i
Kode/Nama Rumpun Ilmu* :165/ Teknologi Pangan dan Gizi
LAPORAN KEMAJUAN
PENELITIAN HIBAH BERSAING
Aktivitas antioksidan Lactobacillus spp isolat feses bayi untuk
pengembangan probiotik
(Tahun ke 1 dari rencana 3 tahun)
PENGUSUL
Ir. Komang Ayu Nocianitri, M.Agr.Sc.
NIDN: 0008036801
Ir. I Nengah Sujaya, M.Agr.Sc., Ph.D.
Dr. Drs. Yan Ramona, M.App.Sc.
NIDN: 0031126651
NIDN: 0022106401
UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
ii
HALAMAN PENGESAHAN PENELITIAN HIBAH BERSAING
Judul Kegiatan : Aktivitas antioksidan Lactobacillus spp isolat feses bayi untuk pengembangan probiotik
Kode/Nama Rumpun Ilmu : 165 / Teknologi Pangan dan Gizi Ketua Peneliti
Nama Lengkap : Ir. KOMANG AYU NOCIANITRI, M.Agr.Sc
NIDN : 0008036801
Jabatan Fungsional : Lektor
Program Studi : Teknologi Pangan
Nomor HP : 08123668356
Surel (e-mail) : nocianitri68@yahoo.com Anggota Peneliti (1)
Nama Lengkap : Ir. I NENGAH SUJAYA, M.Agr.Sc.P.hD.
NIDN : 0031126651
Perguruan Tinggi : UNIVERSITAS UDAYANA Anggota Peneliti (2)
Nama Lengkap : Dr., Drs YAN RAMONA, M.App.Sc
NIDN : 0022106401
Perguruan Tinggi : UNIVERSITAS UDAYANA Institusi Mitra (jika ada)
Nama Institusi Mitra : -
Alamat : -
Penanggung Jawab : -
Tahun pelaksanaan : Tahun ke 1 dari rencana 3 Tahun Biaya Tahun Berjalan : Rp. 62.000.000.00
Biaya Penelitian Keseluruhan : Rp 225.000.000,00
Mengetahui Badung, Bali, 29 - 6 - 2015, Ketua LPPM, Unud Ketua Peneliti,
(Prof. Dr. Ir. I Nyoman Gde Antara, M.Eng) (Ir. Komang Ayu Nocianitri, M.Agr.Sc) NIP/NIK 196408071992031002 NIP/NIK196803081995122001
iii RINGKASAN
Seleksi strain probiotik yang mempunyai aktivitas antioksidan secara in vitro
Oleh
Komang Ayu Nocianitri 1#, I N Sujaya2, Yan Ramona 3 1)
Jurusan Ilmu dan Teknologi Pangan - FTP, 2) PS Ilmu Kesehatan Masyarakat, Fak. Kedokteran, Universitas Udayana, 3) PS Biologi Fakultas MIPA, Unud
# Email : nocianitri68@yahoo.com
Probiotik adalah mikroorganisme hidup yang apabila diberikan pada jumlah yang tepat dapat bermanfaat bagi kesehatan saluran pencernaan (FAO. 2002). Pada awalnya, konsumsi probiotik bertujuan untuk memodulasi dan meningkatkan keseimbangan mikroba usus, akan tetapi saat ini, strain probiotik telah dikembangkan untuk merespon target fisiologis tertentu. Probiotik telah diketahui memberikan dampak menyehatkan pada individu karena dapat meningkatkan keseimbangan mikroba yang menguntungkan dalam saluran pencernaan (Fuller, 1989). Salah satu dampak menyehatkan dari probiotik adalah mempunyai aktivitas sebagai antioksidan (Sekhon, 2010; Kim, 2006ab; Gao, 2011, Basileios et al., 2011, Chu-Chyn et al., 2009).
Pola konsumsi pangan dewasa ini lebih banyak mengkonsumsi pangan siap saji (fast food) yang banyak mengandung lemak dan rendah serat. Makanan berlemak disamping dapat meningkatkan kadar kolesterol darah juga dapat menjadi sumber radikal bebas yang secara endogen dapat membentuk peroksidasi lipid di dalam tubuh. Didalam tubuh terdapat sistem antioksidan untuk melawan radikal bebas secara endogen. Peningkatan radikal bebas melebihi antioksidan endogen dalam tubuh dapat menimbulkan stres oksidatif. Keseimbangan antara radikal bebas dan antioksidan akan terganggu apabila keseimbangan mikroflora usus terganggu. Salah satu cara untuk menjaga keseimbangan mikroflora usus untuk mencegah terjadinya stress oksidatif adalah dengan konsumsi probiotik. Mikroorganisme memiliki sistem antioksidan untuk menjaga tingkat radikal bebas yang tidak beracun bagi sel (Farr dan Kogoma, 1991). Aktivitas antioksidan dari mikroorganisme merupakan salah satu cara untuk meningkatkan ketahanan terhadap stress oksidatif.
