Penapisan Bakteri Kitinolitik dari Sumber Air Panas Penen, Kecamatan Sibiru-biru, Kabupaten Deli Serdang dan Karakterisasi Kitinasenya

(1)

Lampiran 1. Alur Kerja Penelitian

Isolasi bakteri kitinolitik dari Sumber Air Panas

Penen

Pengukuran Indeks kitinolitik

Penentuan Isolat Terpilih

Penentuan Waktu Produksi Enzim Kitinase Sampai hari

ke-8

Pengukuran Aktivitas Enzim Kitinase dan Perhitungan Kadar Protein pada

Produksi Enzim Kitinase Hari ke-4

Presipitasi Enzim Kitinase pada Beberapa Konsentrasi

Amonium Sulfat

Presipitasi Enzim Kitinase pada Konsentrasi 50% Amonium Sulfat (Pengukuran Aktivitas Enzim Kitinase

dan Perhitungan Kadar Protein)

Dialisis

Penentuan suhu dan

pH optimum Penentuan nilai K

m

dan Vmaks

(2)

Lampiran 2. Kurva Standard N-Acetyl-D-Glukosamin (GlcNAc)

konsentrasi GlCNAc

(3)

Lampiran 3. Kurva Standar Bovine Serum Albumin (BSA)

BSA (µgram)

Abs terkoreksi

0 0

Konsentrasi BSA

(4)

Lampiran 4. Pembuatan Larutan Schales

Potasium Ferisianida 0,25 g

Na2CO3 26,4975 g

Dilarutkan dalam 500 ml akuades

Distirer

Dituang ke dalam botol kaca

(5)

Lampiran 5. Uji Aktivitas Kitinase Modifikasi Spindler (1997) Substrat Sampel Kontrol Koloidal Kitin 0,3 % 300 l 300 l Penyangga fosfat 50

mM

200 l 200 l

Enzim 100 l 0 l

Diinkubasi pada suhu 37 ᴼC selama 30 menit

Keterangan Kontrol

Enzim yang setelah dipanaskan selama 10 menit

100 l

Dididihkan 10 menit

Disentrifuge 10.000 rpm selama 5 menit

Substrat Sampel Kontrol Blanko

(6)

Rumus :

 Aktivitas enzim = ((konsentrasi sampel – konsentrasi blanko) – (Konsentrasi kontrol – konsentrasi blanko)) X 600 : Enzim Akhir X 1000 : Enzim awal X 1 : menit X 1 : BM kitinase.

 Total aktivitas enzim : aktivitas enzim (Unit/mL) x volume enzim (mL)  Total protein : protein (mg/mL) x volume enzim (mL)

 Aktivitas spesifik

Unit/mg = Total aktivitas enzim (Unit/mL) Total protein (mg/mL)

Hasil % = Total aktivitas n X 100

Total aktivitas 0

Tingkat kemurnian (kali) = Aktivitas spesifik n

(7)

Lampiran 6. Metode Penentuan Kadar Protein (Bradford, 1976).

Pereaksi Blanko (ml) Sampel (ml)

Akuades 0,5 0

Enzim 0 0,5

Reagen Bradford 0,75 0,75

Divorteks

(8)

Lampiran 7. Komposisi Reagen Bradfrod & Pembuatan Ragen Bradford

A. Larutan Stock Bradford

Comassie Blue G-250 70 mg

Etanol 95% 20 ml

H3Po4 88% 40 ml

Distirer

Disaring dengan kertas saring

B. Pembuatan Reagen Bradford

425 ml akuades 15 ml 95% Etanol 35 ml 88% fosfat 30 ml larutan Stock Distirer

(9)

Lampiran 8. Perhitungan Parameter Kmdan Vmaks

PERSAMAAN LINEAWER-BURK= 0.0045X + 0.014

1/Vmaks= 0.014

Vmaks = 71.4286

Km/Vmak_s = 0.0045

Km= 0.3214

kemiringan= 0.0045

(10)

Lampiran 9. Data Hasil Sequencing Identifikasi Isolat JP2 dengan Menggunakan Gen Penyandi 16S rRNA