PRODUKSI ASAM SITRAT DENGAN METODE FERMENTASI OLEH Aspergillus Niger
I. TUJUAN PRAKTIKUM
- Mengetahui teknik peremajaan mikroorganisme - Mengetahui cara memproduksi asam sitrat
- Menghitung konsentrasi asam sitrat yang dihasilkan II. PERINCIAN KERJA
- Melakukan peremajaan mirkroorganisme - Membuat media starter
- Membuat media produksi - Menghitung kadar produk III. ALAT DAN BAHAN
A. Alat
• Gelas Kimia
• Erlenmeyer
• Pengaduk
• Hot Plate
• Spatula
• Labu Semprot
• Corong
• Autoklaf
• Shaker Incubator
• Neraca Analitik
• Tutup Erlenmeyer B. Bahan
• Tauge
• Gula pasir (sukrosa)
• KH2PO4
• NH4NO3
• FeSO4.7H2O
• Pepton
• Aquadest
• Ca(OH)2
• Kultur murni Aspergillus niger L-51
• Aluminium foil
• Kapas
• Kain kasa IV. LANDASAN TEORI
Perekonomian Indonesia saat ini ditunjang oleh salah satu bidang yaitu Industri bioteknologi. Bioteknologi didefinisikan sebagai suatu bidang penerapan biosains dan teknologi yang menyangkut penerapan praktis organism hidup atau komponen subselulernya pada industri jasa dan manufaktur serta pengelolaan lingkungan bioteknologi memanfaatkan bakteri, ragi, alga, sel tumbuhan atau sel jaringan hewan yang dibiakkan sebagai konsituen berbagai proses.
Teknologi fermentasi sebagian besar merupakan teknologi yang menggunakan mikroorganisme baik secara seluler maupun subseluler untuk produk makanan dan minuman seperti keju yogurt minuman alkohol asam- asam organik acar sosis kecap dan lain-lain. Asam sitrat merupakan padatan kering atau putih dengan rumus kimia C6H8O7 dan memiliki berat molekul 192,12. Senyawa ini terdapat sebagai konstituen alami dalam buah-buahan, seperti jeruk, nanas, apel dan anggur. Asam sitrat untuk pertama kalinya diisolasi dari sari buah jeruk oleh pada tahun 1784.
Asam sitrat yang diperoleh dengan ekstraksi ini disebut sebagai “asam sitrat alami”. Pada tahun 1880, Grimoux dan aadm menemukan cara
pembuatan asam sitrat secara sintesa kimia. Jalan reaksinya didasarkan pada reaksi antara gliserol derivate 1,3-dikloroaseton dengan sianida.
Wehmer pada tahun 1893, pertama kali mendiskripsikan produksi asam sitrat dengan proses fermentasi kapang yaitu Citromyces pfefferianus dan Citromyces glaber dari larutan sukrosa yang mengandung kalsium karbonat. Curie pada tahun 1917 menyatakan bahwa sejumlah strain Aspergillus niger memiliki kemampuan produksi paling baik di dalam fermentasi asam sitrat. Sejak ditemukannya cara fermentasi asam sitrat dari larutan-larutan yang mengandung gula, peranan dari asam sitrat alami semakin menurun (tjokroadikoesoemo, P.S, “HFS dan industri ubi kayu lainnya”. PT. Gramedia Jakarta 1993 hal 160)
Pembentukan asam sitrat di dalam fermentasi larutan gula didasarkan pada teori bahwa asam piruvat yang terbentuk dari glukosa dapat dihasilkan asetil –coA yang di dalam kondensasi dengan asam oksaloasetat
menghasilkan asam sitrat (siklus krebs). Proses fermentasi asam sitrat diterapkan secara besar-besaran untuk pertama kalinya oleh negara jerman pada awal abad ke-20 ini. Dewasa ini hampir 90% dari seluruh produksi asam sitrat di Amerika serikat dihasilkan dengan cara fermentasi.(sri
kumaningsih,1995). Dengan mendirikan pabrik asam sitrat ini diharapkan dapat meningkatkan pemanfaatan bahan yang ada dan diharapkan pula ketergantungan terhadap luar negeri dapat berkurang.
