PERCOBAAN III KROMATOGRAFI KERTAS ASM AMINO

(1)

PERCOBAAN III

Judul : Kromatografi Kertas Daripada Asam-Asam Amino

Tujuan : Untuk mempelajari pemisahan asam amino dengan cara kromatografi kertas

Hari/Tanggal : Rabu/23 Maret 2011

Tempat : Laboratorium Kimia FKIP Unlam Banjarmasin

I. DASAR TEORI Kromatografi Kertas

Kromatografi digunakan untuk memisahkan campuran dari substansinya menjadi komponen-komponennya. Seluruh bentuk kromatografi bekerja berdasarkan prinsip yang sama. Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan atau cairan yang didukung pada padatan) dan fase gerak (cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen dari campuran bersama-sama. Komponen-komponen yang berbeda akan bergerak pada laju yang berbeda pula. Dalam kromatografi kertas, fase diam adalah kertas serap yang sangat seragam. Fase gerak adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.

Beberapa senyawa dalam campuran bergerak sejauh dengan jarak yang ditempuh pelarut; beberapa lainnya tetap lebih dekat pada garis dasar. Jarak tempuh relative pada pelarut adalah konstan untuk senyawa tertentu sepanjang anda menjaga segala sesuatunya tetap sama, misalnya jenis kertas dan komposisi pelarut yang tepat.

Jarak relative pada pelarut disebut sebagai nilai Rf. Untuk setiap senyawa berlaku rumus sebagai berikut:

(2)

Posisi pelarut depan ditandai dengan pensil dan kromatogram lalu dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa berwarna, utamanya coklat atau ungu.

Kromatografi Kertas pada Asam Amino

Asam-asam amino yang bereaksi dengan ninhidrin membentuk suatu produk yang disebut ungu Ruhmann. Reaksi ini biasanya digunakan sebagai uji bercak untuk mendeteksi adanya asam amino pada kertas kromatografi.

Adapun reaksi umum secara keseluruhannya, adalah sebagai berikut :

ninhidrin

+

(3)

Alanin

Semua asam amino, kecuali glisin dapat dianggap sebagai derivat alanin. Alanin diperoleh untuk pertama kalinya oleh Weyl dari hasil hidrolisis fibroin, yaitu protein yang terdapat pada sutera. Struktur alanin :

Treonin

Treonin adalah homolog yang lebih besar dari erin dan termasuk dalam golongan asam amino esensial. Mula-mula treonin diisolasi dari hasil hidrolisis fibrin darah. Berikut struktur treonin :

Glisin

(4)

II. ALAT DAN BAHAN

9) Asam amino (glisin, alanin, treonin)

10) Kertas kromatografi 2 lembar ukuran 19 x 8 cm (kertas saring) 11) Kertas kromatografi 2 lembar ukuran 8 x 5 cm (kertas saring)

III. PROSEDUR KERJA 3.1 Membuat Eluen

1) Eluen 1

(5)

hingga lapisan memisah, lapisan atas digunakan sebagai fase gerak dan lapisan bawah untuk menjenuhkan chamber.

2) Eluen 2

Memasukkan pelarut (eluen) fenol : aquadest dengan perbandingan 3:1 ke dalam gelas kimia. Mendiamkan hingga lapisan memisah, lapisan atas digunakan sebagai fase gerak dan lapisan bawah untuk menjenuhkan chamber.

3.2 Membuat Larutan Standar Asam Amino

1) Melarutkan 3 mg alanin dalam 1 mL etanol, kemudian menambahkan 1 tetes HCl pekat.

2) Mengulangi prosedur satu untuk glisin dan treonin.

3.3 Kromatografi Kertas Asam Amino

1) Menyiapkan kertas kromatografi ukuran 19 x 8 cm.

2) Memasukkan dalam chamber, kemudian menjenuhkan dengan uap eluen 1.

3) Menyiapkan kertas kromatografi ukuran 8 x 5 cm.

