PENGASINGAN DAN PENULENAN SEPARA GELATINASE DARIPADA
LYSINIBACILLUS SPHAERICUS
Munirah ,A. M., Mohd.Fadly L., KhairedzaR. A. H.
Politeknik Metro Kuantan, Pahang, Malaysia
ABSTRAK
Gelatinase yang dihasilkan daripada pelbagai mikroorganisma adalah enzim proteolitik yang menghuraikan substrat gelatin kepada sub-komponen (polipeptida, peptida dan asid amino) yang boleh merentasi sel membran untuk digunakan oleh organisma. Kajian ini merujuk kepada pengasingan dan penulenan separa enzim gelatinase yang dihasilkan oleh bakteria Lysinibacillus sphaericus. Bakteria penghasil gelatinase telah diasingkan daripada pelbagai sampel seperti hasil buangan khinzir, tanah dan juga sumber air panas. Sejumlah 270 koloni bakteria telah di periksa berdasarkan penentuan aktiviti gelatinase. Didapati 1 koloni telah menunjukkan keputusan yang positif terhadap tindakbalas hidrolisis ke atas gelatin iaitu bakteria Lysinibacillus sphaericus yang telah dikenalpasti melalui Biolog GEN III. Keadaan optimum bagi pertumbuhan sel bakteria bagi penghasilan gelatinase adalah dalam tempoh 24 jam pada suhu 37 °C dengan kelajuan emparan 200 rpm di dalam medium penimbal fosfat 0.1M pH 7.0. L.sphaericus dikultur dalam larutan nutrien mengandungi gelatin babi sebagai substrat spesifik bagi gelatinase untuk proses penyesuaian. Gelatinase yang dikumpul daripada supernatan L.sphaericus ditulenkan secara separa menggunakan kaedah pemendakan ammonium sulfat berperingkat pada 0-25%, 0-50%, 25-50% dan 50-75%. Semasa pemeriksaan pemendakan ammonium sulfat, keputusan eksperimen menunjukkan ekstrak kasar enzim daripada L.sphaericus termendak pada ketepuan ammonium sulfat 0-50% dalam larutan penimbal fosfat (0.1 M, pH 7). Aktiviti gelatinase ditentukan secara spektrofotometri pada 570 nm dengan menggunakan gelatin babi sebagai substrat. Gelatinase telah ditulenkan sehingga faktor penulenan sebanyak 1.8 dengan hasil akhir nya 1.3%. Spesifik aktiviti dapat ditentukan sebanyak 0.6 U/mg selepas langkah akhir proses penulenan. Secara keseluruhannya, suhu optimum dan pH optimum bagi gelatinase yang telah di tulenkan separa daripada Lysinibacillus sphaericus ialah 37 °C dan pH 7.0.
Keyword: Lysinibacillus sphaericus; gelatinase; penulenan separa; pemendakan ammonium; pengasingan bacteria
ABSTRACT
Gelatinase , which is produced by several microorganism, is a proteolitic enzymes that allows a living organisms to hydrolyse gelatin into its sub-compound (polypeptides, peptides and amino acids) that can cross the membrane cell and be used by the organism. The present study deals with the isolation and partial purification of enzyme gelatinase produce by bacteria Lysinibacillus sphaericus. The gelatinase producing bacteria was isolated from various samples like pig waste, soil and hot water. A total of 270 colonies bacteria were screened for the gelatinase activity. Out of 270 colonies, 1 colony were showed positive results in hydrolyzing gelatinase namely as Lysinibacillus
sphaericus strains was identified using Biolog GEN III. The optimum conditions for cell growth and gelatinase production were 37 °C in 24 h, agitation speed of 200 rpm in phosphate buffer (0.1M pH 7.0). Gelatinase was collected from supernatant of Lysinibacillus sphaericus culture broth containing porcine gelatine as a substrate and purified to electrophoretic homogenity through a partial purification schemes, which include ammonium sulphate precipitation at different concentration 0-25%, 0-50%, 25-50% dan 50-75%. During ammonium sulphate precipitation screening, it was observed that the crude enzyme from Lysinibacillus sphaericus precipitated at 50% of ammonium sulphate saturation in phosphate buffer (0.1 M, pH 7.0) recpectively. The activity of gelatinase was determined spectrophotometrically at 570 nm by using porcine gelatine as a substrate. The specific activity of partially purified gelatinase obtained from ammonium sulphate fractionation is found to be 0.6 and the fractionation is 1.8 fold purified from the crude enzyme preparation yielding 1.8% from the crude protein. The optimum temperature and pH of the partially purified gelatinase from Lysinibacillus sphaericus is found to be 37 °C and pH 7.0 respectively.
