KRITERIA INOKULUM 11/04/2012 PENGEMBANGAN INOKULUM UNTUK KHAMIR PENGEMBANGAN INOKULUM UNTUK BAKTERI

(1)

Tujuan Instruksional Khusus :

• Mahasiswa mampu menjelaskan pengembangan inokulum untuk proses fermentasi

Elisa Julianti - THP-FP USU

KRITERIA INOKULUM

kultur tersedia dalam keadaan aktif dan sehat  fase lag minimal.

tersedia dalam jumlah cukup

bebas dari kontaminan

kemampuan membentuk produknya stabil

Pada perkembangan inokulum diinginkan jumlah sel yang tinggi dan mempunyai kemampuan yang aktif untuk membentuk produk  komposisi media untuk pengembangan inokulum ≠ media fermentasi.

Sumber karbon pada media untuk pengembangan inokulum < media untuk fermentasi kecuali pada produksi protein sel tunggal (PST).

Proporsi inokulum 3-10% dari volume total media.

PENGEMBANGAN INOKULUM UNTUK KHAMIR

Contoh pengembangan inokulum untuk khamir pada pembuatan ragi roti (baker’s yeast)  dilakukan dalam 5 tahap proses, yaitu 2 (dua) tahap secara aseptik dan 3 (tiga) tahap berikutnya dalam tangki yang bagian atasnya terbuka (Gambar 1)

Tahap 1: 0.2 kg menjadi 190 selama 24 jam Tahap 2: 190kg menjadi 1000 kg selama 9 jam

Tahap 3: 1000kg kg menjadi 5000 kg selama 11 jam

Tahap 4: 1000kg kg menjadi 5000 kg selama 11 jam (Diulangi 5 kali)

Tahap akhir 1000kg kg menjadi 5000 kg selama 11 jam (Diulangi 25 kali)

Waktu Fermentasi (jam) Berat Khamir (103kg)

0 60

20 30 40 50 60

20 40

10 70 80 100

Gambar 1. Proses pengembangan inokulum pada proses produksi baker’s yeast komersial.

PENGEMBANGAN INOKULUM UNTUK BAKTERI

Tujuan Utama : memperoleh sejumlah massa sel aktif pada fase logartima.

Panjang fase log ditentukan oleh : - keadaan fisiologis kultur inokulum

- umur inokulum (pada bakteri pembentuk spora)

Spora terbentuk pada akhir fase log

Inokulum dengan populasi spora   fase log 

(2)

Log jumlah mikrobia yang hidup

A B C

D

E F

Waktu

Gambar 2. Grafik Pertumbuhan Mikrobia. Tahap A-B = tahap istirahat (lag phase), ahap B-C = tahap tumbuh (accelerate phase), Tahap C-D

= fase log, Tahap D-E = tahap tumbuh reda (decelerate phase), Tahap E-F = tahap stasioner, Tahap F = tahap kematian

PENGEMBANGAN INOKULUM UNTUK BAKTERI ...

Contoh :

1. Dalam produksi protease oleh Bacillus sp (thermofil) digunakan 5% inokulum kultur dalam fase logaritma.

2. Produksi oleh B.subtillis diawali dengan

menumbuhkan kultur pada media padat atau cair 1-2 hari, dan tahap berikutnya sampai skala produksi dapat dilihat pada Tabel 1.

3. Produksi aseton butanol oleh Clostridium acetobutylicum juga dilakukan pada 5 tahap seperti terlihat pada Tabel 2.

Tabel 1. Pengembangan inokulum pada proses produksi protease oleh B.subtillis

Tahap Kondisi Kultur Waktu Inkubasi 1 Media 4L, digojog, diinokulasi kultur stok 18-24 jam 2 Kultur tahap 1 diinokulasikan dalam 750 L

media 6 jam

3 Kultur tahap 2 diinokulasikan dalam 6000 L

media 6 jam

4 Kultur tahap 3 diinokulasikan dalam media produksi 120.000 L

Sampai produksi enzim optimal

Tabel 4.2. Pengembangan inokulum pada produksi aseton butanol oleh Clostridium acetobutylicum.