4) Menotolkan larutan asam amino standar (alanin, glisin dan treonin) pada kertas kromatografi ukuran 19 x 8 cm dengan jarak 1 ½ cm pada ujung kertas

5) Mendiamkan beberapa saat hingga kering kemudian memasukkan ke dalam chamber yang telah berisi kertas kromatografi jenuh dan eluen (fase gerak).

6) Mengeluarkan kertas kromatografi ketika larutan elusi berjalan cukup jauh.

7) Mengeringkan kertas kromatografi kemudian menyemprotkan dengan larutan ninhidrin.

(6)

9) Mengulangi percobaan di atas dengan eluen 2.

IV. HASIL PENGAMATAN

No Variabel yang diamati Hasil pengamatan

Eluen 1 Eluen 2  Memasukkan kedalam

chamber (menjenuhkan)

Menotolkan ketiga larutan asam amino pada kertas kromatografi

 Mengelusi  Mengeringkan

 Menyemprot dengan ninhidrin

(7)

geraknya berupa cairan pelarut (eluen). Pelarut (eluen) yang digunakan merupakan campuran beberapa larutan.

Dalam percobaan ini melakukan teknik kromatografi kertas dengan cara 2 dimensi, yaitu menggunakan dua macam larutan eluen yakni eluen pertama berupa n-butanol : asam cuka glasial : aquadest dengan perbandingan 14 mL : 8 mL : 14 mL, sedangkan eluen kedua adalah campuran dari fenol dan aquadest dengan perbandingan 3 : 1. Penggunaan cara 2 dimensi ini dikarenakan dalam percobaan ini menggunakan sampel dengan komponen yang cukup banyak yaitu 3 macam sampel (alanin, glisin, dan treonin).

(8)

Alanin

Glisin

Treonin

Tetapi hasil ester yang diperoleh ini tidak stabil karena dapat bereaksi lebih lanjut sesamanya menghasilkan siklis amida (diketopiperazina). Jadi, penambahan etanol dan HCl pekat bertujuan untuk melarutkan asam amino tersebut, sehingga mudah untuk dipisahkan lebih lanjut.

Dalam percobaan ini alasan untuk menutup rapat botol reagent/chamber adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan kertas saring yang mengelilingi sisi chamber yang terbasahi oleh pelarut.Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut. Karena pelarut bergerak lambat pada kertas, komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai noda-noda asam amino yang berwarna.

(9)

penggunaan pipa kapiler pada saat penotolan adalah agar tetesan asam amino yang diteteskan tidaklah terlalu banyak sehingga dalam satu kertas saring mampu menampung tiga jenis sampel asam amino. Kemudian dimasukkan ke dalam chamber/botol reagent yang telah dijenuhi oleh uap eluen. Kemudian chamber ditutup rapat agar terjadi pemisahan yang sempurna. Pemisahan asam amino dengan cara kromatografi kertas disebabkan adanya perbedaan koefisien partisi antara air dan pelarut organik. Perbedaan koefisien partisi menunjukkan perbedaan laju rambatan pada permukaan kertas dari air dan pelarut organik yang merambat secara perlahan. Fase air akan tertahan dengan kuat di pori-pori kertas karena adanya interaksi yang kuat antara air dengan gugus hidroksil dari selulosa kertas saring.

(10)

sepanjang kertas diangkut oleh pelarut. Mereka akan memiliki nilai Rf yang relatif tinggi.

Dengan kata lain, molekul-molekul polar akan memiliki atraksi yang tinggi untuk molekul-molekul air dan kurang untuk pelarut yang non polar. Dan karenanya, cenderung untuk larut dalam lapisan tipis air sekitar serat lebih besar daripada pelarut yang bergerak. Karena molekul-molekul ini menghabiskan waktu untuk larut dalam fase diam dan kurang dalam fase gerak, molekul-molekul tidak akan bergerak sangat cepat pada kertas.

Berdasarkan literatur, dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat bercak-bercak menjadi tampak dengan jalan mereaksikannya dengan zat kimia sehingga menghasilkan produk yang berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino.Kromatogram dapat dikeringkan dan ditambahkan dengan larutan ninhidrin.Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna khas ungu-biru sampai kecoklatan atau kuning.

