• Tidak ada hasil yang ditemukan

PEMURNIAN PARSIAL DAN KARAKTERISASI ENZIM β -1,3-GLUKANASE DARI CAIRAN PENCERNAAN Achatina fulica

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2019

Membagikan "PEMURNIAN PARSIAL DAN KARAKTERISASI ENZIM β -1,3-GLUKANASE DARI CAIRAN PENCERNAAN Achatina fulica"

Copied!
68
0
0

Teks penuh

(1)

PEMURNIAN PARSIAL DAN KARAKTERISASI ENZIM

β-1,3-GLUKANASE DARI CAIRAN PENCERNAAN Achatina fulica

SKRIPSI

SITI MUNAWAROH WAIDAH

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS AIRLANGGA

(2)

PEMURNIAN PARSIAL DAN KARAKTERISASI ENZIM

β-1,3-GLUKANASE DARI CAIRAN PENCERNAAN Achatina fulica

SKRIPSI

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains Bidang Kimia Pada Fakultas Sains dan Teknologi

Universitas Airlangga

Disetujui oleh:

Pembimbing I,

Dr. Afaf Baktir, M.S. NIP. 19561014 198303 2 001

Pembimbing II,

Dr. Purkan, M.Si.

(3)

LEMBAR PENGESAHAN NASKAH SKRIPSI

Judul :Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim β-1,3-glukanase

Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Penyusun : Siti Munawaroh Waidah

NIM : 080810496

Pembimbing I : Dr. Afaf Baktir, M.S.

Pembimbing II : Dr. Purkan, M.Si.

Tanggal Ujian : 6 Agustus 2012

Disetujui Oleh:

Pembimbing I,

Dr. Afaf Baktir, M.S. NIP. 19561014 198303 2 001

Pembimbing II,

Dr. Purkan, M.Si.

NIP. 19721116 199702 1 001

Mengetahui,

Ketua Departemen Kimia

Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga

(4)

PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI

Skripsi ini tidak dipublikasikan, namun tersedia di perpustakaan dalam

lingkungan Universitas Airlangga, diperkenankan untuk dipakai sebagai referensi

kepustakaan, tetapi pengutipan harus seizin penyusun dan harus menyebutkan

sumbernya sesuai kebiasaan ilmiah. Dokumen skripsi ini merupakan hak milik

(5)

KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan hidayah-Nya, sehingga

penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “ Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica”.

Penulisan skripsi ini tidak lepas dari bantuan berbagai pihak. Oleh karena

itu, dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Ibu Dr. Afaf Baktir, M.S. selaku dosen pembimbing I yang telah meluangkan

waktunya untuk memberikan saran, nasehat dan masukan dalam penyelesaian

proposal ini.

2. Bapak Dr. Purkan, M.Si. selaku dosen pembimbing II atas bimbingan dan

nasehatnya selama penyusunan proposal ini.

3. Ibu Aning, M.Si. selaku dosen wali atas motivasi dan dukungan yang telah

diberikan.

4. Keluarga, bapak, Ibunda, adikku Muhammad Saiful Mujad, bulek Suprihatin,

nenek, kakek dan Valihudddin Rizal tercinta atas dukungan dan semangat baik

moral maupun spiritual demi terselesaikannya proposal ini.

5. Teman-teman UKM Penalaran, Ditty, Muhaymin, aezzi dimitra, nararya, bima

fajar ,fajar shodiq, sobir, ratna, yanis, nimaz, nurul dan lain-lain, terimakasih

untuk kebersamaan dan perjuangan selama ini.

6. Buat Resti, Amel, Riza, Wike, Ve, Rista, Adel, Culan, Julie, Aya, luluk dan

teman-teman kimia lain, terimakasih untuk dukungan kalian.

7. Teman-teman kozt mulyorejo, mbak eka, mbak ida, mbak dinar, mbak finda,

mbak iin, mbak ayu, Cuwi, mbak dora, mbak dyan, terimakasih sudah

merawat, mendukung dan menemani saya selama 4 tahun ini.

8. Teman-teman KKN Tanjungharjo, Fariz, Fitra, Niniz, Ekki, Nikita dan

lain-lain terimakasih untuk kebersamaan kalian.

9. Terimakasih buat Plus Minus Digital yang telah memberikan banyak pelajaran

hidup padaku tentang bagaimana susahnya bekerja. Semoga suatu saat engkau

(6)

10. Terimakasih buat temen-temen Biokim blazt (Dita, Siska, Nadya, Rohiz, Mb

Kunsah, dan Ainur) atas bantuan dan kerjasamanya.

11.Terimakasih buat temen-temen PKL, Mbak Ade dan pembimbing di

Bioteknologi, LIPI, Bogor.

Skripsi ini disusun sebagai syarat tugas akhir yang harus diselesaikan dalam

meraih gelar sarjana S1. Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini

masih banyak kekurangan, sehingga kritik dan saran yang membangun sangat

diharapkan demi kesempurnaan proposal ini.

Surabaya, Juli 2012

Penyusun,

(7)

Siti Munawaroh Waidah, 2012, Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim

β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica. Skripsi di bawah bimbingan Dr. Afaf Baktir, M.S. dan Dr. Purkan, M.Si. Departemen Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga

ABSTRAK

Enzim β-1,3-glukanase merupakan enzim yang dapat mendegradasi dinding sel jamur yang tersusun atas β-1,3 glukan. Penelitian ini bertujuan untuk pemurnian parsial dan karakterisasi enzim β-1,3-glukanase yang diisolasi dari cairan pencernaan Achatina fulica. Pemurnian parsial enzim β-1,3-glukanase dengan pelarut organik aseton dilakukan pada berbagai fraksi hingga mendapatkan fraksi optimum yaitu fraksi dengan aktivitas spesifik terbesar. Hasil pemurnian parsial enzim β-1,3-glukanase didapatkan aktivitas spesifik terbesar yaitu pada fraksi 40-75%. Pada fraksi ini aktivitas spesifik sebesar 0,249 U/mg, sedangkan aktivitas spesifik ekstrak kasar enzim sebesar 0,092 U/mg. Dengan demikian, kemurnian enzim meningkat 1,81 kali dengan % yield sebesar 90,4 %. Fraksi 40-75% yang merupakan fraksi dengan aktivitas spesifik terbesar ini kemudian dilakukan karakterisasi suhu dan pH optimum. Dari penelitian didapatkan suhu optimum aktivitas enzim β-1,3-glukanase pada 370C dan pH optimum aktivitas enzim β -1,3-glukanase pada pH 6.

(8)

Siti Munawaroh Waidah, 2012, Partial purification and characterization of

β-1 ,3-glucanase enzyme from Achatina fulica Digestive fluids. Final project under guidance Dr. Afaf Baktir, M.S. and Dr. Purkan, M.Si. Departement of Chemistry, Faculty Science and Technology, Universitas Airlangga

ABSTRACT

β-1 ,3-glucanase are enzymes that can degrade the cell walls of the fungus composed of β-1, 3 glucan. The aim of this study are to partial purification and characterization of the enzyme β-1 ,3-glucanase isolated from the digestive fluids of Achatina fulica. Partial purification of β-1 ,3-glucanase was done by organic solvent (acetone) on the various factions to get the optimum fraction. The results obtained specific activity of the largest faction is the fraction of 40-75%. In the specific activity of this fraction is 0.249 U/mg, in the other hand the specific activity of crude enzyme extract is 0.092 U/mg. Thus, the purity of the enzyme increased 1.81 times with % yield is 90.4%. The fraction of 40-75% which is a fraction with the greatest specific activity was then carried out the characterization of temperature and pH optimum. The optimum temperature obtained from the research activity of the enzyme β-1 ,3-glucanase at 370C and pH optimum enzyme activity of β-1 ,3-glucanase at pH 6.

(9)

DAFTAR ISI

LEMBAR PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI ... iv

KATA PENGANTAR ... v

2.1.4 Faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim ... 9

2.2 Enzim β-1,3 Glukanase ... 11

2.3 β-1,3 Glukan ... 13

2.4 Achatina fulica ... 13

2.4.1 Klasifikasi Achatina fulica ... 14

2.4.2 Karakteristik umum Achatina fulica ... 15

2.4.3 Sistem pencernaan Achatina fulica ... 16

3.2.2 Bahan-bahan penelitian ... 22

3.3 Diagram Alir Penelitian ... 23

3.4 Prosedur Penelitian... 24

3.4.1 Karantina Achatina fulica ... 24

3.4.2 Panen ekstrak kasar enzim Achatina fulica ... 24

3.4.3 Uji aktivitas spesifik enzim β-1,3-glukanase ... 24

(10)

3.4.6 Pembuatan kurva standar protein ... 26

3.4.7 Penentuan kadar protein ... 27

3.4.8 Karakterisasi Enzim Enzim β-1,3 glukanase 3.4.8.1 Penentuan suhu optimum enzim β-1,3 glukanase ... 27

3.4.8.2 Penentuan pH optimum enzim β-1,3 glukanase ... 27

3.4.9 Analisis Data ... 28

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Karantina Achatina fulica ... 30

