel minyak sawit mentah sedikit demi sedikit disertai pengadukan. Waktu reaksi divariasikan yaitu pada 30, 60, 90, dan 120 menit dengan suhu reaksi dilakukan pada suhu kamar, reaksi dihentikan dengan penambahan THF sebanyak 4 ml. Proses selanjutnya dilakukan pemisahan hasil (Kusumaningsih, dkk., 2006).
3.4.5 Pemisahan hasil
3.4.6 Penentuan ester dengan kromatografi gas
Sampel berupa ester minyak sawit mentah yang diperoleh dari hasil transesterifikasi minyak sawit mentah ditimbang sebanyak 0,05 g, dimasukan kedalam vial. Kemudian ditambahkan internal standar Tricapri sebanyak 100 µl dan MSTFA (N-Metil-N- trimethylsilyl trifluoroasetamida) sebanyak 60 µl. Tambahkan Tetrahidrofuran(THF) sebanyak 0,1 ml dan tutup rapat lalu di fortex selama 1 menit dan diamkan selama 10 menit. Kemudian ditambahkan n-hexana sebanyak 2,5 ml, lalu difortex selama 1 menit, selanjutnya sampel siap untukl dilakukan pengukuran dengan kromatografi gas dan diinjeksikan sebanyak 1 µl.
3.4.7 Kondisi kromatografi gas yang digunakan
Kondisi pada saat menggunakan kromatografi gas antara lain : - Kolom : Kapiler bahan isian silika, panjang 15 m;id 0,25 mm - Bahan isian : Silika
- Jenis : DB 5 HT
- Gas pembawa : Helium - suhu injektor : 360 ºC - Suhu detektor : 360ºC - Volume injeksi : 1 µl
3.5 Pembuatan Media
3.5.1 Media NA
Komposisi:
− Sodium chloride 5 g dan agar 15 g
Cara Pembuatan:
Sebanyak 28 g media NA yang sudah jadi ditimbang, disuspensikan ke dalam air suling 1000 ml, lalu dipanaskan sampai larut sempurna. Media kemudian dimasukkan dalam labu dan disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit (Bridson, 2006).
3.5.2 Media NB
Komposisi:
− Lab-lemco powder 1 g − Yeast extract 2 g − Peptone 5 g
− Sodium chloride 5 g
Cara Pembuatan:
Sebanyak 13 g media NB yang sudah jadi ditimbang, disuspensikan ke dalam air suling 1000 ml, lalu dipanaskan sampai larut sempurna. Media kemudian dimasukkan dalam labu dan disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit (Bridson, 2006).
3.6 Peremajaan Bakteri
3.7 Penyiapan Inokulum Bakteri
Koloni Staphylococcus aureus diambil dari stok kultur dengan jarum ose steril lalu masing-masing disuspensikan dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml NB. Suspensi divorteks hingga diperoleh kekeruhan yang sama dengan standar Mc.Farland No. 0.5 (108CFU/ml). Sebanyak 0,1 ml dari suspensi dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 9,9 ml nutrient broth dan dihomogenkan sehingga diperoleh inokulum bakteri dengan kekeruhan 106 CFU/ml (Rizal, 2016)
3.8 Pembuatan Bahan Uji
Bahan uji dibuat dalam konsentrasi 12,5 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, dan 200 mg/ml dengan menggunakan etanol absolut sebagai pelarut. Sejumlah bahan uji diukur volumenya sesuai konsentrasi, dimasukkan kedalam vial (Nuraida, dkk., 2008).
3.9 Pengujian Antibakteri
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Analisis Asam Lemak Menggunakan Kromatografi Gas
Hasil analisis asam lemak minyak sawit mentah menggunakan kromatografi gas dapat dilihat pada Tabel 4.1 dan gambar kromatogram pada
4 asam palmitoleat 0,1276
5 asam stearat 4,7898
6 asam oleat 39,9214
7 asam linoleat 10,3561
8 asam linolenat 0,2876
9 asam arasidat 0,3267
10 asam 11-eiksanoat 0,1141
Total 100
Berdasarkan hasil analisis asam lemak dari minyak kelapa sawit menggunakan Kromatografi Gas diperoleh asam lemak yang paling dominan yaitu asam palmitat sebanyak 42,8275% dan asam oleat sebanyak 39,9214%,terdapat sedikit perbedaan kandungan asam lemak jika dibandingkan dengan literatur, hal ini mungkin dikarenakan perbedaan bahan baku yang di peroleh.
4.2 Hasil Transesterifikasi minyak sawit mentah gengan Kromatografi Gas
Hasil transesterifikasi minyak sawit mentah dengan Kromatografi Gas dilakukan dengan berbagai variasi penambahan katalisator KOH yaitu 1, 2, 3, 4 dan 5 g serta dengan variasi suhu yaitu pada 30ºC, 55ºC dan 65ºC. Berdasarkan percobaan yang dilakukan maka daiperoleh hasil transesterifikasi dari minyak sawit mentah dengan menggunakan kromatografi gas dapat dilihat pada Tabel 4.2 dan gambar kromatogram pada Lampiran 10 – 25 halaman 45 – 76.
