UJI SITOTOKSIK EKSTRAK ETANOL, FRAKSI N

(1)

UJI SITOTOKSIK EKSTRAK ETANOL, FRAKSI N-HEKSAN, FRAKSI KLOROFORM DAN FRAKSI AIR DARI KULIT BATANG ATTARASA (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) DENGAN

METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST

SKRIPSI

OLEH:

RIZKIA HASYYATI NIM 141501217

PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN

2018

(2)

UJI SITOTOKSIK EKSTRAK ETANOL, FRAKSI N-HEKSAN, FRAKSI KLOROFORM DAN FRAKSI AIR DARI KULIT BATANG ATTARASA (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) DENGAN

METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST

SKRIPSI

Diajukan sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi

Universitas Sumatera Utara

OLEH:

RIZKIA HASYYATI NIM 141501217

PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN

2018

(3)

PENGESAHAN SKRIPSI

UJI SITOTOKSIK EKSTRAK ETANOL, FRAKSIN-HEKSAN, FRAKSI KLOROFORM DAN FRAKSI AIR DARI KULIT BATANG ATTARASA

(Litsea cubeba (Lour.) Pers.) DENGAN METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST

OLEH:

RIZKIA HASYYATI NIM 141501217

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara

Pada Tanggal: 30 April2018

Disetujui Oleh:

Dosen Pembimbing, Panitia Penguji,

Dr. Aminah Dalimunthe, M.Si., Apt. Prof. Dr. Urip Harahap, Apt.

NIP 197806032005012004 NIP 195301011983031004

Dr. Aminah Dalimunthe, M.Si., Apt.

NIP 197806032005012004

Drs. Rasmadin Mukhtar, M.S., Apt.

NIP 194909101980031002

Medan, Juli 2018 Fakultas Farmasi

Universitas Sumatera Utara Dekan,

Prof. Dr. Masfria, M.S.,Apt.

(4)

KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan kasih sayang-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi yang berjudul Uji Sitotoksik Ekstrak Etanol, Fraksi N-Heksan, Fraksi Kloroform dan Fraksi Air dari Kulit Batang Attarasa (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test.

Pada kesempatan ini dengan kerendahan hati, penulis tidak lupa menyampaikan rasa terima kasih kepada Ibu Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Bapak Dr. Panal Sitorus, M.Si, Apt., selaku Kepala laboratorium Farmakognosi yang telah memberi izin untuk melakukan penelitian di Laboratorium Farmakognosi Fakultas Farmasi Universitas Sumatra Utara.

Penulis juga menyampaikan ucapan terimakasih kepada Ibu Dr. Aminah Dalimunthe, S.Si., M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing yang telah membimbing penulis dengan penuh kesabaran selama penelitian hingga selesainya penulisan skripsi ini.

Penulis juga berterima kasih kepada Ibu Dr. Aminah Dalimunthe, M.Si., Apt., Bapak Prof. Dr. Urip Harahap, Apt., dan Bapak Drs. Rasmadin Mukhtar, MS., Apt., sebagai tim penguji yang sangat banyak memberikan masukan dan saran atas skripsi ini.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Imam Bagus Sumantri S.Farm., M.Si., Apt., sebagai dosen penasihat akademik, beserta seluruh dosen pengajar di Fakultas Farmasi atas arahan, bimbingan, dan ilmu yang diberikan kepada penulis selama duduk di bangku perkuliahan.

(5)

Terima kasih penulis ucapkan kepada Ayahanda Andi Firdaus dan Ibunda Siti Fatimah, M.Pd., serta untuk adik saya Ihsan Hadi Maulana dan Ahmad Habibi yang selalu memberikan doa dan dukungan penuh kepada penulis tanpa henti selama ini.

Penulis juga menyampaikan rasa terimakasih kepada asisten farmakologi dan sahabat - sahabatku di Fakultas Farmasi, Yolanda, Nufus, Lola, Nadya, Vega, Dona, Mitra, Rehu dan Rezza Fikrih atas segala bantuan dan dukungan serta canda tawanya dalam proses pengerjaan skripsi ini.

Semoga Allah SWT memberikan balasan yang berlipat ganda atas kebaikan yang telah diberikan. Akhirnya penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi kita semua.

Medan, 30 April 2018 Penulis

Rizkia Hasyyati NIM 141501217

(6)

SURAT PERNYATAAN Saya yang bertanda tangan dibawah ini:

Nama : Rizkia Hasyyati

Nomor Indeks Mahasiswa : 141501217

Program Studi : S1- Reguler Farmasi

Judul Skripsi : Uji Sitotoksik Ekstrak Etanol, Fraksi N-Heksan, Fraksi Kloroform dan Fraksi Air dari Kulit Batang Attarasa (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test.

Dengan ini menyatakan bahwa skripsi ini ditulis berdasarkan data dari hasil pekerjaan yang saya lakukan sendiri, dan belum pernah diajukan oleh orang lain untuk memperoleh gelar keserjanaan di perguruan tinggi lain, dan bukan plagiat karena kutipan yang ditulis telah disebutkan sumbernya di dalam daftar pustaka.

Apabila di kemudian hari ada pengaduan dari pihak lain karena di dalam skripsi ini ditemukan plagiat karena kesalahan saya sendiri, maka saya bersedia mendapat sanksi apapun oleh Program Studi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara dan bukan menjadi tanggungjawab pembimbing.

Demikianlah surat pernyataan ini saya perbuat dengan sebenarnya untuk digunakan jika diperlukan sebagaimana mestinya.

Medan, 30 April 2018

Yang membuat pernyataan

Rizkia Hasyyati

NIM 141501217

(7)

UJI SITOTOKSIK EKSTRAK ETANOL, FRAKSI N-HEKSAN, FRAKSI KLOROFORM DAN FRAKSI AIR DARI KULIT BATANG ATTARASA

(Litsea cubeba (Lour.) Pers.) DENGAN METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST

ABSTRAK

Tumbuhan attarasa (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) merupakan salah satu tanaman dari familiLauraceae yang digunakan untuk mengobati berbagai jenis penyakit. Efek terapetik dari tumbuhan attarasa seperti anti jamur, antibakteri, anti inflamasi, antikanker dan aktivitas lainnya dihubungkan dengan kandungan komponen senyawa bioaktif pada tanaman attarasa, khususnya alkaloid dan minyak atsiri. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas sitotoksik dari ekstrak dan fraksi dari kulit batang attarasa

Ekstraksi dilakukan secara maserasi menggunakan pelarut etanol.

Fraksinasi dilakukan dengan pelarut n-heksan, kloroform, dan air. Pengujian sitotoksik dari ekstrak etanol dan fraksi attarasa menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) dengan hewan uji Artemia salina Leach.

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi kloroform pH 3, pH7, pH 9, dan pH 11dari kulit batang attarasa (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) memiliki aktivitas sitotoksik yang ditandai dengan nilai LC₅₀< 1.000 μg/ml.

Kata kunci:Artemia salina Leach,Brine Shrimp Lethality Test (BSLT), Litsea cubeba (Lour.) Pers.), sitotoksik.

(8)

CYTOTOXIC ACTIVITY OF ETHANOLIC EXTRACT, N- HEXANE FRACTION, CHLOROFORM FRACTION AND WATER FRACTION FROM ATTARASA BARK (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) WITH BRINE

SHRIMP LETHALITY TEST

ABSTRACT

Attarasa (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) is one of Lauraceae plants used to treat various diseases. Therapeutic effects of attarasa such as antifungals, antibacterials, antiinflammatory, anticancer, and other activities are associated with the components of attarasa bioactive compounds, especially alcaloid and essential oil. This study aimed to determine the cytotoxic activity of extract and fractions of attarasa bark.

The exctration was done by maseration method using ethanol as the solvent. Fractionation was performed with n- hexane, chloroform, and water.

Cytotoxic test of the ethanolic extract and fractions of attarasa bark was conducted by Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) method using shrimp larvae Artemia salina Leach as experimental animal.

The results of this study showed that ethanolic extract and fraction of n- hexane, fraction of chloroform pH 3, pH 7, pH 9, and pH 11 of attarasa bark (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) had cytotoxic activity which is marked by value of LC50< 1.000 μg/ml.

Keyword: Artemia salinaLeach, Brine Shrimp Lethality Test(BSLT),cytotoxic,Litsea cubeba (Lour.) Pers.).