4.2 Panen Ekstrak Enzim Kasar Achatina fulica ... 30

4.3 Uji Aktivitas Enzim ... 31

4.3.1 Pembuatan kurva standar glukosa ... 31

4.3.2 Pembuatan kurva progres enzim β-1,3 glukanase ... 32

4.3.3 Penentuan aktivitas enzim β-1,3 glukanase ... 33

4.4 Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Lowry ... 35

4.5 Pemurnian Parsial Enzim Dengan Fraksinasi Aseton ... 36

4.6 Karakterisasi Enzim β-1,3 glukanase ... 41

4.6.1 Penentuan suhu optimum enzim β-1,3 glukanase ... 41

4.6.2 Penentuan pH optimum enzim β-1,3 glukanase ... 43

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan ... 45

5.2 Saran ... 45

DAFTAR PUSTAKA ... 46

(11)

DAFTAR TABEL

Nomor Judul

4.1 Hasil Fraksinasi Aseton ke-1 ... 38

4.2 Hasil Fraksinasi Aseton ke-2 ... 39

4.3 Hasil Fraksinasi Aseton ke-3 ... 39

4.4 Hasil Fraksinasi Aseton ke-4 ... 40

(12)

DAFTAR GAMBAR

Nomor Judul Gambar Halaman

2.1 Mekanisme kerja enzim model lock and key... 8

2.2 Mekanisme kerja enzim model Induced fit ... 9

2.3 Aktivitas Enzim β-1,3-glukanase pada substrat β-1,3-glukan... 12

2.4 Struktur dinding sel C.albicans... 13

2.5 Anatomi Achatina fulica ... 14

2.6 Agregasi protein karena interaksi antara air dan pelarut organik ... 20

2.7 Denaturasi protein jika suhu pelarut organik lebih dari 0oC ... 21

4.1 Kurva standar glukosa ... 32

4.2 Kurva progress enzim β-1,3 glukanase ... 32

4.3 Reaksi DNS dengan gula pereduksi ... 34

4.4 Kurva standar protein ... 36

4.5 Kurva suhu optimum aktivitas enzim β-1,3 glukanase ... 42

(13)

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Judul

1. Pembuatan reagen

2. Tabel penentuan kurva progress

3. Tabel penentuan kurva standar protein

4. Perhitungan aktivitas spesifik enzim

5. Data Karakterisasi enzim

(14)

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1Latar Belakang

Penerapan bioteknologi dalam beberapa bidang seperti bidang kesehatan,

kedokteran dan pertanian tidak lepas dari peranan enzim sebagai biokatalisator.

Hal ini dikarenakan penggunaan enzim sebagai biokatalisator memiliki beberapa

keuntungan, antara lain lebih efisien, ramah terhadap lingkungan, dan dapat

mengkatalis berbagai macam reaksi serta tidak menghasilkan produk samping.

Dalam fungsinya sebagai biokatalisator, enzim berikatan dengan substrat dan

membentuk kompleks enzim-substrat sehingga terjadi perubahan substrat menjadi

produk, reaksi tersebut berlangsung di daerah sisi katalitik atau sisi aktif (Dawn et

al., 2000)

Enzim dibedakan menjadi beberapa golongan berdasarkan reaksi yang

dikatalisis, salah satunya adalah enzim hidrolitik. β-1,3-glukanase merupakan salah satu enzim hidrolitik. Enzim ini dapat ditemukan pada sebagian besar

bakteri, jamur, tanaman tingkat tinggi dan hewan invertebrata. Terdapat dua

jenis β-1,3-glukanase, yang pertama ekso-β-1,3-glukanase yang menghidrolisis ikatan β-1,3-glukan secara berurutan, dari ujung non-reduksi suatu polimer atau oligomers, sehingga dihasilkan monomer glukosa (Reese, 1977). Tipe β -1,3-glukanase yang kedua adalah endo-β-1,3-glukanase, menghidrolisis ikatan β-1,3 pada sisi yang acak sepanjang rantai polisakarida, sehingga dihasilkan

oligosakarida (Reese & Mandels, 1959). Substrat spesifik bagi enzim ini adalah

(15)

ditemukan pada dinding sel jamur patogen (Adams, 2004). Oleh karena itu, enzim

β-1,3-glukanase dinyatakan sebagai komponen penting dalam mekanisme pertahanan melawan patogen termasuk infeksi jamur (Ueda et al., 2011).

Ada berbagai macam jamur yang dapat menginfeksi manusia misalnya

Candida albicans. Jamur ini bersifat patogen terutama pada tubuh yang

mengalami penurunan sistem imun. Candida albicans dapat membentuk biofilm

yang berupa campuran dari beberapa tipe sel, yaitu khamir, rizoid dan matriks

ekstraseluler yang melindungi sel-sel C.albicans (Jabra-Rizk et al., 2004).

Keberadaan biofilm menghalangi penetrasi obat ke dalam sel jamur. Biofilm

dapat dilisis dengan menguraikan penyusun utama biofilm yaitu β-1,3-glukan. Komponen ini dapat dihidrolisis dengan enzim β-1,3-glukanase (Nett et al.,2007).

Gabriel dan Kopecka (1988) melakukan penelitian tentang pengaruh

konsorsium enzim dari kelenjar pencernaan bekicot (Achatina fulica) terhadap

regenerasi dinding sel dalam protoplas Schizosaccharomyces japonicus.

Dilaporkan bahwa, keberadaan konsorsium enzim dari kelenjar pencernaan

Achatina fulica mengakibatkan produksi dinding sel tidak lengkap. Hal ini karena

komponen utama penyusun dinding sel yaitu β-1,3-glukan pada Schizosaccharomyces japonicus terdegradasi oleh konsorsium enzim dari cairan

pencernaan Achatina fulica, yang diantaranya terdiri dari enzim β-1,3-glukanase dan enzim β-1,4-glukanase.

Pada penelitian ini dilakukan isolasi enzim β-1,3-glukanase dari saluran pencernaan Achatina fulica untuk dilakukan pemurnian parsial dan karakterisasi.

(16)

protein lain sehingga aktivitas enzim dapat ditingkatkan. Pemurnian parsial enzim

dilakukan dengan fraksinasi pelarut organik karena memiliki efek presipitasi yang

bagus (Sopes, 1994). Selain itu, pelarut organik tidak memecahkan gugus

prostetik dari molekul protein seperti pada pengendapan dengan garam (Bintang,

2010). Pelarut organik yang digunakan adalah aseton karena aseton mudah

dipisahkan dengan protein yaitu dengan cara penguapan dan sentrifugasi.

1.2 Rumusan Masalah

1. Berapakah aktivitas spesifik enzimβ-1,3-glukanase dari cairan pencernaan Achatina fulica sebelum dan sesudah pemurnian parsial melalui fraksinasi

aseton?

2. Pada fraksi aseton berapakah terdapat aktivitas spesifik terbesar enzim β -1,3-glukanase yang diisolasi dari cairan pencernaan Achatina fulica ?

3. Berapakah pH dan suhu optimum aktivitas enzim β-1,3-glukanase yang di isolasi dari cairan pencernaan Achatina fulica?

1.3Tujuan Penelitian

1. Mengisolasi dan mengetahui aktivitas spesifik enzim β-1,3-glukanase dari cairan pencernaan Achatina fulica.

2. Menentukan fraksi aseton yang menunjukkan keberadaan aktivitas spesifik

terbesar enzim β-1,3-glukanase yang diisolasi dari cairan pencernaan Achatina fulica.

(17)

1.4Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah tentang pemurnian

parsial dan karakterisasi enzim β-1,3-glukanase yang dapat dimanfaatkan pada beberapa bidang. Salah satunya untuk bidang kesehatan yaitu sebagai alternatif

(18)

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Enzim

Enzim merupakan senyawa organik bermolekul besar yang berfungsi

untuk mempercepat jalannya reaksi metabolisme di dalam tubuh tanpa

mempengaruhi keseimbangan reaksi. Enzim berikatan dengan substrat dan

mengarahkannya dengan tepat untuk bereaksi. Substrat adalah substansi yang

mengalami perubahan kimia setelah bereaksi dengan enzim, sedangkan produk

adalah substansi baru yang terbentuk setelah setelah reaksi Masing-masing enzim

mengkatalisis suatu reaksi biokimia spesifik. Enzim hanya bereaksi dengan satu

substrat dan mengubah substrat tersebut menjadi suatu produk. Enzim secara

umum menghasilkan kecepatan, spesifitas, dan kendali pengaturan terhadap reaksi

yang berlangsung dalam tubuh. Hal ini disebabkan karena urutan asam amino

spesifik yang unik yang membentuk enzim serta mengikat dan mengaktifkan

molekul substrat (Voet and Voet, 2004).

2.1.1 Struktur enzim

Kebanyakan enzim merupakan protein globular yang memiliki struktur

tiga dimensi spesifik yang dibentuk oleh struktur primer, sekunder dan tersiernya.

Selain itu, enzim juga ada yang memiliki struktur kuartener karena tersusun atas

lebih dari satu rantai protein (McMurry and Marry, 1994). Struktur primer

merupakan urutan linear asam amino yang disatukan oleh ikatan peptida. Struktur

sekunder terbentuk karena daerah di dalam rantai peptida dapat membentuk

(19)

antara atom-atom ikatan peptida. Ini berhubungan dengan pengaturan kedudukan

ruang residu asam amino yang berdekatan dengan urutan linear dan membentuk

struktur α heliks, β sheet dan loop. Konformasi tersier protein terdiri atas beberapa jenis ikatan antara lain : ikatan hidrogen yang terdapat diantara gugus R residu

asam amino rantai samping yang berdekatan, ikatan ion diantara gugus R yang

berlawanan, interaksi hidrofobik dari gugus R asam amino hidrofobik dan ikatan

kovalen berupa ikatan disulfida dari residu sistein (Stryer, 2002).