Tahap Kultur Medium

1 Rekonstitusi sel kultur stok, 24 jam Potato glucose broth 2 Tahap 1, diinokulasikan dalam 600 ml

media, 20-24 jam 4% glukosa, 5%

amonium sulfat, 6%

kalsium karbonat, 6.2%

fosfor pentaoksida 3 90 ml tahap 2 diinokulasikan dalam 3000

ml media, 20-24 jam Seperti tahap 2

4 3000 ml tahap 3 diinokulasikan dalam 25.000 L media

Seperti tahap 2, glukosa 6%

5 Kultur tahap 4 diinokulasikan (0.5-3%

inokulum) ke dalam 300.000-2.500.000 L media untuk skala produksi

Seperti tahap 4 dengan amonia sebagai kontrol pH

Pengembangan inokulum bakteri asam laktat dalam pembuatan minuman sari buah yang mengandung probiotik :

Kultur yang digunakan adalah kultur liofilisasi yaitu kultur bakteri asam laktat yang diisolasi dari berbagai bahan pangan yang mengalami fermentasi asam laktat seperti pikel sauerkraut, yoghurt, dadih, yakult atau tempoyak .

Kultur liofilisasi dipindahkan ke dalam tabung berisi media MRS broth (de Mann Rogosa Sharpe)

Kultur ini kemudian disimpan pada media MRS agar yang ditambah 0.1% (b/v) CaCO3 dengan menggunakan metode tusuk.

Kultur diinkubasikan pada suhu 37^oC selama 48 jam  kultur stok (disimpan di dalam refrigerator suhu 4^oC) , disegarkan kembali minimal sebulan sekali. Inokulum yang akan ditambahkan ke dalam minuman sari buah dibuat dalam bentuk kultur kerja.

Kultur kerja dibuat dengan menggunakan media sari buah dan susu skim.

Kultur induk sebanyak 0.1% di tumbuhkan pada media sari buah yang mengandung susu skim 10% dan diinkubasikan pada suhu 37^oC selama 48 jam, sehingga dihasilkan koloni sebanyak 1.0-4.0 x 10⁹ koloni/ml dengan kadar asam laktat kurang lebih 2.7%.

Selanjutnya kultur ditambahkan lagi sebanyak 0.5% dalam media sari buah yang ditambah susu skim 10% dan glukosa 3%, dan diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37^oC.

Kultur induk perlu diperbaharui setiap minggu dengan cara menumbuhkannya ke dalam media sari buah dan susu skim 10%.

(3)

Kultur  MRS Broth  Agar MRS

Liofilisasi (48-72 jam 37^oC) Kultur stok

Sari buah + Susu skim 10%

Kultur induk (48 jam, 37^oC)

Sari buah + susu skim 10%

Kultur antara (48 jam, 37^oC)

Sari buah + susu skim 10% + 3% glukosa Kultur kerja (24 jam, 37^oC)

Gambar 3. Tahap-tahap persiapan inokulum bakteri dalam pembuatan minuman sari buah dengan probiotik. Elisa Julianti - THP-FP USU

PENGEMBANGAN INOKULUM UNTUK KAPANG

Inokulum berupa spora aseksual

Jamur dapat membentuk spora pada media yang sesuai dan luas permukaan yang cukup.

Penggunaan sel vegetatif dapat dilakukan, tetapi sulit karena populasi inokulum tidak seragam sehingga perlu pemotongan miselia (misalnya dengan warring blender). Teknik ini digunakan dalam produksi giberelin oleh Gibberella fujikuroi.

Cara-cara pengembangan inokulum kapang :

1. Sistem roll bottle

 Media berupa agar 3% yang disterilisasi dalam botol berbentuk silinder dengan ukuran 1 L hingga melekat di permukaan bagian dalam dari botol, kemudian diinokulasikan spora kapang dan diinkubasi pada suhu 24^oC selama 6-7 hari  diterapkan dalam produksi penisilin oleh Penicillum chrysogenum.

Cara-cara pengembangan inokulum kapang : ...

2. Sporulasi pada media biji-bijian dan sekam

Media berupa biji-bijian dan sekam seperti biji barley dan sekam gandum disterilisasi, kemudian

diinokulasikan dengan jamur dan diinkubasi pada suhu 28^oC selama 6 hari sengan RH 98%.

Contoh: Aspergillus ochraceus dalam 2.8L gelas diisi dengan 100-200 g barley dan sekam, akan menghasilkan 5 x 10¹¹ konidia.

Cara-cara pengembangan inokulum kapang : ...

3. Sporulasi secara submerged culture

Misalnya pada persiapan inokulum untuk produksi gliserofulvin oleh Penucillum patulum dalam media whey dan corn step liquor dengan aerasi yang cukup.