Tabel 4.2 Hasil analisis transesterifikasi yang diperoleh dari minyak sawit mentah menggunakan kromatografi gas dengan berbagai variasi KOH pada suhu 30ºC
* Bahan baku dianalisis sebelum dilakukan reaksi transesterifikasi
Berdasarkan hasil analisis minyak kelapa sawit dengan kromatografi gas diperoleh % ester sebesar 9,0756, hasil ini diperoleh dari dua kali percobaan yang kemudiaan dirata-ratakan.
Hasil analisis transesterifikasi yang diperoleh dari minyak sawit mentah dengan Kromatografi Gas menggunakan berbagai variasi katalisator KOH pada
Perlakuan transesterifikasi dari crude palm oil dilakukan sebanyak dua kali pengulangan kemudian hasil yang diperoleh dirata-ratakan. Hasil analisis transesterifikasi yang diperoleh dari crude palm oil menggunakan GC dengan berbagai variasi KOH pada suhu 55ºC didapat kadar ester dengan jumlah tertinggi yaitu 98,4044% dengan jumlah penambahan katalis KOH sebanyak 5 g. Kadar ester dari crude palm oil dengan jumlah terendah diperoleh pada suhu 55ºC dengan jumlah penambahan katalis KOH sebanyak 1 g yaitu 16,9220%.
Perlakuan transesterifikasi dari minyak sawit mentah dilakukan sebanyak dua kali pengulangan kemudian hasil yang diperoleh dirata-ratakan. Hasil analisis transesterifikasi yang diperoleh dari minyak sawit mentah menggunakan Kromatografi Gas dengan berbagai variasi KOH pada suhu 65ºC didapat kadar ester dengan jumlah tertinggi yaitu 96,8126% dengan jumlah penambahan katalis KOH sebanyak 4 g. Kadar ester dari minyak sawit mentah dengan jumlah terendah diperoleh pada suhu 65ºC dengan penambahan katalis KOH sebanyak 1 g yaitu 22,3472%.
Hasil penelitiaan diatas dapat disimpulkan bahwa hasil transesterifikasi dari minyak sawit mentah yang tertinggi yaitu perlakuan pada suhu 30ºC dengan penambahan katalis KOH sebanyak 2 g, menunjukkan kadar ester 99,0571%. Oleh karena itu, sampel yang akan dijadikan untuk pengujian aktivitas antibakteri adalah sampel dengan kadar ester dari transesterifikasi minyak sawit mentah yang tertinggi dari seluruhnya.
4.3 Hasil Transesterifikasi minyak sawit mentah variasi waktu dengan Kromatografi Gas
Hasil transesterifikasi minyak sawit mentah dengan kromatografi gas dilakukan dengan penambahan katalisator KOH sebanyak 2 g serta dengan suhu 30ºC pada berbagai variasi waktu yaitu 30, 60, 90, dan 120 menit. Berdasarkan percobaan yang dilakukan maka diperoleh hasil transesterifikasi dari minyak sawit mentah dengan menggunakan kromatografi gas dapat dilihat pada Tabel 4.3 dan gambar kromatogram pada Lampiran 26 – 29 halaman 77 – 80.
Tabel 4.3 Hasil analisis transesterifikasi yang diperoleh dari minyak sawit mentah
menggunakan kromatografi gas dengan berbagai variasi waktu pada suhu
Berdasarkan penelitian diatas maka diperoleh hasil analisis transesterifikasi dari minyak sawit mentah menggunakan Kromatografi Gas memengalami peningkatan dari menit kegunakan 30, 60, 90, dan 120 menit. Sampai akhirnya diperoleh kadar ester yang tertinggi yaitu perlakuan pada 30ºC dengan penambahan katalis KOH sebanyak 2 g dan waktu reaksi selama 120 menit yaitu sebesar 98,8476%.
Optimasi proses transesterifikasi diperlukan untuk menentukan kondisi
proses yang paling sesesuai sehingga diperoleh hasil yang optimum. Hasil
transesterifikasi dipengaruhi oleh kecepatan pengadukan, suhu, konsentrasi katalis,
Proses dengan menggunakan katalis basa seperti kalium hidroksida umumnya berlangsung lebih cepat dibandingkan dengan katalis asam dikarenakan reaksi berlangsung searah. Namun pemakaian katalis basa hanya berlangsung sempurna bila minyak atau lemak dalam kondisi netral dan tanpa air (Manurung, 2006).