2.1.2 Klasifikasi enzim

Berdasarkan jenis reaksi yang dikatalisis oleh enzim maka enzim dibagi

menjadi enam klasifikasi yaitu oksidoredutase, transferase, hidrolase, liase,

isomerase dan ligase (McMurry and Mary, 1994).

1. Oksidoreduktase

Enzim oksidoreduktase adalah enzim yang dapat mengkatalisis reaksi

oksidasi atau reduksi suatu bahan. Dalam golongan ini terdapat 2 jenis enzim

yang paling utama yaitu oksidase dan dehidrogenase.

a. Oksidase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi antara substrat dengan

molekul oksigen. Yang termasuk enzim oksidase adalah katalase, peroksidase,

tirosinase, dan asam askorbat oksidase.

b. Dehidrogenase adalah enzim yang aktif dalam pengambilan atom hidrogen dari

substrat. Contohnya yaitu suksinat dehidrogenase, glutamat dehidrogenase, dan

(20)

2. Transferase

Enzim transferase adalah enzim yang ikut serta dalam reaksi pemindahan

(transfer) suatu radikal atau gugus. Enzim yang termasuk dalam golongan ini

adalah transglikosidase, transfosforilase, transaminase, dan transasetilase.

3. Hidrolase

Enzim hidrolase merupakan enzim yang sangat penting dalam pengolahan

pangan, yaitu enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis suatu substrat atau

pemecahan substrat dengan pertolongan molekul air.

4. Liase

Enzim liase adalah enzim yang aktif dalam pemecahan ikatan C-C dan

ikatan C-O dengan tidak menggunakan melekul air. Yang termasuk dalam

golongan enzim ini adalah enzim dekarboksilase.

5. Isomerase

Enzim isomerase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi perubahan

konfigurasi molekul substrat, sehingga dihasilkan molekul baru yang merupakan

isomer dari substrat, atau dengan perubahan isomer posisi. Yang termasuk dalam

golongan ini adalah enzim fosfoheksosa isomerise atau fosfomanosa isomerase.

6. Ligase

Enzim ligase adalah golongan enzim yang mengkatalis terjadinya ikatan

bersama atau penggabungan dua molekul substrat dengan partisipasi dari ATP.

2.1.3 Mekanisme kerja enzim

Enzim bekerja secara spesifik dalam mengkatalisis suatu reaksi. Hanya

(21)

tertentu yang dapat dikatalisis. Enzim mempunyai sisi aktif, yaitu sisi yang ada

pada enzim yang dapat melakukan fungsi pengarahan, pengikatan, dan katalisis,

yang tidak terdapat pada protein pada umumnya. Sisi aktif enzim pada umunya

berbentuk celah, yang tersusun atas sisa asam amino bagian rantai polipeptida

enzim. Substrat enzim sebelum diurai atau digandengkan harus masuk dulu ke

dalam celah. Dalam hal ini substrat yang masuk ke dalam celah harus memenuhi

beberapa syarat yaitu, komplementer dengan celah dan harus ada bagian yang

labil agar bisa digandengkan atau diurai (Martoharsono, 2006)

Sifat komplementer enzim dan substrat dikemukakan dengan teori

pemodelan “lock and key “ dan “induced fit”. Pada pemodelan lock and key sisi

aktif enzim memiliki kesesuaian hanya dengan satu macam substrat saja, sama

seperti dengan kunci yang dapat masuk dengan tepat ke dalam gembok.

Gambar 2.1 Mekanisme kerja enzim model lock and key (Stryer et al., 2002)

Sedangkan melalui penjelasan pemodelan induced-fit, kinerja enzim yang

spesifik dapat dijelaskan dengan lebih luas. Pada induced fit dijelaskan bahwa

beberapa enzim cukup fleksibel dalam mengubah bentuk dan ukuran sisi aktif

mereka untuk disesuaikan dengan ruang yang diperlukan oleh substrat yang

berbeda. Dengan demikian enzim dan substrat dapat bergabung dan interaksi

(22)

Gambar 2.2 Mekanisme kerja enzim model induced fit (Stryer et al., 2002)

Selain bekerja secara spesifik, enzim juga bekerja dengan mempercepat

terjadinya suatu reaksi. Hal ini karena dalam suatu reaksi enzim bekerja dengan

menurunkan energi aktivasi, yaitu jumah energi dalam kalori yang diperlukan

untuk membawa semua molekul pada 1 mol senyawa pada suhu tertentu menuju

tingkat transisi pada puncak batas energi. Enzim juga mempunyai suatu afinitas

yang tinggi terhadap substrat dan mempunyai kemampuan mengikatnya walaupun

bersifat sementara.

2.1.4 Faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim

1. Konsentrasi Substrat

Konsentrasi substrat mempengaruhi kecepatan reaksi suatu enzim.

Konsentrasi yang tinggi dapat memperbesar laju reaksi. Tapi jika konsentrasi

substrat diperbesar maka tidak akan ada lagi penambahan laju reaksi (Stryer,

2002). Keadaan ini telah dijelaskan oleh Michealis – Menten dengan hipotesis

mereka tentang terjadinya kompleks enzim substrat. Untuk dapat terjadi kompleks

enzim substrat, perlu adanya kontak antara enzim dengan substrat.

Kontak ini terjadi pada suatu tempat atau bagian enzim yang disebut

bagian aktif. Pada konsentrasi substrat rendah, bagian aktif enzim ini hanya

(23)

substrat yang berhubungan dengan enzim pada bagian aktif tersebut. Dengan

demikian konsentrasi kompleks enzim substrat makin besar dan hal ini

menyebabkan makin besarnya kecepatan reaksi. Pada suatu batas konsentrasi

substrat tertentu, semua bagian aktif telah dipenuhi oleh substrat atau telah jenuh

dengan substrat. Dalam hal ini, bertambahnya konsentrasi substrat tidak

menyebabkan bertambah besarnya konsentrasi kompleks enzim substrat, sehingga

jumlah hasil reaksi pun tidak bertambah besar.

2. Suhu

Pada suhu rendah reaksi berlangsung lambat, sedangkan pada suhu yang

tinggi reaksi berlangsung cepat. Disamping itu, karena enzim adalah suatu

protein, maka kenaikan suhu dapat menyebabkan terjadinya proses denaturasi.

Apabila terjadi proses denaturasi, maka bagian aktif enzim akan terganggu dan

dengan demikian konsentrasi efektif enzim menjadi berkurang dan kecepatan

reaksinya pun akan menurun.

3. pH

Seperti protein pada umumnya, struktur ion enzim tergantung pada pH

lingkungannya. Enzim dapat berbentuk ion positif, ion negatif atau ion bermuatan

ganda (zwitter ion). Dengan demikian perubahan pH lingkungan akan

berpengaruh terhadap efektivitas bagian aktif enzim dalam membentuk kompleks

enzim substrat. Di samping pengaruh terhadap struktur ion pada enzim, pH rendah

atau pH tinggi dapat pula menyebabkan terjadinya proses denaturasi dan ini akan

(24)

4. Inhibitor

Hambatan atau inhibisi pada suatu reaksi yang menggunakan enzim

sebagai katalis dapat terjadi apabila penggabungan substrat pada bagian aktif

enzim mengalami hambatan. Molekul atau ion yang dapat menghambat reaksi

tersebut dinamakan inhibitor. Hambatan yang dilakukan inhibitor dapat berupa

hambatan tidak reversibel atau hambatan reversibel. Hambatan tidak reversibel

pada umumnya disebabkan oleh terjadinya modifikasi sebuah gugus fungsi atau

lebih yang terdapat pada molekul enzim. Hambatan reversibel dapat berupa

hambatan bersaing atau hambatan tidak bersaing.

5. Ko-enzim dan aktivator

Enzim sering kali memerlukan bantuan substansi lain agar berfungsi

secara efektif. Ko-enzim adalah substansi bukan protein yang mengaktifkan

enzim.

2.2 Enzim β-1,3-glukanase

Enzim β-1,3-glukanase secara luas ditemukan pada sebagian besar bakteri, jamur, tanaman tingkat tinggi dan hewan invertebrata. Enzim β-1,3-glukanase diklasifikasikan sebagai enzim hidrolisis oleh International Union Biokimia dan

Biologi molekuler (IUBMB, 1992) berkaitan dengan aktivitas hirolisisnya pada

substrat. Berdasarkan aktivitas hidrolitiknya terdapat dua jenis β-1,3-glukanase, yang pertama ekso-β-1,3-glukanase yang menghidrolisis ikatan β-1,3-glukan secara berurutan, dari ujung non-reduksi suatu polimer atau oligomers, sehingga

(25)

sepanjang rantai polisakarida, sehingga dihasilkan oligosakarida (Reese &

Mandels, 1959).