Keyword: Lysinibacillus sphaericus; gelatinase;bacteria isolation; ammonium precipitation; bacteria isolation
PENGENALAN
Perkembangan terkini dalam bidang bioteknologi, terutamanya di dalam bidang seperti kejuruteraan protein , telah menyediakan satu alat penting untuk pembangunan kemunculan enzim baru yang lebih berkesan. Keadaan ini telah membantu pembangunan enzim dengan ciri-ciri yang lebih baik untuk aplikasi teknikal yang telah sedia ada amnya serta di dalam proses penghasilan enzim baru yang masih belum diguna pakai di dalam mana-mana industri khususnya. Industri enzim yang semakin berkembang pesat pada hari ini adalah sumbangan daripada pembangunan pesat enzim bermula empat dekad yang lalu (Kirk et al. 2002).
Pada amnya penggunaan enzim di dalam industri adalah bukan dalam bentuk yang asli dan kebanyakannya tidak dilakukan pencirian yang khusus. Namun perkembangan yang semakin pesat di dalam industri enzim telah memberi tumpuan khusus untuk menghasilkan enzim yang asli atau tulen serta pencirian setiap enzim telah dikaji dengan lebih spesifik. Seterusnya enzim yang berjaya dihasilkan mampu di gandakan penghasilannya sehingga mencapai skala industri (Schmidt et all. 2001).
Gelatinase adalah salah satu enzim ekstraselular metallo-endopeptidase yang tergolong di dalam kumpulan protease. Gelatinase mampu menghidrolisis gelatin dan komponen-komponen lain seperti feromon, kolagen, kasein dan fibrinogen. Enzim ini telah digunakan secara meluas bukan sahaja di dalam bidang kimia dan famaseutikal malah telah berkembang sehingga merangkumi industri makanan dan biologi. (Hisano
et al. 1989; Makinen et al. 1994). Selain gelatinase, kolagenase juga merupakan metallo-protease yang sangat penting di mana kedua-dua enzim ini akan bertindakbalas secara spesifik ke atas substrat masing-masing iaitu gelatin dan kolagen.
Dalam kajian ini , bakteria gelatinase iaitu Lactobacillus sphaeicus telah diasingkan daripada pelbagai sampel dan penyaringan bakteria gelatinase dilakukan bagi mengesan gelatinase yang berpotensi mengesan gelatin babi. Lactobacillus sphaeicus dieramkan di dalam substrat yang spesifik iaitu gelatin babi untuk penghasilan enzim gelatinase. Proses pemendakan dan penulenan separa di jalankan ke atas enzim gelainase bagi mengangarkan saiz sebenar enzim yang telah di ekstrak. Enzim yang diperolehi berpotensi untuk digunakan sebagai alat pengesanan substrat gelatin babi di dalam mana-mana bahan makanan yang dihasilkan. Sehingga kini, tiada penyelidikan telah dijalankan, untuk melihat potensi mikroorganisma dalam menentukan kehadiran gelatin babi dalam makanan untuk pengesahan Halal. Bakteria gelatinase berpotensi akan bertindak balas dengan pewarna atau penunjuk yang tidak dibincangkan dalam kerja ini.
METODOLOGI Persampelan
Sebanyak 13 sampel telah digunakan untuk mengasingkan bakteria gelatinase. Semua sampel tanah telah dikumpulkan dari takungan babi termasuk sisa buangan babi kira-kira 200 gram (1 sampel), 9 sampel dari tanah (kedalaman 1 "- 5") dan 3 adalah dari kulit babi dan lembu (saiz 3 "x 2") pada bulan Disember 2010 . Dua belas sampel telah diambil dari Endau, Johor dan 1 sampel adalah air panas (500 ml) di ambil dari Hot Spring, Melaka. Semua sampel yang telah dipilih dan dibawa keluar untuk analisis dikekalkan pada suhu sejukbeku di dalam beg sampel plastik (saiz 5 "x 7") dan kotak sejuk beku bersama beg berisi ais. (Fadly, L. 2014)
Pengasingan dan penyaringan mikroorganisma
Pengasingan strain bakteria dilakukan dengan menimbang 1.0 gram tanah atau kulit kemudian dicampur bersama 2 ml larutan garam (1.5 % w/v). Campuran kemudian melalui pencairan dari 10-1 hingga 10-3 dan di platkan dengan kaedah plat sebaran pada medium agar gelatin [Gram per liter, g/l medium: 15.0 gelatin babi (Sigma), 3.0 beef extract (Merck), 5.0 bacteriological peptone (Oxoid) dan 15.0 agar (Oxoid), pH disesuaikan kepada 7.2] (Su. et al. 1991). Keputusan positif dapat ditentukan daripada
pembentukan halo di sekeliling koloni bakteria yang tumbuh. Kesemua bakteria gelatinase akan tumbuh di atas agar condong nutrient dan di simpan pada suhu 4 oC. Bagi penyimpanan jangka masa panjang bakteria disimpan di dalam 20%(v/v) gliserol dan disimpan pada suhu -20 oC.