(9)

DAFTAR ISI

Halaman

JUDUL ... i

HALAMAN JUDUL ... ii

LEMBAR PENGESAHAN ... iii

KATA PENGANTAR ... iv

SURAT PERNYATAAN TIDAK PLAGIAT ... vi

ABSTRAK ... vii

ABSTRACT ... viii

DAFTAR ISI ... ix

DAFTAR TABEL ... xii

DAFTAR GAMBAR ... xiii

DAFTAR LAMPIRAN ... xiv

BAB I PENDAHULUAN ... 1

1.1 Latar Belakang ... 1

1.2 Rumusan Masalah ... 4

1.3 Hipotesis ... 4

1.4 Tujuan Penelitian ... 4

1.5 Manfaat Penelitian ... 4

1.6 Kerangka Pikir Penelitian ... 5

BAB II TINJAUANPUSTAKA ... 6

2.1 Uji Sitotoksik ... 6

2.2 Brine Shrimp Lethality Test ... 6

2.3 Artemia salina Leach ... 8

(10)

2.5Uraian Tumbuhan Attarasa ... 11

2.6Metode Ekstraksi ... 12

2.7 Fraksinasi Ekstrak Etanol ... 14

2.8 Senyawa Alkaloid ... 16

BABIIIMETODE PENELITIAN... 21

3.1 Alat ... 21

3.2 Bahan... 21

3.3 Penyiapan Bahan Tumbuhan... 21

3.3.1Pengumpulan Bahan Tumbuhan ... 22

3.3.2 Identifikasi Tumbuhan ... 22

3.3.3Pembuatan Simplisia ... 22

3.4 Pembuatan Pereaksi ... 22

3.4.1Larutan Asam Klorida 2 N ... 22

3.4.2 Pereaksi Dragendorf ... 22

3.4.3Pereaksi Natrium Hidroksida 2N ... 23

3.5Pemeriksaan Karakteristik Simplisia ... 23

3.5.1Pemeriksaan Makroskopik ... 23

3.6Pembuatan Ekstrak Etanol Kulit Batang Attarasa ... 23

3.7Fraksinasi Kulit Batang Attarasa ... 23

3.8 Uji Sitotoksik ... 24

3.8.1Pembuatan air laut buatan ... 24

3.8.2Penetasan telur Artemia salina Leach ... 24

3.8.3Uji sitotoksik metode brine shrimp lethality test ... 25

3.9Perhitungan LC50 ... 26

(11)

3.10Analisis Kromatografi Lapis Tipis ... 27

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN ... 28

4.1 Identifikasi Tanaman ... 28

4.2 Karakteristik Simplisia ... 28

4.3 Hasil Ekstraksi dan Fraksinasi ... 29

4.4 Hasil Uji Sitotoksik ... 30

4.5 Analisis Fraksi Kloroform Ph 7 secara KLT ... 40

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 42

5.1Kesimpulan ... 42

5.2 Saran ... 42

DAFTARPUSTAKA ... 43

LAMPIRAN ... 46

(12)

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

2.1 Klasifikasi Alkaloid Berdasarkan Jenis Cincin Heterosiklik ... 18 3.1Probit (Deviasi norma +5) dengan Persentase dalam Margin.. ... 27 4.1Data Berat Hasil Fraksinasi Yang Diperoleh dari Ekstrak

EtanolKulit Batang Attarasa ... 30 4.2 Hasil Pengamatan Kematian Artemia salina Leach setelah 24Jam

Pemberian Ekstrak dan Fraksi dari Kulit Batang Attarasa ... 31 4.3Log Konsentrasi dan Nilai Probit dari Uji Sitotoksik Terhadap

Ekstrak dan Fraksi dari Kulit Batang Attarasa ... 32 4.4Persamaan Regresi Hasil Uji BSLT Ekstrak Etanol, Fraksi

n- heksan,Fraksi Kloroform dengan variasi pH 3, pH 7, pH 9, pH 11 danFraksi Air dari Kulit Batang Attarasa ... 37 4.5Nilai LC50 Ekstrak Etanol, Fraksi n- heksan, Fraksi Kloroform

denganvariasi pH 3, 7, 9, 11 dan Fraksi Air dari Kulit Batang Attarasa ... 39

(13)

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1.1 Skema Kerangka Pikir Penelitian... 5

2.1 Morfologi Artemia salina Leach ... 9

2.2 Reaksi Amina dengan Asam Kuat ... 15

2.3 Reaksi Pembebasan Amina dengan Cara Pembasaan ... 5

4.1 Grafik Log Konsentrasi dengan Nilai Probit Mortalitas Uji Sitotoksik Ekstrak Etanol Kulit Batang Attarasa ... 34

4.2 Grafik Log Konsentrasi dengan Nilai Probit Mortalitas Uji Sitotoksik Fraksi N- heksan Kulit Batang Attarasa ... 34

4.3 Grafik Log Konsentrasi dengan Nilai Probit Mortalitas Uji Sitotoksik Fraksi Kloroform pH 3 Kulit BatangAttarasa ... 35

4.6 Grafik Log Konsentrasi dengan Nilai Probit MortalitasUji Sitotoksik Fraksi Kloroform pH 11 Kulit Batang Attarasa ... 36

4.7 Grafik Log Konsentrasi dengan Nilai Probit Mortalitas Uji Sitotoksik Fraksi Air Kulit Batang Attarasa ... 37

4.8 Kromatogram dari Fraksi Kloroform pH 7 ... 41

(14)

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1 Surat Hasil Identifikasi tumbuhan attarasa ... 46

2 Gambar Tumbuhan Attarasa ... 47

3 Bagan Kerja Penelitian ... 49

4 Artemia salina Leach ... 52

5 Perhitungan LC₅₀ Ekstrak Etanol, Fraksi N- heksan, FraksiKloroform pH 3, pH 7, pH 9, pH 11 dan FraksiAir dariKulit Batang Attarasa ... 53

(15)

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kanker adalah suatu kondisi dimana sel telah kehilangan pengendalian dan mekanisme normalnya sehingga mengalami pertumbuhan yang tidak normal, cepat dan tidak terkendali. Sel- sel kanker akan terus membelah diri dan tidak mengindahkan kaidah hukum- hukum pembiakan. Sejalan dengan pertumbuhan dan perkembangbiakannya, sel- sel kanker membentuk suatu massa dari jaringan ganas yang menyusup ke jaringan di dekatnya (invasif) dan bisa menyebar (metastatis) ke seluruh tubuh (Diananda, 2007).

Penyakit kanker merupakan salah satu penyebab kematian utama di seluruh dunia. Pada tahun 2017 diprediksikan hampir 9 juta orang meninggal di seluruh dunia akibat kanker dan akan meningkat hingga 13 juta orang per tahun di 2030, prevalensi kanker di Indonesia juga cukup tinggi. Menurut data RISKESDAS 2013, prevalensi kanker di Indonesia adalah 1,4 per 100 penduduk atau sekitar 347.000 orang. Sedangkan jika melihat data BPJS kesehatan, terdapat peningkatan jumlah kasus kanker yang ditangani dan pembiayaannya pada periode 2014- 2015 (Kemenkes RI, 2017).

Berbagai upaya telah dilakukan untuk menemukan terapi kanker yang tepat untuk penyembuhan penyakit kanker, salah satunya adalah kemoterapi. Meskipun penemuan dan pemakaian kemoterapi menunjukkan hasil yang cukup baik, namun obat tersebut mempunyai efek samping dan toksisitas yang besar. Akibatnya banyak orang kemudian beralih pada pengobatan dengan bahan alam yang dikenal dengan istilah back to nature.

(16)

Hasil riset tumbuhan obat dan jamuyang dilakukan oleh Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Obat dan Obat Tradisional- Badan Litbang- Kementrian Kesehatan RI pada tahun 2012 menunjukkan bahwa terdapat 19. 738 tanaman yang berpotensi sebagai tanaman obat dengan 13.576 diantaranya sudah teridentifikasi dan terdiri dari 1.740 spesies yang tergolong dalam 211 familia (Kumoro, 2015). Hal ini mendorong senyawa alam khususnya tanaman untuk dijadikan sebagai obat yang bila dikaji dari sejarah perkembangan, beberapa obat modern ternyata sebagian diantaranya juga diisolasi dari tanaman, seperti pada pengobatan kanker yaitu vinkristin dan vinblastin dimana kedua obat tersebut adalah senyawa kimia golongan alkaloid vinca yang berasal dari tanaman Vinca rosae (Dewoto, 2007).

