i
PENGGUNAAN KHAMIR ANTAGONIS
UNTUK PENGENDALIAN PENYAKIT ANTRAKNOSA
PADA BUAH AVOKAD SELAMA PENYIMPANAN
YULI FITRIATI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
iii
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis “Penggunaan Khamir Antagonis untuk Pengendalian Penyakit Antraknosa pada Buah Avokad Selama Penyimpanan” adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, April 2012
Yuli Fitriati
i
ABSTRACT
YULI FITRIATI. The Use of Antagonistic Yeast for Anthracnose Disease Control in Avocado Fruit during Storage. Supervised by SURYO WIYONO and IVONE OLEY SUMARAUW
Anthracnose caused by Colletotrichum gloeosporioides is an important disease in avocado fruit during storage. An effective, cheap, and safe control method is necessary as an alternative to subtitute the use of fungicides in postharvest disease control. This research aims 1) to get a yeast antagonist from avocados that are effective in controlling anthracnose disease on avocado fruit, 2) to identify effective yeast antagonists to control anthracnose disease on avocado fruit, and 3) to examine mechanism of action of yeast antagonists in controlling anthracnose disease on avocado fruit. Research started with isolation of C.
gloeosporioides and yeast from avocado fruit, followed by bioassay in vivo,
antibiosis test, and chitinolitic activity test. In vivo testing was done by dipping avocado fruit on yeast cell suspension to suppress the anthracnose disease in avocado fruits. The isolation of yeasts from avocado obtained 23 yeasts isolates. Based on bioassay in vivo, there were eight yeast isolates (A28, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38) that effectively inhibited anthracnose disease in avocado fruit at a concentration of 106 cells/ml and 107 cells/ml. However, only four isolates were chosen for further characterization based on morphological and molecular identification. Two species of yeast was identified, i.e Pichia anomala (isolates A33 and A37) and Candida intermedia (isolates A35 and A36).
iii
RINGKASAN
YULI FITRIATI. Penggunaan Khamir Antagonis untuk Pengendalian Penyakit Antraknosa pada Buah Avokad Selama Penyimpanan. Dibimbing oleh SURYO WIYONO dan IVONE OLEY SUMARAUW
Avokad (Persea americana Mill.) merupakan salah satu produk hortikultura yang mempunyai nilai ekonomi tinggi dan potensi pasar yang baik serta merupakan komoditas target ekspor. Antraknosa yang disebabkan oleh
Colletotrichum gloeosporioides merupakan salah satu penyakit penting pada buah
avokad selama penyimpanan. Perlakuan pascapanen penggunaan fungisida untuk mengendalikan penyakit pascapanen menimbulkan residu yang tidak dikehendaki oleh konsumen dan negara tujuan. Oleh karena itu, diperlukan metode pengendalian yang efektif, murah, dan aman. Salah satu agens pengendali hayati yang telah dilaporkan dapat mengendalikan beberapa patogen pada berbagai sayuran dan buah-buahan adalah khamir.
Penelitian ini bertujuan untuk 1) mendapatkan khamir antagonis dari buah avokad yang efektif untuk mengendalikan penyakit antraknosa pada buah avokad, 2) mengidentifikasi khamir antagonis untuk mengendalikan penyakit antraknosa pada buah avokad, dan 3) meneliti mekanisme kerja khamir antagonis dalam mengendalikan penyakit antraknosa pada buah avokad.
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Balai Besar Karantina Pertanian Tanjung Priok Wilayah Kerja Bogor. Sampel buah diambil dari desa Limbangan Tengah, Kecamatan Limbangan, Kabupaten Garut, Jawa Barat. Tahapan penelitian meliputi isolasi C. gloeosporioides dari buah avokad, dilanjutkan dengan pengujian in vivo khamir terhadap penyakit antraknosa pada buah avokad, uji antibiosis in vitro khamir terhadap C. gloeosporioides, uji kemampuan kitinolitik, dan identifikasi khamir.
Cendawan C. gloeosporioides diisolasi dari buah avokad dengan menggunakan media Green Bean Agar (GBA) dan Potato Dextrose Agar (PDA). Isolat khamir diisolasi dari buah avokad dengan menggunakan media YGC dan YGCA. Hasil isolasi khamir dari buah avokad diperoleh 23 isolat khamir.
Penyaringan in vivo khamir terhadap penyakit antraknosa pada buah avokad dilakukan untuk memperoleh khamir yang efektif mengendalikan penyakit antraknosa pada buah avokad selama penyimpanan. Pengujian dilakukan dengan mencelupkan buah avokad pada suspensi sel khamir pada konsentrasi 106 sel/ml dan 107 sel/ml kemudian ditetesi 30 µl suspensi konidia C. gloeosporioides dengan konsentrasi 107 spora/ml. Pengamatan dilakukan dengan mengukur diameter penghambatan perkembangan cendawan C. gloeosporioides selama 7 hari pengamatan serta menghitung kejadian penyakit antraknosa pada buah avokad. Fungisida benomil dengan konsentrasi 5% digunakan sebagai fungisida pembanding dalam mengendalikan C. gloeosporioides pada buah avokad selama penyimpanan. Hasil penyaringan in vivo menunjukkan adanya delapan khamir yang efektif mengendalikan penyakit antraknosa pada buah avokad selama penyimpanan pada konsentrasi 106 sel/ml dan 107 sel/ml yaitu isolat A28, A32, A33, A34, A35, A36, A37, dan A38 kemudian dikarakterisasi lebih lanjut.
iv
Uji in vitro dilakukan untuk mengetahui mekanisme kerja khamir dalam menghambat perkembangan C. gloeosporioides pada media PDA. Uji antibiosis dilakukan dengan menggoreskan sebanyak 1 lup inokulasi isolat khamir secara tegak lurus pada PDA dan menanam C. gloeosporioides pada sisi kanan dan kiri khamir dengan jarak 3 cm. Pengamatan dilakukan terhadap zona hambat khamir terhadap C. gloeosporioides selama 15 hari pengamatan. Hasil uji in vitro terhadap aktivitas antibiosis khamir terhadap C. gloeosporioides pada media PDA menunjukkan bahwa tidak ada khamir yang memberi zona hambatan. Hal ini menunjukkan bahwa mekanisme kerja dari keempat isolat khamir dalam menekan pertumbuhan cendawan C. gloeosporioides bukan merupakan antibiosis.
Uji kemampuan kitinolitik dilakukan dengan menggoreskan dalam sebanyak 1 lup inokulasi isolat khamir secara tegak lurus pada media kitin agar 0.2%. Pengamatan dilakukan terhadap zona bening yang terbentuk di sekitar khamir. Hasil pengamatan uji kemampuan kitinolitik terhadap seluruh isolat khamir yang diisolasi dari buah avokad pada media kitin agar 0.2% hingga hari ketujuh tidak ditemukan adanya zona bening pada seluruh isolat.
Hasil uji antibiosis dan kemampuan kitinolitik secara in vitro menunjukkan bahwa antibiosis dan produksi enzim kitinase bukan merupakan mekanisme kerja khamir dalam mengendalikan penyakit antraknosa pada buah avokad selama penyimpanan.
Karakterisasi khamir secara morfologi dan molekuler hanya dilakukan terhadap empat isolat khamir yaitu isolat A33, A35, A36, dan A37. Morfologi keempat isolat khamir pada media PDA terlihat koloni yang berwarna putih, permukaan koloni licin, bentuk tepi koloni halus, dan bentuk sel bulat. Namun, elevasi koloni isolat A33 dan A37 cembung sedangkan elevasi koloni isolat A36 dan A36 datar.
Identifikasi secara molekuler dilakukan dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan primer umum 18 S rDNA dengan forward primer ITS1 (5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’) dan reverse primer ITS4 (5’-(5’-TCC (5’-TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’). Hasil analisis BLAST terhadap isolat A33 dan A37 menunjukkan tingkat kesamaan sikuen nukleotida dengan Pichia anomala sedangkan hasil analisis BLAST terhadap isolat A35 dan A36 menunjukkan tingkat kesamaan sikuen nukleotida dengan Candida intermedia.
v
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2012 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB.
vii
PENGGUNAAN KHAMIR ANTAGONIS
UNTUK PENGENDALIAN PENYAKIT ANTRAKNOSA
PADA BUAH AVOKAD SELAMA PENYIMPANAN
YULI FITRIATI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada
Program Studi Fitopatologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
viii
ix Judul Tesis : Penggunaan Khamir Antagonis untuk Pengendalian Penyakit
Antraknosa pada Buah Avokad Selama Penyimpanan Nama : Yuli Fitriati
NIM : A352100184
Disetujui Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Suryo Wiyono, M.Sc.Agr. Ir. Ivone Oley Sumarauw, M.Si. Ketua Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Fitopatologi Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Sri Hendrastuti Hidayat, M.Sc. Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr.
xi
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul “Penggunaan Khamir Antagonis untuk Pengendalian Penyakit Antraknosa pada Buah Avokad Selama Penyimpanan”. Tesis ini disusun sebagai salah satu syarat dalam menyelesaikan pendidikan pada Program Studi Fitopatologi Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
Pada kesempatan ini, penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Ir. Suryo Wiyono, M.Agr.Sc dan Ibu Ir. Ivone Oley Sumarauw, M.Si sebagai komisi pembimbing yang dengan penuh kesabaran telah memberikan arahan, pengkayaan wawasan, saran, kritik serta dukungan dalam penyelesaian tesis ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr. Efi Toding Tondok, SP., M.Sc. sebagai penguji luar yang telah memberikan masukan dan saran untuk kesempurnaan tulisan ini, Badan Karantina Pertanian yang telah memberikan beasiswa program khusus karantina, Balai Besar Karantina Pertanian Tanjung Priok, Ibu Trisnasari, Jati Adiputra, rekan-rekan di Bidang Non Benih Tumbuhan Badan Karantina Pertanian, Mbak Ita di Laboratorium Klinik Tanaman IPB yang telah banyak membantu dan mendukung pelaksanaan kegiatan penelitian ini.
