Penetapan Kandungan Fenolat Total Dan Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal Dpph Fraksi Etil Asetat Sari Buah Apel Beludru (Diospyros Blancoi a. Dc.)

1. Pendahuluan

Radikal bebas berupa atom atau molekul yang reaktif karena elektron pada orbital terluarnya tidak berpasangan (Clarkson and

Thompson, 2000). Radikal bebas tidak stabil sehingga mencari pasangan elektron dari molekul disekitarnya untuk mencapai kestabilan (Prakash, 2001).

R e a k t i v i t a s r a d i k a l b e b a s d a p a t m e n y e b a b k a n g a n g g u a n f u n g s i sel,kerusakan struktur sel, modifikasi molekul sehingga tidak dikenali sistem imun, dan bahkan menyebabkan mutasi. Target utama radikal bebas di dalam sel tubuh adalah protein, asam lemak tak jenuh, lipoprotein, dan unsur DNA (Winarsi, 2007).

R e a k t i v i t a s r a d i k a l b e b a s d a p a t dinetralkan oleh antioksidan, karena kemampuannya menyumbangkan elektron

(Prakash, 2001). Antioksidan dapat berasal dari bahan alam maupun sintetis. Senyawa antioksidan sintetissering memiliki efek samping tidak baik, sehingga banyak dicari alternatif antioksidan dari bahan alami (Sunarni, 2005).

Senyawa-senyawa polifenol mampu m e n g h a m b a t a u t o o k s i d a s i m e l a l u i mekanisme radikal scavenging dengan menyumbangkan satu elektron yang tidak berpasangan pada radikal bebas (Pokorny, Yanishlieva, and Gordon, 2001).Penelitian yang dilakukan oleh Lee, Jiang, Juan, Lin,

and Hou (2006) menunjukkanbahwa

Diospyros blancoi A. DC. mengandung senyawa golongan fenolat lebih dari 30 mgekivalen asam galat per gram ekstrak tanaman. Menurut Duke (2001) kuersetin yang merupakan suatu senyawa golongan

PENETAPAN KANDUNGAN FENOLAT TOTAL DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL DPPH FRAKSI ETIL ASETAT

SARI BUAH APEL BELUDRU (Diospyros blancoi A. DC.)

JOHANES BAPTISTA YUNIO RAHMAWAN, YOHANES DWIATMAKA

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta

Abstract: Antioxidant plays a role in inhibiting oxidation by binding to free radicals. As a result, the cell damage that leads to degenerative diseases can be inhibited. This research was conducted to determine the antioxidant activity and total phenolic content of ethyl acetate fraction of velvet aple (Diospyros blancoi A.DC.) juice. Previously known that other plants from genus Diospyros contain phenolic compounds such as quercetin. Antioxidant activity test performed qualitatively and quantitatively using radical of 1,1-diphenyl-2 pikrilhidrazil (DPPH) and expressed as the value Inhibition Concentration 50 (IC ). Determination of total 50

phenolic using Folin-Ciocalteu method expressed as equivalent mass of gallic acid. Phenolic compounds will be oxidized by the Folin-Ciocalteu under alkaline conditions, forming a blue solution. The results showed that the ethyl acetate fraction of velvet apple juice has very strong antioxidant activity with IC of (30.0 ± 0.09) mg / mL. Total phenolic content of (393.5 ± 0.35) mg 50

gallic acid equivalents per gram of ethyl acetate fraction.

Keywords: antioxidant, velvet apple (Diospyros blancoi A. DC), ethyl acetate fraction, DPPH, total phenolic content.

flavonoid ditemukan pada tanaman

American persimmon (Diospyros virginiana

L.) yang masih satu genus dengan apel beludru (Diospyros blancoi).

D a r i i n f o r m a s i t e r s e b u t d a p a t diperkirakan apel beludru juga memiliki kandungan flavonoid. Golongan flavonoid juga memiliki kerangka struktur fenolat, maka tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas antioksidan dan kandunganfenolat total dari buah apel beludru. Buah apel beludrudapat dikonsumsi dan sering dijumpai di pedagang buah.