Sifat fungsional dari mikroba probiotik bersifat spesifik strain, dimana setiap strain probiotik mempunyai sifat fungsional yang berbeda. Bakteri asam laktat yang telah diisolasi dari feses bayi mempunyai potensi untuk dikembangkan sebagai probiotik, akan tetapi sifat-sifat fungsional (aktivitas antioksidan) dari probiotik tersebut perlu dieksplorasi lebih jauh.
Penelitian tahun pertama bertujuan untuk mencari strain probiotik yang mempunyai aktivitas antioksidan tertinggi secara in vitro dari beberapa strain probiotik yang telah diisolasi dari feses bayi. Hasil sementara diperoleh bahwa semua isolat yang dipergunakan termasuk bakteri Gram positif, katalase negatif, tidak membentuk gas dengan bentuk batang berantai. Semua isolat menunjukkan pertumbuhan yang baik dengan nilai OD pada panjang gelombang
iv
660 nm berkisar antara 1,184 sampai 2,889 dengan total BAL berkisar antara 106 sampai 1010. Selanjutnya dilakukan pengujian aktivitas antioksidan dari masing-masing strain untuk mendapatkan satu strain yang mempunyai aktivitas antioksidan tertinggi secara in vitro.
v PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Kuasa karena berkat rahmat-Nya laporan penelitian yang berjudul “ Aktivitas antioksidan Lactobacillus spp isolat feses bayi untuk pengembangan probiotik” ini dapat diselesaikan tepat pada waktunya. Melalui penelitian ini diharapkan dapat diperoleh kandidat probiotik asli Indonesia yang memiliki potensi sebagai strain probiotik yang dapat dikembangkan sebagai makanan fungsional (functional food).
Dalam mengerjakan penelitian ini penulis memperoleh banyak bantuan dan dukungan dari berbagai pihak, oleh sebab itu pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada :
1. Direktoran Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional, yang telah membiayai penelitian ini.
2. Bapak Prof. Dr. Ir. I Nyoman Gde Antara, M.Eng., selaku Kepala Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat, Universitas Udayana yang telah mendanai penelitian ini melalui alokasi dana Hibah Bersaing
3. Bapak Dr. Ir. I D.G. Mayun Permana, MS selaku Dekan Fakulktas Teknologi Pertanian, Universitas Udayana atas segala dukungan yang diberikan
4. Staf UPT. Laboratorium Biosains dan Bioteknologi beserta seluruh pihak yang turut berperan dalam penelitian dan penyusunan laporan ini yang tidak bisa penulis sebutkan satu per satu.
Peneliti menyadari laporan penelitian ini masih jauh dari sempurna, untuk itu penulis sangat mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari pembaca untuk penyempurnaannya. Penulis berharap semoga laporan penelitian ini dapat memberikan sumbangan bagi bidang ilmu pengetahuan.
Bukit Jimbaran, 29 Juni 2015
vi DAFTAR ISI Hal JUDUL ……….. i HALAMAN PENGESAHAN ………... ii RINGKASAN ………... iii PRAKATA ……… v DAFTAR ISI ………... vi BAB I PENDAHULUAN ………... 1
BAB II KAJIAN PUSTAKA ……….. 4
BAB III TUJUAN DAN MANFAAT …..………... 11
BAB IV. METODOLOGI PENELITIAN ………... 12
BAB V. HASIL YANG TELAH DICAPAI ………. 15
BAB VI. RENCANA TAHAP BERIKUTNYA ... 17
BAB VII. KESIMPULAN DAN SARAN ……… 17
1
BAB I. PENDAHULUAN
1. Latar Belakang
Pola konsumsi pangan dewasa ini lebih banyak mengkonsumsi pangan siap saji (fast food) yang banyak mengandung lemak dan rendah serat. Pola makan yang mengandung lemak tinggi, khususnya yang mengandung kolesterol tinggi dan lemak jenuh, memberikan peluang meningkatkan kadar kolesterol darah, umumnya meningkatkan kemungkinan seseorang menderita arterosklerosis. Makanan berlemak disamping dapat meningkatkan kadar kolesterol darah juga dapat menjadi sumber radikal bebas yang secara endogen dapat membentuk peroksidasi lipid di dalam tubuh.