A. Sejarah Asam Sitrat
Asam Sitrat diyakini ditemukan oleh alkimiawan Arab-Yemen (kelahiran Iran) yang hidup pada abad ke-8, Jabir Ibnu Hayyan. Pada zaman pertengahan, para ilmuwan Eropa membahas sifat asam sari buah lemon dan limau; hal tersebut tercatat dalam Ensiklopedia Speculum Majus (Cermin Agung) dari abad ke-13 yang dikumpulkan oleh Vincent dari Beauvais. Aspergillus niger dapat menghasilkan Asam Sitrat secara efisien, dan perusahaan kimia Pfizer memulai produksi Asam Sitrat skala industri dengan cara tersebut dua tahun kemudian. (Wikipedia. 2008) Di alam, Asam Sitrat tersebar luas sebagai bahan penyusun rasa dari berbagai macam buah-buahan (sitrun, nenas, pear, dan lain-lain). Asam Sitrat terdapat pada berbagai jenis buah dan sayuran, namun ditemukan pada konsentrasi tinggi, yang dapat mencapai 8 % bobot kering, pada jeruk lemon dan limau (misalnya jeruk nipis dan jeruk purut ). Karena sifat- sifatnya yang tidak beracun, dapat mengikat logam-logam berat (besi maupun bukan besi), dan dapat menimbulkan rasa yang menarik, Asam Sitrat banyak dimanfaatkan di dalam industri pengolahan alkyd resin.
Asam Sitrat alami juga banyak diproduksi di Sisilia, India Barat,
Kalifornia, Hawaii, dan di berbagai wilayah lainnya. Produksi Asam Sitrat dengan proses fermentasi diterapkan secara besar-besaran dalam skala industri oleh Jerman pada awal abad ke-20 dan sekarang hampir 90% dari seluruh produksi Asam Sitrat di Amerika Serikat dihasilkan dengan cara fermentasi.
B. Struktur dan Sifat-sifat Asam Sitrat
• Struktur Kimia Asam Sitrat (C6H8O7)
Rumus kimia Asam Sitrat adalah C6H8O7 atau CH2(COOH)- OH(COOH)-CH2 (COOH), struktur asam ini tercermin pada nama IUPAC-nya, asam 2-hidroksi-1,2,3-propanatri karboksilat. Keasaman Asam Sitrat didapatkan dari tiga gugus karboksil COOH yang dapat melepas proton dalam larutan. Jika hal ini terjadi, ion yang dihasilkan adalah ion sitrat.
• Sifat-sifat Asam Sitrat Sifat Fisika
1. Berat molekul : 192 gr/mol 2. Spesific gravity : 1,54 (20°C) 3. Titik lebur : 153°C
4. Titik didih : 175°C
5. Kelarutan dalam air : 207,7 gr/100 ml (25°C)
6. Pada titik didihnya asam sitrat terurai (terdekomposisi).
7. Berbentuk kristal berwarna putih, tidak berbau, dan memiliki rasa asam.
Sifat Kimia
1. Kontak langsung (paparan) terhadap Asam Sitrat kering atau larutan dapat menyebabkan iritasi kulit dan mata.
2. Mampu mengikat ion-ion logam sehingga dapat digunakan sebagai pengawet dan penghilang kesadahan dalam air.
3. Keasaman Asam Sitrat didapatkan dari tiga gugus karboksil -COOH yang dapat melepas proton dalam larutan.
4. Asam Sitrat dapat berupa kristal anhidrat yang bebas air atau berupa kristal monohidrat yang mengandung satu molekul air untuk setiap molekulnya.
5. Bentuk anhidrat Asam Sitrat mengkristal dalam air panas, sedangkan bentuk monohidrat didapatkan dari kristalisasi Asam Sitrat dalam air dingin.