Penulis menyampaikan rasa hormat dan terima kasih yang sedalam-dalamnya kepada orang tua tercinta Bapak Suparmin dan Ibu Widiastuti di Klaten, Bapak Paidjan dan Ibu Sutiyem di Yogyakarta serta adik-adikku (Nugraha, Danang, Rindha) yang banyak memberikan dukungan, dorongan, kasih sayang, do’a serta semangatnya kepada penulis selama ini. Teruntuk suami terkasih Arif Kurniawan juga ananda tersayang Anindha Naazih Ramadhani, ibu mengucapkan terima kasih banyak atas semua yang telah kalian berikan untuk ibu selama ini.
Tidak lupa penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Aprida Cristin, Selamet, Ratih Rahayu, Erna Maryana, Dwi Wahidati Oktarima, Aulia Nusantara, Rahma Susila, Joni Hidayat, Nur Fitriawati, Sri Setiyawati, Nurul Dwi Handayani, Lulu Sugiharto, Catur Yogo Hendro dan seluruh pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu atas dukungan, persahabatan dan kerjasamanya selama ini. Semoga ini menjadi awal yang baik dan sukses selalu untuk kita semua.
Semoga karya kecil ini dapat bermanfaat.
Bogor, April 2012
xiii
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Klaten pada tanggal 29 Juli 1980 dari Ayah Suparmin dan Ibu Widiastuti. Penulis merupakan putri pertama dari empat bersaudara.
Penulis melanjutkan studi ke Universitas Gadjah Mada pada Jurusan Hama Penyakit Tumbuhan pada tahun 1998 melalui seleksi Penyaringan Bibit Unggul Daerah (PBUD) dan mendapatkan gelar sarjana tahun 2002. Penulis bekerja di Badan Karantina Pertanian sejak tahun 2005 sebagai petugas fungsional Pengendali Organisme Pengganggu Tumbuhan (POPT). Tahun 2005-2007 penulis ditugaskan di Stasiun Karantina Pertanian Kelas II Tanjung Pandan dan mulai tahun 2008 penulis pidah tugas ke Badan Karantina Pertanian di Jakarta.
Tahun 2010 penulis berkesempatan melanjutkan studi pada Program Studi Fitopatologi Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Saat ini penulis telah menikah dengan Arif Kurniawan dan dikaruniai seorang putri bernama Anindha Naazih Ramadhani.
xv
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ... xvii
DAFTAR GAMBAR ... xix
DAFTAR LAMPIRAN ... xxi
PENDAHULUAN ... 1 Latar Belakang ... 1 Tujuan Penelitian ... 4 Hipotesis ... 4 Manfaat Penelitian ... 4 TINJAUAN PUSTAKA ... 5
Arti Penting Penyakit Antraknosa pada Buah Avokad ... 5
Gejala Penyakit Antraknosa pada Buah Avokad ... 6
Morfologi dan Daur Penyakit ... 7
Pengendalian Penyakit Pascapanen ... 10
Penggunaan Khamir untuk Pengendalian Hayati Penyakit ... 11
BAHAN DAN METODE ... 15
Waktu dan Tempat ... 15
Bahan ... 15
Metode ... 15
Isolasi C. gloeosporioides dari Buah Avokad ... 15
Isolasi Khamir dari Buah Avokad ... 16
Pengujian in Vivo Khamir terhadap Penyakit Antraknosa pada Buah Avokad ... 16
Uji Antibiosis in Vitro Khamir terhadap C. gloeosporioides ... 17
Uji Kemampuan Kitinolitik ... 17
Identifikasi Khamir ... 18
Analisis Data ... 19
HASIL DAN PEMBAHASAN ... 21
Isolasi C. gloeosporioides dari Buah Avokad ... 21
Isolasi Khamir dari Buah Avokad ... 22
Pengujian in Vivo Khamir terhadap Penyakit Antraknosa pada Buah Avokad ... 24
Uji Antibiosis in Vitro Khamir terhadap C. gloeosporioides ... 28
Uji Kemampuan Kitinolitik ... 29
Identifikasi Khamir ... 31
KESIMPULAN DAN SARAN ... 39
Kesimpulan ... 39
Saran ... 39
DAFTAR PUSTAKA ... 41
xvii
DAFTAR TABEL
Halaman 1 Kandungan komposisi zat gizi dalam 100 gram buah avokad segar 1 2 Kejadian penyakit antraknosa pada buah avokad yang diinokulasi
C. gloeosporioides dan diberi perlakuan dengan khamir ... 24
3 Hasil uji in vivo terhadap diameter (Ø) bercak inokulasi C.
gloeosporioides dan tingkat hambatan relatif (THR) khamir dalam
menghambat perkembangan penyakit antraknosa pada buah avokad 25 4 Morfologi koloni dan bentuk sel khamir pada media PDA ... 32 5 Isolat khamir pada GenBank yang dibandingkan dengan empat
isolat khamir yang diisolasi dari avokad ... 34 6 Mekanisme kerja P. anomala pada uji in vitro ... 36
xix
DAFTAR GAMBAR
Halaman 1 Gejala penyakit antraknosa pada buah avokad: gejala awal (a dan
b), gejala di penyimpanan (c) ... 6 2 Massa konidia (a) dan miselium (b) C. gloeosporioides pada media
PDA (perbesaran 10 x 40) ... 8 3 Tubuh buah C. gloeosporioides di bawah mikroskop : aservulus
(a), seta (b), konidia (c) dan miselium (d) pada perbesaran 10 x 40 8 4 C. gloeosporioides pada media PDA : biakan murni (a), konidia
(berwarna kuning/oranye) dan miselium (berwarna putih) (b) ... 9 5 Siklus hidup C. gloeosporioides pada avokad (Kotzé 1978) ... 10 6 Uji antibiosis in vitro khamir terhadap C. gloeosporioides ... 17 7 Uji kemampuan kitinolitik khamir pada media kitin agar 0.2% ... 18 8 Gejala awal serangan antraknosa pada buah avokad ... 21 9 Morfologi C. gloeosporioides pada media PDA: biakan
C. gloeosporioides (a), massa konidia (b dan c) ... 21 10 Konidia C. gloeosporioides ... 22 11 Hasil inokulasi C. gloeosporioides pada buah avokad (4 hari
setelah inokulasi: perlakuan benomil (a), tanpa perlakuan (b), perlakuan khamir isolat A12(c), perlakuan khamir isolat A31(d), perlakuan khamir isolat A33 (e), isolat A35 (f), isolat A36 (g),
isolat A37 (h) ... 27 12 Hasil inokulasi C. gloeosporioides pada buah avokad (5 hari
setelah inokulasi: perlakuan benomil (a), tanpa perlakuan (b), perlakuan khamir isolat A12(c), perlakuan khamir isolat A31(d), perlakuan khamir isolat A33 (e), isolat A35 (f), isolat A36 (g),
isolat A37 (h) ... 28 13 Uji antibiosis in vitro khamir (a) terhadap C. gloeosporioides (b)
pada media PDA ... 29 14 Zona bening sebagai tanda aktivitas kitinolitik khamir tidak terlihat
di sekitar khamir yang digoreskan pada bagian tengah media kitin
agar 0.2% ... 30 15 Morfologi koloni 4 isolat khamir pada media PDA: khamir isolat
A33 (a), isolat A35 (b), isolat A36 (c), dan A37 (d) ... 32 16 Morfologi sel 4 isolat khamir: isolat A33 (a), isolat A35 (b), isolat
A36 (c), dan A37 (d) ... 33 17 Hasil PCR khamir isolat A33, A35, A36, dan A37 menggunakan
xxi
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1 Analisis sidik ragam kejadian penyakit (KP) antraknosa pada buah
avokad yang diinokulasi C. gloeosporioides dan diberi perlakuan
dengan khamir ... 49 2 Analisis sidik ragam hasil uji in vivo terhadap diameter (Ø) bercak
inokulasi C. gloeosporioides pada buah avokad ... 49 3 Analisis sidik ragam hasil uji in vivo terhadap tingkat hambatan
relatif (THR) khamir dengan kerapatan 107 sel/ml untuk
menghambat perkembangan penyakit antraknosa pada buah avokad
pada hari ketujuh ... 49 4 Analisis sidik ragam hasil uji in vivo terhadap tingkat hambatan
relatif (THR) khamir dengan kerapatan 106 sel/ml untuk
menghambat perkembangan penyakit antraknosa pada buah avokad
pada hari ketujuh ... 50 5 Komposisi media Martin Agar, Yeast Glucose Chloramphenicol
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Avokad (Persea americana Mill.) merupakan salah satu komoditas hortikultura yang mempunyai nilai ekonomi dan nilai gizi tinggi (Tabel 1) serta potensi pasar yang baik sebagai salah satu komoditas target ekspor. Selain dikonsumsi sebagai buah segar dan olahan, daging buah avokad juga dimanfaatkan sebagai bahan dasar kosmetik. Daun buah avokad yang masih muda juga dapat digunakan sebagai obat tradisional untuk obat batu ginjal dan rematik (Menegristek 2000).