Analisis Sistem Pengenalan Biolog
Pengenalpastian bakteria penghasil gelatinase telah dijalankan oleh Sistem Pengenalan Biolog GEN III (Biolog, Amerika Syarikat). Pengenalan itu berdasarkan keupayaan bakteria untuk menghidrolisis sumber karbon yang telah tersedia di microplate berkenaan. Bakteria yang dipencilkan telah berkembang pada agar nutrien pada suhu 37 o
C selama 24 jam. Penyediaan sel bakteria dilakukan dengan meletakkan koloni bakteria ke dalam cecair steril Biolog FF, kemudian sel bakteria diratakan secara perlahan-lahan dan kepekatan campuran dipastikan berada diantara 90 98 % menggunakan standard Biolog turbidimeter. Bakteria kemudian di inokulasi ke dalam setiap plat mikro (100 μL /telaga menggunakan pipet 8-channel) dan dieram pada 33 oC selama 24 jam. Baktreia yang tersedia di dalam plat di analisis menggunakan Bacaan plat Biolog.
Penyediaan Kultur Bakteria L. sphaericus
Sejumlah 1 x 108 cfu/ml koloni bakteria di eram 24 jam pada suhu 37°C di dalam nutrient broth (oxoid) [g/l; 10 peptone, 10 beef extract, 5 sodium chloride] dan 1 ml (w/v) di pindahkan ke dalam tiub pengempar mikro. Kultur kemudian inokulasikan ke dalam 15 ml media nutrien mengandungi 10% BHI (Brain Heart Infusion) dan di eram pada suhu 37C selama 24 jam (Balan et al. 2012). Bacaan kekeruhan (Optical Density) selepas tempoh inkubasi 24 jam ialah 8.7 x 10-3 pada A600 dengan bilangan koloni 8.7 x 102 CFU/ml. Berdasarkan laporan Balan et al. (2012),di anggarkan 3 ml inokulum mengandungi kepekatan mikrobial sebanyak 5.6 x 106 / ml di dalam 100 ml media kultur fermentasi.
Pengektstrakan enzim
Sebanyak 60 ml inokulum L. sphaericus di kulturkan ke dalam kelalang yang mengandungi 2 Liter media gelatin [g/l): 3.0 ekstrak lembu (nacalai tasque), 5.0 peptone bakteriologi (Sigma), 30.0 gelatin kulit babi (Sigma)] (Su et al. 1991) dengan pengubahsuaian. Kultur media di eram pada suhu 37C selama 48 jam dan diempar pada kelajuan 80 rpm , 4C (Makinen et al. 1989). Selepas 48 jam tempoh eraman, kultur media diemparkan pada kelajuan 3000 rpm selama 20 minit, suhu 4C (Balan et
al. 2012). Oleh kerana gelatinase adalah enzim ekstraselular, supernatan dikumpulkan, ditentukan isipadu baru dan di simpan pada suhu 4C untuk langkah pengasaian enzim dan pengekstrakan seterusnya.
Penyediaan Larutan Penimbal Fosfat (0.1 M, pH 7.0)
Sebanyak 13.6 g hablur kalium dihidrogen fosfat, KH2PO4 (JMR 136.1 g/L) dilarutkan dalam 1000 ml air suling. Kemolaran larutan menjadi 0.1M. Sebanyak 14.2 g dinatrium hydrogen fosfat Na2HPO4 (JMR 142 g/L) dilarutkan dalam 1000 ml air suling. Kemolaran larutan menjadi 0.1 M. Sebanyak 500 ml larutan KH2PO4 dituangkan ke dalam bikar dan ditambahkan larutan Na2HPO4 sedikit demi sedikit sehingga pH larutan menjadi 7.0.