Asam amino merupakan jenis zat tidak berwarna, sehingga untuk mengetahui letak noda diperlukan pereaksi lokasi, maka pada kertas kromatografi disemprotkan larutan ninhidrin. Dalam percobaan ini digunakan larutan ninhidrin yang disemprotkan pada kertas kromatografi setelah dikeringkan, sehingga noda-noda pada kertas kromatografi dapat terlihat yakni noda yang berwarna ungu. Terbentuknya noda berwarna ungu ini disebabkan karena terjadinya reaksi antara hidrat dari triketon siklik (ninhidrin) dengan asam amino.

(11)

Reaksi alanin dengan ninhidrin secara terperinci ialah :

Glisin

ninhidrin

+

+ HCHO + CO2 + 3H2O + H+

(12)

Reaksi glisin dengan ninhidrin secara terperinci ialah :

Treonin

ninhidrin

+

+ CH3CHOHCHO + CO2 + 3H2O + H+

(13)

Reaksi treonin dengan ninhidrin secara terperinci ialah :

Noda-noda ini kemudian diukur dengan membandingkan jarak komponen yang dipisahkan (analit) dengan jarak pergerakan pelarut, disimbolkan dengan

Rf. Rumusnya : Rf=

jarak noda

jarak eluen

Rf

=

jarak yang ditempuh oleh senyawa

jarak yang ditempuh oleh pelarut

(14)

Berdasarkan perhitungan diperoleh bahwa masing-masing asam amino memiliki harga Rf yang berbeda. Untuk eluen pertama yaitu alanin Rf = 0,44; glisin Rf = 0,3; dan treonin Rf = 0,4. Sedangkan untuk eluen kedua, ialah harga Rf alanin = 0,9; Rf glisin = 0,94 dan Rf treonin =1. Perbedaan ini dipengaruhi oleh keterikatan analit terhadap eluen. Karena eluen yang digunakan bersifat non polar maka senyawa yang lebih non polar akan terikat lebih kuat pada eluen sehingga harga Rf akan semakin besar.

Jika dibandingkan dengan harga Rf asam-asam amino standar yakni untuk alanin (Rf=0,38), glisin (Rf=0,26) dan treonin (Rf=0,35) berbeda dengan harga Rf hasil percobaan. Hal ini karena harga Rf dipengaruhi oleh eluen, sedangkan pada harga Rf standar tidak diketahui eluen yang digunakan, bisa saja eluen yang digunakan berbeda sehingga hasil daripada harga Rf juga berbeda. Tapi bila dilihat antara harga Rf hasil percobaan dengan harga Rf standar diperoleh suatu urutan yang sama yakni harga Rf untuk alanin lebih besar daripada glisin dan treonin kemudian treonin lebih besar daripada glisin.

Pada eluen pertama, harga Rf masing-masing sampel asam amino menunjukkan alanin lebih larut dalam eluen pertama, yaitu 1-butanol yang bersifat non polar sehingga dapat dikatakan bahwa alanin bersifat lebih non polar dibandingkan dengan kedua sampel lainnya. Treonin bersifat lebih nonpolar daripada glisin. Sedangkan eluen kedua digunakan pelarut fenol yang bersifat non polar, sehingga senyawa yang lebih larut urutannya adalah alanin terlebih dahulu lalu treonin dan glisin karena dilihat dari strukturnya alanin bersifat lebih non polar dibandingkan kedua asam amino lainnya, dan treonin bersifat lebih non polar dibandingkan dengan asam amino glisin atau dapat dikatakan bahwa glisin merupakan asam amino yang paling polar dibandingkan kedua sampel asam amino yang digunakan.