Penentuan aktivitas antioksidan dalam penelitian ini menggunakan metode DPPH. R a d i k a l D P P H ( 1 , 1 d i f e n i l 2 -p i k r i l h i d r a z i l ) d a -p a t d i r e d u k s i a t a u distabilisasi oleh antioksidan. Larutan DPPH memiliki panjang gelombang serapan maksimum pada 517 nm. Penurunan absorbansi DPPH dalam larutan campuran dengan antioksidan menjadi dasar pengujian antioksidan pada metode DPPH ini (Duh, Tu,

and Yen, 1999). Besarnya aktivitas antioksidan dinyatakan dalam nilai IC , 50

yaitu konsentrasi senyawa antioksidan yang menyebabkan penurunan 50% dari konsentrasi DPPH awal (Sunarni, 2005). Sedangkan penetapan kadar fenolat total dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteau menurut Aqil, Ahmad, dan Mehmood(2006). Kadar fenolat total dinyatakan dalam kesetaraan dengan massa ekivalen asam galat.

Berdasarkan uraian di atas, maka penelitian ini ingin mengetahui kandungan fenolat total yangdinyatakan dengan massa

e k i v a l e n a s a m g a l a t d a n n i l a i aktivitasantioksidan fraksi etil asetat sari buah apel beludru yang dinyatakan dengan IC .50

2. Metode Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah.Beberapa bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah: buah apel beludru, methanol (Merck), kuersetin (Sigma), DPPH (Sigma), reagen Folin-Ciocalteu (Sigma), asam galat (Sigma).Peralatan yang digunakan antara lain: spektrofotometer UV-VIS (Shimadzu), mikropipet 10-1000 μL; 1-10 mL (Acura 825, Socorex), neraca analitik (Scaltec SBC 22, BP 160P), vacuum rotary evaporator

(Junke & Kunkel).

2.1. Determinasi tanaman

Determinasi tanaman apel beludru dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Fakultas farmasi Universitas Sanata Dharma menurut Morton (1987) danUnited States of Department Agriculture NRCS.

2.2. Pengumpulan bahan

Buah apel beludru diperoleh dari kawasan Kampus III Universitas SanataDharma Paingan, Sleman, Yogakarta. Pemanenan buah masak yang tidak berbiji, pada pagi hari dilakukan akhirbulan januari.

2.3. Preparasi buah apel beludru

dikupas dan dibersihkan denganair mengalir kemudian dipotong sekecil dan setipis mungkin. Diambil 350 gramdaging buah segar yang telah dipotong kemudian ditambahkan akuades hinggaterendam selanjutnyadihaluskan dengan blender. Sari buah merupakan filtrat yangdiperoleh melalui penyaringan berulang dengan bantuan pompa vakum. Sari buah yang didapat diekstraksi cair-cair menggunakan

wash benzinedengan perbandingan (1:1 v/v), kemudian didiamkan sampai terpisah sempurna.Langkah ini dilakukan sebanyak 3 kali.Fraksi wash benzinedisingkirkan, selanjutnya sari buah diekstraksi cair-cair m e n g g u n a k a n e t i l a s e t a t denganperbandingan 1:1 (v/v) sehingga didapatkan sari buah dan fraksietil asetat. Fraksi etil asetat dipekatkan dengan vacuum rotaryevaporator hingga pelarut etil asetat tidak mengalir, lalu dikeringkan dalam oven

o

pada 50 C sampai bobot tetap, selanjutnya disebut fraksi etil asetat buah apel beludru.

2.4. Uji kandungan fenolat

2.4.1. Pembuatan larutan baku asam galat

Asam galat dilarutkan dalam campuran akuades:metanol (1:1) dan dibuat seri pengenceran sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50; 75; 100; 125;dan 150 μg/mL.

2.4.2. Pembuatan larutan uji untuk penentuan kandungan fenolat total

Dibuat larutan uji fraksi etil asetat sari buah apel beludrudalam metanol, dengan konsentrasi 300 μg/mL.