Kaedah pengekstrakan akues pemendakan ammonium sulfat
Sebanyak 2 Liter supernatan mengandungi ekstrak kasar gelatinase dimendakkan secara berperingkat iaitu pada 0 - 25%, 0 – 50 %, 25 - 50% dan 50 - 75% ammonium sulfat pada suhu 4ºC berdasarkan kaedah Green & Hughens (1955). Jumlah ammonium sulfat bagi ketepuan 0 – 25 % adalah sebanyak 268 g berdasarkan jadual kepekatan akhir ammonium sulfat . Ammonium sulfat dimasukkan sedikit demi sedikit sehingga habis sambil pengacauan dengan magnet diteruskan pada suhu 4C dan pH 7.0 sentiasa dikekalkan menggunakan pH meter. Setelah kesemua ammonium sulfat terlarut, pengacauan diteruskan selama 30 minit. Protein yang telah terpisah seterusnya diempar pada 10000 rpm menggunakan ( Sorvall SLA 1500, Super-Lite), pada suhu 4ºC selama 20 minit. Pellet atau mendakan yang terbentuk kemudian dikumpulkan dan dilarutkan ke dalam tiub falkon yang mengandungi larutan penimbal fosfat (0.1 M, pH 7.0) sebelum peoses dialisis (Hashim et al. 2011). Jumlah penimbal fosfat (0.1 M, pH 7.0) yang diperlukan untuk melarutkan mendakan adalah dalam jumlah yang paling minimum dan isipadu dicatatkan.
Larutan protein perlu di dialisis menggunakan membran dialisis bersama larutan penimbal Fosfat (0.1 M, pH 7) semalaman diikuti penukaran penimbal fosfat beberapa kali. Tiub dialisis selulosa dicuci dengan memanaskannya selama 5 minit di dalam bikar yang mengandungi 1% EDTNaHCO3 untuk menyingkirkan sisa kimia.. Hasil larutan (dialisat) dalam bilik sejuk (4ºC ) dikenali sebagai gelatinasae separa tulen. Kromatografi Penukar Anion (DEAE-Toyopearl 650M)
Enzim yang telah didialisis dimasukkan ke dalam turus DEAE-Toyopearl 650M (16 x 40 cm) yang diseimbangkan menggunakan tiga kali isipadu turus 0.1 M penimbal fosfat
(pH 7.0) sebagai penimbal penulenan. Kepekatan protein bagi ekstrak kasar adalah rendah berbanding kepekatan maksimum protein turus bagi memastikan tiada lebihan protein akan terkeluar sebelum proses elutan. Pada fasa pegun penulenan, turus yang mengandungi sampel enzim ini telah dialirkan dengan penimbal penulenan sebanyak tiga isipadu turus bagi membolehkan protein yang tidak terikat pada resin dielut keluar. Protein yang terikat pada resin pula dielut dengan penimbal penulenan yang mengandungi kepekatan linear 0 sehingga 1.0 M Natrium klorida. Proses elutan protein dilakukan pada kadar aliran 1.5 mL/min denganelutan 7 mL per fraksi. Setiap fraksi elutan yang diperoleh melalui turus ini dilakukan pengasaian aktiviti gelatinase pada penyerapan 570 nm.
Kromatografi Penurasan Gel (TSK Gel -G3000 SW)
Kesemua fraksi aktif hasil pengelutan turus DEAE-Toyopearl 650 M di pekatkan sehingga 5 ml sebelum dimasukkan ke dalam turus TSK Gel-G3000SW.
Larian Elektroforesis
Sampel gelatinase akan dimasukkan ke dalam perigi-perigi (weld) pada gel poliakrilamida. Setiap sampel perlu di pipet sebanyak 30 µl ntuk setiap perigi di mana sampel perlu dicampur dengan 10 µl ‘tracking dye’. Bagi setiap gel yang disediakan terdapat dua jenis protein piawai dimasukkan sekali iaitu broad range dan kaleidescop. Ini bermakna pada setiap larian elektroforesis gel besar yang mengandungi 20 perigi masing-masing terdiri daripada 18 perigi yang mengandungi sampel dan 2 perigi yang mengandungi protein piawai. Peranan protein piawai ialah untuk memberi anggaran berat molekul protein yang terdapat di dalam sampel.
Larutan penimbal yang disediakan dimasukkan ke dalam tangki elektroferosis, berfungsi sebagai pengalir arus elektrik dalam proses elektroferosis. Bekalan arus elektrik yang digunakan adalah 300 V. Sampel akan bergerak menuruni gel semasa larian dijalankan. Larian elektroferosis boleh dihentikan apabila sampel telah menuruni sebanyak 99% atau dalam jangka masa 5 jam. Selepas larian dihentikan, gel poliakrilamida perlu ditanggalkan daripada kepingan kaca dan perlu direndam di dalam bekas yang mengandungi pewarna.