Prinsip suatu tanaman dapat digunakan sebagai antikanker adalah apabila tanaman tersebut mengandung senyawa sitotoksik. Tanaman yang berpotensi sebagai antikanker salah satunya adalah attarasa (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) yang merupakan famili Lauracea. Tanaman dari margaLitsea kaya akan senyawa alkaloid golongan isokuinolin (Feng, et al., 2009). Alkaloid isokuinolin merupakan senyawa alkaloid yang memiliki aktivitas dalam penghambatan kanker melalui jalur PI3K/ Akt dan mTOR. Selain itu memiliki pengaruh terhadap asam amino dan beberapa protein termasuk telomerase, DNA topoisomerase I, p53, Nf- kB, MMPs dan reseptor estrogen. Penghentian siklus sel dan meningkatkan apoptosis pada sel kanker selain itu alkaloid golongan ini memiliki aktivitas antioksidan yang kuat (Ortiz, et al., 2014).

Kulit merupakan lapisan luar kambium yang mengelilingi batang, cabang,dan akar yang jumlahnya sekitar 10-15% dari berat pohon. Pada umumnya

(17)

kulit kayu lebih kaya kandungan metabolit sekunder baik dari segi kuantitas maupun kompleksitasnya dibandingkan dengan kayu. Banyak konstituen yang terdapat dalam kayu juga terdapat dalam kulit walaupun proporsinya berbeda.

Metabolit sekunder dari kulit dapat dibagi menjadi konstituen lipofil dan hidrofil.

Kandungan total keduanya dalam kulit biasanya lebih tinggi dibandingkan dalam kayu dan bervariasi antara 20-40% berat kering kulit. Bagian lipofil terutama terdiri atas lemak, lilin, terpenoid dan alkohol alifatik tinggi yang dapat diekstraksi dengan pelarut-pelarut non polar, sedangkan bagian hidrofil mengandung sejumlah besar konstituen fenol yang dapat diekstraksi hanya dengan air atau pelarut-pelarut organik polar (Sjostrom,1998).

Pemilihan pelarut organik yang digunakan dalam ekstraksi metabolit sekunder merupakan faktor penting untuk mencapai tujuan sasaran ekstraksi komponen selain itu dapat memberikan efektivitas yang tinggi dengan memperhatikan kelarutan senyawa bahan alam dalam pelarut tersebut. Sifat kelarutan zatsesuai dengan pernyataan like dissolve like yaitu suatu zat akan cenderung larut pada zat yang sama tingkat kepolarannya. Dengan perbedaan senyawa yang tersari maka aktivitas dari masing-masing ekstrak akan mempunyai tingkatan sitotoksisitas yang berbeda (Khopkar, 2003)

Salah satu uji sitotoksisitas yang paling sederhana, yang dapat dilakukan dengan mudah dan dapat diandalkan adalah adalah uji sitotoksisitas metode brine shrimp lethality test menggunakan larva udang laut Artemia salina Leach.

Kandungan kimia aktif dimaksudkan sebagai komponen aktif biologi terhadap manusia, hewan dan tumbuhan. Kandungan kimia aktif biologi dapat bersifat racun jika digunakan pada dosis yang tinggi, dengan demikian secara in vivo

(18)

kematian suatu hewan percobaan dapat dipakai sebagai alat pemantau penapisan awal kandungan kimia aktif suatu bahan alam terhadap ekstrak, fraksi maupun isolat (Meyer, et al., 1982).

Berdasarkan uraian diatas, penelitian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas sitotoksik ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi kloroform kulit batang attarasa (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) dengan metode brine shrimp lethality test . 1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang diatas maka rumusan masalah penelitian ini adalah apakah ekstrak etanol, fraksi n- heksan, fraksi kloroform pH 3, pH 7, pH 9, pH 11 dan fraksi air kulit batang attarasa mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap Artemia salina Leach berdasarkan metode brine shrimp lethality test?

1.3 Hipotesis

Berdasarkan perumusan masalah maka hipotesis penelitian ini adalah ekstrak etanol, fraksi n- heksan, fraksi kloroformpH 3, pH 7, pH 9, pH 11 dan fraksi air kulit batang attarasa mempunyai aktivitas sitotoksikterhadap Artemia salina Leach berdasarkan metode brine shrimp lethality test.

1.4 Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas sitotoksik ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi kloroform dan fraksi air kulit batang attarasa terhadap Artemia salina Leach sberdasarkan metode brine shrimp lethality test.

1.5 Manfaat Penelitian

Berdasarkan tujuan penelitian, maka manfaat penelitianuntuk mendapatkan informasi tanaman attarasa sebagai pengobatan.

(19)

1.6 Kerangka Pikir Penelitian

Penelitian ini menggunakan Artemia salina Leach sebagai hewan uji.

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah kelompok perlakuan EEKBA dengan konsentrasi 1, 10, 100, 1000 μg/ ml, fraksi n- heksan dengan konsentrasi 1, 10, 100, 1000 μg/ ml, fraksi kloroform dengan variasi pH 3, 7, 9, dan 11 dengan konsentrasi 1, 10, 100, 1000 μg/ ml dan fraksi air dengan konsentrasi 1, 10, 100, 1000 μg/ ml. Variabel terikat pada penelitian ini adalah hasil aktivitas sitotoksik terhadap Artemia salina Leach yang dilihat melalui nilai LC₅₀ yang terlihat dalam skema kerangka pikir penilitian pada Gambar 1.1

Variabel Bebas Variabel Terikat Parameter

Gambar 1.1 Skema Kerangka Pikir Penelitian

Aktivitas sitotoksik

terhadap Artemia salina

Leach.

Nilai LC₅₀ Ekstrak etanol kulit batang

attarasa

Konsentrasi 1, 10, 100, 1000 μg/ ml

Fraksi n- heksan

Fraksi kloroform dengan variasi pH 3, 7, 9, dan 11.

Fraksi air

(20)

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Uji Sitotoksik

Banyak senyawa alam diisolasi, dikarakterisasi, dan dipublikasi tanpa pengujian farmakologi apapun. Aktivitas farmakologi tidak diketahui selama bertahun- tahun dan penemuan konstituen tanaman obat baru tidak lebih dari fitokimia murni. Penelitian terdahulu, untuk menentukan aktivitas farmakologi yang spesifik seperti antikanker yang dilakukan oleh National Cancer Institute sering menggunakan bioassay yang harganya mahal. Selain itu pencarian tertentu sering tidak terdekteksi atau diabaikan dalam proses pendahuluan. Oleh karena itu dibutuhkan suatu uji aktivitas yang sederhana, mudah dan murah namun dapat dipercaya dan dapat mendeteksi adanya senyawa yang mempunyai aktivitas farmakologi secara luas yang terdapat pada ekstrak, fraksi dan isolat. Beberapa uji pendahuluan untuk pencarian obat kanker yang memenuhi syarat- syarat diatas antara lain: Metode potato disc, brine shrimp lethality test, dan uji terhadap Lemna minor L. yang bisa memandu untuk mendapatkan uji pendahuluan antikanker (Meyer, et al., 1982).

2.2 Brine Shrimp Lethality Test

Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) merupakan salah satu metode uji toksisitas yang banyak digunakan dalam penelusuran senyawa bioaktif yang bersifat toksik dari bahan alam. Metode ini dapat digunakan sebagai bioassay guided fractination dari bahan alam karena mudah, cepat, murah, dan cukup reprodusibel. Beberapa senyawa bioaktif yang telah berhasil diisolasi dan

(21)

aktivitasnya dimonitor dengan metode BSLT menunjukkan adanya korelasi terhadap suatu uji spesifik antikanker (Harmita dan Radji, 2008)

Korelasi positif ditemukan antara penentuan aktivitas sitotoksik dengan metode brine shrimp lethality test dan aktivitas sitotoksik terhadap 9 kB sel karsinoma nasofaring manusia maupun untuk sel P-388 leukimia secara in vivo.

Diantaranya adalah antikanker, antitumor, antimalaria, antimikroba, immunosuppressive, antifeedant, dan residu pestisida (Meyer, dkk., 1982).

Menurut panjaitan (2011) Artemia salina Leachmemiliki kesamaan tanggapan dengan mamalia seperti tipe DNA-dependent RNA polymerase (DNA yang mengarahkan proses transkripsi RNA). Hal ini menyebabkan senyawa atau ekstrak yang memiliki aktivitas pada sistem tersebut dapat dideteksi melalui metode ini.

Brine shrimp lethality test adalah metode yang mudah untuk mengamati aktivitas biologis dari berbagai jenis spesies tumbuhan. Walaupun metode ini tidak bisa menunjukkan bagaimana mekanisme aksi terjadinya sitotoksik, metode ini mempunyai beberapa keuntungan yaitu:

a. Cepat (pengamatan dapat dilakukan dengan waktu 60 jam, tetapi dalam beberapa kasus data yang relevan untuk perhitungan LC₅₀ didapatkan setelah 24 jam setelah pemaparan).

b. Pengerjaan yang praktis (tidak perlu pelatihan khusus untuk peralatan dan pengujian).

c. Persyaratan yang rendah (tidak diperlukan teknik aseptik, tidak diperlukan peralatan khusus, dan jumlah sampel yang dibutuhkan sedikit)

(22)

d. Ketahanan (telur dari Artemia salina Leach tersedia di pasaran sehingga tes dapat dilakukan di seluruh dunia dengan bahan asli yang sama tanpa masalah)

e. Murah (jumlah telur Artemia salina Leach yang dibutuhkan untuk tes sangat sedikit sehingga harganya bisa diabaikan) (Hamidi, dkk., 2014).