4.4 Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Ester minyak sawit mentah
Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode sumur, dan ester yang digunakan yaitu ester pada suhu 30ºCdengan penambahan katalis KOH sebanyak 2 g menunjukkan nilai 99,0571%. Hasil uji aktivitas antibakteri ester minyak sawit mentah dapat dilihat pada Tabel 4.4 dan Gambar 4.1- 4.3.
Tabel 4.4 Hasil pengujian aktivitas antibakteri ester minyak sawit mentah
Konsentrasi (mg/ml)
Diameter daerah hambatan (mm)*
Staphylococcus aureus
200 9,7
100 7
50 6,8
25 6,5
Gambar 4.1 Hasil pengujian aktivitas antibakteri ester minyak kelapa sawit terhadap staphylococcus aureus (percobaan I).
Keterangan gambar :
A1 = blanko (percobaan 1)
B1 = diameter daerah hambat dengan konsentrasi 12,5 mg/ml (percobaan 1) C1 = diameter daerah hambat dengan konsentrasi 25 mg/ml (percobaan 1) D1 = diameter daerah hambat dengan konsentrasi 50 mg/ml (percobaan 1) E1 = diameter daerah hambat dengan konsentrasi 100 mg/ml (percobaan 1) F1 = diameter daerah hambat dengan konsentrasi 200 mg/ml (percobaan 1)
Gambar 4.2 Hasil pengujian aktivitas antibakteri ester minyak kelapa sawit terhadap staphylococcus aureus (percobaan II).
Keterangan gambar :
A2 = blanko (percobaan 2)
B2 = diameter daerah hambat dengan konsentrasi 12,5 mg/ml (percobaan 2) C2 = diameter daerah hambat dengan konsentrasi 25 mg/ml (percobaan 2) D2 = diameter daerah hambat dengan konsentrasi 50 mg/ml (percobaan 2) E2 = diameter daerah hambat dengan konsentrasi 100 mg/ml (percobaan 2) F2 = diameter daerah hambat dengan konsentrasi 200 mg/ml (percobaan 2)
Gambar 4.3 Hasil pengujian aktivitas antibakteri ester minyak kelapa sawit terhadap staphylococcus aureus (percobaan III).
Keterangan gambar :
A3 = blanko (percobaan 3)
B3 = diameter daerah hambat dengan konsentrasi 12,5 mg/ml (percobaan 3) C3 = diameter daerah hambat dengan konsentrasi 25 mg/ml (percobaan 3) D3 = diameter daerah hambat dengan konsentrasi 50 mg/ml (percobaan 3) E3 = diameter daerah hambat dengan konsentrasi 50 mg/ml (percobaan 3) F3 = diameter daerah hambat dengan konsentrasi 200 mg/ml (percobaan 3)
Berdasarkan hasil pengukuran diameter daerah hambatan pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus memperlihatkan bahwa ester minyak sawit mentah dapat menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus. Diameter daerah hambatan antibakteri yang paling tinggi terhadap uji antibakteri adalah 9,7 mm yaitu hambatan pertumbuhan pada bakteri Staphylococcus aureus dengan konsentrasi 200 mg/ml.
Ester gliserol hanya aktif pada bakteri gram positif sehingga tidak dapat menghambat Escherichia coli. Penambahan monokaprin pada kondisi asam dapat membunuh Escherichia coli tetapi bakteri gram negatif ini resisten pada pH netral.Penambahan gliserol monolaurat sampai konsentrasi 1000 dan 2000 µ g/ml tidak berpengaruh terhadap pertumbuhan E. coli karena adanya lapisan lipopolisakarida yang menghambat penetrasi gliserol monolaurat ke dalam sel (Nuraida, dkk., 2008).
Mekanisme penghambatan dan kerusakan mikroba oleh senyawa antimikroba secara umum disebabkan oleh gangguan pada komponen penyusun sel terutama komponen penyusun dinding sel, reaksi dengan membran sel yang dapat mengakibatkan perubahan permeabilitas dan kehilangan komponen penyusun sel,
penghambatan terhadap sintesis protein, dan gangguan fungsi material genetik .Monolaurin dilaporkan dapat mengakibatkan kerusakan membran,
menyebabkan kebocoran protein intraselular dan asam nukleat sehingga menurunkan aktivitas enzim yang berperan dalam metabolisme. Sifat lipolitik dari MAG memungkinkan untuk menembus plasma dan bekerja sebagai antimikroba (Nuraida, dkk., 2008).
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian diatas, maka diperoleh kesimpulan sebagai berikut :
a. Kadar ester paling optimum yang diperoleh dari hasil transesterifikasi minyak sawit mentah adalah 99,0571 % yang dianalisis dengan Kromatografi Gas. b. Hasil transesterifikasi minyak sawit mentah mempunyai diameter sebesar 9,7
mm pada konsentrasi 200 mg/ml terhadap bakteri Staphylococcus aureus.
5.2 Saran
Berdasarkan hasil penelitian diatas, maka peneliti memberikan saran sebagai berikut :