(15)

Alanin Glisin Treonin Alanin mempunyai gugus R non polar, glisin dan threonin mempunyai gugus R polar, tetapi gugus R pada glisin, yaitu suatu atom hidrogen terlalu kecil untuk mempengaruhi derajat polaritas gugus α-amino dan α-karboksil yang tinggi sehingga treonin lebih non polar dibandingkan dengan glisin. Hal ini sesuai dengan hasil Rf yang diperoleh dari kedua eluen untuk masing-masing asam amino. Sehingga urutan kepolarannya dari yang paling polar adalah :

Glisin > Threonin > Alanin

VI. KESIMPULAN

1)

Kromatografi kertas dapat digunakan untuk mengidentifikasi/memisahkan asam amino dalam suatu campuran 2) Harga Rf masing-masing analit untuk eluen 1 adalah :

a) Alanin = 0,44 b) Treonin = 0,4 c) Glisin = 0,3

Harga Rf masing-masing analit untuk eluen 2 adalah :

a) Alanin = 0,9 b) Treonin = 1 c) Glisin = 0,94

(16)

Glisisn > Treonin > Alanin

Sedangkan untuk eluen 2 adalah :

Alanin > Glisin > Treonin

VII. DAFTAR PUSTAKA

Anwar, Chairil, Bambang Purnowo, Harno Dwi Pranowo dan Tutik Dwi Wahyuningsih. 1996. Pengantar Praktikum Kimia Organik. Jakarta: Depdikbud.

Clark, Jim. 2007. Kromatografi Kertas (online). http://www.chem-is-try.org/author/Jim_Clark/. Diakses pada tanggal 27 Maret 2011.

Fessenden dan Fessenden. 1994. Kimia Organik Jilid 2 Edisi Ketiga. Jakarta: Erlangga.

Harborne, J. B. 1996. MetodeFitokimia. Bandung: ITB

Matsjeh, Sabirin, Hardjono Sastrihamidjojo dan Respati Sastrosajdono. 1996.

Kimia Organik II. Jakarta: Depdikbud.

Poedjiadi, Anna dan F. M. Titin Supriyanti. 2006. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI-Press.

(17)

LAMPIRAN I PERHITUNGAN

Pengukuran harga Rf untuk tiap noda pada kromatografi kertas melalui rumus:

Sehinnga,

a. Untuk eluen pertama (campuran 1-butanol : asam cuka glasial : aquadest dengan perbandingan 18 mL : 4 mL : 18 mL) diperoleh data sebagai berikut : Jarak alanin 2,2 cm

Jarak glisin 1,5 cm Jarak treonin 2 cm Jarak pelarut 5 cm

Maka dapat ditentukan harga Rf masing-masing noda adalah sebagai berikut :

Rf Alanin = _{jarak eluen}jarak noda=2,2₅_cmcm = 0,44 cm

Rf Glisin = _{jarak eluen}jarak noda=1,5₅_cmcm=0,3cm

Rf Treonin = _{jarak eluen}jarak noda=2₅cm_cm=0,4cm

b. Uuntuk eluen kedua (campuran fenol : aquadest dengan perbandingan 30 mL : 10 mL) diperoleh data sebagai berikut :

(18)

Rf Alanin = _{jarak eluen}jarak noda=4,5₅_cmcm=0,9cm

Rf Treonin = _{jarak eluen}jarak noda=5₅cm_cm=1cm

(19)

LAMPIRAN II

LEMBAR PERTANYAAN DAN JAWABAN

1. Hitung harga Rf tiap-tiap noda dan catat warnanya. Kemudian tetapkan komponen asam-asam amino dalam larutan yang diselidiki dengan membandingkan Rf-nya dengan Rf asam-asam amino standar.

Jawaban :

Pengukuran harga Rf untuk tiap noda pada kromatografi kertas melalui

rumus: Sehinnga,

c. Untuk eluen pertama (campuran 1-butanol : asam cuka glasial : aquadest dengan perbandingan 18 mL : 4 mL : 18 mL) diperoleh data sebagai berikut :

Jarak alanin 2,2 cm Jarak glisin 1,5 cm Jarak treonin 2 cm Jarak pelarut 5 cm

Rf Alanin = _{jarak eluen}jarak noda=2,2₅_cmcm = 0,44 cm

Rf Treonin = _{jarak eluen}jarak noda=2₅cm_cm=0,4cm

(20)