KEPUTUSAN DAN PERBINCANGAN
Kajian telah dijalankan untuk mengasingkan bakteria yang berpotensi mengesan kehadiran gelatin babi. Oleh itu, pemeriksaan bakteria yang mampu menghasilkan
gelatinase telah dijalankan. Dalam kajian ini, sebanyak 13 sampel tanah, kulit dan air telah digunakan untuk mengasingkan lebih 270 bakteria jenis. Daripada 270 strain terpencil, 1 strain telah menunjukkan aktiviti enzim dengan menunjukkan zon yang jelas pada koloni bakteria selepas 24 jam pengeraman pada 37 ºC (Jadual 1). Strain yang terpilih ialah L. sphaericus yang menunjukkan aktiviti gelatinase yang berbeza dalam pada medium gelatin babi, lembu dan ikan.
Kemampuan 1 strain dipilih juga menunjukkan tahap aktiviti gelatinase yang berbeza. Keamatan yang kuat ditunjukkan oleh 3 (+++), pertengahan (++) dan lemah (+). Pengeluaran gelatinase dikesan berdasarkan enzim proteolitik mampu menghidrolisis gelatin protein kepada asid amino dengan menambah 10% (w / v) HgCl reagen (Frazier 1926, Jones et al. 1998, Kohei Nakamura et al. 2004, Maria de Fatima Silva Lopes et al. 2006) atau larutan TCA (Medina & Baresi 2007) pada koloni bakteria.
Semua strain bakteria telah dikenal pasti menggunakan Biolog GEN III (Jadual 1 dan Jadual 2). Pengenalpastian bakteria menggunakan 16S rDNA mendekati menunjukkan keputusan tahap lebih daripada 85% daripada persamaan dan bukannya sistem pengenalan Biolog. Ia telah dilaporkan bahawa pengenalan 16S rDNA mempunyai peratus ketepatan yang lebih tinggi berbanding kaedah lain seperti yang dinyatakan oleh Megan (2009) dan Matsui (1993). penemuan yang serupa juga menunjukkan di sini di mana pendekatan molekul menunjukkan hasil yang lebih tepat dalam eksperimen berulang berbanding Sistem Pengenalan Biolog. 16S rDNA urutan pengenalan memberikan ketepatan tinggi untuk pengenalpastian mana-mana bakteria organisma, kebolehpercayaan, dan kebolehulangan (Drancourt et al, 2004;. Kolbert dan Persing, 1999).
JADUAL 1. Aktiviti enzim daripada bakteria strain pada media gelatin yang berbeza dan sumber berbeza
Strains Source of sample Gelatinase activity Pig gelatin Bovine gelatin Fish gelatin G6 Peat soil ++ + +
JADUAL 2: Pengenalpastian Lysinibasillus sphaericus yang diasingkan menggunakan
Biolog GEN III dan analisis 16S rDNA gene sequencing analysis
Strains
Organis m type
Identification by Biolog GN species (% Similarity)
Identification by 16S rDNA gene sequencing species (% Similarity) G6 GP-rodsb Lysinbacillus sphaericus (43%) Lysinbacillus fusiformis B6 (95%)
Hasil pengkulturan bakteria lysinibacillus sphaericus di dalam 2 Liter kultur media gelatin, supernatan yang diperolehi telah diekstrak dengan kaedah pemendakan ammonium sulfat, seterusnya melalui penulenan menggunakan kromatografi penukar anion (DEAE-Toyopearl 650M) dan akhir sekali kromatografi penurasan gel (TSK G3000SW).
Dalam kajian ini, gelatinase di ekstrak daripada bakteria lysinibacillus sphaericus melalui kaedah pengekstrakan akues iaitu pemendakan ammonium sulfat secara berperingkat. Aktiviti gelatinase ditentukan secara spektrofotometri pada 570 nm dengan menggunakan gelatin babi sebagai substrat berdasarkan kaedah ninhidrin (Sun et al. 2006). Analisis data pada jadual 1 menunjukkan bahawa enzim daripada pemendakan ammonium sulfat dengan peratusan 0 hingga 50% mencatatkan aktiviti gelatinase yang paling tinggi, iaitu 2.16 U/ml. Ini diikuti oleh enzim yang dimendakkan pada peratusan 0 hingga 25% ammonium sulfat, kemudian 25 hingga 50% dan akhir sekali 50 hingga 75%. Berdasarkan keputusan yang diperoleh daripada kajian ini, gelatinase dengan pemendakan ammonium sulfat 0 – 50% telah dipilih untuk dimasukkan ke dalam turus kromatografi bagi langkah penulenan.