Tahap pengembangan inokulum untuk jamur benang sama dengan bakteri dan khamir.

Contoh produksi penicilin dilakukan dengan 5 (lima) tahap persiapan inokulum seperti terlihat pada Tabel 3

(4)

Tabel 3. Tahap pengembangan inokulum dalam proses produksi penisilin oleh Penicillum chrysogenum.

Tahap 1 Kultur stok-spora dalam pasir steril Tahap 2 Kultur dipindah ke media agar

Tahap 3 Kultur dalam roll tube, kultur spora dalam 1L botol Tahap 4 Miselia dan spora tumbuh dalam skala produksi pertama Tahap 5 Tahap 4 digunakan untuk inokulasi skala produksi kedua,

produksi penisilin (volume inokulum 7-10%).

INOKULASI SECARA ASEPTIK

Teknik inokulasi dalam industri fermentasi meliputi:

pemindahan kultur mikroba dari suspensi spora pada skala laboratorium sampai skala produksi (pabrik)  harus dilakukan secara aseptik.

Dasar teknik aseptik pada proses inokulasi adalah :

Mempertahankan tekanan positif di dalam tanki

Tempat jalan masuk pemindahan kultur (port) harus dilengkapi dengan jalur persediaan uap panas.

Sistem klep (valve) dapat diatur sedemikian rupa hingga setiap jalur yang dilalui kultur dapat disterilkan terlebih dahulu.

PENGGUNAAN SEL TERIMOBILISASI DALAM FERMENTASI

Inokulum yang digunakan dalam proses fermentasi dapat juga berupa sel-sel yang sudah diimobilisasi

Teknologi imobilisasi sel adalah lokalisasi sel selama proses perombakan berlangsung sehingga sel tersebut mudah dipisahkan dari substrat dan produk untuk digunakan kembali.

Keuntungan teknologi imobilisasi adalah :

pemanfaatan sel dapat berulang-ulang

mempermudah pengendalian proses

meningkatkan stabilitas sel

diperoleh produk bebas sel/enzim

tahan lama dan kerusakannya dapat diperhitungkan

Metode-metode untuk imobilisasi sel mikroba dibagi menjadi 3 (tiga) kelompok (Chibata et al., 1983) : 1. Metode Ikatan dengan pembawa (carrier) 2. Metode Ikatan melintang

3. Metode Penjeratan

ad 1. Metode Ikatan dengan pembawa

Didasarkan pada pengikatan sel-sel mikroba langsung pada pembawa yang tidak larut air dengan 3 metode penyerapan yaitu fisik, ionik dan kovalen.

Carrier : polisakarida tidak larut air (sellulosa, dekstran dan turunan agarosa), protein (gelatin dan albumin), polimer sintetik (resin pertukaran ion dan polivinilklorida) dan oksida logam (zirkonium oksida dan titanium oksida), serta gelas berliang renik.

ad.2. Metode Ikatan Melintang

Didasarkan pada pembentukan ikatan melintang di antara sel-sel dengan bantuan pereaksi-pereaksi bifungsional atau multifungsional.

Digunakan untuk imobilisasi sel-sel E.coli yang mempunyai aktivitas aspartase yang tinggi.

Sel-sel E.coli diimobilisasi dengan memperkuat dinding sel dan mengikat sel-sel secara melintang dengan pereaksi bifungsional seperti glutaraldehida atau toluendiisosianat.

(5)

CH═N-sel-N═CH(CH2)3CH═N-sel═CH

│ N ║ CH │ OHC(CH2)3CHO + sel  (CH2)3

glutaraldehida │ CH ║ N │ -CH═N-sel-N-CH-

Gambar 3. Imobilisasi sel dengan metode ikatan melintang antar sel menggunakan glutaraldehida

ad.3. Metode Penjeratan

Metode yang menjerat sel secara langsung ke dalam matriks polimer.

Paling banyak digunakan untuk imobilisasi sel dalam keadaan hidup.

Jenis-jenis pembawa yang digunakan untuk menjerat sel dikelompokkan berdasarkan mekanisme pembentukan gel (Tabel 4).

Tabel 4. Metode yang dapat diterapkan untuk imobilisasi sel utuh dengan metode penjeratan dalam gel.