Jarak alanin 4,5 cm Jarak glisin 4,7 cm Jarak treonin 5 cm Jarak pelarut 5 cm

Rf Alanin = _{jarak eluen}jarak noda=4,5₅_cmcm=0,9cm

Rf Treonin = _{jarak eluen}jarak noda=5₅cm_cm=1cm

Berdasarkan hasil perhitungan harga Rf di atas dapat dibandingkan dengan harga Rf asam-asam amino standar ternyata menunjukkan bahwa komponen-komponen asam amino dalam larutan meliputi alanin, glisin, dan treonin. Hal ini juga dibuktikan dengan hasil percobaan yang menghasilkan noda berwarna ungu ketika disemprot dengan senyawa ninhidrin, dan tentunya kita ketahui bahwa senyawa asam mino akan mmeberikan uji positif dengan senyawa ninhidrin yang akan ditandai dengan terbentuknya warna ungu.

2. Jika suatu asam amino memiliki harga Rf 0,45, sehingga jauh asam amino itu akan bergerak pada plat kromatografi kertas di mana pelarut bergerak 15,2 cm?

Jawaban :

Jarak atau jauh asam amino itu bergerak pada plat kromatografi kertas dapat ditentukan dengan perhitungan dibawah ini,

(21)

= 0,45 x 15,2 cm = 6,84 cm

Jadi, jauh asam amino tersebut akan bergerak pada plat kromatografi kertas adalah dengan jarak 6,84 cm.

3. Apa yang terjadi jika Anda tidak menggunakan sarung tangan dan jari Anda terkena semprotan ninhidrin ?

Jawaban : kesederhanaannya pada pelaksanaan pemisahan, yaitu hanya pada lembaran kertas saring yang berlaku sebagai medium pemisahan dan penyangga. Untuk kromatografi kertas preparatif diperlukan kertas yang lebih besar dari pada untuk analisis. Keuntungan yaitu beban langan bilangan Rf yang besar sehingga pengukuran Rf merupakan parameter yang berharga dalam memaparkan senyawa tumbuhan baru. Sedangkan kerugian atau kelemahan dari metode pemisahan dengan kromatografi kertas adalah tidak bisa melakukan analisis kuantitatif pada komponen-komponen sampel hnaya terbatas pada analisis kualitatif saja.

5. Apakah metode kromatografi kertas dapat digunakan untuk analisis kuantitatif?

(22)

Dengan metode kromatografi kertas ini tidak dapat melakukan analisis yang bersifat kuantittaif, tetapi hanya dapat digunakan untuk analisis kualitatif terhadap suatu larutan yang berisi bermacam-macam komponen, misalnya seperti pada percobaan ini yaitu analisi kualittaif terhadap suatu larutan yang berisi bermacam-macam asam amino, dan hal ini semua ditandai dengan adanya warna ungu serta dari harga Rf sampel yang diselidiki lalu dibandingkan dengan harga Rf standarnya.

6. Faktor apa saja yang mempengaruhi nilai Rf? Jawaban :

Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu:

a. Pelarut, disebabkan pentingnya koefisien partisi, maka perubahan-perubahan yang sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan-perubahan harga Rf.

b. Suhu, perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan aliran.

c. Ukuran dari bejana, volume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari atmosfer jadi mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponen-komponen pelarut dari kertas. Jika bejana besar digunakan, ada tendensi perambatan lebih lama, seperti perubahan komposisi pelarut sepanjang kertas, maka koefisien partisi akan berubah juga. Dua faktor yaitu penguapan dan kompisisi mempengaruhi harga Rf.

d. Kertas, pengaruh utama kertas pada harga Rf timbul dari perubahan ion dan serapan, yang berbeda untuk macam-macam kertas. Kertas mempengaruhi kecepatan aliran juga mempengaruhi kesetimbangan partisi.

(23)

selalu mempengaruhi karakteristik dari kelarutan satu terhadap lainnya hingga terhadap harga Rf mereka.

LAMPIRAN III GAMBAR

Gambar 1. Pemisahan

larutan dengan corong pisah (eluen 1)

(24)

Gambar 3. Penjenuhan gambar 4. pengeringan

Gambar 7. Chamber Eluen 2 Gambar 5. Penyemprotan

dengan ninhidrin

Gambar 6. Kromatografi kertas eluen 1