Tabel 1 Kandungan komposisi zat gizi dalam 100 gram buah avokad segar
No Unsur Penyusun Daging Buah Kadar
1 Air 84.30 g 2 Kalori 85.00 kalori 3 Protein 0.90 g 4 Lemak 6.50 g 5 Karbohidrat 7.70 g 6 Kalsium 10.00 mg 7 Fosfor 20.00 mg 8 Zat besi 0.90 mg 9 Vitamin C 13.00 mg 10 Vitamin B1 0.05 mg 11 Vitamin A 180.00 S.I 12 Serat 1.40 g Sumber : Menegristek 2000
Penyebab utama mutu buah avokad masih rendah adalah serangan penyakit yang terjadi pada saat prapanen sampai pascapanen. Dalam rangka menghadapi tantangan era perdagangan bebas melalui AFTA (Asean Free Trade Agreement), perlu dilakukan langkah-langkah dalam mengantisipasi muncul dan berkembangnya penyakit sehingga mutu dapat lebih baik (Sugipriatini 2009).
Busuk buah-buahan dan sayuran pascapanen menimbulkan kerugian yang nyata. Kehilangan pascapanen pada buah dan sayuran cukup tinggi, sekitar 10% sampai 40%, tergantung dari komoditas dan teknologi yang digunakan untuk pengemasan (Gholamnejad et al. 2009). Pembusukan buah dan sayuran yang
2
dipanen di negara maju akibat penanganan pascapanen diperkirakan mencapai 20%–25% . Kerugian pascapanen di negara-negara berkembang seringkali lebih tinggi karena penyimpanan dan fasilitas transportasi yang kurang memadai (Sharma et al. 2009). Pengemasan yang kurang baik dapat menimbulkan kontaminasi, misalnya: Aspergillus rot dan stem end rot (Prabawati et al. 1993).
Busuk buah avokad pascapanen adalah masalah besar terutama pada buah yang akan diekspor. Cendawan penting yang terlibat dalam busuk buah avokad adalah Colletotrichum gloeosporioides yang menyebabkan penyakit antraknosa dengan gejala warna coklat pada buah dan termasuk penyakit yang bersifat laten. Meskipun buah sudah terinfeksi sebelum panen, infeksi laten oleh cendawan penyebab busuk buah menjadi aktif dan gejala akan muncul pada saat buah menjadi lembut. Pada kondisi yang sesuai untuk perkembangannya, kerusakan buah akibat penyakit antraknosa dapat mencapai 50% (Hashem & Alamri 2009).
Perlakuan pascapanen terhadap buah-buahan dan sayuran pada umumnya dilakukan dengan pengelolaan lingkungan abiotik pada saat penyimpanan serta penggunaan fungisida (Sharma et al. 2009). Sampai saat ini, untuk mengurangi kerugian hasil akibat penyakit antraknosa banyak menggunakan fungisida sintetik sebagai cara perlindungan yang paling umum dijumpai. Akibat intensifnya penggunaan fungisida dilaporkan bahwa beberapa jenis patogen telah resisten terhadap fungisida dan tertinggalnya residu bahan kimia pada produk pertanian (Indratmi 2008). Fungisida sintetik seperti imazil, tiabendazol, pirimetanil, dan prokloraz adalah fungisida yang umum digunakan untuk mengendalikan patogen pascapanen (Hao et al. 2010).
Residu pestisida pada buah dan sayuran merupakan perhatian utama bagi konsumen dan industri buah serta sayuran. Peningkatan kesehatan dan perhatian lingkungan mengenai limbah pestisida dan residunya pada produk segar, perkembangan strain patogen pascapanen yang resisten terhadap fungisida, pendaftaran kembali beberapa fungisida yang lebih efektif (Droby 2006; Robiglio
et al. 2011), gagalnya ekspor produk pertanian ke beberapa negara akibat
tingginya residu bahan kimia serta tingginya biaya yang diperlukan untuk pengedalian secara kimiawi telah mendorong untuk mengembangkan metode pengendalian yang lebih efektif dan aman terhadap manusia dan lingkungan
3 (Droby 2006). Salah satu alternatif untuk mengatasi masalah residu pestisida adalah dengan pengendalian hayati yang telah banyak dikembangkan dan telah dilaporkan cukup efektif untuk mengendalikan penyakit pascapanen (Indratmi 2008; Kefialew & Ayalew 2009).
Strategi umum pengendalian hayati adalah penggunaan mikroorganisme antagonis dalam pengendalian penyakit pascapanen dan prapanen. Beberapa pendekatan biologi termasuk penggunaan mikrooorganisme antagonis atau bahan alami, telah dikembangkan sebagai alternatif penggunaan fungisida sintetik untuk pengelolaan penyakit pascapanen (Janisiewicz & Korsten 2002) dan mengendalikan pembusukan pada buah dan sayuran pascapanen (Ippolito & Nigro 2000). Khamir dan bakteri antagonis telah banyak dilaporkan secara alami terdapat pada permukaan buah (Qin et al. 2004; Droby 2006; Sharma et al. 2009).
Beberapa tahun terakhir ini, khamir telah digunakan sebagai agens pengendali hayati untuk mengendalikan cendawan (Wang et al. 2009). Khamir merupakan mikroorganisme yang potensial digunakan sebagai agens pengendali hayati karena mudah diperbanyak dan memiliki beberapa karakter yang dapat dimanipulasi untuk meningkatkan efisiensi penggunaanya (Robiglio et al. 2011). Khamir memiliki banyak sifat yang bermanfaat untuk pengendalian, antara lain tidak menghasilkan spora alergik atau mikotoksin, tidak menghasilkan antibiotik yang mungkin dihasilkan oleh bakteri antagonis (Droby & Chalutz 1994). Khamir umumnya memerlukan nutrisi yang sederhana dan mampu mengkolonisasi permukaan inang dalam kondisi kering pada waktu yang cukup lama seperti pestisida yang umum digunakan untuk perlakuan pascapanen. Selain itu, khamir dapat tumbuh cepat dan mudah menghasilkan sel dalam jumlah besar (Druvefors 2004). Hasil studi juga menyatakan bahwa khamir juga tidak berbahaya bagi konsumen, sel khamir juga mengandung vitamin, mineral, dan asam amino penting yang telah dimanfaatkan dalam makanan dan pakan (Hashem & Alamri 2009). Khamir umumnya tidak menghasilkan spora alergik atau mikotoksin (Droby & Chalutz 1994). Selain itu, beberapa spesies khamir dapat menunda pemasakan buah dengan menghambat produksi etilen (Droby et al. 1997). Mekanisme kerja mikroorganisme antagonis berkaitan dengan sekresi
4
antibiotik, kompetisi ruang dan nutrisi, produksi enzim penghancur dinding sel (Qin et al. 2004).
Perlakuan khamir tersebut lebih efektif dibandingkan dengan perlakuan konvensional dengan klorin (Chanchaichaovivat et al. 2007). Lima strain khamir (Pichia anomala Moh 93, P. anomala Moh 104, P. guilliermondii Moh 10,
Lipomyces tetrasporus Y-115 dan Metschnikowia lunata Y-1209) juga telah
diketahui dapat mengendalikan busuk diplodia pada jambu yang disebabkan oleh
Botryodiplodia theobromae (Hashem & Alamri 2009). Khamir Aureobasidium pullulans dan Rhodotorula mucilaginosa yang diisolasi dari pir dapat menekan
kejadian penyakit hingga 33% dan mengurangi pembusukan setelah 60 hari inkubasi akibat infeksi Penicillium expansum (Robiglio et al. 2011).
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk : 1) mendapatkan khamir antagonis dari buah avokad yang efektif untuk mengendalikan penyakit antraknosa pada buah avokad, 2) mengidentifikasi khamir antagonis untuk mengendalikan penyakit antraknosa pada buah avokad, dan 3) meneliti mekanisme kerja khamir antagonis dalam mengendalikan penyakit antraknosa pada buah avokad.
Hipotesis
Hipotesis penelitian ini adalah 1) penggunaan khamir antagonis efektif menghambat perkembangan penyakit antraknosa pada buah avokad selama penyimpanan, 2) antibiosis dan kemampuan kitinolitik khamir berperan dalam pengendalian hayati.
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian diharapkan dapat menemukan teknologi pengendalian hayati dengan khamir antagonis untuk mengendalikan penyakit antraknosa pada buah avokad selama penyimpanan.