Dewasa ini pangan fungsional berkembang dengan pesat, dimana pangan yang dikonsumsi diharapkan tidak hanya dapat memenuhi kebutuhan zat nutrisi, tetapi juga dapat menstimulasi salah satu fungsi khusus dalam kesehatan individu. Bakteri asam laktat (BAL) telah banyak dimanfaatkan oleh industri pangan dalam menciptakan produk pangan fungsional untuk memelihara kesehatan saluran pencernaan manusia, yang dikenal dengan istilah probiotik. Probiotik adalah mikroorganisme hidup yang apabila diberikan pada jumlah yang tepat dapat bermanfaat bagi kesehatan saluran pencernaan (FAO. 2002).
Pada awalnya, konsumsi probiotik bertujuan untuk memodulasi dan meningkatkan keseimbangan mikroba usus, akan tetapi saat ini, strain probiotik telah dikembangkan untuk merespon target fisiologis tertentu. Probiotik telah diketahui memberikan dampak menyehatkan pada individu karena dapat meningkatkan keseimbangan mikroba yang menguntungkan dalam saluran pencernaan (Fuller, 1989). Beberapa dampak menyehatkan dari probiotik antara lain: penanggulangan diare (Salazar et al., 2007; Pant et al., 2007 ; Tabbers dan Benninga, 2007; Collado et al., 2009 ), menstimulasi sistem kekebalan tubuh (Isolauri et al., 2001 ; Isolauri dan Salminen, 2008), mencegah kanker kolon dan usus (Pato, 2003; Liong, 2008), penanggulangan dermatitis atopik pada anak-anak (Betsi et al., 2008; Torii et al., 2010), menurunkan kadar kolesterol darah (Ooi et al., 2010; Kumar et al., 2012; Lee et al.,
2
2009),dan sebagai antioksidan (Sekhon, 2010; Kim, 2006ab; Gao, 2011, Basileios et al., 2011, Chu-Chyn et al., 2009).
Radikal bebas dapat merusak makromolekul seperti merusak lipid membran sel, DNA, protein dan menyebabkan stres oksidatif sel (Valko et al, 2006). Didalam tubuh terdapat sistem antioksidan untuk melawan radikal bebas secara endogen. Antioksidan endogen adalah antioksidan yang dihasilkan oleh tubuh yang terdiri atas enzim-enzim superoksida dismutase (SOD), glutation peroksidase (GPx) atau glutation reduktase (GR) serta enzim katalase (CAT) dan antioksidan non enzimatik seperti glutation (GSH), transferin, asam urat dan lain lain. Peningkatan radikal bebas melebihi antioksidan endogen dalam tubuh dapat menimbulkan stres oksidatif. Keseimbangan antara radikal bebas dan antioksidan akan terganggu apabila keseimbangan mikroflora usus terganggu. Salah satu cara untuk menjaga keseimbangan mikroflora usus untuk mencegah terjadinya stress oksidatif adalah dengan konsumsi probiotik. Mikroorganisme memiliki sistem antioksidan untuk menjaga tingkat radikal bebas yang tidak beracun bagi sel (Farr dan Kogoma, 1991). Aktivitas antioksidan dari mikroorganisme merupakan salah satu cara untuk meningkatkan ketahanan terhadap spesies oksigen reaktif (ROS).
Bakteri asam laktat (BAL) banyak dipergunakan sebagai probiotik. Disisi lain, probiotik yang beredar di Indonesia pada saat ini kebanyakan dari strain yang bukan asli Indonseia (import). Hal ini memacu penelitian untuk menggali potensi BAL dari sumber alam Indonesia untuk meningkatkan derajat kesehatan penduduk Indonesia. Serangkaian penelitian telah dilakukan untuk mengisolasi BAL dari feses bayi sehat (23 strain) yang mempunyai potensi sebagai probiotik (Koleksi UPT laboratorium terpadu biosain dan bioteknologi, Unud). Beberapa BAL yang telah diisolasi mempunyai ketahanan yang baik pada kondisi saluran pencernaan seperti pH rendah (pH 2, 3, dan 4) dan empedu (deoksi kolat), mampu melewati kondisi usus dengan kandungan 0,4 mM sodium deoksi kolat dan pankreatin sehingga isolat ini mempunyai potensi sebagai probiotik (Sujaya et al., 2008 a,b: Febianingsih et al., 2007; Marsia et al., 2007 dan Nocianitri et al., 2011)
Sifat fungsional dari mikroba probiotik bersifat spesifik strain, dimana setiap strain probiotik mempunyai sifat fungsional yang berbeda. Bakteri asam laktat yang
3
telah diisolasi dari feses bayi mempunyai potensi sebagai probiotik isolat lokal, akan tetapi sifat-sifat fungsional (aktivitas antioksidan) dari probiotik tersebut perlu dieksplorasi lebih jauh, sehingga dapat dipergunakan untuk pengembangan pangan fungsional.