Substrat spesifik bagi enzim ini adalah polisakarida berikatan β-1,3-glukan yang dinamakan laminarin dan banyak ditemukan pada dinding sel jamur patogen

(Adams, 2004). Salah satu jamur patogen yang dapat menginfeksi manusia yaitu

C.albicans. Jamur ini merupakan jamur patogen penyebab kandiasis dalam tubuh.

Percobaan yang dilakukan oleh Nett et al. (2007) menunjukkan bahwa kandungan

β-1,3 glukan meningkat pada dinding sel C.albicans dalam bentuk biofilm dibandingkan dengan sel bebas. Dinding sel C.albicans itu sendiri terdiri dari

struktur lapisan multilayer diluar lapisan membran plasma. Struktur multilayer

inilah yang merupakan struktur yang sangat penting bagi fungsi biologik jamur

yaitu mempertahankan bentuk jamur, sebagai barrier permeabilitas dan pelindung

bagi membran dan sitoplasma didalamnya. Oleh karena itu, untuk menghambat

pertumbuhan C. albicans dengan menghidrolisis β-1,3 glukan pada dinding sel dengan enzim β-1,3 glukanase. Enzim β-1,3-glukanase melakukan penyerangan subsrat β-1,3-glukan pada sisi ikatan 1,3.

Gambar 2.3 Aktivitas enzim β-1,3-glukanase terhadap substrat β-1,3-glukan (Kirstee et al, 2005). Tanda panah menunjukkan sisi pemotongan enzim terhadap

(26)

2.3 β-1,3-glukan

β-1,3-glukan adalah komponen struktur utama dinding sel dari banyak jamur patogenik khususnya C.albicans. Strukturnya terdiri dari 1.500 residu

glukosa yang bergabung dalam konfigurasi ikatan β-glikosidik (Kirstee et al., 2005). Ikatan glikosidik adalah ikatan antara dua molekul monosakarida. Ikatan

ini terbentuk antara gugus hidroksil dari atom C nomor satu yang juga disebut

karbon anomerik dengan gugus hidroksil dan atom C pada molekul gula yang

lain.

Komposisi β-glukan dalam dinding sel C.albicans adalah 47 - 60%. Polimer ini menyajikan struktur mikrofibrillar yang memberikan elastisitas dan

kekuatan tarik ke dinding sel jamur (de Nobel et al, 2001). Dinding sel Candida

albicans juga tersusun dari mannoprotein, β-glukan, kitin, komponen protein, dan lipid ( Bernadus, 2007). Sehingga untuk menekan pertumbuhan dinding sel jamur

yaitu dengan menghidrolisis ikatan β-1,3-glukan menggunakan enzim β -1,3-glukanase yang diisolasi dari Achatina fulica.

Gambar 2.4 Struktur dinding sel C.albicans dengan komponen utama β- glukan.

2.4 Achatina fulica

Bekicot (Achatina fulica) merupakan Gastropoda paling besar, berasal dari

(27)

concha yang mengunjungi Mauritrius membawa beberapa specimen hidup ke

Calcutta. Di situ Achatina fulica berkembang baik dan tersebar luas tanpa ada

musuhnya. Di Sumatra dan Jawa hewan ini telah merusak perkebunan karet. Pada

tahun itu juga telah mencapai Taiwan dan disambut hangat orang-orang jepang

sebagai makanan menarik dan berkhasiat sebagai obat (Radiopoetro, 1988)

2.4.1 Klasifikasi Achatina fulica

Klasifikasi Achatina fulica menurut Malek (1980) adalah sebagai berikut :

Subkingdom : Metazoa

Species : Achatina fulica

(28)

2.4.2 Karakteristik umum Achatina fulica

Bekicot (Achatina fulica) merupakan salah satu jenis molusca dengan

ciri-ciri umum bertubuh lunak dan terbungkus dalam rumah berkapur yang berasal

dari sekretnya sendiri. Rumah berkapur atau biasa disebut dengan cangkang ini

berfungi sebagai pelindung badan untuk mempertahankan diri dari musuh

(Santoso, 1989). Pada bagian kepala terdapat dua tentakel sebagai alat peraba

(perasa). Tentakel ini berguna untuk merasakan perubahan suhu, sebagai

penunjuk jalan dan sebagai penunjuk adanya makanan.

Dalam mulut terdapat radula (semacam lidah) untuk memarut daun.

Bagian bawah kaki terdapat kelenjar yang dapat mengeluarkan lendir pada saat

berjalan. Achatina fulica aktif di waktu malam dan bergerak maju, dengan

gelombang aksi otot-otot pada sisi ventral kaki, di atas bekas lendir yang dibuat

oleh kelenjar kaki di bawah mulut. Dengan radula, tanaman hijau yang lunak dan

tidak berbulu dipegang oleh rahang lalu diparut dengan radula (Radiopoetro,

1988).

Tempat yang disukai Achatina fulica adalah tempat yang menyediakan

makanan, temperatur rendah, dan terlindung dari sinar matahari. Faktor-faktor

yang mempengaruhi habitatnya adalah temperatur, persediaan kalsium, pH tanah,

kelembaban dan persediaaan makanan. Achatina fulica mempunyai ketahanan

fisik dan ketahanan hidup yang tinggi serta mudah berkembang biak di daerah

tropis (Radiopoetro, 1988). Achatina fulica merupakan hewan hermaprodit, akan

(29)

fulica mempunyai sistem reproduksi, respirasi, ekskresi, dan digesti (pencernaan)

yang kompleks.

2.4.3 Sistem pencernaan Achatina fulica

Sistem pencernaan Achatina fulica terdiri dari rongga mulut dilanjutkan

kedalam esophagus yang sempit, yang kemudian melebar membentuk ingluvies.

Ingluvies berupa sebuah kantong besar dengan deretan glandulae salivales dalam

sepanjang dindingnya dan saluran- salurannya bermuara di ujung anterior

esophagus. Glandulae salivales menghasilkan lendir berair yang berisi enzim –

enzim diastase, yaitu yang menguraikan hidrat arang. Ingluvies juga berisi cairan

yang berasal dari glandulae digestoriae yang mengalir dari tempat keluarnya

kedalam ventriculus, cairan ini berisi enzim – enzim dan termasuk juga

didalamnya enzim cytase yang mencerna seluosa, seperti halnya pada Helix, yaitu

sejenis siput darat yang ada di Amerika (Radiopoetro, 1988).

Enzim cytase tersebut berasal dari bakteri hidup di dalam intestinum dan

ingluives. Enzim ini menghancurkan dinding sel tumbuh- tumbuhan sehingga isi

sel dapat dilepaskan keluar. Bagian berikutnya setelah ingluives adalah

ventriculus yang berupa kantong yang cukup luas tetapi sederhana,dilingkupi oleh

glandulae digestoriae yang menggerombol di sekeliling kebanyakan alat – alat

dalam. Glandulae digestoriae terdiri dari kumpulan tubuli yang bercabang –

cabang dan berakhir buntu pada gerombolan sel – sel. Dikenal ada tiga macam

sel, yaitu:

(30)

2) Sel yang menyerap partikel- partikel makanan dan mencernakannya intra-

seluler, juga menyerap hasil –hasil pencernaan di luar sel.

3) Sel yang mengasilkan CaCO3, fungsinya terutama ialah untuk membentuk

concha. Lanjutan ventriculus ialah intestinum yang berjalan berkelok – kelok yang

berakhir pada rektum yang bermuara keluar melalui anus. Penyerapan hasil – hasil

pencernaan terutama berlangsung di dalam intestinum (Radiopoetro, 1995).

Selain itu, Weel (1961) menyatakan bahwa ekstrak kelenjar saluran

pencernaan (digestive gland) Achatina fulica memiliki campuran enzim

carbohydrase yaitu berupa enzim kitinase, xilase, cellulase, lichenase, inulase,

hemiselulase, amilase, maltase, dan sukrase. Disamping itu, dygestive gland siput

mengandung enzim protease, dan polypeptidase. Selain itu juga mengandung

enzim hidrolitik yang terdiri dari enzim β-1,3-glukanase dan enzim β -1,4-glukanase (Gabriel and Kopecka, 1987). Enzim β-1,3-glukanase merupakan enzim yang menghidrolisis ikatan β-1,3-glukan pada dinding sel jamur patogen salah satunya C. albicans.

2.5 Pemurnian Enzim

Tujuan yang ingin dicapai dalam pemurnian enzim adalah mengisolasi

enzim spesifik dari senyawa lain yang tidak dikehendaki. Tahap-tahap pemurnian

tergantung tujuan akhir, apakah untuk tujuan komersial sebagai enzim industri

atau tujuan riset. Untuk kepentingan riset, biasanya enzim perlu dimurnikan

beberapa tahap dengan resiko terjadi kehilangan yang cukup besar (hingga 90%).

Enzim untuk kepentingan industri sedapat mungkin dicegah dari kehilangan,

(31)

menghilangkan senyawa yang mengganggu proses. Pemurnian protein dilakukan

berdasarkan sifat kelarutan, ukuran, muatan afinitas pengikatan protein itu sendiri.

Oleh karena itu campuran protein selanjutnya dipisahkan dengan berbagai seri

pemisahan.