5
TINJAUAN PUSTAKA
Arti Penting Penyakit Antraknosa pada Buah Avokad
Antraknosa adalah penyakit utama pascapanen yang disebabkan oleh
C. gloeosporioides yang menyerang buah-buahan di daerah tropis dan sub tropis
(Capdeville 2007), salah satunya adalah buah avokad (Nelson 2008). Penyakit ini menyerang semua bagian tanaman, kecuali akar. Bagian yang terinfeksi berwarna cokelat karat, kemudian daun, bunga, buah/cabang tanaman yang terserang akan gugur (Rukmana 1997).
Colletotrichum sp. adalah penyebab penyakit antraknosa dan memainkan
peranan penting pada ekonomi subsistem pertanian di seluruh dunia. Patogen ini menginfeksi sejumlah tanaman mulai dari monokotil hingga tanaman dikotil. Meskipun infeksi antraknosa dapat terjadi pada semua stadia tanaman, namun stadia yang harus diwaspadai adalah terjadinya infeksi pada berbagai macam buah-buahan pascapanen (Dickman 1993).
C. gloeosporioides merupakan bentuk anamorf dari Glomerella cingulata,
sedangkan G. cingulata merupakan bentuk teleomorf dari cendawan patogen ini (CAB Internasional 2007). Patogen dapat menginfeksi buah dan batang avokad, mempunyai kisaran inang yang luas, merupakan patogen parasit fakultatif, mampu hidup sebagai saprofit pada bagian tanaman yang mati dan sisa-sisa tanaman sakit dan mengkolonisasi bagian tanaman avokad yang telah mati yang terkumpul di bawah tajuk tanaman atau berada di permukaan tanah. Cendawan dapat menyebabkan beberapa masalah selama musim buah (Nelson 2008).
C. gloeosporioides menyerang avokad yang belum matang di kebun buah.
Spora yang berkecambah membentuk apresorium dan menembus kutikula tetapi hifa yang telah mencapai subkutikula menjadi quiescent dan tidak berkembang sampai buah dipanen dan matang. Perubahan fisiologi yang signifikan terjadi pada buah yang dapat mengaktivasi patogen quiescent. Terdapat empat dugaan yang dapat menjelaskan mengapa buah yang belum matang lebih tahan terhadap serangan patogen: (i) kurangnya nutrisi yang diperlukan oleh patogen, (ii) adanya komponen anti cendawan, (iii) adanya induksi komponen anti cendawan, dan (iv) kurangnya faktor yang mengaktivasi patogenesitas cendawan . Ketahanan avokad
6
yang belum matang terhadap serangan C. gloeosporioides berkaitan dengan adanya komponen anti cendawan 1-acetoxy-2-hydroxy-4-oxoheneicosa-12,15-diene (1-acetoxy-2-hydroxy-4-oxoheneicosa-12,15-diene) pada perikarp buah yang belum matang (Beno-Moualem & Prusky 2000).
Gejala Penyakit Antraknosa pada Buah Avokad
Gejala serangan penyakit antraknosa dapat muncul di seluruh bagian tanaman yang terserang. Gejala serangan pada daun adalah terjadinya bercak coklat sampai ungu dan daun cepat rontok. Gejala pada cabang dan ranting adalah terjadinya kematian ujung ranting (die back), sedangkan pada bunga adalah terjadinya perubahan warna bunga menjadi cokelat tua dan mudah rontok/berguguran (Rukmana 1997).
Gambar 1 Gejala penyakit antraknosa pada buah avokad: gejala awal (a dan b), gejala di penyimpanan (c)
Serangan cendawan C. gloeosporioides pada buah menimbulkan gejala Bercak berwarna gelap, cekung, berbentuk bulat pada kulit buah (Gambar 1) yang meluas secara cepat dan menjadi lunak, menyebabkan pembusukan (Nelson 2008). Warna gelap/coklat akibat serangan C. gloeosporioides muncul karena cendawan tersebut menghasilkan enzim selulase yang dapat menghidrolisis selulosa kulit buah sehingga kulit buah terdisintegrasi dan lunak sehingga berubah warna menjadi coklat yang dapat meluas dan akhirnya membusuk. Proses pembusukan semakin cepat ketika buah mencapai kematangan puncak (Kotzé 1978; Ippolito & Nigro 2000)
7 Ciri khas dari penyakit ini adalah terbentuknya massa spora lengket. Bercak memiliki ukuran yang bervariasi dan dapat terjadi di setiap bagian buah avokad yang dapat berkembang dan berwarna salmon. Gejala dapat muncul secara cepat selama 1 atau 2 hari terutama dalam kondisi penyimpanan hangat dan lembab. Bercak berbentuk bulat, berwarna gelap ini biasanya muncul dalam infeksi laten pada kulit buah setelah panen dan pematangan buah. Ukuran diameter Bercak bervariasi tergantung kultivar avokad dan berkisar antara millimeter sampai sentimeter (Nelson 2008).
Antraknosa dapat berkembang pada buah yang belum matang di pohon, menyertai luka yang disebabkan oleh serangga. Buah biasanya rontok karena serangan patogen sebelum pematangan buah. Gejala bercak pada cabai juga dapat terjadi pada avokad (CAB Internasional 2007).
Morfologi dan Daur Penyakit
Cendawan C. gloeosporioides mempunyai miselium berwarna putih hingga keabu-abuan, memiliki konidia yang berbentuk oval dengan ujung tumpul atau membulat, hialin, bersel satu, tidak bersekat, terbentuk dalam aservulus, dan berukuran 9–15 x 3–7 µm. Massa konidia berwarna merah muda seperti warna salmon (Gambar 2) (Rubert 1992; Dickman 1993; Semangun 2000). Konidiofor berukuran 18 x 3 µm, berbentuk silinder, hialin atau agak kecoklatan. Aservulus dangkal dengan diameter 90–270 µm, memiliki seta dengan konidiofor yang sederhana, pendek, dan tegak (Gambar 3). Colletorichum mempunyai stroma yang terdiri dari massa miselium yang membentuk aservulus (seperti bantalan), bersepta dengan panjang antara 30–90 µm (Bailey & Jeger 1992). Aservulus berlilin dan hanya dihasilkan dalam jaringan yang terinfeksi. Seta berwarna coklat tua, panjang 60–160 µm, sering bersekat 1 atau 2 dan teratur di tepi aservulus (Semangun 2000).
8
Gambar 2 Massa konidia (a) dan miselium (b) C. gloeosporioides pada media PDA (perbesaran 10 x 40)
Gambar 3 Tubuh buah C. gloeosporioides di bawah mikroskop : aservulus (a), seta (b), konidia (c) dan miselium (d) pada perbesaran 10 x 40
C. gloeosporioides merupakan cendawan yang umum terdapat di berbagai
tanaman. Cendawan ini merupakan parasit lemah yang dapat menginfeksi dan berkembang pada jaringan yang telah menjadi lemah, khususnya karena proses penuaan. Cendawan ini dapat menginfeksi melalui luka atau lentisel. Konidium jamur dipencarkan oleh angin dan air hujan. Infeksi buah banyak terjadi dari konidium yang berasal dari bercak pada daun dan tangkai daun. Pada cuaca menguntungkan, cendawan membentuk konidium. Konidium dipencarkan oleh
a b
9 percikan air hujan dan siraman karena terbentuk dalam massa spora yang lengket (CAB International 2007).
Cendawan dapat diisolasi dari jaringan tanaman tropis yang tampak sehat dan berada baik di permukaan mikroflora maupun sebagai endofit (Gambar 4). Patogen ini menimbulkan serangan berat pada kondisi kelembaban dan suhu yang tinggi. Cendawan dapat tumbuhan pada suhu rendah 4 0C, tetapi optimum pada suhu 25–29 °C. Perkecambahan spora, infeksi dan produksi askospora memerlukan kelembaban relatif mendekati 100%, namun ekspresi penyakit akan muncul pada kondisi kering karena infeksi laten atau quiescent akan aktif pada jaringan yang rusak (CAB Internasional 2007).
Gambar 4 C. gloeosporioides pada media PDA : biakan murni (a), konidia (berwarna kuning/oranye) dan miselium (berwarna putih) (b)
Kondisi iklim yang sesuai pada saat terjadinya infeksi sangat menentukan terjadinya epidemi penyakit. Penyakit antraknosa ini dapat menimbulkan kehilangan yang signifikan pada iklim hangat dan lembab (CAB Internasional 2007). Spora hanya dapat berkecambah bila ada air bebas, atau bila kelembaban nisbi udara tidak kurang dari 95%. Infeksi tidak akan terjadi bila kelembaban udara tidak kurang dari 96%. Spora tumbuh paling baik pada suhu 25–28 oC, sedang dibawah 5 oC dan di atas 40 oC spora tidak dapat berkecambah. Bailey dan Jeger (1992) menyatakan bahwa infeksi cendawan pada percobaan di rumah kaca dan laboratorium terjadi pada kelembaban lebih dari 96% pada suhu 26–31 oC (Semangun 2000).
b a
10
Gambar 5 Siklus hidup C. gloeosporioides pada avokad (Kotzé 1978) Patogen bertahan di dalam biji, sampah, dan gulma inang, dan dipencarkan melalui percikan air, aliran air, serangga atau benda lain yang menyentuh cendawan. C. gloeosporioides menyebabkan penyakit pada bagian daun, bunga dan buah (Gambar 5). Pada jaringan tua, perkembangan penyakit lebih lambat, seringkali quiescent atau tinggal sebagai cendawan endofit yang tidak berbahaya hingga kondisi fisiologi memungkinkan untuk perkembangan cendawan (Rukmana 1997).