4
BAB II. KAJIAN PUSTAKA
1. Probiotik
Lilley dan Stiwel pada tahun 1965 pertama kali mengemukakan istilah probiotik sebagai sejenis senyawa yang dihasilkan oleh satu organism yang mampu menstimulasi pertumbuhan organisme lain (Neha et al., 2012). Probiotik didefinisikan sebagai mikroorganisme hidup yang apabila dikonsumsi dalam jumlah yang cukup dapat memberikan manfaat kesehatan bagi yang mengkonsumsinya FAO (2002). Menurut Fuller (1989), probiotik adalah bakteri hidup suplemen bahan makanan yang memberikan efek menguntungkan bagi manusia dengan menjaga keseimbangan bakteri menguntungkan di dalam saluran pencernaan. Pengertian-pengertian tentang probiotik menyatakan bahwa baik strain maupun produk dari bakteri probiotik tersebut telah terbukti secara ilmiah aman dan dapat memberikan manfaat bagi kesehatan (Salminen et al., 2004). Probiotik bermanfaat bagi kesehatan karena mikroba tersebut dapat meningkatkan keseimbangan mikroba yang menguntungkan dalam saluran pencernaan (Fuller, 1989). Bahan makanan yang mengandung probiotik juga tergolong pangan fungsional jika secara nyata memiliki pengaruh terhadap satu atau lebih fungsi tubuh sehingga memberikan efek kesehatan ataupun pengobatan pada manusia diluar nilai nutrisi yang dimiliki (Salminen et al. 2004).
Probiotik umumnya dari golongan bakteri asam laktat (lactobacilli dan bifidobacteria) karena bakteri ini telah diterima sebagai food grade bacteria dan telah dianggap sebagai bakteri yang aman (GRAS, generally recognized as safe) karena dipergunakan dalam produksi bahan pangan terfermentasi secara alamiah. Penelitian tentang bakteri asam laktat dalam saluran pencernaan manusia menunjukkan bahwa lactobacilli dan bifidobacteria merupakan spesies BAL dominan disamping itu Weisella spp., Pediococcus spp, dan Leuconostoc spp. merupakan populasi yang sangat terbatas (Vaughan et al., 2002; Sujaya et al., 2003a).
Produk probiotik bakteri yang beredar di pasar secara garis besar tujuan penggunaannya adalah: (1) probiotik untuk mencegah diarrhea: Lactobacillus acidophilus dikombinasikan dengan Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus. rhamnosus
5
GG, Enterococcus faecium SF68i dan Bifidobacterium longum, Saccharomyces boulardi; (2) probiotik untuk gastroenteritis akut: L. rhamnosus GG, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus casei strain Shirota, Enterococcus faecium SF68 dan Sacc. boulardi; (3) probiotik untuk traveller’s diarrhea: L. acidophilus, L. acidophilus dikombinasikan dengan L. bulgaricus, Lactobacillus fermentum strain KLD, L. rhamnosus GG dan Sacc. boulardi (Marteau et al., 2001).