2.4.3. Uji pendahuluan keberadaan senyawa fenolat

Sejumlah 0,5 mL larutan uji 300,0

μg/mL dan larutan pembanding asamgalat 150,0 μg/mL masing-masing dimasukkan dalam tabung reaksi dan ditambah 2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteu yang telahdiencerkan dengan akuades (1:10 v/v). Larutan didiamkan selama 10menit, lalu ditambahkan 2 mL larutan natrium karbonat 1 M, kemudian dihomogenkan dengan vortex selama 30detik. Perubahan warna larutan menjadi biru menunjukkan keberadaan golongan senyawa fenolat.

2.4.4. Penetapan kandungan fenolat total

1) Pembuatan kurva baku asam galat

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50, 75, 100, 125, dan 150 μg/mL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1M. Setelah OT,

absorbansinya dibaca pada λmaksyaitu 751 nm terhadap blanko yang terdiri atas akuades : metanol p.a (1:1), reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat 1M. Pengerjaan dilakukan 3 kali.

2) Estimasi kandungan fenolat total larutan uji

Diambil 0,5 mL larutan uji 300 μg/mL, lalu dimasukan ke dalam labu takar 10,0 mL dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku asam galat. Kandungan fenolat total dinyatakan sebagai miligram ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat, dilakukan 3 kali replikasi.

2.5. Uji aktivitas antioksidan

2.5.1. Pembuatan larutan pembanding kuersetin

Kuersetin dilarutkan dalam metanol dan dibuat seri pengenceran sehingga diperoleh konsentrasi larutan kuersetin sebesar 5; 7,5; 10; 12,5; dan 15 μg/mL.

2.5.2. Larutan uji untuk aktivitas antioksidan

Dibuat seri larutan uji fraksi etil asetat dalam metanol, dengan konsentrasi 15, 20, 25, 30, dan 35 μg/mL.

2.5.3. Pembuatan larutan DPPH

DPPH sebanyak 15,7 mg dilarutkan menggunakan metanol dalam labu ukur 100,0 mL sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.

2.5.4. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan

Ke dalam tiga buah tabung reaksi masing-masing dimasukkan sebanyak 1 mL larutan DPPH.Selanjutnya masing-masing ditambah dengan 1 mL metanol, larutanpembanding kuersetin 37,5 μg/mL, dan larutan uji 200

μg/mL. Selanjutnyalarutan ditambah dengan 3 m L m e t a n o l . K e m u d i a n l a r u t a n dihomogenkan dengan vortex selama 30 detik. Perubahan warna larutan menjadi kekuningan menunjukkan adanya aktivitas antioksidan.

2.5.5. Uji aktivitas antioksidan

Uji aktivitas antioksidan ditentukan d e n g a n m e n g g u n a k a n metodespektrofotometri sesuai dengan penelitian Nusarini (2007).

1) Pengukuran absorbansi larutan

DPPH (kontrol)

Pada labu ukur 10 mL, dimasukan sebanyak 2 mL larutan DPPH.Ditambahkan larutan tersebut dengan metanol hingga tanda b a t a s . K e m u d i a n l a r u t a n d i b a c a absorbansinya pada saat OT (35 menit) dan panjang gelombangserapan maksimum yaitu 516 nm. Pengerjaan dilakukan sebanyak 3 kali.

2) Pengukuran absorbansi larutan

pembanding dan larutan uji

Sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mLkemudian ditambah dengan 2 mL larutan pembanding dan uji pada berbagai s e r i k o n s e n t r a s i y a n g t e l a h d i b u a t . Selanjutnya larutan tersebut ditambah dengan metanol hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian dihomogenkan dengan vortex selama 30 detik dandiamkan selama

OT (30 menit). Larutan dibaca absorbansinya dengan spektrofotometervisibel pada panjang gelombang serapan maksimum hasil optimasi, yaitu 516 nm. Pengujian dilakukandengan 3 kali replikasi.

3) Estimasi aktivitas antioksidan

Data hasil pengukuran absorbansi larutan uji (fraksi etil asetat sari buah apel beludrudan senyawa pembanding larutan rutin)digunakan untuk menghitung nilai %IC dan IC .50

Aktivitas penangkapan radikal DPPH (%IC) dihitung dengan rumus :

Nilai aktivitas antioksidan yang

dinyatakan denganIC50 ditentukan dengan

persamaan garis regresi linear antara

konsentrasi larutan uji (sumbu x) dengan % IC (sumbu Y).