Uji sitotoksik pada hewan uji dimaksudkan untuk mengekstrapolasikan hasil terhadap manusia untuk mencari dosis yang aman. Parameter yang digunakan dalam uji ini adalah efek toksikan (respon) terhadap hewan uji. Respon tersebut dapat dilihat hanya berupa immobilisasi kedalam tiap tabung berisi konsentrasi toksikan yang berbeda dimasukkan 10 ekor hewan uji, disertai dengan tabung kontrol. Immobilisasi ini sudah dianggap sebagai kematian untuk hewan uji seperti Artemia salina Leach Nilai LC50 diperoleh dengan ekstrapolasi kurva (Soemirat, 2005).

2.3Artemia salina Leach

Artemia salina Leach atau brine shrimpmerupakan zooplankton dan tergolong udang primitif. Nama artemia diberikan untuk pertama kali oleh Shlosscer yang menemukannya di suatu danau asin pada tahun 1755. Artemia salina Leachsemula diberi nama Cancer salina oleh Linnaeus pada tahun 1778 melengkapi jasad renik ini menjadi Artemia salina Leach (Harefa, 1997).

Klasifikasi Artemia salina Leachdalam sistematika hewan adalah sebagai berikut:

Kingdom : Animal Filum : Arthropoda Kelas : Crustacea Subkelas : Branchiopoda

(23)

Ordo : Anostraca Famili : Artemilidae Marga : Artemia

Jenis : Artemia salina Leach (Bougis, 1979)

Bentuk Artemia dewasa menyerupai udang kecil. Ukurannya hanya 10-20 mm. Bagian kepala berukuran lebih besar dan kemudian mengecil hingga ke bagian ekor. Panjang ekor kurang lebih sepertiga dari total panjang tubuh. Di bagian kepala terdapat sepasang mata dan sepasang antenatula (sungut). Pada bagian tubuh terdapat sebelas pasang kaki atau secara khusus disebut torakopoda.

Jumlah kaki inilah yang membedakan Artemiasalina Leach dengan spesies dari Crustacea lain yang umumnya hanya memiliki sepuluh pasang kaki. Antara ekor dan pasangan kaki paling belakang terdapat sepasang alat kelamin, yaitu penis pada jantan dan ovarium pada betina. Ovarium akan menghasilkan telur dan apabila telah masak, telur tersebut kemudian akan menjadi oosit (Harefa, 1997).

Morfologi Artemia salinaLeachdapat dilihat pada Gambar 2.1.

Gambar 2.1 Morfologi Artemia salina Leach (Harefa, 1997)

(24)

Telur Artemia salina Leach. dapat bertahan dalam kondisi kering dan dapat disimpan cukup lama. Penetasan telur dilakukan dengan memasukkan telur Artemia salina Leach yang kering kedalam air laut, akan menetas dalam waktu 24- 36 jam dan dari cangkang keluar larva yang disebut dengan istilah nauplii.

Pada perkembangan selanjutnya nauplii akan mengalami 15 kali perubahan bentuk (metamorfosis). Setiap kali mengalami perubahan bentuk merupakan satu tingkatan. Tahapan perkembangan pertama disebut instar I, bentuk lonjong dan panjang sekitar 0,4 mm dan beratnya 15 mikrogram. Warnanya kemerah- merahan karena masih banyak mengandung cadangan makanan. Oleh karena itu masih belum memerlukan makanan. Setelah 24 jam menetas, nauplii akan berubah menjadi instar II. Pada tingkat ini, nauplii mulai mempunyai mulut, saluran pencernaan dan dubur. Oleh karena itu nauplii mulai mencari makanan dan bersamaan dengan itu cadangan makanannya pun mulai habis. Artemia salina Leachmempunyai cara makan dengan cara menyaring makanannya atau filter feeder. Selama perubahan bentuk terjadi, nauplii akan mengalami perubahan mata majemuk, antena dan kaki. Setelah menjadi instar XV, kakinya sudah lengkap 11 pasang maka nauplii telah berubah menjadi Artemia salina Leachdewasa. Proses ini berlangsung antara 1-3 minggu. Artemia salina Leach dewasa mempunyai panjang sekitar 1 cm, beratnya 10 mg, dapat hidup sampai 6 bulan dan bertelur 4- 5 kali. Setiap kali bertelur dapat menghasilkan 50- 300 butir telur (Mudjiman, 1989).

2.4 Analisis Probit

Untuk obat yang ditetapkan secara hayati, kurva respons terhadap log- dosis pada rentang dosis yang memadai, harus berupa garis lurus. Jika diperlukan

(25)

uji pendahuluan atau penetapan tergantung pada interpolasi dari kurva multi- dosis baku, gambarkan di kertas koordinat kurva respons rata- rata baku tiap tingkat dosis pada ordinat terhadap log dosis x pada absis.Jika secara prinsip garis cenderung linier dalam rentang dosis yang ditentukan, maka unit respons awal dapat digunakan langsung sebagai y. Jika garis jelas merupakan lengkungan, transformasi yang sesuai tiap pembacaan awal dapat menghasilkan linearitas.

Salah satu transformasi yang mungkin ialah logaritma atau diubah kedalam nilai probit hingga diperoleh harga y baru untuk semua perhitungan selanjutnya.

Transformasi probit memberikan keuntungan dalam hal memperlebar rentang kerja dari linearitas (Depkes RI, 1995). LC₅₀ didesain untuk menggambarkan respon yang mematikan komponen dalam populasi dari suatu organisme terhadap senyawa kimia dalam suatu konsentrasi yang bervariasi. Hubungan yang ditunjukkan berbentuk sigmoid menjadi linear (Kanwar, 2007).

2.5 Uraian Tumbuhan Attarasa

Hasil survey di Provinsi Sumatera Utara menunjukkan bahwa pohon attarasa dijumpai di hutan sekunder di tempat terbuka atau di ladang masyarakat di pinggir hutan. Selain itu ditemukan juga pada hutan primer di bagian pinggir atau bagian atas hutan yang agak terbuka pada ketinggian 1.000-1.300 meter di atas permukaan laut. Tegakan attarasa bahkan ditemukan pada hutan rawa gambut seperti yang terdapat di Kawasan Ekosistem Lauser Aceh (Kurniaty, dkk., 2014)

Tinggi pohon attarasa berkisar antara 3 m sampai 10 m. Daun berbintik- bintik kelenjar yang dapat tembus cahaya, bila diremas berbau keras seperti lemon, bentuk lonjong atau lanset, sedangkan bagian ujungnya lancip, permukaan mengkilat. Daun yang telah dewasa gundul, tipis menjangat, panjang daun

(26)

berkisar antara 7 cm sampai 15 cm, lebar daun 15 mm sampai 30 mm, tulang daun lateral, terdapat 8 sampai 18 pasang, permukaannya agak menonjol, panjang tangkai daun berkisar antara 7 mm sampai 18 mm. Perbungaan berupa tandan , terdapat daun pembalut yang tersusun didalamnya , panjang 2 mm sampai 10 mm.

Bunga jantan dan betina terpisah, mempunyai 5 sampai 6 daun tenda yang berwarna kekuningan, licin, panjang 1,5 mm sampai 2,5 mm , dasar berbentuk cawan. Benang sari 9 helai, terdapat rambut yang menyebar, berkelenjar tidak bertangkai. Buah buni, bulat, berwarna hitam, garis tengah 5 mm sampai 6 mm, panjang gagang buah 3 mm sampai 5 mm (Depkes RI, 1980).

Kedudukan kategori taksa untuk jenis attarasa di dalam sistematika tumbuhan adalah sebagai berikut:

Kingdom : Plantae

Divisi : Spermatophyta Kelas : Dicotyledonae Ordo : Laurales Famili : Lauraceae Genus : Litsea

Spesies : Litsea cubeba (Lour.) Pers.

Tumbuhan attarasa ini memiliki berbagai sebutan seperti di Jawa tanaman ini disebut ki lemo atau krangenyan, di Sunda disebut lemo, di Kalimantan Timur disebut apokayan, di China disebut may chang, dan di Malaysia disebut medang ayer(Kurniaty, dkk., 2014).