Permasalahan dalam pemurnian protein atau enzim adalah memisahkan

enzim yang dikehendaki dari ratusan protein yang mempunyai stuktur kimia dan

fisika yang serupa. Semua langkah pemurnian menggunakan larutan penyangga

dengan pH tertentu. Larutan penyangga yang digunakan mempengaruhi sifat

biofisika protein. Jumlah protein enzim diakhir proses pemurnian tidak hanya

bergantung pada material awal tetapi juga bergantung pada proses. Ada protein

yang hilang pada setiap pemurnian, oleh karena itu perlu memaksimalkan langkah

kerja sehingga dapat memperoleh enzim yang optimal (Harris dan Angal, 1989)

Harris (1989) menyebutkan ada tiga faktor yang harus diperhatikan dalam

pemurnian enzim yaitu faktor kualitas, kuantitas dan ekonomis. Faktor kualitas

yaitu perlu tindakan untuk mempertahankan aktivitas protein dengan cara

mengurangi proteolisis dan denaturasi. Faktor kuantitas yaitu pemakaian akhir

dari protein murni akan menentukan kualitas enzim yang diperlukan sedangkan

ekonomis merupakan kunci penting bila akan dipakai dalam industri atau

diterapkan dalam skala laboratorium.

Pemurnian enzim dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain dengan

cara pengendapan dalam garam ammonium sulfat (salting out) atau pelarut

(32)

Penggunaan amonium sulfat untuk salting out memiliki keuntungan, antara

lain harga relatif murah, kelarutannya tinggi, pH larutan tidak berubah secara

ekstrem, dan tidak bersifat toksik. Kerugiannya ialah konsentrasi garam yang

tertinggal dalam produk tinggi sehingga kurang efisien dalam menghilangkan

pengotor. Pengendapan protein dengan pelarut organik seperti aseton lebih mudah

dilakukan karena penghilangan sisa aseton dapat dilakukan dengan sentrifugasi

dan penguapan.

2.6 Fraksinasi Pelarut Organik

Fraksinasi dengan pelarut organik dapat menggunakan aseton dan etanol.

Namun, untuk pemurnian protein lebih mudah menggunakan aseton karena aseton

tidak memilik efek azeotrop seperti etanol. Prinsip kerja dari fraksinasi dengan

pelarut aseton yaitu teknik pengendapan untuk meniadakan efek perlindungan

molekul air di sekitar permukaan molekul protein, akibatnya

molekul-molekul protein akan beragregasi sesamanya kemudian mengendap. Pengendapan

protein dengan pelarut organik aseton didasarkan pada sifat yang tidak saling larut

antara aseton (non-polar) dan molekul air (polar).

Penambahan aseton ke dalam larutan protein akan menurunkan konstanta

dielektrikum pelarut air dan mengurangi solvasi air terhadap residu hirofilik

enzim. Posisi air di sekitar daerah hidrofobik dari permukaan protein akan

(33)

Gambar 2.6 Agregasi protein karena interaksi antara air dan pelarut organik (Scopes, 1994).

Pada pengendapan dengan aseton, efek hidrofobisitas mempunyai

pengaruh yang kecil. Pengendapan justru terjadi karena adanya interaksi

elektrostatik antara muatan yang berlawanan pada permukaan protein. Interaksi

tersebut mengakibatkan protein berada pada kondisi isoelektrik, kemudian

beragregasi dan akhirnya mengendap. Pengendapan dengan aseton baik dilakukan

untuk mengisolasi protein-protein kaya akan residu hidrofobik yang lokasinya

disekitar membran (Scopes, 1994). Prosedur fraksinasi pelarut organik aseton

dilakukan pada suhu dibawah 00C. Pada suhu diatas 100C, akan terjadi

denaturasi.

Bagian hidrofobik

(34)

Gambar 2.7 Proses denaturasi protein jika suhu pelarut organik lebih dari 0oC (Scopes, 1994)

Pada proses denaturasi, konformasi protein akan segera berubah yang

memungkinkan molekul-molekul pelarut organik mendapatkan jalan masuk

kebagian dalam struktur protein, kemudian merusak interaksi hidrofobik (Harris

1989, Scopes 1994).

Interaksi internal hidrofobik

Molekul pelarut organik berinteraki dengan residu hidrofobik

Denaturasi

(35)

BAB III

METODE PENELITIAN

3. 1 Tempat dan waktu penelitian

Penelitian ini di kerjakan di laboratorium Biokimia Departemen Kimia

Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga pada bulan Februari 2012 -

Juli 2012.

3.2 Alat dan bahan penelitian

3.2.1 Bahan penelitian

Bahan-bahan yang digunakan adalah Achatina fulica yang didapatkan dari

kota Kediri, substrat laminarin, garam Rochelle, fenol, asam 3,5-dinitrosalisilat,

glukosa anhidrat, aseton, buffer fosfat, asam sitrat, buffer sitrat, reagen Lowry C,

akuades, dan kertas saring.

3.2.2 Peralatan penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat

gelas yang biasa digunakan di laboratorium kimia seperti gelas ukur, gelas arloji,

pipet tetes, pipet volume dll. Alat-alat yang digunakan adalah sentrifugator

(Centrific-228), inkubator (Memmert), spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu),

blender (Philip), neraca analitik (Kern 870), timbangan (Kern 444-45), water bath,

pHmeter (Orion-420A), magnetic stirer (Thermolyne Cimarec), kulkas (Sharp),

(36)
(37)

3.4 Prosedur Penelitian

3.4.1 Karantina Achatina fulica

Sejumlah Achatina fulica dikarantina selama 1 minggu dalam sebuah

kandang tertutup dengan beberapa ventilasi. Kandang dibuat lembab sesuai

dengan habitat asli Achatina fulica. Proses karantina bertujuan agar Achatina

fulica tersebut berada pada kondisi nutrisi yang sama dengan pemberian sumber

makanan berupa serat seperti kubis, daun singkong dll sehingga kandungan enzim

hidrolase dalam cairan pencernaan Achatina fulica maksimal serta lebih homogen.

3.4.2 Panen ekstrak kasar enzim Achatina fulica

Cangkang ekor (apex) Achatina fulica dipecah, cairan yang keluar dari

ekor Achatina fulica ditampung. Cairan ini berasal dari kelenjar pencernaan yang

mengandung konsorsium enzim. Cairan yang terkumpul disentrifugasi dengan

kecepatan 4000 rpm selama 20 menit. Jika terdapat endapan dan supernatan, maka

supernatan merupakan ekstrak kasar enzim cairan pencernaan Achatina fulica.

Preparat ekstrak kasar enzim dari cairan pencernaan Achatina fulica harus segera

digunakan agar tidak rusak.

3.4.3 Pembuatan kurva standar glukosa

Untuk membuat kurva standar, ditimbang 1 gram glukosa anhidrat

kemudian dilarutkan dalam labu ukur 100 mL akuades dalam labu ukur 100 mL

diperoleh larutan induk glukosa dengan konsentrasi 10 mg/mL. Standar glukosa

dibuat pada variasi konsentrasi 2-8 mg/mL. Penentuan kurva standar glukosa

berdasarkan metode DNS (Asam 3,5-dinitrosalisilat) sebagai berikut : Larutan

(38)

DNS 3 mL, dikocok dan dipanaskan pada penangas air mendidih 100oC selama 15

menit, kemudian didinginkan dalam air es selama 20 menit. Absorbansi diukur

dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada λ 550 nm. Prosedur yang sama digunakan untuk blanko dengan mengganti glukosa dengan aquades.

3.4.4 Uji aktivitas enzim β-1,3-glukanase

Untuk menentukan aktivitas enzim β-1,3-glukanase dengan cara menentukan jumlah glukosa yang terbentuk, yaitu dengan metode DNS (Asam

3,5-dinitrosalisilat). Penentuan aktivitas enzim β-1,3-glukanase yang diisolasi dari Achatina fulica dilakukan secara kuantitatif menggunakan substrat laminarin.

Sampel berupa 75 µL ekstrak enzim β-1,3-glukanase dalam 750 µL substrat 1% dalam buffer sitrat fosfat pH 5. Campuran tersebut diinkubasi dalam waterbath

pada suhu 37oC selama 10 menit. Hasil Inkubasi ditambahkan dengan 450 µL DNS lalu tabung diletakkan dalam penangas air mendidih selama 15 menit.

Kemudian segera didinginkan dalam air es selama 20 menit. Gula pereduksi yang

terbentuk diukur pada spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm dengan

menggunakan glukosa sebagai standar.

Satu unit aktivitas β-1,3-glukanase didefinisikan sebagai jumlah enzim β -1,3-glukanase dalam 1 mL ekstrak β-1,3-glukanase yang membebaskan 1 µmol gula pereduksi yang dihitung sebagai glukosa per menit pada kondisi percobaan.

Sedangkan untuk penentuan aktivitas spesifik enzim β-1,3-glukanase harus diketahui kadar protein. Aktivitas spesifik adalah total unit aktivitas enzim per

(39)

3.4.5 Pemurnian parsial dengan fraksinasi aseton

Fraksinasi aseton dilakukan pada suhu rendah dibawah -100C dengan

beberapa percobaan hingga didapatkan fraksi yang optimum. Fraksinasi pertama,

dimulai dari prosentase aseton 0-40% dan 40-75%. Ekstrak enzim β -1,3-glukanase sebanyak 20 mL ditambahkan aseton pada suhu -200C. Penambahan

volume aseton sesuai dengan tabel fraksinasi pada lampiran. Setelah penambahan

aseton, kemudian disentrifuga pada kecepatan 8000 rpm selama 20 menit.