3. Hasil dan Pembahasan 3.1. Penyiapan bahan penelitian

Determinasi menjadi langkah awal penelitian untuk mendapatkan kepastian mengenai kebenaran tanaman yang hendak digunakan. Determinasi tanaman dalam penelitian inidilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Fakultas Farmasi UniversitasSanata Dharma menurut Morton (1987) dan United States of Department AgricultureNRCS. Berdasarkan hasil degterminasi tersebut diketahui bahwa tanaman yang digunakan adalah Diospyros blancoi A. DC yang umum dikenal dengan nama apel beludru.

Buah dari tanaman apel beludru untuk penelitian ini diperoleh dari lingkungan Kampus III Universitas SanataDharma Paingan, Sleman, Yogakarta. Pemanenan buah yang sudah masak dilakukan akhirbulan Januari 2013 dengan kriteria warna merahkusam, tidak berbiji, utuh, segar.Buah sesegera mungkin dikupas dan daging buahnya dihaluskan. Menurut Evans and Hedger (2001) enzim polifenol oksidase cepat mendegradasi senyawa-senyawa polifenol. Untuk meminimalkan kerusakan, maka sari buah yang didapatkan segera diekstrasi cair-cair dengan wash benzine

kemudian fraksi air diekstraski dengan etil asetat.

Ekstraksi menggunakan washbenzine

digunakan untuk menarik senyawa non polar seperti klorofil, vitamin, minyak dan lemak

(Snyder 1997). Kelompok senyawa-senyawa t e r s e b u t k u r a n g d i k e n a l a k t i v i t a s antioksidannya, sehingga perlu disingkirkan. Fase air yang didapat dari proses ekstraksi dengan washbenzine kemudian diekstraksi menggunakan etil asetat. Ekstraksi dengan etil asetat ditujukan untuk menarik senyawa a g l i k o n t e r m a s u k d a r i g o l o n g a n polifenol.Hasil ekstraksi cai-cair ini akan menghasilkan fraksi etilasetat yang banyak mengandung golongan fenolat, sehingga aktivitas antioksidannya diharapkan cukup tinggi. Fraksi etil asetat yang diperoleh kemudian diuapkan pelarutnya dengan

vacuumrotary evaporator supaya tidak merusak kestabilan senyawa fenolat. Setelah dikeringkan dalam oven sampai bobot tetap, rendemen fraksi etil asetat yang didapat sebesar 0,046%.

3. 2. Uji senyawa fenolat

Langkah awal adalah uji kualitatif senyawa fenolat pada fraksi etil asetat.Uji ini menggunakan prinsipreaksi oksidasi-reduksi pada suasana basa. Dalam suasana basa, senyawa fenolat akan berubah menjadi ion fenolat. Menurut Singleton dan Rossi (1965)ion fenolat bersifatlebih reaktif terhadap adanya pereaksi fenol Folin- Ciocalteu. Asam fosfomolibdatfosfotungstat dalam pereaksi fenol Folin- Ciocalteu akan tereduksi oleh ion fenolattersebut sehingga akan terbentuk larutan dengan warna biru. Pengujian (Gambar 1) menunjukkan hasil positif bahwa fraksi etil asetat sari buah apel beludrumengandung senyawa fenolat.

sebagai ekivalen asam galat. Berdasarkan persamaan kurva baku asam galat yang

-3

diperoleh (y = 5,3782.10 x – 0,0564 dan R= 0,9997) maka kandungan fenolat total dalam fraksi etil asetat sari buah apel beludru dapat ditentukan (Tabel I).