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Damanik (2016) kulit batang attarasa positif mengandung metabolit sekunder berupa alkaloid, glikosida,

(27)

Triterpenoid/ steroid, flavonoid, tanin dan saponin. Khasiat tanaman attarasa dipercaya sebagai karminatif, spasmolitik, stomakik (Depkes RI, 1980)

2.6 Ekstraksi

Ekstraksi (dalam istilah farmasi) yaitu proses pemisahan bagian senyawa aktif yang berkhasiat sebagai obat dari jaringan tanaman atau hewan dengan menggunakan pelarut tertentu, sesuai prosedur standart yang akan menghasilkan ekstrak (Depkes RI, 1979). Senyawa aktif yang terdapat dalam simplisia dapat digolongkan ke dalam golongan minyak atsiri, alkaloid, flavonoid dan lain- lain (Ditjen POM, 2000).

Metode ekstraksi dapat dilakukan dengan berbagai cara (Ditjen POM, 2000), yaitu:

a. Cara dingin i. Maserasi

Maserasi adalah proses ekstraksi dengan cara merendam simplisia dalam pelarut yang sesuai pada temperatur ruangan dan terlindung dari cahaya yang disertai pengocokan atau pengadukan..

ii. Perkolasi

Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai sempurna (exhaustive extraction) yang umumnya dilakukan pada temperatur ruangan. Proses terdiri dari tahapan pengembangan bahan, tahap maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya (penetesan/penampungan ekstrak) terus-menerus sampai diperoleh ekstrak (perkolat) yang jumlahnya 1-5 kali bahan.

(28)

b. Cara panas i. Refluks

Refluks adalah proses penyarian simplisia dengan menggunakan pelarut pada temperatur titik didihnya selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas relatif konstan dengan adanya pendingin balik.

ii. Sokletasi

Sokletasi adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik.

iii. Digesti

Digesti merupakan maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinu) pada temperatur yang lebih tinggi dari temperatur kamar, umumnyadilakukan pada suhu 40- 50^o C

iv. Infundansi

Infundasi adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur penangas air (bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih, temperatur terukur 96-98^oC selama waktu tertentu (15-20 menit).

v. Dekoktasi

Dekoktasi adalah infundasi pada waktu yang lebih lama (≥ 30 menit) dan temperatur sampai titik didih air.

(29)

2.7 Fraksinasi Ekstrak Etanol

Fraksinasi adalah proses untuk memisahkan golongan utama kandungan senyawa yang satu dengan golongan utama yang lainnya dari suatu ekstrak sebelum dilakukan kromatografi. Senyawa akan lebih terlarut pada pelarut yang memiliki kemiripan sifat dengan senyawa tersebut. Sifat kimia yang membedakan senyawa nitrogen dari senyawa organik lain adalah sifat kebasaannya jadi membentuk garam dengan asam mineral. Selain itu, dapat diekstraksi dari jaringan tumbuhan dengan menggunakan pelarut asam lemak dan kemudian terendapkan secara terpilah dari ekstrak tersebut dengan menambahkan ammonia (Harborne, 1987).

Robinson (1995) menyatakan bahwa untuk memisahkan alkaloid disekat pada pH tertentu dengan pelarut organik (asas keller). Prinsip pengerjaan dengan asas kelleryaitu alkaloid yang terdapat dalam suatu sampel sebagai bentuk garam dari hasil pengasaman dibebaskan dari ikatan garam tersebut menjadi alkaloid bebas untuk itu ditambahkan basa lain yang lebih kuat daripada basa alkaloid.

Alkaloid yang bebas tadi diekstraksi dengan pelarut tertentu, misalnya dengan etil asetat, kloroform. Alkaloid biasanya diperoleh dengan cara mengekstraksi bahan memakai air yang diasamkan, hal ini bertujuan untuk membentuk garam alkaloid amina serta memperbesar kelarutan alkaloid dalam air. Alkaloid amina bereaksi dengan asam kuat akan membentuk garam alkil amonium. Jenis reaksi amina ini digunakan untuk memisahkan amina dari zat netral atau zat yang larut dalam air bersuasana asam. Reaksi amina dapat dilihat pada Gambar 2.2

..

(30)

Gambar 2.2 Reaksi amina dengan asam kuat

Garam alkaloid dari hasil pengasaman dapat dibasakan dengan penambahan NH₄OH yang semula dalam bentuk garamnya yang larut dalam air akan menjadi alkaloid bebas yang tidak larut dalam air tapi larut dalam pelarut organik seperti kloroform atau eter. Dimana proses ini merupakan proses pembebasan amina dari garamnya dengan penambahan basa yang sesuai reaksi pada Gambar 2.3

Gambar 2.3 Reaksi pembebasan amina dengan cara pembasaan (Robinson, 1995) 2.8 Senyawa Alkaloid

Alkaloid merupakan suatu golongan senyawa organik yang terbanyak ditemukan di alam. Hampir seluruh senyawa alkaloid berasal dari tumbuh- tumbuhan dan tersebar luas dalam berbagai jenis tumbuhan. Lebih dari 5000 senyawa alkaloid yang ditemukan dalam tumbuhan mempunyai keaktifan fisiologis tertentu. Semua alkaloid mengandung paling sedikit satu atom nitrogen yang biasanya bersifat basa (Lenny, 2006).

Alkaloid telah dikenal selama bertahun- tahun dan telah menarik perhatian terutama karena pengaruh fisiologinya terhadap binatang menyusui dan pemakaiannya di bidang farmasi, tetapi fungsinya dalam tumbuhan hampir sama sekali kabur. Beberapa pendapat mengenai kemungkinan perannya ialah sebagai berikut:

R R

R NH

⁺

X+ NH

4+

OH

^-

R N + H

2

O + NH

4

X

R R

Garam alkaloid Alkaloid

¨

(31)

a. Salah satu pendapat yang dikemukakan pertama kali, sekarang tidak dianut lagi ialah bahwa alkaloid berfungsi sebagai buangan nitrogen seperti urea dan asam urat dalam tumbuhan.

b. Beberapa alkaloid mungkin bertindak sebagai tandon penyimpanan nitrogen meskipun banyak alkaloid ditimbun dan tidak mengalami metabolisme lebih lanjut meskipun sangat kekurangan nitrogen

c. Pada beberapa kasus, alkaloid dapat melindungi tumbuhan dari serangan parasit atau pemangsa tumbuhan

d. Alkaloid dapat berlaku sebagai pengatur tumbuh karena, dari segi struktur, beberapa alkaloid menyerupai pengatur tumbuh. Beberapa alkaloid merangsang perkecambahan yang lainnya menghambat

e. Semula disarankan oleh Liebig bahwa alkaloid, karena sebagian besar bersifat basa, dapat mengganti basa mineral dalam mempertahankan keseimbangan ion dalam tumbuhan. Alkaloid dapat pula berfungsi dengan cara pertukaran dengan kation tanah (Robinson, 1995)

Sebagian besar alkaloid bereaksi dengan alkil halida membentuk kristal.

Garam alkaloid berbeda sifatnya dengan alkaloid bebas. Alkaloid bebas biasanya tidak larut dalam air (beberapa dari golongan pseudoalkaloid dan protoalkaloid larut), tetapi mudah larut dalam pelarut organik yang agak polar (seperti benzena, eter, kloroform). Alkaloid bentuk garam mudah larut dalam pelarut organik polar (Robinson, 1995).

Salah satu cara untuk mengklasifikasikan alkaloid adalah berdasarkan jenis cincin heterosiklik nitrogen merupakan bagian dari struktur molekul. Klasifikasi alkaloid berdasarkan jenis cincin heterosiklik dapat dilihat pada Tabel 2.1

(32)

Tabel 2.1 Klasifikasi alkaloid berdasarkan jenis cincin heterosiklik

No Jenis alkaloid Struktur

1. Alkaloid pirolidin, yaitu alkaloid yang mengandung inti pirolidin.

2. Alkaloid piridin yaitu alkaloid yang mengandung inti piridin.

3. Alkaloid piperidin yaitu alkaloid yang mengandung inti piperidin

4. Alkaloid indol yaitu alkaloid yang mengandung gugus indol dan turunannya

5. Alkaloid kuinolin yaitu alkaloid yang mengandung inti kuinolin atau turunannya

6. Alkaloid isokuinolin yaitu alkaloid yang mengandung inti isokuinolin atau turunannya

7. Alkaloid tropana yaitu alkaloid yang mengandung inti tropan.

(Achmad, 1986)

(33)

Berdasarkan asal mula kejadian (biosintesis) dan hubungannya dengan asam amino senyawa alkaloid dapat dikelompokkan menjadi alkaloid sejati, protoalkaloid dan pseudoalkaloid

a. Alkaloid sejati, alkaloid jenis ini mempunyai ciri-ciri antara lain basa, toksik, keaktifan fisiologi besar, biasanya mengandung atom nitrogen di dalam cincin heterosiklik, turunan amino, distribusinya terbatas dan biasanya terbentuk di dalam tumbuhan sebagai garam dan asam organik.