Merujuk kajian yang lepas oleh Hamza et al. (2006) , pemendakan ammonium sulfat yang terbaik bagi gelatinase diekstrak daripada Brevibacillus laterosporus dilaporkan pada 60% mendakan ammonium sulfat. Manakala Balan et al. (2012) mendapati gelatinase di ekstrak daripada Bacillus spp. menunjukkan aktiviti gelatinase yang paling tinggi pada 40% mendakan ammonium sulfat. Hasil kajian ini menunjukkan peratus ketepuan ammonium sulfat pada 0 – 50% masih berada di dalam julat ketepuan yang berkesan untuk mengekstrak enzim. Penjelasan ini disokong oleh kajian Abdalla et al. (2010, 2011) yang menyatakan ketepuan 40-50% dan 60% ammonium sulfat
masing-masing adalah paling berkesan dalam pemendakan protein antara 0 -90% yang diuji.
Selain itu kaedah pemendakan ammonium sulfat secara berperingkat turut membantu meningkatkan nilai aktiviti enzim. Whitaker (1972) menjelaskan, proses pemendakan sekali tidak berupaya menghasilkan enzim tulen. Ini adalah kerana bukan semua molekul daraipada campuran protein dapat dimendakkan melalui kepekatan garam tunggal. Terdapat pertindihan protein dalam proses pemendakan tersebut. Oleh itu, pemendakan secara berperingkat dengan meningkatkan ketepuan ammonium sulfat secara beransur-ansur akan memberi kesan yang lebih aktif.
RAJAH 1 : Aktiviti Gelatinase pada pada ketepuan ammonium sulfat yang berbeza Pada peringkat pertama proses penulenan protein yang telah di dialisis daripada proses pemendakan ammonium sulfat seterusnya dimasukkan ke dalam turus DEAE - Toyopearl 650M pada pH 7.0. Kromatografi DEAE - Toyopearl 650M adalah sejenis kromatografi penukar anion di mana protein yang bercas negatif akan terikat pada resin turus ini. Berdasarkan profil elutan pada rajah 4.3.1, dua puncak telah di elut keluar secara berturutan. Walaubagaimanapun hanya puncak yang kedua mempunyai aktiviti gelatinase. Puncak aktiviti gelatinase tersebut di elut keluar pada elutan terus dengan jumlah 63.1% (416.69 ml) 0.1 M penimbal fosfat ( pH 7.0) dengan kehadiran 1M Nacl. Keputusan tersebut menunjukkan bahawa gelatinase yang di elut keluar adalah bercas negatif dengan nilai aktiviti enzim sebanyak 70.80 U/ml.
0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 0-25% 0-50% 25-50% 50-75% Ak tiv it i G ela tina se (U/m l)
RAJAH 2: Profil elutan aktiviti gelatinasae dan protein gelatinase (A280) dari turus kromatografi penukar anion DEAE-Toyopearl 650M (16 x 40 cm) pada pH 7.0. Proses elutan dilakukan pada kadar 1.5 ml / min dengan elutan 7 ml per fraksi.
Daripada keseluruhan fraksi , fraksi 52 hingga 67 mempunyai aktiviti gelatinase tinggi hasil elutan kromatografi penukar anion DEAE-Toyopearl 650M telah dikumpulkan dan dimasukkan ke dalam turus TSK GEL G3000SW untuk kromatografi penurasan gel. Kromatografi TSK GEL G3000SW adalah kromatografi penurasan gel di mana protein akan dipisahkan berdasarkan saiz. Protein dengan saiz molekul yang lebih besar akan di elut keluar dahulu diikuti protein yang bersaiz lebih kecil. Melalui turus pemisahan kromatografi penurasan gel TSK gel G3000SW didapati 4 puncak telah terhasil, P1, P2, P3 dan P4. Namun hanya 1 puncak iaitu (P2) menunjukkan aktiviti gelatinase (Rajah 3). Hamza et al. (2006) turut melaporkan, terdapat 4 puncak yang terhasil selepas kromatografi penurasan gel (Sephadex G-150), walaubagaimanapun hanya 3 aktiviti dicatatkan. Aktiviti spesifik bagi gelatinase meningkat lebih tinggi berbanding langkah kromatografi penukar anion. Gelatinase mencatatkan aktiviti spesifik 6.60 U/mg dengan kadar faktor penulenan yang meningkat kepada 18.5. Walaubagaimanapun, peratus kembalian bagi gelatinase adalah 0.1.
Secara keseluruhan, langkah penulenan ini berjaya menemui satu enzim dengan aktiviti dan faktor penulenan yang tinggi. Walaubagaimanapun, jumlah protein yang tinggal bagi gelatinase adalah rendah pada akhir langkah penulenan. Bagi memperolehi enzim tulen dengan kepekatan protein yang lebih tinggi, penyediaan sampel dalam jumlah yang lebih besar perlu disediakan.