Berdasarkan hasil perhitungan didapatkan hasil kandungan fenolat total rata-rata pada sampel sebesar 393,52 ± 0,35 mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat sari buah apel beludru. Kandungan fenolat total

i n i b e r h u b u n g a n d e n g a n d a y a antioksidannya. Namun demikian tidak selalu kenaikan kandungan fenolik total diikuti naiknya aktivitas antioksidan. Jenis senyawa fenolat yang ada juga sangat menentukan aktivitasnya. Oleh karena itu masih diperlukan tahap penelitian lanjutan yaitu menentukan senyawa yang paling berperan dalam aktivitas antioksidan dalam fraksi etil asetat sari buah apel beludru ini.

3.3. Uji aktivitas antioksidan

Senyawa DPPH banyak digunakan untuk uji aktivitas antioksidan. Senyawa radikal DPPH cukup stabil pada suhu ruangan dan berwarnaviolet dalam metanol. Antioksidan a k a n m u d a h m e r u s a k r a n t a i y a n g bertanggung jawab sebagai warna ungu dan menjadi warnakuning (Badarinath et al., 2010).

Senyawa DPPH memiliki elektron yang tidak berpasangan sehingga bersifat radikal. Ketika elektronnya menjadi berpasangan karena bereaksi dengan suatu antioksidan ( p e n a n g k a p r a d i k a l b e b a s ) , m a k a absorbansinya menurun secarastoikiometri sesuai jumlah elektron yang diambil ( G a m b a r 2 ) . K e b e r a d a a n senyawaantioksidan dapat mengubah warna l a r u t a n D P P H d a r i u n g u m e n j a d i kuning(Dehpour, Ebrahimzadeh, Nabavi,

and Nabavi, 2009). Sifat inilah yang

Replikasi Fenolik total

(mg ekivalen) Rata-rata ± sd CV (%) I 393,12 393,52 ±0,35 0,0877 II 393,75 III 393,68

Gambar 1. Hasil uji pendahuluan keberadaan senyawa fenolat (A = kontrol negatif [Folin Ciocalteu danNa CO ], B = kontrol positif [asam 2 3 galat + Folin Ciocalteu dan Na CO ], C= larutan uji 2 3

[fraksietil asetat sari buah apel beludru + Folin Ciocalteu dan Na CO ], D =asam galat, E =fraksi 2 3

etilasetat sari buah apel beludru)

Tabel I. Hasil perhitungan kandungan fenolat total

digunakan sebagai dasar penggunaan radikal DPPH sebagai bahan uji aktivitas antioksidan.

Penelitian ini menunjukkan hasil positif dengan larutan uji berwarna kuningseperti kontrol positif (larutan kuersetin). Hal ini menunjukkan bahwa fraksi etil asetat sari buah apelbeludru memiliki aktivitas antioksidan (Gambar 3).

Parameter aktivitas antioksidan dengan metodepenangkapan radikal DPPH ini adalah nilaiIC yakni konsentrasi senyawa 50

uji yangdibutuhkan untuk mengurangi jumlah radikal DPPH sebesar 50%. Nilai IC 50

diperoleh daripersamaan regresi linier yang m e n y a t a k a n h u b u n g a n a n t a r a konsentrasisenyawa uji dengan persen aktivitas antioksidan. Semakin kecil nilai IC senyawauji, maka semakin poten 50

senyawa uji tersebut sebagai antioksidan. Dari hasil penelitian ini diperoleh bahwa bahan uji fraksi etil asetat sari buah

apel beludru memiliki daya antioksidan yang sangat kuat (IC = 29,920,09 µg/mL), 50

walaupun tidak sekuatkuersetin (IC = 50

10,800,31 µg/mL).Hal ini disebabkan karena fraksi etil asetat buah apel beludru masih merupakan campuran berbagai senyawa fenolat yang tidak semuanya memiliki aktivitas antioksidan yang kuat, sementara kuersetin merupakan senyawa murni. Berdasarkan nilai IC yang cukup rendah 50

(aktivitas sangat kuat) ini, maka fraksi etil asetat cukup potensial digunakan sebagai salah satu alternatif sumber senyawa antioksidan.

4. Kesimpulan dan Saran 4.1. Kesimpulan

1. Kandungan fenolat total fraksi etil asetat sari buah apel beludru sebesar 393,5 ± 0,35 mgekivalen asam galat per gram fraksi.