Pengendalian Penyakit Pascapanen
Pembusukan buah-buahan dan sayuran pascapanen berasal dari infeksi yang terjadi baik antara pembungaan dan pematangan buah, atau selama penanganan panen, dan penyimpanan (Droby 2006). Infeksi dapat terjadi sebelum panen (preharvest) dan tetap bertahan sampai buah menjadi tua sampai pascapanen dan selama penyimpanan. Namun, sebagian besar infeksi terjadi melalui luka yang ditimbulkan permukaan komoditas pada saat panen, pascapanen dan pada penanganan selanjutnya. Kerugian akibat infeksi ini dapat ditangani dengan
askospora askospora berkecambah infeksi daun ranting buah aservulus konidia konidia berkecambah askospora dilepaskan Askus dengan spora
peritesium telah matang dengan askus
pembentukan peritesium
anteridium
askogonium
11 menggunakan fungisida yang diaplikasikan di lapangan atau setelah panen (Droby 2006).
Selama dekade terakhir, pengendalian penyakit komoditas hortikultura semakin sulit dilakukan (Bautista-Bañosa et al. 2006). Fungisida sintetik adalah bahan utama yang digunakan untuk mengendalikan pembusukan pascapanen (Sharma et al. 2009). Residu pestisida pada buah-buahan dan sayuran menjadi perhatian utama konsumen dalam industri buah dan sayuran. Peningkatan kesehatan dan perhatian terhadap residu pestisida pada produk segar, perkembangan strain patogen yang tahan terhadap fungisida, dan pendaftaran kembali beberapa fungisida yang lebih efektif, telah mendorong pengembangan alternatif yang lebih aman terhadap kesehatan manusia dan lingkungan (Droby 2006).
Saat ini banyak dilakukan alternatif pengendalian yang lebih aman dan aman terhadap lingkungan dalam mengendalikan pembusukan pascapanen (Sharma et al. 2009). Salah satu teknik pengendalian pascapanen yang saat ini sedang dikembangkan adalah pengendalian hayati. Strategi umum pengendalian hayati adalah penggunaan mikroorganisme hidup untuk mengendalikan mikroorganisme yang lain (Druvefors 2004). Penggunaan agen pengendali hayati perlu mempertimbangkan keamanan pangan dan penerimaan masyarakat terhadap agens pengendali hayati. Salah satu agen hayati yang digunakan untuk pengendalian penyakit pascapanen adalah khamir dan pelapis produk untuk memperpanjang masa simpan buah. Pelapis digunakan untuk memperpanjang masa simpan produk segar dan melindungi kerusakan buah dari pengaruh lingkungan yang tidak menguntungkan, misalnya serangan mikroorganisme (Sugipriatini 2009).
Penggunaan Khamir untuk Pengendalian Hayati Penyakit
Pada awal tahun 1990, berbagai mikrob antagonis dilaporkan dapat digunakan untuk mengendalikan berbagai patogen pada beberapa buah. Salah satu mikrob antagonis tersebut adalah khamir (Druvefors 2004). Khamir merupakan kelompok mikroorganisme uniseluler termasuk dalam filum Ascomycota dan Basidiomycota. Beberapa khamir dan mikroorganisme lain telah
12
dilaporkan dapat menghambat patogen tanaman, khususnya patogen yang berada di dalam buah dan sayuran, serta beberapa produk komersial (Janisiewicz & Korsten, 2002). Jones dan Prusky (2002) melaporkan bahwa beberapa khamir antagonis juga telah dilaporkan efektif untuk menghambat patogen pascapanen pada beberapa buah-buahan dan dapat digunakan sebagai agens pengendali hayati cendawan pascapanen penyebab busuk pada buah apel, grey dan blue mold yang disebabkan oleh Botrytis cinerea dan Penicillium italicum, dan pada buah jeruk (McLaughlin et al. 1990). Secara khusus, kehadiran khamir secara alami pada buah-buahan dan sayuran berpotensi sebagai antagonis penyakit pascapanen (Droby 2006). Khamir (Pichia guilliermondii strain US-7 dan Hanseniaspora
uvarum strain 138) diketahui dapat digunakan untuk mengendalikan berbagai
patogen penyebab pembusukan pada jeruk, buah pome, dan tomat (Chalutz & Wilson, 1990). Debaromyces hansenii dilaporkan dapat mengendalikan busuk buah jeruk pascapanen (Wisniewski et al. 1991) dan beberapa spesies
Cryptococcus sp. dapat digunakan untuk mengendalikan pembusukan pascapanen
pada buah apel dan pir (Roberts 1990). Keberadaan mikrob antagonis baik secara alami maupun buatan dapat dipertimbangkan sebagai alternatif penggunaan fungisida untuk mengendalikan penyakit pascapanen (Wisniewski & Wilson 1992). Keuntungan dari penggunaan khamir antagonis, dapat diisolasi dari alam, bersifat non patogenik terhadap tanaman dan binatang termasuk manusia, mudah dibiakkan, dan reproduksinya cepat (Payne & Bruce 2001). Khamir juga memiliki banyak kegunaan, biasanya tidak menghasilkan spora alergik atau mikotoksin seperti cendawan miselial. Sel khamir juga mengandung vitamin, mineral, dan asam amino penting yang telah dimanfaatkan dalam makanan dan pakan (Hashem & Alamri 2009).
Mekanisme agens pengendali hayati dalam mengendalikan patogen taget belum banyak diketahui (Janisiewicz & Korsten 2002). Khamir Debaryomyces sp. efektif menghambat perkembangan penyakit antraknosa yang disebabkan oleh
C. gloeosporioides. Debaryomyces sp. kerusakan hifa dan konidia patogen C. gloeosporioides. Penghambatan patogen C. gloeosporioides oleh Debaryomyces
sp. terjadi melalui mekanisme kompetisi dan parasitisme (Indratmi 2008). Kompetisi nutrisi diduga sebagai mode of action beberapa agens pengendali
13 hayati, seperti P. guilliermondii dalam mengendalikan Penicillium digitatum (Droby et al. 1989), Candida guilliermondii, Cryptococcus laurentii dan
Metschnikowia pulcherima dalam mengendalikan Botrytis cinerea dan Penicillium expansum (Vero et al. 2002).
Penggunaan khamir menunda pemasakan buah saat penyimpanan. Konsentrasi suspensi khamir yang digunakan di laboratorium umumnya 107 cfu/ml. Suspensi sel khamir pada konsentrasi 106 sampai 107 cfu/ml efektif menghambat perkembangan penyakit (Droby et al. 1997).
Strain tertentu dari khamir Saccharomyces cerevisiae dilaporkan dapat memproduksi toksin yang dapat membunuh strain lain dalam spesies yang sama. Beberapa toksin yang dihasilkan oleh khamir juga dilaporkan memiliki pengaruh terhadap spesies khamir lain termasuk bakteri dan cendawan (Izgu & Altinbay 1997). Droby et al. (1991) membuktikan bahwa P. guilliermondii dapat menstimulasi produksi etilen pada anggur. Etilen pada jeruk dapat menstimulasi produksi fitoaleksin (Rodov et al. 1994). Aureobasidium pullulans dan Candida
saitoana diketahui dapat menginduksi ß-1,3-glukanase, kitinase dan peroksidase
pada apel (Ippolito et al. 2000). Hal ini dapat menstimulasi mekanisme pertahanan suatu tanaman (Druvefors 2004).
Saat ini terdapat tiga khamir yang dikomersialkan sebagai produk pengendali hayati dan telah dipasarkan untuk mengendalikan pembusukan pada buah. Aspire® (Ecogen, Inc., Langhorne, Pa) dengan bahan dasar khamir
Candida oleophila digunakan untuk mengendalikan penyakit pascapanen pada
buah pome serta jeruk dengan cara penyemprotan atau pencelupan (Janisiewicz & Korsten 2002), dan telah digunakan di Amerika Serikat pada tahun 1996. Produk komersial Yield Plus® dengan Cryptococcus albidus sebagai bahan aktifnya dipasarkan di Afrika Selatan pada tahun 1997 dan digunakan untuk pengendalian hayati Botrytis sp., Penicillium sp. dan Mucor sp. pada buah apel dan pir dan masih diteliti kemungkinannya untuk digunakan pada komoditas lain. Produk terbaru Shemer® yang diregistrasi di Israel dengan bahan dasar khamir
Metschnikowia fructicola (Kurtzman & Droby 2001) diketahui efektif
15
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Balai Besar Karantina Pertanian (BBKP) Tanjung Priok Wilayah Kerja Bogor, mulai bulan Oktober 2011 sampai Februari 2012.