Pada awal perkembangan era probiotik, L.casei strain Shirota (Yakult) serta L. rhamnosus GG, merupakan dua strain lactobacilli yang mengawali perkembangan probiotik bakteri. Seiring dengan kemajuan teknologi, beberapa strain baru dikembangkan sebagai probiotik dengan harapan dapat memberikan berbagai keunggulan spesifik pada aspek kesehatan (Klaenhammer dan Kullen, 1999). Beberapa kriteria yang diharapkan dalam pengembangan probiotik baru seperti: (1) kecocokan (untuk probiotik konsumsi manusia sebaiknya diisolasi dari saluran pencernaan manusia sehingga mengurangi resiko toksisitasnya); (2) kecocokan dalam teknologi pengembangan/produksi dimana diharapkan mudah diproduksi secara masal/skala besar, viabilitas yang tinggi, tidak mengganggu nilai sensoris bahan pangan apabila diikutkan dalam bahan pangan tertentu, stabil secara genetis dan memungkinkan dilakukan rekayasa genetika; (3) kemampuan bersaing seperti mampu bertahan dan berkembang biak di dalam saluran pencernaan, tahan terhadap kondisi saluran pencernaan (asam empedu, pH rendah), mampu bersaing dengan flora normal di dalam saluran pencernaan, dan mampu melakukan adhesi pada sel epitel saluran pencernaan; (4) efek fungsional seperti mampu menimbulkan dampak menyehatkan, antagonis terhadap patogen, produksi zat antimikrobial, imunstimulator, anti karsinogenik dan anti mutagenik, produksi bioaktif (enzyme, vaccines, peptida) (Klaemhammer dan Kullen, 1999).
Telah diketahui bahwa probiotik memberikan dampak menyehatkan pada individu yang mengkonsumsinya. Beberapa aspek menyehatkan probiotik antara lain: penanggulangan diare (Salazar et al., 2007; Pant et al., 2007 ; Tabbers dan Benninga, 2007; Collado et al., 2009 ), menstimulasi sistem kekebalan (immune) tubuh (Isolauri et al., 2001 ; Isolauri dan Salminen, 2008), menurunkan kadar kolesterol (Ooi et al., 2010; Kumar et al., 2012; Lee et al., 2009), pencegahan kanker kolon dan usus (Pato, 2003;
6
Liong, 2008), penanggulangan dermatitis atopik pada anak-anak (Betsi et al., 2008; Torii et al., 2010), dan sebagai antioksidan (Sekhon, 2010; Kim, 2006; Gao, 2011, Basileios et al., 2011, Chin-Chyn et al., 2009). Dengan berbagai aspek menyehatkan (efek fungsional) dari probiotik, maka memberi potensi baru dalam pengembangan makanan fungsional
2.2 Aktivitas antioksidan dari probiotik
Antioksidan merupakan senyawa yang diperlukan oleh tubuh untuk melindungi sel-sel tubuh dari kerusakan yang diakibatkan oleh radikal bebas. Radikal bebas adalah molekul yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan pada orbit terluarnya. Dalam upaya penstabilan diri atau pemulihan keganjilan elektronnya, elektron pada radikal bebas tersebut secara cepat ditransfer atau menarik elektron makromolekul biologis sekitarnya seperti asam lemak jenuh, protein, polisakarida, asam nukleat, dan asam deoksiribonukleat. Radikal bebas sangat diperlukan bagi kelangsungan beberapa proses fisiologis dalam tubuh terutama untuk transportasi elektron. Bila jumlah radikal bebas dalam tubuh lebih tinggi dari jumlah sistem antioksidan maka akan terjadi stress oksidatif. Radikal bebas dapat merusak makromolekul seperti merusak lipid membran sel, DNA, protein dan menyebabkan stres oksidatif sel (Valko et al, 2006). Makromolekul yang teroksidasi akan terdegradasi dan jika makromolekul tersebut merupakan bagian dari sel atau organelnya maka akan berakibat pada kerusakan sel (Halliwell & Gutteridge, 1999)
Radikal bebas dapat berasal dari dalam tubuh (endogenus) maupun luar tubuh (eksogenus). Secara endogen radikal bebas merupakan hasil sampingan proses metabolisme. Radikal bebas secara endogen dapat berasal dari makanan sumber lipid yang dapat membentuk peroksidasi lipid di dalam tubuh, maupun pada keadaan kondisi stress, sakit dan olah raga yang berlebihan. Menurut Hwang et al. (2005) yang termasuk kedalam radikal bebas endogenus adalah superoksida (O-), hidroksil (OH-), hidrogen peroksida (H2O2), dan peroksinitrit. sedangkan radikal bebas eksogenus dapat berasal dari radiasi, asap rokok, kabut asap, emisi kendaraan, NO2 dan NO. Peningkatan radikal
7
bebas melebihi antioksidan endogen dalam tubuh dapat menimbulkan stres oksidatif, sehingga menyebabkan terjadinya penurunan antioksidan.