Didapatkan endapan fraksi 0-40% dan supernatan. Endapan disimpan untuk

diukur aktivitasnya sedangkan supernatan diambil dan ditambahkan aseton untuk

fraksi selanjutnya.

Setiap endapan yang terbentuk dari masing-masing fraksi dilakukan

pengukuran aktifitas dari enzim β-1,3-glukanase. Jika aktivitas spesifik yang didapatkan dari fraksinasi masih kecil maka, dilakukan fraksinasi lagi dengan

prosentase aseton yang berbeda. Setiap fraksinasi menghasilkan aktivitas spesifik

yang berbeda. Dimungkinkan dalam tahap fraksinasi ini masih belum optimum,

artinya, masih ada enzim yang belum terendapkan pada rentang prosentase aseton.

Maka, harus dilakukan fraksinasi kembali hingga mendapatkan aktifitas enzim

yang paling tinggi.

3.4.6 Pembuatan kurva standar protein

Kurva standar protein dibuat menggunakan metode Lowry. Sebanyak 1

gram BSA (Bovin Serum Albumin) pada labu ukur 100 ml. Dengan demikian

(40)

kemudian dibuat larutan standar dengan variasi konsentrasi 100-500 µg/ml. Dari masing-masing konsentrasi larutan standar diambil 0,5 ml kemudian ditambah

larutan C (Komposisi larutan di Lampiran). Kedua larutan yang sudah dicampur

di vortex pada suhu ruang selama 5-10 menit. Selesai di vortex kemudian

ditambahkan 0,25 ml larutan D dan di vortex lagi. Setelah 20-30 menit, diukur

absorbansinya pada panjang gelombang 750 nm.

3.4.7 Penentuan kadar protein

Membuat 4 larutan yaitu Larutan A, Larutan B, Larutan C dan Larutan D

(Komposisi larutan ada di lampiran). Kemudian 0,5 mL larutan sampel

ditambahkan 2,5 mL larutan C. Kedua larutan yang sudah dicampur di vortex

pada suhu ruang selama 5-10 menit. Selesai di vortex kemudian ditambahkan 0,25

ml larutan D dan di vortex lagi. Setelah 20-30 menit, diukur absorbansinya pada

panjang gelombang 750 nm.

3.4.7 Karakterisasi Enzim

3.4.7.1 Penentuan suhu optimum aktivitas enzim β-1,3-glukanase

Pengujian suhu optimal aktivitas enzim β-1,3-glukanase dilakukan dengan menginkubasikan enzim dan substrat laminarin 1 mg/mL pada variasi suhu 300C,

370, 450C dan 500C.

3.4.7.2 Penentuan pH optimum akivitas enzim β-1,3-glukanase

pH optimum enzim ditentukan dengan menguji aktivitas enzim β -1,3-glukanase dengan substrat laminarin 1 mg/mL pada kisaran pH 4-8. Buffer sitrat

digunakan untuk pendaparan pH 3-6, buffer fosfat untuk pendaparan pH 7-8,

(41)

3.4.8 Analisis data

Aktivitas enzim dapat dihitung dengan membuat kurva baku glukosa yang

dibuat dari absorbansi pada panjang gelombang 550 nm terhadap kadar glukosa

standar menggunakan persamaan regresi linier sebagai berikut :

Y=bx+a

Dengan ketentuan :

Y= absorbansi

Absorbansi = Abssampel - Abskontrol

X=kadar glukosa (ug/mL)

b=Kemiringan Kurva

a=intersept

Ativitas Enzim ditentukan menggunakan rumus :

U = (X) x FP

BM X Waktu Inkubasi

Keterangan :

U = Aktivitas Enzim (Unit/ml)

X = Kadar glukosa yang terbentuk (mg/ml)

FP = Faktor Pengenceran

BM = Berat Molekul Glukosa

Sedangkan untuk mencari aktivitas spesifik dengan menggunakan rumus :

(42)

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Karantina Achatina fulica

Achatina fulica yang digunakan pada penelitian ini didapat dari kota

Kediri, Jawa Timur. Sebelum dilakukan isolasi cairan pencernaan, Achatina fulica

dikarantina terlebih dahulu. Proses karantina bertujuan agar Achatina fulica

berada pada kondisi nutrisi homogen yang berupa serat seperti kubis, daun

pepaya, daun singkong dll. Dengan demikian, diharapkan kandungan enzim

hidrolase dalam cairan pencernaan Achatina fulica dapat maksimal. Hal ini

berdasarkan teori enzim induktif yaitu enzim yang dibentuk karena adanya

induksi oleh substrat atau derivatnya.

Karantina Achatina fulica berlangsung selama 1 minggu dalam sebuah

kandang tertutup dengan beberapa ventilasi. Pemberian ventilasi bertujuan untuk

pertukaran udara. Kandang dibuat lembab dan terlindung dari cahaya matahari

secara langsung agar sesuai dengan habitat asli Achatina fulica. Kandang juga

harus dalam keadaan bersih agar Achatina fulica berada dalam keadaan steril.

Kelembapan kandang dapat dijaga dengan diberi pelepah pisang atau wadah berisi

air.

4.2 Panen Ekstrak Enzim Kasar Achatina fulica

Cairan pencernaan Achatina fulica yang mengandung konsorsium enzim

dipanen setiap akan dilakukan percobaan agar enzim tidak mengalami penurunan

aktivitas. Proses pengambilan cairan pencernaan dengan cara memecah cangkang

(43)

pada gelas beker dalam es agar tidak terjadi perubahan aktivitas. Hal ini karena,

aktivitas enzim salah satunya dipengaruhi oleh faktor suhu. Dari 50 ekor Achatina

fulica didapatkan sekitar 30 mL cairan pencernaan yang merupakan konsorsium

enzim salah satunya terdiri dari enzim β-1,3 glukanase.

Konsorsium enzim dari cairan pencernaan masih mengandung partikel dan

biomassa sel sehingga harus dipisahkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 4000

rpm selama 20 menit. Sentrifugasi bertujuan untuk sedimentasi partikel

berdasarkan peningkatan medan gravitasi. Biomassa sel yang mempunyai massa

dan kerapatan lebih besar daripada protein mengendap , sedangkan protein enzim

tetap dalam larutan sebagai supernatan.

4.3 Uji Aktivitas Enzim

4.3.1 Pembuatan kurva standar glukosa

Kurva standar diperlukan untuk menentukan konsentrasi larutan sampel

yang telah diketahui absorbansinya. Untuk membuat kurva standar glukosa,

digunakan standar glukosa pada variasi konsentrasi 2-8 mg/ml. Pembuatan kurva

standar glukosa berdasarkan metode DNS (Asam 3,5-dinitrosalisilat). Dari

pengukuran didapatkan nilai absorbansi yang kemudian dimasukkan dalam kurva

dan didapatkan persamaan regresi y= 0,121x-0,064. Persamaan ini selanjutnya

digunakan untuk pengukuran aktivitas enzim β-1,3 glukanase sebelum dan setelah dilakukan pemurnian parsial dengan fraksinasi aseton. Nilai y pada persamaan

regresi tersebut merupakan selisih antara absorbansi sampel dan absorbansi

kontrol, sedangkan nilai x merupakan kadar glukosa yang terbentuk dari aktivitas

(44)

Gambar 4.1 Penentuan kurva standar glukosa

4.3.2 Pembuatan kurva progress enzim β-1,3 glukanase

Jumlah enzim ditentukan dengan cara uji aktivitas enzim berdasarkan

metode DNS (Asam 3,5-dinitrosalisilat) menggunakan substratnya pada waktu

inkubasi tertentu. Untuk menentukan waktu inkubasi yang optimal dibuat kurva

progres aktivitas enzim terhadap waktu pada selang waktu 10-50 menit. Kurva

progres merupakan gambaran untuk mendapatkan Vo yaitu kondisi yang tepat

untuk mendapatkan waktu inkubasi yang optimal. Vo didapatkan dari titik saat

kurva berbentuk garis lurus selanjutnya kurva tidak lurus lagi dengan V lebih

rendah daripada Vo.

Gambar 4.2 Penentuan kurva progres enzim β-1,3-glukanase

12

O

D

λ550

nm

O

D

λ550

nm

(45)

Berdasarkan Gambar 4.2, didapatkan bahwa pembentukan produk

persatuan waktu maksimal dan meningkat tajam sampai masa inkubasi 10 menit.

Dalam kondisi ini enzim berada pada kecepatan awal (Vo). Pada Gambar 4..2,

nilai slope garis mula-mula tinggi namun slope menurun dimulai menit ke-12.

Nilai slope atau kemiringan tersebut menunjukkan kecepatan reaksi enzim.

Setelah waktu 12 menit, kecepatan reaksi enzim menurun dari Vo dan hampir

tidak terbentuk produk lagi. Kecepatan reaksi enzim yang mengalami penurunan

dari Vo ini antara lain dapat disebabkan karena inhibisi enzim oleh produk atau

suhu reaksi enzimatis. Semakin lama waktu inkubasi, produk yang terbentuk akan

menjenuhi enzim. Sedangkan faktor suhu yaitu pada waktu inkubasi yang

semakin lama bagi enzim tertentu dapat mengalami perubahan struktur pada sisi

aktif. Sehingga dari Gambar 4.2 dapat disimpulkan bahwa, waktu inkubasi yang

optimal yaitu 10 menit ketika kecepatan masih Vo.