Beberapa senyawa alkaloid yang tidak bersifat basa, tidak mempunyai cincin heterosiklik dan termasuk alkaloid kuartener yang lebih cenderung bersifat asam, contoh kolkisina dan asam aristolosit.

b. Protoalkaloid, alkaloid jenis ini mempunyai ciri-ciri antara lain memiliki struktur amino sederhana dimana atom nitrogen dari asam aminonya tidak berada di dalam cincin heterosiklik, biosintesis berasal dari asam amino dan basa, contoh meskalin dan efedrin.

c. Pseudoalkaloid, alkaloid jenis ini mempunyai ciri-ciri antara lain tidak diturunkan dari asam amino dan umumnya bersifat basa, contoh kafein (Achmad, 1986).

Satu- satunya sifat kimia alkaloid yang paling penting ialah kebasaannya.

Metode pemurnian dan pencirian ialah umunya mengandalkan sifat ini, dan pendekatan khusus beberapa alkaloid (misalnya rutaekarpina, kolkisina, risinina) yang tidak bersifat basa. Alkaloid biasanya diperoleh dengan cara mengekstraksi bahan tumbuhan memakai air yang diasamkan yang melarutkan alkaloid sebagai garam atau bahan tumbuhan dapat dibasakan dengan natrium karbonat dan

(34)

sebagainya dan basa bebas diesktraksi dengan pelarut organik seperti kloroform, eter, dan sebagainya (Robinson, 1995).

Campuran pelarut netral hanya cocok untuk alkaloid netral yang menunjukkan tak ada kecendrungan terprotonisasi atau untuk alkaloid kuartener yang bermuatan positif pada semua harga pH. Untuk kebanyakan alkaloid yang bersifat basa lemah, pelarut yang didapar pada harga pH antara harga pKa alkaloid yang akan dipisahkan memberikan hasil yang baik. Pereaksi deteksi yang paling umum dipakai untuk menyemprot kromatogram ialah pereaksi dragendorf yang terdapat dalambeberapa ragam dengan kepekaan terhadap alkaloid sekitar sepuluh kalinya (Robinson, 1995).

Pada umumnya sukar mengidentifikasi alkaloid baru dari suatu tumbuhan tanpa mengetahui kira-kira jenis alkaloid yang terkandung didalamnya. Secara kimia alkaloid begitu heterogen dan begitu banyak sehingga alkaloid tidak dapat diidentifikasi dalam ekstrak tumbuhan dengan menggunakan kromatografi tunggal (Achmad, 1986).

(35)

BAB III

METODE PENELITIAN

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental untuk mengetahui aktivitas sitotoksik terhadap Artemia salina Leach berdasarkan metode brine shrimp lethality test. Tahap penelitian meliputi identifikasi bahan, pengumpulan dan pengolahan bahan, pembuatan ekstrak etanol, fraksinasi ekstrak etanol dengan n- heksan dan kloroform dengan berbagai variasi pH, dan pengujian sitotoksik terhadap Artemia salina Leach dengan metode brine shrimp lethality test.

3.1 Alat

Alat- alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat- alat gelas, bejana penetasan telur Artemia salina Leach, blender (Philips), corong pisah (Pyrex), lampu 5 watt (Philips), lemari pengering, neraca listrik (Boeco), penangas air (Yenaco), plat silika GF₂₅₄,rotary evaporator (Stuart), vial.

3.2 Bahan

Bahan- bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah kulit batang attarasa, telur Artemia salina Leach, garam laut, ragi. Bahan kimia yang digunakan kecuali dinyatakan lain adalah berkualitas pro analisis, yaitu: air suling, dimetil sulfoksida (DMSO), etanol (Merck), n- heksan (Merck), kloroform (Merck).

3.3 Penyiapan Bahan Tumbuhan

Penyiapan bahan tumbuhan meliputi pengumpulan bahan tumbuhan, identifikasi tumbuhan dan pembuatan simplisia kulit batang attarasa (Litsea cubeba Lour.) Pers.).

(36)

3.3.1 Pengumpulan bahan tumbuhan

Pengumpulan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Sampel yang digunakan adalah kulit batang attarasa (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) yang diperoleh dari Kecamatan Balige Provinsi Sumatera Utara.

3.3.2 Identifikasi tumbuhan

Identifikasi tumbuhan dilakukan diHerbarium Medanense (MEDA) Universitas Sumatera Utara. Bagian tumbuhan yang diidentifikasi adalah bagian kulit batang dari tumbuhan attarasa.

3.3.3 Pembuatan simplisia

Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah kulit batang attarasa yang telah dikumpulkan dan dicuci bersih dengan air mengalir, kemudian ditiriskan lalu disebarkan diatas kertas merang hingga airnya terserap, setelah itu bahan ditimbang. Kemudian bahan dikeringkan dengan cara di dalam lemari pengering.

Berat dari bahan yang kering ditimbang. Selanjutnya disimpan dalam kantung plastik kedap udara ditempat yang terlindung dari sinar matahari.

3.4 Pembuatan Pereaksi

3.4.1 Larutan asam klorida 2N

Sebanyak 17 mL asam klorida pekat diencerkan dengan air suling sampai 100 mL (Depkes RI, 1995).

3.4.2 Pereaksi Dragendorf

Sebanyak 0,8 g bismut nitrat dilarutkan dalam asam nitrat pekat 20 mL kemudian dicampurkan dengan larutan kalium iodida sebanyak 27,2 g dalam 50 mL air suling. Campuran didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan jernih

(37)

diambil dan diencerkan dengan air suling secukupnya hingga 100 mL (Depkes RI, 1995).

3.4.3 Pereaksi Natrium hidroksida 2 N

Sebanyak 8,001 gram kristal natrium hidroksida ditimbang, dilarutkan dalam air suling sehingga diperoleh larutan 100 mL (Depkes RI, 1995).

3.5 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia 3.5.1 Pemeriksaan makroskopik

Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk luar dari simplisia kulit batang attarasa (Litsea cubeba (Lour.) Pers.).

3.6 Pembuatan Ekstrak Etanol Kulit Batang Attarasa

Ekstraksi dilakukan secara maserasi menggunakan pelarut etanol 96%.

Masukkan serbuk simplisia ke dalam wadah kaca, ditambahkan 75 bagian pelarut, tutup biarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil diaduk sekali- kali.

Maserat dipisahkan, diperas, ampas maserasi dicuci dengan etanol 96% hingga diperoleh 100 bagian. Pindahkan ke dalam bejana tertutup, biarkan ditempat sejuk, terlindung dari cahaya, selama 2 hari. Tuangkan atau saring dengan menggunakan alat rotary evaporator pada suhu ± 40^oC (Depkes RI, 1979).

3.7 Fraksinasi Kulit Batang Attarasa

Fraksinasi dilakukan dengan metode Atta - ur rahman (2004) yang dimodifikasi menggunakan pelarut n- heksan dan kloroform.

a. Fraksinasi dengan n- heksan

Sebanyak 10 g ekstrak etanol kulit batang attarasa ditambahkan 20 mL etanol dan 50 ml aquadest yang telah dipanaskan, kemudian diektraksi dengan n- heksan sebanyak 200 mL menggunakan corong pisah. Lapisan n-

(38)

heksandipisahkan dan kemudian diuapkan hingga diperoleh fraksi n- heksan pekat dan ditimbang.

b. Fraksinasi dengan kloroform

Sebanyak 10 g ekstrak etanol kulit batang attarasa ditambahkan 20 mL etanol dan 50 mL aquadest yang telah dipanaskan, kemudian diektraksi dengan kloroform sebanyak 200 mL menggunakan corong pisah. Diekstraksi kloroform pada pH 3,7, 9 dan 11 dengan penambahan HCl dan NaOH. Lapisan kloroform dipisahkan dan kemudian diuapkan hingga diperoleh fraksi kloroform pH 3,7, 9, dan 11 pekat dan ditimbang.

3.8 Uji Sitotoksik

Pengujian dilakukan terhadap ekstrak, fraksi n- heksan, fraksi air dan fraksi kloroform dengan variasi pH 3, 7, 9, dan 11 dari kulit batang attarasa (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) menggunakan larva Artemia salina Leach. dengan metode brine shrimp lethality test.