Di dalam tubuh terdapat mekanisme antioksidan atau anti radikal bebas secara endogenik, tetapi bila jumlah radikal bebas dalam tubuh berlebih maka dibutuhkan antioksidan yang berasal dari sumber alami atau sintetik dari luar tubuh. Berdasarkan sumbernya antioksidan dibagi dua yaitu antioksidan endogen dan antioksidan eksogen. Antioksidan endogen adalah antioksidan yang dihasilkan oleh tubuh yang terdiri atas enzim-enzim superoksida dismutase (SOD), glutation peroksidase (GPx) atau glutation reduktase (GR) serta enzim katalase (CAT) dan antioksidan non enzimatik seperti glutation (GSH), transferin, asam urat dan lain lain. Antioksidan eksogen adalah antioksidan yang dibutuhkan dari luar seperti senyawa senyawa flavonoid, vitamin C, vitamin E dan karotenoid yang banyak ditemukan dalam sayur-sayuran dan buah-buahan (Heinonen and Albanes, 1994). Mekanisme antioksidan dalam menangkal radikal bebas adalah dengan cara: (1) mengkatalisir pemusnahan radikal bebas dalam sel oleh enzim superoksida dismutase (SOD), katalase (CAT), gluthathion peroksidase (GPx), gluthathion reduktase (GR), (2) pengikatan ion logam seperti Fe2+ dan Cu2+ oleh antioksidan logam transisi terikat protein seperti: transferin, haptoglobin, hemopeksin dan seruloplasmin, dan (3) pembersihan spesies oksigen reaktif (ROS) oleh antioksidan dengan senyawa-senyawa yang memiliki berat molekul kecil yang dapat menerima dan memberi elektron dari atau ke radikal bebas, sehingga membentuk senyawa baru yang stabil seperti: glutation tereduksi (GSH), asam askorbat, bilirubin, α-tokoferol dan asam urat (Halliwell & Gutteridge, 1999).
Konsumsi probiotik atau produk-produk pangan yang mengandung probiotik merupakan salah satu cara ideal untuk menjaga keseimbangan mikroflora usus. Apabila keseimbangan mikroflora usus terganggu, maka keseimbangan antara radikal bebas dan antioksidan juga terganggu dan dampaknya adalah terjadi stress oksidatif. Bakteri probiotik menunjukkan aktivitas antioksidan melalui mekanisme: (1) memperkuat pertahanan seluler dengan mensekresikan enzim antioksidan; (2) melepaskan dan memacu produksi GSH yaitu antioksidan nonenzimatik utama dan penangkap radikal
8
bebas; (3) meningkatkan produksi biomolekul antioksidan tertentu, seperti EPSS, dan (4) pengikatan ion logam (Basileios et al., 2011).
Superoksida dismutase (SOD) merupakan enzim antioksidan endogen yang menjadi lini pertahanan pertama antioksidan tubuh dalam melindungi sel dari radikal bebas (Fridovich 1995). Superoxide dismutase (SOD) merupakan enzim antioksidan endogen yang paling efektif dalam mengkatalisis dan mengkonversi radikal bebas anion superoksida menjadi molekul oksigen dan hidrogen peroksida. SOD bekerja melalui sistem pertahanan preventif, menghambat atau merusak proses pembentukan radikal bebas. Spesies probiotik mempunyai kemampuan dalam memproduksi dan melepaskan SOD. Lactobacillus plantarum dan Lactococcus lactis mampu memproduksi dan melepaskan SOD dan menunjukkan efek anti inflamasi dalam TNBS kolitis model (Basileios et al., 2011). Lactobacillus casei Zhang mampu meningkatkan aktivitas SOD dan GSH-Px pada hati dan serum tikus hyperlipidemik (Zhang et al., 2010). Penelitian lain menunjukkan bahwa Lactobacillus gasseri mampu menghasilkan Mn-SOD yang dapat mengurangi radang usus pada tikus (Caroll et al., 2007). Dua strain Lactobacillus fermentum E-3 dan E-18 dan Streptococcus thermophilus menunjukkan aktivitas antioksidan yang signifikan karena mampu memproduksi SOD (Kullisaar et al., 2002 dan Chang and Hassan, 1997).