2. Fraksi etil asetat sari buah apel beludru memiliki daya antioksidan sangat kuat denga nilai IC sebesar30,0 ± 0,09 50 μg/mL.

4.2. Saran

Perlu dilakukan identifikasi senyawa yang paling potensial sebagai antioksidan dalam fraksi etil asetat sari buah apel beludru.

Daftar Pustaka

Aqil, F., Ahmad,I., and Mehmood, Z., 2006, Antioxidant and Free Radical Scavenging Properties of Twelve Traditionally Used Indian Medical Plants, Turk J Biol, 30,177-183

Badarinath, A.V., Mallikarjuna, K., , Chetty, C., Sudhana, M., Ramkanth, S., Rajan, T.V.S, and Gnanaprakash, K., 2010, A Review on In-vitro Antioxidant Methods: Comparisons, Correlations

Gambar3. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A= kontrol negatif [blanko DPPH], B=kontrolpositif [kuersetin + DPPH], C= larutan uji

[fraksi etil asetat sari buah + DPPH], D=kuersetin,E=fraksi etil asetat sari buah apel

and Considerations, Int. J. Pharm. Tech. Research, Vol.2, No.2, pp. 1276-1285.

Clarkson, P.M., and Thomson, H.S. 2000. Antioxidants: What role do they play in physical activity and health, Am. J. Clin. Nutr. 729 (Suppl): 637.

Dehpour AA, Ebrahimzadeh MA, Nabavi SF, and Nabavi SM (2009), Antioxidant activity of methanol extract of Ferula assafoetida and its essential oil composition, Grasas Aceites, 60(4): 405-412.

Duh, P., Tu,Y. and Yen,G., 1999, Antioxidant activity of water extract of Harng Iyur (Chrysanthemum morifolium Ramat), Lebensm Wiss U Technol 32: 269-277.

Duke, J.A., 2001, Handbook of Phytochemical Constituents of Grass Herbs and Other Economic Plants, CRC Press, Washington D.C., pp.235 Evans, C.S., and Hedger, J.N., 2001, Degradation of

Plant Cell Wall Polymers, in Gadd, G.M., (Ed.), Fungi in Bioremediation, Cambridge University Press, United Kingdom, 18.

Lee, M.H., Jiang, C.B., Juan, S.h., Lin, R.D. and Hou, W.C. 2006. Screening of medicinal plant extracts for antioxidant activity, Life Science, 73: 167-179. Morton, J., 1987, Fruit of Warm Climate, Mabolo,

Miami, FL, pp. 418-419.

Nusarini, N.M.R., 2007, Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat Ekstrak metanolik Herba Ketul ( Bidens pilosa L.), Skripsi, 15-20, Fakultas Farmasi

Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Pokorny, J., Yanishlieva, N., and Gordon, M., 2001, Antioxidant in Food, Practical Aplication, Wood publishing Limite, Cambridge, England, pp. 22-123.

Prakash, A., 2001, “ Antioxidant Activity “ Medallion Laboratories : Analithycal Progress Vol 19 No : 2. 1 – 4.

Singleton,V.L. and Rossi, J.A., 1965,Colorimetry of To t a l P h e n o l i c s w i t h P h o s p h o m o l y b d i c -phosphotungstic Acid Reagents, Am. J. Enol. Vitic.16:144-58.

Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L., 1997, nd Practical HPLC Method Development, 2 ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 67-68, 6. Sunarni, T., 2005, Aktivitas Antioksidan Penangkap

Radikal Bebas Beberapa kecambah Dari Biji Tanaman Familia Papilionaceae, 53-61, Jurnal Farmasi Indonesia 2 ( 2 ) , Jakarta.

United States of Department Agriculture (USDA) NRSC, Plant database: Diospyros blancoi A. DC., http://plants.usda.gov/java/nameSearch, diakses tanggal 31 Mei 2013.

Winarsi, H., 2007,Antioksidan Alami Dan Radikal, edisi I, Kanisius, Yogyakarta, p.17.

World Health Organization, 2003, WHO Guidelines on Good Agricultural and Collection Practices (GACP) for Medicinal Plants, Government of the Grand Duchy of Luxembourg, pp. 11-15.