3.8.1 Pembuatan air laut buatan

Bahan yang digunakan dalam pembuatan air laut buatan adalah garam laut tanpa yodium sebanyak 38 gram dalam 1000 mL air suling (Geetha, et al., 2010).

Dilarutkan garam laut tanpa yodium dalam gelas beker sampai terlarut sempurna kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 1000 mL dan ditambahkan air suling sampai 1000 ml.

3.8.2 Penetasan telur Artemia salina Leach.

Disiapkan bejana penetasan yang mempunyai dua bagian bersekat. Sekat dalam wadah tersebut di lubangi agar larva dapat berpindah dari tempat yang gelap ke tempat yang terang. Masukkan air laut buatan ke dalam bejana. Telur

(39)

Artemia salina Leach ditaburkan secara berhati - hati (Indiastuti, dkk., 2008).

Bagian wadah yang berisi telur tersebut ditutup dengan aluminium foil sedangkan bagian wadah yang tidak ditempati telur diterangi dengan sinar lampu 5 watt untuk menghangatkan suhu dalam penetasan, setelah 48 jam, diambil larva udang yang akan diuji dengan pipet tetes (Juniarti dan Yuhermita, 2009). Gambar wadah penetasan dapat dilihat pada Lampiran 4, halaman 52.

3.8.3 Uji sitotoksik metode Brine Shrimp Lethality Test

Larutan uji yang terdiri dari ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi kloroform dengan variasi pH yaitu pH 3, pH 7, pH 9, pH 11 dan fraksi air dengan konsentrasi 1000, 100, 10 dan 1 μg/ml dengan masing- masing konsentrasi diuji dengan tiga kali pengulangan, disiapkan vial dan setiap vial dikalibrasi 5 mL.

Larutan induk I dibuat dengan menimbang 50 mg ekstrak dan fraksi lalu dilarutkan dengan DMSO 0,5 mL lalu dicukupkan dengan air laut buatan sampai 5 mL sehingga diperoleh konsentrasi 10.000 μg/ml. Dipipet 0,5 mL larutan induk I lalu diencerkan sampai 5 mL sehingga diperoleh larutan induk II dengan konsentrasi 1000 μg/ml. Dipipet 0,5 mL larutan induk II lalu diencerkan sampai 5 mL sehingga diperoleh konsentrasi 100 μg/ml. Dipipet 0,5 mL dari larutan konsentrasi 100 μg/ml lalu diencerkan sampai 5 mL sehigga diperoleh konsentrasi 10 μg/ml. Dipipet 0,5 mL dari larutan konsentrasi 10 μg/ml lalu diencerkan sampai 5 ml sehigga diperoleh konsentrasi 1 μg/ml. Kontrol dibuat dengan menambahkan DMSO 0,5 mL ke dalam vial lalu dicukupkan air laut buatan sampai 5 mL. Lalu ditambahkan 10 ekor larva Artemia salina Leach ke dalam masing-masing vial yang telah berisi larutan uji dan larutan kontrol. Tambahkan 1

(40)

tetes suspensi ragi (3 mg dalam 5 mL air laut buatan) sebagai makanannya, kemudian semua vial diletakkan di bawah cahaya lampu.

Amati selama 24 jam dan dihitung jumlah persentase kematian larva tiap konsentrasi dan kontrol. Bagan uji sitotoksik dapat dilihat pada Lampiran 3, halaman 51.

3.9 Perhitungan LC50

Data persentase kematian larva Artemia salina Leach yang diperoleh ditentukan dengan menggunakan rumus Abbot:

% Kematian= tes -kontrol

kontrol X 100%

Persentase kematian yang diperoleh kemudian diubah dalam nilai probit dengan menggunakan tabel probit sesuai dengan persentase dalam margin (Tabel 3.1) hingga diperoleh nilai probit (sumbu y) yang akan diplot dengan log konsentrasi (sumbu x) untuk mendapatkan nilai LC₅₀yang dihitung menggunakan Microsoft excel 2007, setelah diperoleh persamaan regresi, dicari harga anti log x, dimana y=5 (Sarker, 2013).

(41)

Tabel 3.1 Probit (deviasi normal +5) sesuai dengan persentase dalam margin (Depkes RI, 1995)

% 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0 - 2.67 2.95 3.12 3.25 3.36 3.45 3.52 3.59 3.66 10 3.72 3.77 3.82 3.87 3.92 3.96 4.01 4.05 4.08 4.12 20 4.16 4.19 4.23 4.26 4.29 4.33 4.36 4.39 4.42 4.45 30 4.48 4.50 4.53 4.56 4.59 4.61 4.64 4.67 4.69 4.72 40 4.75 4.77 4.80 4.82 4.85 4.87 4.90 4.92 4.95 4.97 50 5.00 5.03 5.05 5.08 5.10 5.13 5.15 5.18 5.20 5.23 60 5.25 5.28 5.31 5.33 5.36 5.39 5.41 5.44 5.47 5.50 70 5.52 5.55 5.58 5.61 5.64 5.67 5.71 5.74 5.77 5.81 80 5.84 5.88 5.92 5.95 5.99 6.04 6.08 6.13 6.18 6.23 90 6.28 6.34 6.41 6.48 6.55 6.64 6.75 6.88 7.05 7.33 - 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 99 7.33 7.37 7.41 7.46 7.51 7.58 7.65 7.75 7.88 8.09

3.10 Analisis Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Sampel yang memiliki nilai LC₅₀ paling baikdilakukan analisis secara KLT menggunakan fase diam silika gel GF254 dan fase gerak campuran diklorometan:metanol:amonia dengan perbandingan (95:5:1), (90:10:1), (85:15:1), (80:20:1), (75:25:1), (70:30:1), (65:35:1), (60:40:1).Sebagai penampak bercak digunakan pereaksi dragendorff.

(42)

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Identifikasi tanaman

Identifikasi sampel dilakukan di Herbarium Medanense (MEDA) Universitas Sumatera Utara. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa sampel termasuk suku Lauraceae, spesies Litsea cubeba (Lour.) Pers. Hasil dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 46.

4.2 Karakteristik simplisia

Hasil pemeriksaan makroskopik terhadap potongan kulit batang attarasa adalah permukaan luar kasar tidak beraturan berwarna coklat. Permukaan dalam rata berwarna coklat sampai kehitaman. Sangat mudah patah dan bekas patahan tidak teratur. Memiliki aroma yang khas, rasa agak pedas dan agak pahit. gambar potongan kulit batang attarasa dapat dilihat pada Lampiran 2, halaman 47.

Hasil pemeriksaan makroskopik terhadap simplisia kulit batang attarasa diperoleh bentuk gelondong atau pipa menggulung dengan tebal 0,5– 1,5 mm.

Permukaan luar kasar tidak beraturan berwarna coklat. Permukaan dalam rata berwarna coklat sampai kehitaman. Memiliki aroma yang khas, rasa agak pedas dan agak pahit. Sangat mudah patah dan bekas patahan tidak rata. Gambar simplisia kulit batang attarasa dapat dilihat pada Lampiran 2, halaman 48.

Hasil pemeriksaan makroskopik terhadap serbuk simplisia kulit batang attarasa diperoleh serbuk kasar yang terdapat banyak serat berwarna coklat serta memiliki rasa dan bau yang khas. Gambar serbuk simplisia dapat dilihat pada Lampiran 2, halaman 48 .

(43)

4.3 Hasil ekstraksi dan fraksinasi

Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan pelarut etanol 96% dengan metode maserasi. Hasil yang diperoleh yakni ekstrak kasar sebanyak 69,255 g.

Pelarut etanol digunakan sebagai pengekstraksi karena etanol merupakan senyawa organik yang memiliki struktur molekul kecil dan dua gugus yang berbeda yaitu gugus alkil yang bersifat non polar dan gugus hidroksil yang bersifat polar.

Karakteristik demikian menyebabkan etanol mampu menembus semua jaringan dan menarik semua komponen, baik yang bersifat polar maupun non polar (Masriani, 2014).

Komponen polar dan non polar dalam ekstrak etanol dipisahkan dengan partisi cair- cair. Ekstrak etanol didispersikan dengan air dan dipartisi dengan n- heksan, karena merupakan pelarut organik non polar, sehingga fraksi non polar yang terdapat dalam ekstrak etanol seperti minyak atsiri, lemak, dan steroid akan terpartisi ke dalam n- heksan, sedangkan komponen polar seperti alkaloid terpartisi ke dalam air (Masriani, 2014).