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah isolat C. gloeosporioides dan isolat khamir hasil isolasi dari buah avokad, buah avokad lokal dari Garut, akuades steril, media Potato Dextrose Agar (PDA), Martin Agar (MA), Yeast
Glucose Chloramphenicol (YGC), Yeast Glucose Chloramphenicol Agar
(YGCA), Kitin Agar 0.2%, Green Bean Agar (GBA), Potato Dextrose Broth (PDB), alkohol 70%, fungisida benomil, dan primer umum 18S rDNA dengan
forward primer ITS1 (5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’) dan reverse primer ITS4 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’).
Metode Isolasi C. gloeosporioides dari Buah Avokad
Isolasi C. gloeosporioides dilakukan dengan metode penanaman jaringan buah avokad yang bergejala antraknosa pada media GBA dan PDA.
Buah avokad dari lapangan dicuci dengan air steril. Buah yang bergejala dipotong pada bagian antara yang sehat dan sakit, kemudian dipotong kecil-kecil dan direndam dalam klorox (NaOCl) 1% selama 2 menit, selanjutnya dicuci dengan air steril dan ditanam pada media PDA secara aseptik. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang (27 0C –30 0C) hingga koloni cendawan tumbuh pada media. Pemurnian isolat C. gloeosporioides dilakukan dengan mengambil kultur C.
gloeosporioides dan dibiakkan lagi dalam media GBA hingga diperoleh kultur
murni. Isolat yang sudah murni disimpan dan diremajakan kembali dalam medium PDA sebelum digunakan untuk percobaan.
16
Isolasi Khamir dari Buah Avokad
Isolasi khamir dilakukan dengan metode pencucian dan pengkayaan. Metode pencucian dilakukan dengan merendam buah avokad dalam air steril sebanyak dua kali berat buah kemudian digoyang dengan kecepatan 120 rpm selama 24 jam. Air rendaman buah avokad kemudian diencerkan dengan seri pengenceran 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, dan 10-5 kemudian disebar pada media Martin Agar. Khamir yang tumbuh kemudian dimurnikan dengan mengambil koloni tunggal khamir dan menggoreskannya pada media PDA yang telah ditambah Streptomycin 2%. Isolat yang telah murni disiapkan untuk perlakuan selanjutnya.
Metode pengkayaan dilakukan dengan mengambil daging buah avokad yang telah matang sebanyak 10 g, kemudian dimasukkan dalam 90 ml media YGC dan digoyang dengan kecepatan 140 rpm selama 72 jam. Bagian bawah diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan dalam 9 ml air steril dan diencerkan berseri mulai 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5. Setiap pengenceran diambil 0.1 ml dan diratakan pada media YGCA kemudian diinkubasi selama 48 jam. Pemurnian khamir dilakukan dengan mengambil koloni tunggal khamir pada media YGCA dan disimpan pada media PDA miring.
Pengujian in Vivo Khamir terhadap Penyakit Antraknosa pada Buah Avokad
Pengujian dilakukan dengan modifikasi teknik pelukaan (Korsten et al. 2005). Buah avokad disterilkan dengan natrium hipoklorit (NaOCl) 1% selama 2 menit kemudian dicuci 2 kali dengan akuades steril dan dikeringanginkan. Buah avokad yang telah disterilkan dicelupkan dalam suspensi khamir pada konsentrasi 106 sel/ml dan 107 sel/ml yang telah ditambah 1% Tween 20 dan dikeringanginkan. Inokulasi cendawan C. gloeosporioides konsentrasi 107 konidia/ml dilakukan dengan meneteskan 30 µl suspensi C. gloeosporioides tersebut pada buah dengan 3 (tiga) titik inokulasi pada bagian ujung, tengah dan pangkal buah avokad. Sebagai pembanding, buah avokad yang telah disterilkan dicelupkan dalam larutan fungisida benomil 0.5% dan dikeringanginkan kemudian diinokulasi C. gloeosporioides 107 konidia/ml dengan meneteskan 30 µl suspensi
17
C. gloeosporioides tersebut pada buah dengan 3 (tiga) titik inokulasi pada bagian
ujung, tengah dan pangkal buah.
Seluruh perlakuan diulang tiga kali. Kejadian penyakit diamati dan dihitung setiap hari selama 7 hari pengamatan dengan rumus sebagai berikut :
KP =
KP = Kejadian penyakit
= Jumlah titik inokulasi yang menunjukkan gejala sakit = Jumlah titik inokulasi yang diamati
Uji Antibiosis in Vitro Khamir terhadap C. gloeosporioides
Khamir digoreskan pada media PDA tepat di tengah petridish (Ø 9 mm) secara tegak lurus sebanyak 1 lup inokulasi. Biakan murni C. gloeosporioides berumur 14 hari yang diambil dengan bor gabus (Ø 5 mm), diletakkan pada sisi kanan dan kiri goresan khamir dengan jarak + 3 cm kemudian diinkubasikan pada suhu kamar. Pengamatan dilakukan dengan mengukur lebar zona hambat khamir terhadap C. gloeosporioides setiap hari sampai hari ke-15 inkubasi (Gambar 6).
Gambar 6 Uji antibiosis in vitro khamir terhadap C. gloeosporioides Uji Kemampuan Kitinolitik
Khamir berumur 3–5 hari digoreskan pada media kitin agar 0.2 % secara tegak lurus sebanyak 1 lup inokulasi tepat di tengah petridish (Ø 9 mm) dan Isolat khamir Digoreskan
transversal sebanyak
1 lup inokulasi
Letakkan biakan murni
C. gloeosporioides
Ukur dan hitung lebar zona hambat khamir terhadap pertumbuhan patogen (r1 + r2) 3 cm
18
diinkubasikan pada suhu ruang. Pengamatan dilakukan setiap hari selama 7 hari terhadap zona bening yang terbentuk pada tepi koloni khamir (Gambar 7).
Gambar 7 Uji kemampuan kitinolitik khamir pada media kitin agar 0.2% Identifikasi Khamir
Empat isolat khamir yang dipilih diidentifikasi secara morfologi dan molekuler dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan primer umum 18S rDNA dengan forward primer ITS1 (5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’) dan reverse primer ITS4 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-G-3’) (Mirhendi et al. 2007).
a). Ekstraksi DNA khamir
Biakan khamir pada media PDB diambil sebanyak 1 ml, disentrifugasi dengan kecepatan 15.000 x g selama 5 menit kemudian ditambah bufer Harju sebanyak 200 µl dan divortex selama 1 menit. Setelah itu, didinginkan dalam es selama 2 menit kemudian diinkubasi pada suhu 95 0C selama 1 menit dan didinginkan kembali dalam es selama 2 menit kemudian diinkubasi pada suhu 95 0C selama 1 menit. Selanjutnya divortex selama 30 detik, ditambahkankloroform sebanyak 200 µl dan divortex selama 2 menit kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 15.000 x g selama 5 menit, ambil supernatan kemudian tambahkan 400 µl etanol dingin dan diinkubasi dalam suhu -20 0C selama 30 menit. Setelah itu, sentrifugasi dengan kecepatan 15.000 x g selama 8 menit. Pelet kemudian diambil dan ditambah dengan 500 µl etanol dingin kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 15.000 x g selama 8 menit. Pelet yang terbentuk diambil dan disuspensikan dalam 30 µl ddH2O (nuclease free water) (Harju et al. 2004).
Isolat khamir Media kitin agar 0.2%
Khamir digoreskan secara tegak lurus sebanyak 1 lup inokulasi
Pengamatan zona bening yang terbentuk pada tepi koloni khamir setiap hari selama 7 hari pengamatan
19
b). Polymerase Chain Reaction (PCR)
Sebanyak 2 µl larutan DNA diamplifikasi dengan volume reaksi 25 µl yang terdiri atas 12.5 µl master mix (Qiagen), 1 µl forward primer (ITS1), 1 µl
reverse primer (ITS4), dan 8.5 µl dH2O. Amplifikasi menggunakan primer 18S rDNA yaitu pasangan forward primer ITS1 (5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’) dan reverse primer ITS4 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’). Amplifikasi dilakukan dengan mesin PCR Fast Thermal Cycler
Gene Amp PCR System 9800 (PE Applied Biosystems, Norwalk, USA)
dengan siklus denaturasi awal 95 0C selama 5 menit, denaturasi 95 0C selama 45 detik, annealing 55 0C selama 30 detik dan extension 72 0C selama 1 menit 30 detik. Langkah ke 2–4 diulang sebanyak 35 siklus dan final extension 72 0
C selama 7 menit. Elektroforesis dilakukan dalam 1.5% w/v gel agarose (TopVision, Frementas) dengan marker GeneRuler 50 bp DNA Ladder (Fermentas) dan diwarnai dengan ethidium bromide.
Hasil PCR disikuen di PT First Base Genetica Science menggunakan pasangan primer ITS1 dan ITS4. Analisis homologi nukleotida khamir menggunakan BLAST (Blast Local Alignment Search Tool) pada situs National
Center for Biotechnology Information (NCBI) di www.blast.ncbi.nlm.nih.gov.
Analisis Data
Seluruh pengujian dilakukan dengan menggunakan rancangan acak lengkap dengan 5 ulangan. Data yang diperoleh dianalisis dengan Minitab 16. Pengaruh perlakuan dianalisis dengan sidik ragam dan dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Terkecil (Fisher’s test) dengan tingkat kepercayaan 95%.