6. Bentuk monohidrat Asam Sitrat dapat diubah menjadi bentuk anhidrat dengan pemanasan pada suhu 70-75°C.
7. Jika dipanaskan di atas suhu 175°C akan terurai (terdekomposisi) dengan melepaskan karbon dioksida (CO2) dan air (H2O).
C. Proses Pembentukan Asam Sitrat
• Bahan Baku Pembuatan Asam Sitrat
Mikroorganisme : Aspergillus niger berumur 5 hari.
1. Medium propagasi untuk inokulum terdiri dari:
− Gula pasir 15 gram
− Ekstrak tauge 20% (b/v) 11 ml
− (NH4)2SO4 450 mg
− KH2PO4 225 mg
Semuanya bahan kemudian dilarutkan dalam 100 ml akuades, pH 6,0
2. Medium fermentasi terdiri dari:
− Gula pasir 15% (b/v)
− (NH4)2SO4 0,6% (b/v)
− KH2PO4 0,3% (b/v) pH medium fermentasi 6,0 3. Kondisi fermentasi :
− Suhu : 29oC
− Agitasi 150 rpm
−
Lama 5 hari4. Sumber karbon dalam proses fermentasi
Pada proses fermentasi ini, sumber gula yang digunakan adalah sukrosa. Sukrosa akan dipecah menjadi fruktosa dan glukosa. Menurut Kubicek dan Rohr (1989) sukrosa baik untuk dijadikan sebagai sumber glukosa oleh A. niger karena memiliki ikatan intervase mycelium ekstraselular yang kuat dan aktif pada pH rendah sehingga hidrolisis sukrosa relatif lebih cepat. Gupta et al. (1976), Hossain et al. (1984) dan Xu et al. (1989) melaporkan keunggulan penggunaan sukrosa dari pada glukosa dan fruktosa pada proses fermentasi asam sitrat.
Alat yang digunakan adalah spektrofotometer, tabung reaksi, gelas ukur, timbangan, vortex, erlenmeyer, labu ukur, pipet, kertas pH, shaker, autoklaf, kertas saring, oven, alat titrasi dan alat vakum.
D. Kegunaan Asam Sitrat
Penggunaan utama Asam Sitrat saat ini adalah sebagai zat pemberi cita rasa dan pengawet makanan dan minuman, terutama minuman ringan.
Kode Asam Sitrat sebagai zat aditif makanan (E number) adalah E330.
Sifat sitrat sebagai larutan penyangga digunakan sebagai pengendali pH dalam larutan pembersih dalam rumah tangga. Kemampuan Asam Sitrat untuk mengikat ion-ion logam menjadikannya berguna sebagai bahan sabun dan deterjen. Dengan mengikat ion-ion logam pada air sadah, Asam Sitrat akan memungkinkan sabun dan deterjen membentuk busa dan berfungsi dengan baik tanpa penambahan zat penghilang kesadahan.
Asam Sitrat juga digunakan untuk memulihkan bahan penukar ion yang digunakan pada alat penghilang kesadahan dengan menghilangkan ion-ion logam yang terakumulasi pada bahan penukar ion tersebut sebagai
kompleks sitrat. Asam Sitrat dapat pula ditambahkan pada es krim untuk menjaga terpisahnya gelembung-gelembung lemak, dan dalam resep makanan Asam Sitrat dapat digunakan sebagai pengganti sari jeruk. Asam Sitrat dikategorikan aman digunakan pada makanan oleh semua badan pengawasan makanan nasional dan internasional utama. (Wikipedia. 2008) E. Mikroba yang Berperan dalam Pembentukan Asam Sitrat
1. Aspergillus Niger
Aspergilus niger merupakan fungi dari filum ascomycetes yang berfilamen, mempunyai hifa berseptat, dan dapat ditemukan melimpah di alam. Fungi ini biasanya diisolasi dari tanah, sisa tumbuhan, dan udara di dalam ruangan. Koloninya berwarna putih pada Agar Dekstrosa Kentang (PDA) 25 °C dan berubah menjadi hitam ketika konidia dibentuk. Kepala konidia dari A. niger berwarna hitam, bulat, cenderung memisah menjadi bagian-bagian yang lebih longgar seiring dengan bertambahnya umur.