Komponen polar yang terdapat dalam fraksi air terdiri dari alkaloid dan non alkaloid. Untuk memisahkan kedua komponen tersebut, fraksi diasamkan dengan HCl 0,1 N sampai pH 3 sehingga terbentuk garam alkaloid yang dapat larut dalam air. Penambahan pelarut organik kloroform yang tidak larut dalam air akan memisahkan antara komponen non alkaloid dengan alkaloid. Komponen alkaloid akan terpartisi ke lapisan air-asam, sedangkan komponen non alkaloid akan dibasakan dengan dengan NaOH 0,1 N sampai pH 7, 9, dan 11.

Penambahan larutan basa bertujuan untuk membebaskan alkaloid dari garamnya.

Partisi dengan dengan pelarut kloroform bertujuan untuk memisahkan antara

(44)

komponen alkaloid yang kurang polar dengan alkaloid polar. Alkaloid kurang polar akan terpartisi ke dalam kloroform, sedangkan alkaloid polar akan terpartisi dalam lapisan air- basa (Masriani, 2014). Hasil partisi ekstrak etanol dengan pelarut n- heksan, air, dan kloroform dengan variasi pH 3, 7, 9, dan 11 dapat dilihat pada Tabel 4.1

Tabel 4.1 Berat fraksi yang diperoleh dari ekstrak etanol kulit batang attarasa.

No Fraksi Berat (g)

1 Fraksi n- heksan 3,2720

2 Fraksi kloroform pH 3 2,7211

6 Fraksi air 15,8196

Komponen yang larut dalam lapisan air- basa (fraksi air) merupakan komponen yang paling banyak (15,8196 g). Komponen tersebut diperkirakan adalah alkaloid yang bersifat sangat polar, hanya larut dalam air tetapi tidak larut dalam kloroform. Komponen tersebut hanya dapat dipisahkan dengan pelarut yang lebih polar seperti yang telah dilakukan oleh Atta-ur rahman, et al (2004).

4.4 Hasil Uji Sitotoksik

Hasil uji sitotoksik dapat diketahui dari jumlah kematian larva Artemia salina Leach disebabkan adanya pengaruh dari pemberian ekstrak, fraksi kloroform dengan variasi pH yaitu pH 3, 7, 9, 11, fraksi n- heksandan fraksi air dari kulit batang attarasa pada konsentrasi 1, 10, 100, dan 1000 μg/ml. Selain itu, dibuat kontrol negatif berupa air laut buatan dan larva tanpa penambahan ekstrak

(45)

dan fraksi. Hasil pengamatan kematianArtemia salina Leach setelah 24 jam pada ekstrak dan fraksi dari kulit batang attarasa dapat dilihat dalam Tabel 4.2

Tabel 4.2 Hasil pengamatan kematian Artemia salina Leach setelah 24 jam pemberian ekstrak dan fraksi dari kulit batang attarasa

Sampel Pengulangan ke-

Jumlah Artemia salina Leach yang mengalami kematian pada berbagai konsentrasi 1 μg/ml 10

μg/ml 100 μg/ml 1000 μg/ml

Ekstrak etanol

I 1 4 6 10

II 0 7 5 10

III 1 4 8 10

Rata- rata

kematian 0,66 5 6,33 10

Fraksi n- heksan

I 0 2 2 6

II 1 2 2 6

III 0 2 3 6

Rata- rata

kematian 0,33 2 2,33 6

Fraksi kloroform

pH 3

I 2 4 7 9

II 4 4 7 10

III 2 4 6 9

Rata- rata

kematian 2,67 4 6,67 9,33

pH 7

I 5 5 8 10

II 4 5 9 10

III 3 6 10 10

Rata- rata

kematian 4 5,33 9 10

pH 9

I 0 7 10 10

II 4 7 9 10

III 1 5 10 10

Rata- rata

kematian 1,67 6,33 9,67 10

pH 11

I 2 4 8 8

II 2 2 6 8

III 0 4 6 9

Rata- rata

kematian 1,33 3,33 6,67 8,33

Fraksi air

I 0 1 3 3

II 1 1 2 2

III 0 2 3 5

Rata- rata

kematian 0,33 1,33 2,67 3,33

(46)

Uji sitotoksik ekstrak etanol, fraksi n- heksan, fraksi air dan fraksi kloroform dengan variasi pH 3, 7, 9, dan 11 terhadap Artemia salina Leach dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan pada masing- masing konsentrasi 1 μg/ml, 10 μg/ml, 100 μg/ml, 1000 μg/ml.

Rata- rata kematian yang didapat dibandingkan dengan kelompok kontrol, dimana pada kelompok kontrol, larva tidak mengalami kematian dari jumlah awal yaitu 10 ekor. Sehingga dapat dipastikan bahwa kematian larva pada kelompok uji disebabkan oleh pengaruh ekstrak dan fraksi kulit batang attarasa.

Sehingga dapat dicari % kematian dengan rumus:

% Kematian= Rata Kematian

Kontrol X 100%

Nilai Persentase kematian yang didapat diubah kedalam nilai probit sehingga diperoleh data Tabel 4.3

Tabel 4.3 Log konsentrasi dan nilai probit dari uji sitotoksik terhadap ekstrak dan fraksi dari kulit batang attarasa

Sampel

Konsentrasi

(μg/ml) Log Konsentrasi

Rata- rata kematian

% kematian

Nilai probit Ekstrak

etanol

1 0 0,66 6,60 3,45

10 1 5 50 5,00

100 2 6,33 63,3 5,33

1000 3 10 100 8,09

Fraksi n- heksan

1 0 0,333 3,33 3,12

10 1 2 20 4,16

100 2 2,333 23,33 4,26

1000 3 6 60 5,25

pH 3

1 0 2,67 26,7 4,36

10 1 4 40 4,75

100 2 6,67 66,7 5,41

1000 3 9,33 93,3 6,48

pH 7

1 0 4 40 4,75

10 1 5,33 53,3 5,08

100 2 9 90 6,28

1000 3 10 100 8,09

(47)

Tabel 4.3 (Lanjutan) Sampel

Konsentrasi

(μg/ml) Log Konsentrasi

Rata- rata kematian

% kematian

Nilai probit Fraksi

kloroform pH 9

1 0 1,67 16,7 4,01

10 1 6,33 63,3 5,33

100 2 9,67 96,7 6,75

1000 3 10 100 8,09

pH 11

1 0 1,33 13,3 3,87

10 1 3,33 33,3 4,56

100 2 6,67 66,7 5,41

1000 3 8,33 83,3 5,95

Fraksi air

1 0 0,33 3,33 3,12

10 1 1,33 13,3 3,87

100 2 2,67 26,7 4,36

1000 3 3,33 33,3 4,48

Tabel 4.3 menunjukkan bahwa adanya hubungan antara konsentrasi penambahan ekstrak dan fraksi kulit batang attarasa dengan total kematian larva.

Semakin tinggi konsentrasi yang diberikan akan meningkatkan kematian larva.

Analisis probit dilakukan untuk mendapatkan kurva yang membentuk garis lurus sehingga penentuan nilai LC50 lebih tepat. Jika hanya memplotkan persentase kematian larva (nilai y) dengan logaritma konsentrasi (nilai x) maka akan didapatkan kurva berbentuk sigmoid sehingga dalam penentuan nilai LC50

dapat menjadi kurang tepat. Analisis probit akan didapatkan kurva yang berbentuk garis lurus karena konsentrasi sampel ditransformasikan menjadi logaritma konsentrasi sebagai variable tetap (nilai x) dan persentase kematian larva ditransformasikan menjadi nilai probit sebagai variable terikat (nilai y) (Kurniansyah, 2015).

Nilai LC₅₀ diperoleh berdasarkan persamaan regresi linier yang didapatkan dengan cara memplot log konsentrasi larutan uji dan nilai mortalitas probit uji toksisitas ekstrak dan fraksi kulit batang attarasa, dimana log konsentrasi larutan

(48)

dilihat grafik hubungan antara log konsentrasi dengan nilai probit mortalitas ekstrak etanol kulit batang attarasa (Gambar 4.1), fraksi n- heksan (Gambar 4.2), fraksi kloroform pH 3 (Gambar 4.3), fraksi kloroform pH 7 (Gambar 4.4), fraksi kloroform pH 9 (Gambar 4.5), fraksi kloroform pH 11 (Gambar 4.6), dan fraksi air (Gambar 4.7).

Gambar 4.1 Grafik log konsentrasi dengan nilai probit mortalitas uji sitotoksik ekstrak etanol kulit batang attarasa

Gambar 4.2 Grafik log konsentrasi dengan nilai probit mortalitas uji sitotoksik fraksi R² = 0.907

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

probit mortalitas

log konsentrasi

R² = 0.926

0 1 2 3 4 5 6

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

log konsentrasi

(49)

Gambar 4.3 Grafik log konsentrasi dengan nilai probit mortalitas uji sitotoksik fraksi kloroform pH 3 dari kulit batang attarasa