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71
-A 280•
Aktivi ti En zim (U /m l) Fraksi 1 MRAJAH 3 : Profil elutan aktiviti gelatinasae dan protein gelatinase (A280) dari turus kromatografi penurasan gel TSK Gel G3000SW (0.78 x 30 cm) pada pH 7.0. Proses elutan dilakukan pada kadar 0.5 ml / min dengan elutan 3 ml per fraksi. P2 mempunyai aktiviti gelatinase.
Berat molekul natif bagi gelatinase telah ditentukan dengan menggunakan kromatografi penurasan gel TSK GEL G3000SW 16/40 yang telah dikalibrasikan dengan protein-protein piawai dan dikira berdasarkan plot graf isipadu fraksi elutan iaitu 1ml / fraksi melawan log berat molekul protein piawai. Gelatinase telah dianggarkan mempunyai berat molekul natif 121 kDa (Rajah 4).
Di dapati berat molekul natif bagi gelatinase di dapati berbeza jika dibandingkan berat molekul natif gelatinase daripada sumber bakteria lain iaitu antara 30 kDa hingga 60 kDa seperti di laporkan oleh Yuan et al. (2009) yang mencatatkan saiz gelatinase daripada Enterococcus faecalis 69 kDa manakala Makinen et al. (1989) daripada Streptococcus faecalis adalah 31.5 kDa. Walaubagaimanapun gelatinase daripada sumber manusia/haiwan masih mencatatkan bacaan berat molekul yang besar diantara julat 100 kDa hingga 250 kDa. Kajian lepas menunjukkan bahawa berat molekul natif bagi gelatinase daripada carrageenin di ambil dari tikus mempunyai saiz 245000 kDa dan 185000 kDa (Nakagawa et al. 1990), polymorpho nuclear leucocytes (225000 kDa) (Murphy et al.1982), neutrophyl manusia (150000 kDa -180000 kDa)(Hibbs et al. 1985).
Berat molekul bagi gelatinase telah ditentukan berdasarkan plot graf nilai Rf melawan log berat molekul protein piawai (Rajah 5). Berat molekul bagi gelatinase ialah 67 kDa. Berdasarkan hasil yang diperoleh, gelatinase daripada lysinibacillus sphaericus wujud sebagai homodimer dengan satu subunit sahaja. Sehingga kini masih
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 1 3 5 7 9 11 13 15 17
-A280•
Aktivi ti En zim (U /m l) Fraksi P1 P2 P3 P4tiada gelatinase yang telah ditulenkan daripada L. spharecus. Melalui perbandingan berat molekul di antara gelatinase daripada sumber bakteria dan manusia/haiwan, didapati berat molekul gelatinase daripada L. spharecus masih berada di bawah julat 100 kDa tidak melebihi berat molekul gelatinase dari sumber manusia/ haiwan.
RAJAH 4: Plot nilai mobiliti nilai melawan log berat molekul protein piawai daripada gel poliakrilamida SDS. Protein piawai berat molekul yang digunakan adalah
PageRulerTM Prestained Protein Ladder. ~ 10-170
kDa (26616) daripada Thermo Scientific
y = -1,8278x + 2,1914 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 L og Ber at M oleku l (x1000) Nilai Rf 67 kDa Marker Gelatinase kDa 170 130 100 70 55 40 35 25 15 10 67 kDa
RAJAH 5: Elektroforesis gel poliakrilamida SDS (12.5%) bagi gelatinase tulen daripada Lysinibacillus sphaericus. Marker: Protein piawai berat molekul PageRulerTM Prestained Protein Ladder. ~ 10-170 kDa (26616) daripada Thermo Scientific.
KESIMPULAN
Bakteria gelatinase berupaya diasingkan dari segi keupayaan terhidrolisis melalui sumber gelatin yang berbeza dan boleh di dapati daripada pelbagai sumber. Dua langkah penulenan yang dijalankan telah berjaya memisahkan satu isoenzim iaitu gelatinase menggunakan kaedah kromatografi penukar anion (DEAE-Toyopearl 650M) dan kromatografi penurasan gel (TSK-Gel G3000SW). Pemisahan gelatinase pada peringkat kromatografi penukar anion membuktikan bahawa gelatinase yang diperolehi adalah bercas negatif. Berat molekul bagi 1 subunit enzim gelatinase ditentukan menggunakan SDS-PAGE. Saiz yang didapati adalah protein ekstraselular homodimer dengan saiz subunit 67 kDa. Hasil pemisahah kromatografi penurasan gel daripada turus TSK-Gel G3000SW mendapati berat molekul natif bagi gelatinase adalah dicadangkan 121 kDa. Penghasilan gelatinase yang mampu mengesan kehadiran medium gelatin daripada sumber yang berbeza mampu menggalakkan lagi pengeluaran enzim secara besar-besaran dengan kos yang lebih rendah,
RUJUKAN
Abdalla, M.O.M., Ali, D. & Mohamed, B.E. 2010. Extraction, milk-clotting activity measurements and purification of Solanum dubium Fresen (Gubbain) for cheese making. World Journal of Dairy & Food Sciences 5 (2): 152:159.