a. Habitat Aspergillus Niger
A. niger dapat tumbuh optimum pada suhu 35-37 °C, dengan suhu minimum 6-8 °C, dan suhu maksimum 45-47 °C. Selain itu, dalam proses pertumbuhannya fungi ini memerlukan oksigen yang cukup (aerobik). A. niger memiliki warna dasar berwarna putih atau kuning dengan lapisan konidiospora tebal berwarna coklat gelap sampai hitam.
b. Metabolisme Aspergillus Niger
Dalam metabolismenya A. niger dapat menghasilkan asam sitrat sehinga fungi ini banyak digunakan sebagai model fermentasi karena fungi ini tidak menghasilkan mikotoksin sehingga tidak membahayakan. A. niger dapat tumbuh dengan cepat, oleh karena itu A. niger banyak digunakan secara komersial dalam produksi asam sitrat, asam glukonat, dan pembuatan berapa enzim seperti amilase, pektinase, amiloglukosidase, dan selulase.
Selain itu, A. niger juga menghasilkan gallic acid yang merupakan senyawa fenolik yang biasa digunakan dalam industri farmasi dan juga dapat menjadi substrat untuk memproduksi senyawa antioksidan dalam industri makanan.
A. niger dalam pertumbuhannya berhubungan langsung dengan zat makanan yang terdapat dalam substrat, molekul sederhana yang terdapat disekeliling hifa dapat langsung diserap sedangkan molekul yang lebih kompleks harus dipecah dahulu sebelum diserap ke dalam sel, dengan menghasilkan beberapa enzim ekstra seluler seperti protease, amilase, mananase, dan α- glaktosidase. Bahan organik dari substrat digunakan oleh
Aspergillus niger untuk aktivitas transport molekul, pemeliharaan struktur sel, dan mobilitas sel.
Aspergillus Niger
Mikrograf dari A. niger yang ditumbuhkan pada medium Sabouraud agardengan perbesaran 100x
Klasifikasi ilmiah
F. Mekanisme Pembentukan Asam Sitrat
Langkah pertama dari mekanisme pembentukan asam sitrat tersebut, yaitu penyatuan asetil ko-A oksaloasetat untuk membentuk asam sitrat. Pertama-tama, asetil ko-A hasil dari reaksi antara (dekarboksilasi oksidatif) masuk ke dalam siklus dan bergabung dengan asam oksaloasetat membentuk asam sitrat. Setelah "mengantar" asetil masuk ke dalam siklus Krebs, ko-A memisahkan diri dari asetil dan keluar dari siklus. Kemudian, asam sitrat mengalami pengurangan dan penambahan satu molekul air sehingga terbentuk asam isositrat.
Lalu, asam isositrat mengalami oksidasi dengan melepas ion H+, yang kemudian mereduksi NAD+ menjadi NADH, dan melepaskan satu molekul CO2 dan membentuk asam a-ketoglutarat (baca: asam alpha
Domain: Eukaryota
Kerajaan: Fungi
Filum: Ascomycota
Upafilum: Pezizomycotina
Kelas: Eurotiomycetes
Ordo: Eurotiales
Famili: Trichocomaceae
Genus: Aspergillus
Spesies: A. niger
ketoglutarat). Setelah itu, asam a-ketoglutarat kembali melepaskan satu molekul CO2, dan teroksidasi dengan melepaskan satu ion H+ yang kembali mereduksi NAD+ menjadi NADH. Selain itu, asam a-ketoglutarat mendapatkan tambahan satu ko-A dan membentuk suksinil ko-A. Setelah terbentuk suksinil ko-A, molekul ko-A kembali meninggalkan siklus, sehingga terbentuk asam suksinat. Pelepasan ko-A dan perubahan suksinil ko-A menjadi asam suksinat menghasilkan cukup energi untuk menggabungkan satu molekul ADP dan satu gugus fosfat anorganik menjadi satu molekul ATP. Kemudian, asam suksinat mengalami oksidasi dan melepaskan dua ion H+, yang kemudian diterima oleh FAD dan membentuk FADH2, dan terbentuklah asam fumarat. Satu molekul air kemudian ditambahkan ke asam fumarat dan menyebabkan perubahan susunan (ikatan) substrat pada asam fumarat, karena itu asam fumarat berubah menjadi asam malat.