Mekanisme pembentukan gel Polimer

Polimerisasi Poliakrilamida, polimetakrilat Ikatan melintang Berbagai prapolimer protein Polikondensasi Poliuretan, Resin epoksi Pembentukan gel secara thermal Kolagen, gelatin, agar/agarose, -

karagenan

Secara ionotropik Alginat, Kitosan

Presipitasi Selulosa, selulosa triasetat

Tabel 5. Produksi senyawa-senyawa penting menggunakan sel-sel hidup terimobilisasi

Senyawa Sel-sel Mikroba Carrier untuk Imobilisasi Bir Saccharomyces

carlsbergensis Saccharomyces cerevisae

Polivinil klorida, bata, berliang renik, Kalsium alginat

Etanol Saccharomyces cerevisae Kalsium alginat, k- karagenan,poliakrilamida, cincin Raschig berlapis, serpihan kayu Saccharomyces

carlsbergensis Saccharomyces bayanus Kluyveromyces fragilis Pachysolen tannophilus Zymomonas mobilis

k-karagenan, silika berliang renik k-karagenan

kalsium alginat kalsium alginat

kalsium alginat, k-karagenan, manik- manik polistiren, borosilikat, hambalan serat gelas.

Senyawa Sel-sel Mikroba Carrier untuk Imobilisasi Gliserol Saccharomyces cerevisae k-karagenan

Asam Asetat Acetobacter acetii Keramik berliang renik, Titanium hidrus Asam Sitrat Aspergillus niger

Saccharomyces lipolytica Kalsium alginat Serpihan kayu Asam Glukonat Aspergillus niger Kalsium alginat Asam laktat Lactobacillus lactis

Lactobacillus delbrueckii Kalsium alginat Kalsium alginat

Asam L-

Glutamat Brevibacterium flavum

Corynebacterium glutamicum Kolagen L-Isoleusin Serratia marcescens k-karagenan Vitamin B12 Propionibacterium freudenreichii Poliuretan

Amilase Bacillus subtilis Poliakrilamida

Selulase Trichoderma raesei k-karagenan

Protease Streptomyces fradie Poliakrilamida

PENGAWETAN DAN PEMELIHARAAN KULTUR

1. Suhu dingin, 5-10^oC, dilakukan penyegaran dengan cara pergantian media setiap minggunya.

2.Pembekuan :

 Suhu -20^oC atau lebih rendah.

 Perlu penambahan cryoprotective misalnya gliserol.

 Selama transportasi kultur harus dalam keadaan beku.

 Viabilitas 1-2 tahun 3. Pembekuan suhu ultra cold

 Suhu -50 sampai -80^oC.

 Cryoprotective yang digunakan : gliserol 10% (v/v) dan dimetil sulfoxida (DIMSO) 5% (v/v).

 Sel dipanen pada saat pertengahan atau akhir fase pertumbuhan 4. Pembekuan dengan Nitrogen cair dengan suhu -196^oC.

5. Pengeringan kultur.

(6)

Pengeringan Kultur

a.Pengeringan Vakum

b.Pengeringan Semprot (suhu 70^oC)

Telah berhasil di USA dan Swedia

Untuk mencegah kerusakan selama pengeringan ditambahkan senyawa :

- asam askorbat - Na-glutamat - Lisin

c. Pengeringan beku :

- Asam L-glutamat - Skim - L-arginin - Gliserol - Lactosa - Kasiton - Malt ekstrak - Asetil Glisin - Sukrosa

Pengawetan Spora Kapang

1. Pengeringan pada substrat tanah :

1 ml suspensi konidia + 5 g tanah kering steril kemudian dikeringkan pada suhu 25^oC.

2. Pengeringan pada silika gel :

Tabung reaksi (13 x 100 mm) diisi setengahnya dengan silika gel 6-12 mesh grade 40.

Sterilisasi 180^oC, 1.5 jam

Ditambahkan 0.5 ml suspensi spora

Tabung dikocok

Dikeringkan pada suhu 25^oC

Contoh : untuk Neurospora

3. Pengeringan pada pecahan porselen (untuk penyimpanan bakteri)

10-12 pecahan porselen dimasukkan ke dalam botol kecil (10 ml)

Disterilisasi 121^o C selama 15 menit

Dipindahkan ke dalam cawan petri

Ditetesi dengan kultur yang berisi 20% sukrosa (b/v)

Dipindahkan kembali ke dalam tabung

Dikeringkan vakum 72-96 jam

Botol disimpan dalam wadah logam tertutup dan berisi penyerap udara