Abdalla, M.O.M., Kheir, S.E.O. & El Owni, O.A.O.2011. Effect of extraction method am monium sulfat concentration, temperature and pH on milk-clotting activity of Sola num dubium fruit extract. Advance Journal of Food Science and Technology 3 (1): 40:44.
Athel, C.B. 1995. Fundamentals of Enzyme Kinetics. London:Portland Press.
Balan, S.S.,Nethaji, R., Sankar, S., Jayalakshmi, S. 2012. Production of gelatinase enzyme
from Bacillus spp isolated from the sediment sample of Porto Novo Coastal sites. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine S1811-S1816
Bradford, M. 1976. A Rapid and Sensitive method for the quantitation of microgram quanti ties of protein utilizing the principle of protein –dye binding. Analytical Biochemistry 72:248-254
Boran, G., & Regenstein, J. M. 2010. Chapter 5. Fish gelatin. Advances in Food and Nutrition Research 60, 119–143.
DeClerck, E. Vanhoutte, T. Hebb, T. Geerinck, J. Devos, J., & Devos, P. 2004. .Appl. and Environ. Microbio 70(6): 3664.
Fadly, L. 2014. Pemencilan, pengenalpastian dan aktiviti enzim bagi bakteria gelatinase terhadap pengesanan gelatin babi bagi tujuan pengesahan halal. Universiti Kebangsaan Malaysia, Bangi.
Fahmy, A.S., Ali, A.A. & Mohamed, S.A. 2004. Characterization of a cysteine protease from wheat
Triticum aetivum (cv. Giza 164). Bioresource Approach. Belmont: Thomson Brook/Cole.
Farrel, S.O. & Taylor, L.E. 2006. Experiments in Biochemistry: A Hands-on Approach. Belmont: Thomson Brook/Cole.
Fernandez-Diaz, M. D., Montero, P. & Gomez-Guillen, M. C. 2001. Gel properties of collagens from skins of cod (Gadus morhua) and hake (Merluccius merluccius) and their modification by the coenhancers magnesium sulphate, glycerol and transglutaminase.
Food Chemistry.74: 161 – 167.
Foulquire, E., Ginestoux, C., Quaray, Z. & Lefranc, M.P. 2013. Formula of the 20 amino acids and structural details of side chain.
http://www.imgt.org/IMGTeducation/Aide-memoire/_UK/aminoacids/formuleAA/
(30 Jun 2015)
Frazier, W. C. 1926. A Method for the Detection of Changes in Gelatin Due to Bacteria.Journal of Infectious Diseases.(39): 302-309.
Gelatin Manufacturer’s Institute of America, Inc (GMIA) revised 2012. Gelatin
Handbook, available in
http://www.gelatingmia.com/images/GMIA_Gelatin_Manual_ 2012.pdf
Giannelli G. & Antonaci S .2002. Gelatinases and their inhibitors in tumor metastasis:from biological research to medical applications . Histol Histopathol (2002) 17: 339-345.
Hamza, H.M., Ali, S.M. & Hassan, H.G. 2005. Partial Purification of Gelatinase Enzyme
from Local Isolate of Brevibaccillus laterosporus. National Journal of Chemistry 23(2006)437-442
Hibbs, M.S., Hasty, K.A., Seyer, J.M., Kang, A.H. & Mainardi, C.C. 1985. Biochemical and immunological characterization of the secreted forms of human netrophyl gelatinase. Journal of Biological Chemistry. 260: 2493-2500.
Hisano, T., Abe, S., Wakashiro, M., Kimura, A. & Murata, K. 1989. Isolation and properties of collagenase with caseinolytic activity from a Pseudomonas sp. J Fermen Bioeng 68(6) (399-403)
Medina, P. & Baresi, L. 2007. Rapid Identification of Gelatin and Casein Hydrolysis Using Tca. Journal of Microbiological Methods 69(2007): 391-393.
Su., Y. A., Sulavik, M. C., He, P., Makinen, K. K., Makinen, P.-L., Fiedler, S., Wirth, R. & Clewelll, D. B. 1991. Nucleotide Sequence of the Gelatinase Gene (Gele) from Enterococcus Faecalis Subsp. Liquefaciens. Infect. Immun 59(1): 415-420.