Terakhir, asam malat mengalami oksidasi dan kembali melepaskan satu ion H+, yang kemudian diterima oleh NAD+ dan membentuk NADH, dan asam oksaloasetat kembali terbentuk. Asam oksaloasetat ini kemudian akan kembali mengikat asetil ko-A dan kembali menjalani siklus Krebs.
Pada A. niger, fosfoenol piruvat dapat diubah langsung menjadi oksaloasetat (tanpa melalui piruvat) oleh enzim fosfoenol piruvat
karboksilase. Reaksi tersebut membutuhkan ATP sebagai sumber energi, Mg2+, atau Mn2+, dan K+, atau NH4+.
Judoamidjojo dan Darwis (1992) menyatakan bahwa apabila sumber karbon bukan glukosa, misalnya asam asetat, atau senyawa alifatik berantai panjang (C9 – C23), maka isositrat liase akan terinduksi sehingga dengan asam isositrat diubah menjadi glioksilat, selanjutnya glioksilat diubah menjadi malat oleh sintetase. Bila glukosa ditambahkan siklus tersebut akan terhambat.
Pada pembentukan asam sitrat dalam proses fermentasi dibatasi oleh ketersediaan beberapa unsur kelumit (P, Mn, Zn). Peranan ion logam dalam proses ini belum diketahui secara menyeluruh. Nilai pH optimum
sekitar 1,7 – 2,0. Jika pH lebih tinggi (alkalis) menyebabkan pembentukan asam – asam oksalat dan glukonat dalam jumlah banyak. Karenanya pengendalian kondisi proses secara cermat merupakan prasyarat untuk mempertahankan keteraturan metabolik dan mendukung pembentukan asam sitrat yang lebih banyak. Kondisi yang sesuai tersebut
memungkinkan stimulasi glikolisis untuk penyediaan aliran karbon yang tidak terbatas ke dalam metabolisme antara. Akumulasi sitrat selanjutnya tergantung pada pemasokan oksaloasetat (Mangunwidjaja & Suryani 1994).
Mangunwidjaja & Suryani (1994) juga menjelaskan bahwa kekurangan mangan akan menurunkan aktivitas enzim dalam siklus asam trikarboksilat yang diikuti oleh penurunan anabolisme. Gangguan
metabolisme ini menyebabkan perbedaan tingkat ion amonium
intraselluler yang dapat membantu menghilangkan penghambatan enzim fosfofruktose oleh sitrat. Mangan juga terlibat dalam biokimia permukaan sel dan morfologi hifa. Kebutuhan oksigen yang tinggi memungkinkan reoksidasi sitoplasma NADH tanpa pembentukan ATP dan melibatkan suatu cabang respirasi alternatif yang berbeda dari rantai respirasi normal.
Beberapa faktor yang berpengaruh terhadap produksi biogas sebagai berikut:
1. Derajat keasaman (pH)
Hal ini merupakan hal yang sangat penting dallam proses fermentasi, pH pada media juga mempengaruhi produksi asam sitrat dari A. niger karena beberapa enzim yang berperan dalam siklus TCA sensitif terhadap pH. pH yang rendah selama fermentasi untuk produksi asam sitrat yang optimal diperlukan pH sekitar 2. Jika kondisi tersebut tidak diperoleh hasil produksi akan berkurang (Mattey, 1992). Papagianni (1995) & Papagianni et al.
(1999) melaporkan bahwa pH mempengaruhi morfologi dan produktivitas asam sitrat dari A. niger dari hasil data kuantitatif.
Morfologi dengan agregat yang kecil dan filament yang pendek