21
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi C. gloeosporioides dari Buah Avokad
Isolasi C. gloeosporioides diambil dari bagian buah yang menunjukkan gejala antraknosa (Gambar 8). Hasil isolasi cendawan dari buah avokad pada media PDA, diperoleh kultur cendawan C. gloeosporioides dengan ciri-ciri morfologi miselium berwarna putih hingga putih keabu-abuan, massa konidia kebasah-basahan berwarna seperti warna ikan salmon (Gambar 9).
Gambar 8 Gejala awal serangan antraknosa pada buah avokad
Gambar 9 Morfologi C. gloeosporioides pada media PDA: biakan
C. gloeosporioides (a), massa konidia (b dan c)
Selain itu, ujung konidia membulat, hialin, bersel satu, memiliki seta pendek dan konidiofor yang tegak. Menurut CAB Internasional (2007), ukuran konidia
C. gloeosporioides dalam media buatan sangat bervariasi. Dalam media PDA,
konidia berukuran 6–9 x 1–4 µm (Gambar 10). Ukuran ini lebih kecil apabila b
c a
22
dibandingkan dengan ukuran konidia C. gloeosporioides yang diambil langsung dari buah avokad yang terserang antraknosa dari lapangan yang dapat mencapai 10–15 x 5–7 µm. Hal ini mungkin terjadi karena perbedaan nutrisi yang tersedia secara alami pada inang dan ketersediaan nutrisi yang ada pada media buatan. Seta berwarna coklat tua dan berada di tepi aservulus.
Gambar 10 Konidia C. gloeosporioides Isolasi Khamir dari Buah Avokad
Hasil isolasi khamir dari tiga sampel buah avokad dengan menggunakan media YGC diperoleh 23 isolat khamir yang memiliki koloni berbeda pada media YGCA. Seluruh isolat khamir ini selanjutnya diuji kemampuannya dalam menekan kejadian penyakit antraknosa pada buah avokad dan menunjukkan tingkat hambatan relatif tinggi terhadap perkembangan C. gloeosporioides pada buah avokad. Penggunaan media YGC dilakukan untuk pengkayaan khamir yang ada dalam buahsehingga lebih banyak khamir yang dapat diisolasi dari buah avokad.
Strategi yang efektif untuk mencegah penyakit pascapanen yang disebabkan oleh keberadaan cendawan patogen di lingkungan tersebut dilakukan dengan memilih dan menggunakan mikroorganisme antagonis yang diisolasi dari lingkungan yang sama dimana buah disimpan. Hal ini disebabkan karena adanya keterbatasan kemampuan suatu agens pengendali hayati untuk pascapanen untuk beradaptasi dengan kondisi buah dan lingkungan penyimpanan (Robiglio et al.
23 2011). Berdasarkan hal tersebut, maka khamir diisolasi secara langsung dari buah avokad untuk mendapatkan khamir antagonis sudah beradaptasi dengan kondisi buah dan lingkungan sehingga diperoleh khamir yang efektif mengendalikan penyakit antraknosa pada buah avokad.
Beberapa strain khamir menunjukkan aktivitas antagonis yang kuat terhadap cendawan di lapangan dan penyimpanan. Khamir memiliki potensi besar untuk digunakan sebagai agen pengendali hayati terhadap cendawan penyebab penyakit tumbuhan, khususnya dalam menghambat cendawan penyebab busuk buah pascapanen, karena khamir adalah kompetitor yang baik dalam mendapatkan ruang dan nutrisi. Saat ini, terdapat tantangan untuk mengetahui bagaimana khamir bekerja di lingkungan pertanian, atau menemukan bagaimana mikroorganisme ini dapat membantu dalam proses produksi, serta mengetahui perannya menjaga keseimbangan ekosistem dalam mengurangi penggunaan fungisida (Rosa-Magri et al. 2011). Khamir memiliki sifat untuk dapat digunakan sebagai alternatif fungisida sintetik. Selain tidak memproduksi mikotoksin atau spora alergik, pada umumnya khamir tidak bersifat patogenik terhadap manusia dan binatang dan beberapa spesies khamir mampu hidup dengan jumlah air dan oksigen yang rendah (Coda et al. 2011).
Sampai saat ini kerugian hasil akibat penyakit antraknosa diatasi dengan menggunakan fungisida sintetik sebagai cara perlindungan tanaman yang paling umum dijumpai, baik sebagai tindakan preventif maupun kuratif. Akibat intensifnya penggunaaan fungisida dilaporkan beberapa jenis patogen telah resisten tehadap benomil, kuintozen, dan blastisidins, serta terdapatnya residu bahan kimia pada hasil pertanian (Indratmi 2008). Kecenderungan dunia saat ini mulai beralih terhadap pengurangan residu pestisida pada buah dan sayuran. Dengan adanya kecenderungan ini, maka upaya pengendalian secara fisik dan biologi diteliti sebagai suatu alternatif pengendalian yang lebih aman daripada menggunakan fungisida. Penggunaan mikroorganisme antagonis untuk pengendalian penyakit pascapanen mendapatkan perhatian khusus dan diteliti lebih jauh (Droby 2006) serta telah berhasil digunakan untuk mengendalian penyakit baik sebelum panen maupun pascapanen (Janisiewicz & Korsten 2002).
24
Pengujian in Vivo Khamir terhadap Penyakit Antraknosa
pada Buah Avokad
Pengujian in vivo dilakukan untuk mengetahui kemampuan khamir hasil isolasi dari buah avokad dalam menekan kejadian penyakit antraknosa pada buah avokad yang diinokulasi dengan C. gloeosporioides. Selain itu, pengujian in vivo dilakukan untuk mengetahui tingkat hambatan relatif khamir terhadap perkembangan C. gloeosporioides pada buah avokad.
Tabel 2 Kejadian penyakit antraknosa pada buah avokad yang diinokulasi
C. gloeosporioides dan diberi perlakuan dengan khamir
Isolat Khamir
Kejadian Penyakit (KP) Antraknosa pada Konsentrasi Khamir **) 106 sel/ml *) 107 sel/ml *) A11 100.00 a 100.00 a A12 100.00 a 100.00 a A13 100.00 a 100.00 a A14 100.00 a 100.00 a A15 100.00 a 100.00 a A16 100.00 a 89.00 ab A17 100.00 a 100.00 a A21 89.00 ab 89.00 ab A22 33.33 cd 55.33 abc A23 22.33 cd 43.33 bcd A24 78.00 abc 22.00 cd A25 0.00 d 66.67 abc A26 11.00 d 89.00 ab A27 44.33 bcd 33.33 cd A28 22.33 cd 22.33 cd A31 44.33 bcd 66.67 abc A32 0.00 d 33.33 cd A33 0.00 d 0.00 d A34 11.00 d 0.00 d A35 33.33 cd 0.00 d A36 33.33 cd 0.00 d A37 22.33 cd 0.00 d A38 11.00 d 33.33 cd Fungisida Benomil 0.00 d 0.00 d *)
Nilai yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata; **) Kejadian penyakit (KP) ditentukan pada 7 HSI
25 Tabel 2 menunjukkan bahwa pada konsentrasi sel khamir 106 sel/ml, terdapat 14 isolat khamir yang efektif mengurangi kejadian penyakit antraknosa pada buah avokad yang diinokulasi C. gloeosporioides, yaitu isolat A22, A23, A25, A26. A27, A28, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38. Hasil pengamatan kejadian penyakit antraknosa pada buah yang dicelupkan dalam suspensi khamir 107 sel/ml menunjukkan terdapat 11 isolat khamir yang efektif mengurangi kejadian penyakit antraknosa pada buah avokad yang diinokulasi C.
gloeosporioides, yaitu isolat A23, A24, A27, A28, A32, A33, A34, A35, A36,
A37, A38.