Molekul antioksidan non-enzimatik intraseluler yang paling penting adalah glutathione (GSH). Glutathione adalah tripeptide yang berisi grup sulfhidril (-SH) (glutamin, sistein, and glisin)dan sangat efisien dalam mendetoksifikasi spesies reaktif oksigen dan peroksida. Dalam reaksi berantai oksidatif, GSH dikonversi menjadi bentuk glutathione disulfida teroksidasi (GSSG). Salah satu fungsi yang paling penting dari GSH adalah bertindak sebagai penangkap radikal hidroksil (OH.) apabila radikal hidroksil tidak dapat dihilangkan dengan reaksi enzimatik (Pompella et al., 2003). Strain probiotik bifidobacterium dan lactococcus dapat langsung menghasilkan atau memacu pelepasan glutathione ke usus, sehingga bisa memiliki nilai terapi yang potensial (Musenga et al., 2007). Strain probiotik Lactobacillus fermentum dapat memproduksi GSH dan prekursor dipeptida γ-Glu-Sis yang memfasilitasi pemulihan peradangan jaringan pada model TNBS kolitis tikus secara in vitro (Peran et al., 2006). Penelitian
9
lain menunjukkan bahwa jumlah GSH meningkat pada pankreas setelah pemberian probiotik Lactobacillus acidophilus W70, L. Casei W56, L. salivarius W24, Lactococcus lactis W58, Bifidobacterium bifidum W23, dan B. lactis W52 (Lutgendorff et al., 2008).
Probiotik dapat menunjukkan aktivitas antioksidan dengan memproduksi senyawa antioksidan tertentu untuk mengurangi stres oksidatif yaitu eksopolisakarida (EPS). Eksopolisakarida merupakan rantai panjang polisakarida terdiri dari gula atau turunan gula, seperti galaktosa, glukosa, dan rhamnosa. Bakteri probiotik melepaskan EPS ke lingkungan sekitarnya untuk melindungi diri mereka dari kondisi yang tidak menguntungkan seperti pada pH dan suhu yang ekstrim. Kodali dan Sen (2008) melaporkan bahwa probiotik bakteri Bacillus coagulans RK-02 mensintesis EPS ekstraselular dan EPS ini menunjukkan aktivitas antioksidan dan menunjukkan penangkapan radikal bebas secara signifikan bila dibandingkan dengan standar antioksidan seperti vitamin C dan vitamin E secara in vitro.
Probiotik selain memproduksi zat dengan aktivitas antioksidan dan penangkapan radikal bebas juga menunjukkan aktivitas pengikatan ion logam. Ion logam berhubungan dengan patogenesis berbagai penyakit kronis seperti penyakit jantung koroner, karsinogenesis, dan arthritis, terutama dengan memacu produksi radikal bebas melalui reaksi Fenton. Ion logam transisi dapat memulai peroksidasi lipid dan memulai reaksi berantai dengan memecah hidroperoksida (ROOH) menjadi peroxyl (ROO*) dan radikal Alkyoxyl (RO*). Ion besi dan ion tembaga merupakan ion yang sangat reaktif dan memainkan peran pada reaksi berantai radikal bebas. Lin dan Yen (1999) melaporkan bahwa Streptococcus thermophilus 821 dan Bifidobacterium longum memiliki kemampuan tinggi dalam mengikat logam Cu2+ dan Fe2+. Amanatidou et al. (2001) dan Lee et al. (2005) melaporkan bahwa Lactobacillus sake dan L. casei KCTC 3260 mempunyai kemampuan dalam mengikat ion logam Fe.
2.3. Penelitian yang telah dilakukan
Penelitian yang telah dilakukan untuk mengisolasi BAL dari feses bayi sehat mendapatkan 23 isolat yang mempunyai potensi sebagai probiotik (Koleksi UPT
10
laboratorium terpadu biosain dan bioteknologi, Unud). Isolat BAL yang telah diisolasi mempunyai ketahanan yang baik pada kondisi saluran pencernaan seperti pH rendah (pH 2, 3, dan 4) dan empedu (deoksi kolat), mampu melewati kondisi usus dengan kandungan 0,4 mM sodium deoksi kolat dan pankreatin sehingga isolat ini mempunyai potensi sebagai probiotik
Tabel 1. Peta jalan penelitian sifat fungsional probiotik isolat asli Indonesia • Penelitian yang telah dilakukan:
Uji in vitro isolat bakteri asam laktat:
- Tahan terhadap pH rendah
- Stabil terhadap garam empedu
- Menghambat patogen
- Mampu menempel pada usus
Luaran:
23 Isolat Bakteri asam laktat yang potensial sebagai probiotik
• Penelitian yang akan dilakukan 1. Penelitian Tahun I
Uji aktivitas antioksidan Isolat probiotik secara in vitro Variabel yang diamati:
• Penghambatan peroksidasi lipid
• aktivitas penangkapan radikal hidroksil • aktivitas pengikatan ion Fe
Luaran:
Satu isolat probiotik yang mempunyai aktivitas antioksidan tinggi secara in vitro
2. Penelitian Tahun II
Aktivitas antioksidan isolat probiotik terseleksi secara in vivo pada tikus putih dengan pakan lemak tinggi.