4.3.3 Penentuan aktivitas enzim β-1,3-glukanase

β-1,3-glukanase merupakan enzim hidrolase yang memiliki kemampuan untuk menghidrolisis β-1,3-glukan menjadi glukosa. Satu unit aktivitas enzim β -1,3-glukanase didefinisikan sebagai jumlah enzim per ml sediaan enzim yang

diperlukan untuk membentuk 1µmol glukosa per menit dalam kondisi percobaan.

Jumlah glukosa yang dihasilkan dalam campuran reaksi berbanding lurus dengan

aktivitas enzim.

Pada pengukuran aktivitas enzim β-1,3-glukanase, 75 µL enzim ditambahkan 750 µL substrat kemudian diinkubasi pada suhu 370C selama 10

(46)

menghasilkan glukosa. Setelah inkubasi, kemudian ditambahkan 450 µl DNS.

Pada setiap penambahan DNS, tabung eppendorf harus dikocok untuk

menghomogenkan larutan. Jika ada beberapa sampel enzim yang akan ditentukan

aktivitasnya, jumlah pengocokan harus sama. Penentuan aktivitas enzim harus

dilakukan secara teliti dan kuantitatif.

Setelah penambahan DNS kemudian dipanaskan dalam air mendidih

selama 10 menit. Pemanasan dalam air mendidih bertujuan untuk menghentikan

reaksi antara substrat dan enzim. Kadar glukosa yang terbentuk ditentukan dengan

menggunakan metode DNS. Hal ini karena, gula pereduksi dapat bereaksi dengan

DNS yang kemudian diukur secara spektrofotometri pada panjang gelombang 550

nm. Reaksi ini dibuktikan dengan adanya perubahan warna larutan dari warna

kuning berubah menjadi warna kecoklatan (asam 3-amino-5-nitrosalisilat). Reaksi

yang terjadi adalah sebagai pada gambar 4.3.

Asam 3,5-dinitrosalisilat Asam 3-amino-5-nitrosalisilat

(kuning) (Coklat)

Gambar 4.3 Reaksi DNS dengan gula pereduksi

Warna coklat (Asam 3-amino-5-nitrosalisilat) pada reaksi tersebut menandakan

adanya gugus aldehid pada glukosa yang tidak lain merupakan suatu gula

pereduksi.

(47)

Pada penelitian uji aktivitas enzim β-1,3-glukanase digunakan kontrol yang berfungi untuk mengurangi pengaruh pengotor berupa glukosa yang dapat

terdeteksi dengan reagen DNS. Komposisi kontrol sama dengan komposisi sampel

tetapi berbeda pada perlakuan. Urutan perlakuan pada komposisi kontrol yaitu

enzim ditambahkan DNS kemudian dididihkan terlebih dahulu sebelum

ditambahkan substrat. Hal ini bertujuan supaya enzim menjadi non aktif saat

direaksikan dengan substrat. Sedangkan pada sampel enzim terlebih dahulu

ditambahkan substrat kemudian di inkubasi selama 10 menit supaya enzim

bereaksi dengan subtrat baru kemudian ditambahkan DNS. Uji aktivitas enzim

dilakukan pada ekstrak kasar enzim dan hasil fraksinasi parsial.

4.4 Penentuan Kadar Protein dengan Metode Lowry

Kandungan protein pada ekstrak enzim tidak dapat menggambarkan

kuantitas enzim yang terkandung, akan tetapi penting untuk menentukan aktivitas

spesifik enzim. Protein yang terkandung pada enzim β-1,3 glukanase diukur dengan metode Lowry. Metode ini mengkombinasikan pereaksi Biuret dengan

pereaksi lain (Folin-Ciocalteau phenol) yang bereaksi dengan residu tyrosine dan

tryptophan dalam protein. Reaksi ini menghasilkan perubahan warna dari kuning

menjadi biru. Semakin banyak kandungan protein pada larutan, semakin biru

warna larutan sesudah penambahan reagen folin-ciocalteau.

Untuk menghitung kadar protein enzim, digunakan kurva standar bovin

serum albumin (BSA). Kurva standar dibuat dari larutan BSA dengan variasi

konsentrasi 100-500 µg/ml dan diukur pada panjang gelombang 750 nm. Dari

(48)

yaitu y= 0.004x + 0.029. Kemudian persamaan ini digunakan untuk menentukan

kadar protein enzim tahap purifikasi parsial dan ekstrak kasar enzim.

Gambar 4.4 Kurva Standar Protein

4.5 Pemurnian parsial enzim β-1,3-glukanase dengan fraksinasi aseton

Ekstrak kasar enzim β-1,3-glukanase yang dihasilkan masih mengandung protein-protein lain. Untuk memisahkan enzim β-1,3-glukanase dari campuran protein-protein lain tersebut, dilakukan fraksinasi dengan aseton terhadap ekstrak

kasar enzim β-1,3-glukanase. Dalam penelitian ini dipilih aseton sebagai pelarut organik untuk fraksinasi, karena aseton lebih mudah dipisahkan dari protein yaitu

dengan cara sentrifugasi dan penguapan.

Penambahan aseton ke dalam larutan protein akan menurunkan konstanta

dielektrikum pelarut dan mengurangi solvasi air terhadap residu hirofilik enzim.

Posisi air di sekitar daerah hidrofobik dari permukaan protein akan digantikan

oleh pelarut aseton dan segera terjadi interaksi hidrofobik. Pengendapan terjadi

O

D

λ7

5

0

n

(49)

karena adanya interaksi elektrostatik antara muatan yang berlawanan pada

permukaan protein sebagaimana pada gambar 2.7.

Prosedur fraksinasi pelarut organik dengan aseton dilakukan pada suhu

dibawah 00C. Pada suhu diatas 100C, akan terjadi denaturasi (Scopes, 1994). Oleh

karena itu, digunakan dry es karena dapat menjaga suhu hingga di bawah 00C.

Pada penelitian ini, penambahan enzim pada aseton dilakukan saat suhu aseton

-200C . Volume aseton yang ditambahkan bergantung pada prosentase fraksinasi,

sesuai dengan tabel fraksinasi pada lampiran. Kemudian, campuran enzim dan

aseton diaduk dengan pengaduk magnetik stirer selama 7 menit dalam keadaan

terendam dry ice.

Pengadukan dengan pengaduk magnetik bertujuan untuk

menghomogenkan campuran aseton dan enzim sehingga dapat menyempurnakan

pengendapan protein. Penambahan aseton dan pengadukan dilakukan dengan

perlahan-lahan untuk menghindari pembentukan buih yang dapat menyebabkan

protein terdenaturasi. Kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 9000

rpm selama 20 menit. Suhu dalam sentrifuga adalah -100C sehingga sebelum

campuran enzim dan aseton dimasukkan dalam sentrifuga, suhu sentrifuga harus

dikondisikan terlebih dahulu sampai -100C.

Setelah sentrifugasi campuran enzim dan aseton, diperoleh endapan dan

supernatan. Endapan merupakan enzim target sedangkan supernatan merupakan

campuran berbagai protein terlarut. Ukuran molekul juga mempengaruhi

pengendapan protein oleh aseton. Pada molekul-molekul lebih besar, presentase

(50)

terbentuk dari fraksinasi hanya mengandung protein, karena biomassa sel dan

partikel padat sudah diendapakan sebelumnya melalui sentrifugasi awal ekstrak

enzim awal. Pelarut dan partikel yang relatif lebih kecil berada dalam supernatan.

Endapan yang dihasilkan kemudian dipisahkan dari supernatan sedangkan

supernatan ditambah dengan aseton untuk mengendapkan fraksi selanjutnya.

Endapan protein pada setiap fraksi harus dibebaskan dari aseton, karena

sisa aseton dapat menyebabkan denaturasi. Penghilangan aseton cukup dengan

dianginkan-anginkan karena aseton mudah menguap. Selain itu, penghilangan

aseton juga dibantu dengan kertas saring steril yaitu dengan meletakkan kertas

saring pada permukaan endapan bagian atas karena kemungkinan penguapan

aseton mengumpul dari bawah ke atas. Dengan demikian, aseton dapat

dihilangkan dan hasil fraksinasi dapat optimum. Endapan kemudian dilarutkan

dalam aquades sampai tepat larut. Setelah bau aseton hilang kemudian dilakukan

perhitungan aktivitas enzim.

Fraksinasi aseton dilakukan pada 4 percobaan dengan prosentase aseton

berbeda-beda. Percobaan pertama, fraksinasi dilakukan pada prosentase aseton

0-40% dan 40-75%.

Tabel 4.1 Hasil Fraksinasi Aseton ke-1

(51)

Berdasarkan Tabel 4.1, aktivitas spesifik enzim terbesar pada fraksi 40-75

yaitu 0,1004 U/mg. Namun aktivitas spesifik enzim masih menyebar pada fraksi

0-40 yaitu sebesar 0,087. Untuk mengumpulkan aktivitas enzim pada 1 fraksi

dilakukan fraksinasi ke-2, yaitu 0-50% dan 50-70%.