Tabel 3 Hasil uji in vivo terhadap diameter (Ø) bercak inokulasi
C. gloeosporioides dan tingkat hambatan relatif (THR) khamir dalam
menghambat perkembangan penyakit antraknosa pada buah avokad Konsentrasi Khamir
Perlakuan 106 sel/ml 107 sel/ml
Ø bercak (cm) THR (%) Ø bercak (cm) THR (%)
A11 2.05 abc 13.45 ef 1.80 abcd 14.29 defg
A12 1.51 bcd 21.36 def 1.74 abcd 19.03 defg A13 1.97 abc 5.32 ef 1.71 abcde 3.94 fg
A14 2.51 a 0.00 f 2.40 a 0.00 g
A15 2.21 ab 5.60 ef 1.78 abcd 8.82 efg
A16 1.82 bc 12.46 ef 1.35 bcdef 29.63 defg
A17 2.08 abc 9.24 ef 1.09 ab 0.00 g
A21 1.57 bc 24.28 cdef 1.87 abc 14.78 defg
A22 0.54 ef 77.17 ab 0.84 efghij 51.35 bcd
A23 0.39 ef 83.47 ab 1.17 cdefg 44.54 bcdef
A24 1.21 cde 24.42 cdef 0.09 ij 94.41 a
A25 0.00 f 100.00 a 1.08 cdefgh 35.43 defg
A26 0.02 f 95.76 ab 0.75 fghij 48.29 bcde
A27 0.65 def 49.80 bcde 0.00 j 100.00 a
A28 0.38 ef 66.67 abcd 0.11 ij 94.20 a
A31 0.52 ef 73.07 ab 0.97 defghi 39.78 cdefg
A32 0.00 f 100.00 a 0.44 ghij 81.51 ab A33 0.00 f 100.00 a 0.44 ghij 81.51 ab A34 0.13 f 92.75 ab 0.00 j 100.00 a A35 0.48 ef 66.67 abcd 0.00 j 83.51 ab A36 0.34 ef 69.40 abc 0.00 j 100.00 a A37 0.13 f 75.76 ab 0.00 j 100.00 a
A38 0.08 f 95.83 ab 0.26 hij 80.02 abc
Tanpa perlakuan 1.50 bc 0.00 f 1.71 abcde 0.00 g Fungisida Benomil 0.00 f 100.00 a 0.00 j 100.00 a Nilai yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata
26
Hasil pengukuran terhadap THR khamir terhadap perkembangan penyakit antraknosa pada uji in vivo diketahui bahwa pada konsentrasi sel khamir 106 sel/ml, terdapat 13 isolat khamir yang memiliki THR tidak berbeda nyata dengan fungisida yaitu A33, A32, A25, A38, A26, A34, A23, A22, A37, A31, A36, A35, dan A28 dengan nilai THR sebesar 66.67 % sampai 100%. Hasil pengukuran THR terhadap isolat khamir pada konsentrasi 107 sel/ml, terdapat 10 isolat khamir yang memiliki THR tidak berbeda nyata dengan fungisida yaitu isolat A37, A36, A34, A27, A24, A28, A35, A33, A32, dan A38 dengan nilai THR sebesar 80.02% sampai 100% (Tabel 3).
Tabel 2 dan Tabel 3 menunjukkan bahwa 8 (delapan) isolat khamir hasil isolasi dari buah avokad efektif dalam menekan kejadian penyakit antraknosa pada buah avokad dan memberikan tingkat hambatan relatif yang tidak berbeda nyata dengan fungisida benomil. Delapan isolat khamir yang berpotensi untuk dapat digunakan sebagai agens pengendali hayati C. gloeosporioides di penyimpanan adalah isolat A28, A32, A33, A34, A35, A36, A37 dan A38. Namun, hanya 4 isolat yang dikarakterisasi lebih lanjut yaitu isolat A33, A35, A36 dan A37.
Khamir sesuai digunakan sebagai agens pengendali hayati penyakit pascapanen pada buah dan sayuran karena cepat mengkolonisasi dan bertahan pada permukaan buah dalam waktu yang cukup lama pada berbagai kondisi, mampu berkompetisi penggunaan nutrisi dengan patogen (Jones & Prusky 2002). Selain itu, kebutuhan nutrisi khamir sederhana, dapat tumbuh cepat dengan menghasilkan sel dalam jumlah besar (Druvefors 2004), tidak menghasilkan spora alergik atau mikotoksin, serta menghasilkan vitamin, mineral, dan asam nukleat penting yang digunakan dalam makanan (Hashem & Alamri 2009). Aspek psikososial juga merupakan salah satu pertimbangan pemilihan khamir sebagai agens pengendali hayati pada komoditas pascapanen. Pada umumnya masyarakat yang merasa lebih aman apabila suatu komoditas diberi perlakuan dengan khamir daripada dengan menggunakan bakteri atau virus. Selain itu, khamir juga memiliki kemampuan hidup yang sangat baik dalam lingkungan penyimpanan karena khamir menghasilkan spora sebagai struktur tahan.
27 Salah satu faktor yang menentukan daya saing suatu produk dalam perdagangan bebas yaitu adanya jaminan mutu dan keamanan (safety) pangan bagi konsumen dalam mengkonsumsi/menggunakan produk yang bersangkutan (Mentan 2008). Selain itu, dengan ditetapkannya batas maksimum residu produk pertanian khususnya benomil pada avokad sebesar 0.5 mg/kg (Menkes & Mentan 1996) serta peningkatan kesehatan dan perhatian lingkungan mengenai limbah pestisida dan residunya pada produk segar mendorong pengembangan metode pengendalian yang lebih efektif dan aman terhadap manusia dan lingkungan (Droby 2006).
Keberadaan mikroba filoplan memberikan peranan terhadap besarnya kejadian timbulnya infeksi oleh patogen tanaman. Tanaman dengan populasi mikroba filosfer yang rendah diduga lebih rentan terhadap serangan patogen. Tanaman dengan komplek populasi mikroba filosfer yang tinggi diduga dapat lebih tahan atau terlindungi dari serangan patogen. Hal ini disebabkan karena mikroba filosfer epifit maupun endofit memberikan barier alami terhadap serangan patogen. Selain itu diantara mikroba tersebut sangat mungkin bertindak sebagai kompetitor ataupun bersifat antagonis terhadap patogen sehingga menguntungkan tanaman (Indratmi 2008). Jeffries dan Koomen (1992) menyatakan bahwa metode pengendalian dengan mikroorganisme antagonis terhadap Colletotrichum sp. bertujuan untuk mengurangi sejumlah infeksi awal.
Gambar 11 Hasil inokulasi C. gloeosporioides pada buah avokad (4 hari setelah inokulasi: perlakuan benomil (a), tanpa perlakuan (b), perlakuan khamir isolat A12(c), perlakuan khamir isolat A31(d), perlakuan khamir isolat A33 (e), isolat A35 (f), isolat A36 (g), isolat A37 (h)
a b c d
28
Gambar 12 Hasil inokulasi C. gloeosporioides pada buah avokad (5 hari setelah inokulasi: perlakuan benomil (a), tanpa perlakuan (b), perlakuan khamir isolat A12(c), perlakuan khamir isolat A31(d), perlakuan khamir isolat A33 (e), isolat A35 (f), isolat A36 (g), isolat A37 (h) Gambar 11 dan 12 menunjukkan perkembangan penyakit antraknosa pada buah avokad yang diinokulasi C. gloeosporioides pada konsentrasi 107 konidia/ml. Perkembangan bercak antraknosa pada buah avokad yang diberi perlakuan dengan fungisida benomil tidak terlihat pada titik inokulasi C.
gloeosporioides, sedangkan pada buah avokad yang tidak diberi perlakuan terlihat
muncul bercak yang menandai perkembangan penyakit antraknosa pada buah avokad pada titik inokulasi. Bercak antraknosa juga tidak terlihat pada buah avokad yang diberi perlakuan dengan khamir A33, A35, A36, dan A37, sedangkan pada buah avokad yang diberi perlakuan dengan khamir lainnya tampak bergejala dan ditumbuhi konidia cendawan C. gloeosporioides pada titik inokulasi. Hal ini menunjukkan bahwa keempat isolat khamir tersebut efektif dalam menghambat perkembangan penyakit antraknosa pada buah avokad.
Uji Antibiosis in Vitro Khamir terhadap C. gloeosporioides
Pengamatan hasil uji antibiosis secara in vitro menunjukkan bahwa hingga hari ke-15 tidak terjadi aktivitas antibiosis khamir terhadap C. gloeosporioides. Hal ini ditunjukkan dengan tidak adanya zona hambatan khamir terhadap perkembangan C. gloeosporioides pada media PDA (Gambar 13). Keadaan ini membuktikan bahwa mekanisme kerja dari keempat isolat khamir dalam menekan pertumbuhan cendawan C. gloeosporioides bukan merupakan antibiosis.
a b c d
29
Gambar 13 Uji antibiosis in vitro khamir (a) terhadap C. gloeosporioides (b) pada media PDA
Sebagian potensi pengendalian yang dikembangkan mengarah pada penentuan mekanisme antagonisme antara agens pengendali hayati dengan patogen target. Mekanisme penghambatan ini penting diketahui karena berkaitan dengan efektivitas dan efisiensi penerapan agens pengendali hayati selanjutnya. Kejadian antagonisme dapat terjadi karena adanya kontak langsung antara agens pengendali biologi dengan patogen, maupun antara zat/senyawa yang dihasilkan oleh agens pengendali hayati berupa metabolit sekunder antimikroba dengan patogen (Indratmi 2008). Tingginya efisiensi khamir sebagai agens pengendali hayati karena daya adaptasi khamir yang tinggi pada berbagai lingkungan serta kondisi nutrisi yang berbeda, kemampuannya tumbuh pada suhu yang rendah, dan kemampuannya untuk menutup luka (Robiglio et al. 2011).
Uji Kemampuan Kitinolitik
Hasil uji kemampuan kitinolitik khamir selama tujuh hari pengamatan menunjukkan bahwa seluruh isolat khamir hasil isolasi dari buah avokad tidak melakukan aktivitas kitinolitik. Hal ini ditunjukkan dengan tidak adanya zona bening di sekitar isolat khamir yang digoreskan secara tegak lurus pada media kitin agar 0.2% sebagai tanda terjadinya aktivitas khamir menguraikan kitin (Gambar 14).
a