Tabel 4.2 Hasil Fraksinasi Aseton ke-2

Berdasarkan Tabel 4.2, aktivitas spesifik enzim terbesar pada fraksi

50-70% yaitu 0,11074 U/mg. Nilai aktivitas spesifik pada fraksi ini lebih besar

daripada nilai aktivitas spesifik fraksi 40-75% di percobaan pertama. Sehingga,

pengumpulan aktivitas enzim pada 1 fraksi sudah berhasil. Namun, pada

percobaan ke-2 aktivitas spesifik enzim masih menyebar pada fraksi 0-50% yaitu

sebesar 0,092. Sehingga, perlu dilakukan percobaan fraksinasi selanjutnya untuk

mencari fraksi paling optimum yang dapat mengumpulkan aktivitas enzim.

Tabel 4.3 Hasil Fraksinasi Aseton ke-3

(52)

Percobaan ke-3 dilakukan pada fraksi 0-40% dengan hasil aktivitas

spesifik sebesar 0,113 U/mg, pada fraksi 40-60% hasil aktivitas spesifik sebesar

0,119 U/mg dan pada fraksi 60-80% hasil aktivitas spesifik sebesar 0,0138 U/mg.

Berdasarkan Tabel 4.3, aktivitas spesifik terbesar pada fraksi 40-60%. Aktivitas

spesifik fraksi 40-60% ini lebih besar dari pada aktivitas spesifik terbesar dari

percobaan 2. Jadi, aktivitas enzim sudah lebih terkumpul pada 1 fraksi. Namun,

masih terdapat aktivitas spesifik pada fraksi 0-40% dan 60-80%.

Agar aktivitas enzim lebih banyak yang terkumpul pada 1 fraksi,

dilakukan percobaan lagi yaitu dengan fraksi lebih besar dari 40-60% namun lebih

kecil dari 60-80%. Pemurnian parsial dengan fraksinasi aseton memang harus

dilakukan berkali-kali unuk mendapatkan nilai fraksi yang optimum. Penentuan

untuk nilai fraksi selanjutnya harus tepat agar aktivitas enzim dapat meningkat

dan terkumpul dalam 1 fraksi. Sehingga fraksi yang tepat untuk percobaan ke-4

yaitu fraksi 0-45%, 45-70% dan 70-80%. Dari percobaan ke-4 ini diharapkan

fraksi dapat terkumpul pada fraksi 45-70% mengacu dari hasil percobaan ke-3.

Tabel 4.4 Hasil Fraksinasi Aseton ke-4

Dari percobaan ke-4, didapatkan aktivitas spesifik pada fraksi 0-45%

(53)

sebesar 0,031 U/mg. Aktivitas spesifik terbesar pada fraksi 45-70%. Dari tiga

percobaan yang sebelumnya, aktivitas spesifik pada fraksi ini paling besar. Pada

fraksi terakhir yaitu 70-80%, aktivitas spesifik sangat kecil dari aktivitas spesifik

45-70%. Sehingga, dapat disimpulkan bahwa fraksi optimum untuk pemurnian

parsial enzim β-1,3-glukanase dengan fraksinasi aseton yaitu pada fraksi 45-70%. Namun, pada fraksi 0-40% masih terdapat aktvitas spesifik enzim β -1,3-glukanase. Kemungkinan hal ini karena adanya isozim yang merupakan kelompok

enzim yang mengkatalisa reaksi yang sama tetapi berbeda dalam sifat fisik, kimia

dan imunologinya. Enzim dapat membentuk isozim memiliki sifat oligomer yang

terdiri dari 2 atau lebih monomer (subunit). Dengan demikian, pada proses

fraksinasi, isozim yang terdiri dari beberapa monomer terpisah saat pengendapan,

membentuk unit-unit dan menyebar pada fraksi berikutnya. Untuk melihat adanya

isozim ini dapat dengan menggunakan metode zimogram. Nilai aktivitas spesifik

pada hasil fraksinasi lebih besar dari ekstrak kasar yaitu 0,137. Sehingga ada

peningkatan kemurnian enzim dari ekstrak kasar enzim.

Tabel 4.5 Data Purifikasi Parsial enzim β-1,3-glukanase

4.6 Karakterisasi Enzim β-1,3-glukanase

4.6.1 Penentuan suhu optimum aktivitas enzim β-1,3-glukanase

(54)

enzim akan terganggu dan dengan demikian aktifitas enzim menjadi berkurang dan

kecepatan reaksinya pun akan menurun. Penentuan suhu optimum enzim dilakukan

pada suhu 300C, 370C, 450C dan 500C. Untuk penentuan suhu optimum prosedurnya

sama seperti penentuan aktivitas enzim, namun berbeda pada suhu inkubasi.

Gambar 4.5 Kurva suhu optimum aktivitas enzim β-1,3 glukanase

Laju reaksi enzimatik sangat dipengaruhi suhu. Pada penelitian yang telah

dilakukan, peningkatan suhu dari 300C sampai dengan 370C meningkatkan aktivitas

enzim β-1,3-glukanase, karena terjadi peningkatan energi kinetik. Peningkatan energi kinetik mempercepat gerak vibrasi, translasi, serta rotasi enzim dan substrat,

sehingga meningkatkan peluang molekul-molekul untuk saling berinteraksi.

Berdasarkan Gambar 4.5, pada suhu diatas 370C enzim mengalami

penurunan aktivitas. Tingginya suhu akan menyebabkan rusaknya interaksi non

kovalen (ikatan hidrogen, ikatan vander waals, interaksi hidrofobik, dan interaksi

elektrostatistik) yang menjaga struktur tiga dimensi enzim, sehingga enzim Suhu (0C)

O

D

λ5

5

0

n

(55)

terdenaturasi. Berdasarkan gambar 4.4, dapat disimpulkan bahwa suhu optimum

enzim pada 370C.

4.6.2 Penentuan pH optimum aktivitas enzim β-1,3-glukanase

Enzim merupakan suatu protein yang memiliki aktifitas biokimiawi

sebagai katalis suatu reaksi. Karena merupakan suatu protein, enzim sangat rentan

terhadap kondisi lingkungan. Adanya perubahan pH lingkungan akan

mengakibatkan aktivitas enzim ikut mengalami perubahan. Karena itu tiap enzim

mempunyai pH tertentu yang menyebabkan aktifitasnya mencapai keadaan

optimum. Penentuan pH optimum enzim dilakukan pada variasi pH 4, pH 5, pH 6,

pH 7 dan pH 8.

Gambar 4.6 Kurva pH optimum aktivitas enzim β-1,3 glukanase

Berdasarkan Gambar 4.6, pH optimum enzim β-1,3 glukanase pada pH 6. Pada pH ini enzim berada pada tingkat ionisasi yang paling sesuai untuk berikatan

dengan substrat. Konformasi enzim dalam bentuk yang sangat stabil, sehingga

efektifitas pengikatan enzim-substrat tinggi. Perubahan pH di sekitar pH optimum

menyebabkan berubahnya muatan residu-residu asam amino, terutama yang

O

D

λ5

5

0

n

(56)

substrat. Hal ini menyebabkan turunnya efektifitas pengikatan enzim-substrat,

sehingga perubahan pH di sekitar pH 6 menyebabkan turunnya aktivitas enzim.

Perubahan pH yang terlalu jauh dari pH optimum menyebabkan enzim mengalami

denaturasi, sehingga aktivitas yang dihasilkan sangat kecil. Hal ini terjadi ketika

(57)

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 KESIMPULAN

1. Aktivitas spesifik enzim β-1,3 glukanase yang diisolasi dari cairan pencernaan Achatina fulica sebelum dilakukan pemurnian parsial dengan

fraksinasi aseton sebesar 0,137 U/mg sedangkan aktivitas spesifik enzim

β-1,3 glukanase setelah dilakukan pemurnian parsial dengan fraksinasi aseton sebesar 0,249 U/mg. Sehingga tingkat kemurnian enzim sebesar

1,81 kali.

2. Pemurnian parsial enzim β-1,3 glukanase menggunakan fraksinasi aseton menghasilkan aktivitas spesifik terbesar pada fraksi 45-70%. Pada fraksi

ini, nilai aktivitas spesifik enzim β-1,3 glukanase sebesar 0,249 U/mg. 3. Dari hasil karakterisasi enzim β-1,3 glukanase didapatkan suhu optimum

aktivitas enzim β-1,3 glukanase pada 370C dan pH optimum 6.

5.2 SARAN

Dilakukan pemurnian dengan beberapa tahap lagi untuk mendapatkan

enzim β-1,3 glukanase yang lebih murni. Dengan demikian, enzim β -1,3-glukanase dapat dimanfaatkan untuk berbagai bidang salah satunya untuk bidang

Gambar

Gambar 2.1  Mekanisme kerja enzim model lock and key (Stryer et al., 2002)
Gambar 2.2 Mekanisme kerja enzim model induced fit (Stryer et al., 2002)
Gambar 2.3 Aktivitas enzim β-1,3-glukanase terhadap substrat β-1,3-glukan
Gambar 2.4 Struktur dinding sel C.albicans dengan komponen utama β-   glukan.
+7

Referensi

Dokumen terkait