Variabel Yang diamati: • Total BAL
• pH Sekum
• Aktivitas antioksidan (SOD, GPx,) dan MDA pada hati
Probiotik yang mempunyai aktivitas antioksidan tinggi secara in vivo
3. Penelitian Tahun III
Pengembangan probiotik dalam bentuk mikroenkapsulasi serta ketahanan resuksiasinya
Variabel Yang diamati: • Viabilitas isolate probiotik
• Ketahanan probiotik pada berbagai suhu
Produk mikroenkapsulasi probiotik yang mempunyai aktivitas antioksidan serta cara penyajiannya
11
BAB III. TUJUAN DAN MANFAAT
3.1. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk menyeleksi satu strain probiotik yang mempunyai aktivitas antioksidan tertinggi secara in vitro dari beberapa strain probiotik yang diisolasi dari feses bayi sehat yang merupakan koleksi UPT Laboratorium Terpadu Biosain dan Bioteknologi Universitas Udayana.
3.2. Manfaat Penelitian
Potensi bioteknologi dan kesehatan BAL yang diisolasi dari feses bayi, dapat memberi potensi baru pada probiotik isolat lokal dalam pengembangan pangan fungsional untuk meningkatkan derajat kesehatan masyarakat Indonesia.
12
BAB IV. METODOLOGI PENELITIAN
a. Subyek penelitian
Penelitian ini dilakukan untuk menyeleksi satu strain probiotik yang mempunyai aktivitas antioksidan tertinggi dari beberapa strain probiotik koleksi UPT Laboratorium Terpadu Biosain dan Bioteknologi Universitas Udayana.
Pada penelitian ini digunakan strain probiotik yang diisolasi dari feses bayi dimana strain-strain ini telah diuji mempunyai potensi sebagai probiotik. Strain yang digunakan dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Strain Bakteri asam laktat yang dipergunakan dalam penelitian
No Strain Probiotik No Strain Probiotik 1 Lactobacillus sp. FBB 4 13 Lactobacillus sp. FBB 42 2 Lactobacillus sp. FBB 5 14 Lactobacillus sp. FBB 52 3 Lactobacillus sp. FBB 9 15 Lactobacillus sp. FBB 57 4 Lactobacillus sp. FBB 10 16 Lactobacillus sp. FBB 59 5 Lactobacillus sp. FBB 13 17 Lactobacillus sp. FBB 60 6 Lactobacillus sp. FBB 18 18 Lactobacillus sp. FBB 72 7 Lactobacillus sp. FBB 21 19 Lactobacillus sp. FBB 74 8 Lactobacillus sp. FBB 22 20 Lactobacillus sp. FBB 75 9 Lactobacillus sp. FBB 26 21 Lactobacillus sp. FBB 81 10 Lactobacillus sp. FBB 38 22 Lactobacillus sp. F212 11 Lactobacillus sp. FBB 40 23 Lactobacillus sp.F213 12 Lactobacillus sp. FBB 41 b. Parameter penelitian
Parameter yang diamati pada tahap ini adalah aktivitas penghambatan peroksidasi lipid, aktivitas penangkapan radikal hidroksil, dan aktivitas pengikatan ion Fe oleh strain probiotik secara in vitro.
13
c. Metode analisis 1. Persiapan sel lysate
Strain probiotik ditumbuhkan pada MRS broth dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Sel probiotik dipanen dengan centrifugasi pada 5000 g selama 10 menit pada suhu 4oC dan cuci dengan 20 mM sodium phosphat buffer (PBS; 0,85% NaCl, 2,86 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, dan 1,76 mM KH2PO4, pH 7) sebanyak 2 kali. Pellet sel probiotik ditambahkan 20 mM sodium phosphat buffer pH 7 sampai konsentrasi sel 109 sel/ml (Kim et al., 2006 b).
2. Analisis penghambatan peroksidasi lipid
Analisis penghambatan peroksidasi lipid dilakukan dengan uji TBARS menurut metode Kim et al., (2006 b). Campuran reaksi dasar mengandung 0,6 ml 20 mM PBS (pH 7,0), 1 ml emulsi asam linoleat (0,1 ml asam linoleat; 99%, Sigma, 0,2 ml Tween 20, dan 19,7 ml aquades) dan 0,2 ml sampel. Reaksi dimulai dengan menambahkan H2O2 (0,2 ml, 0,56 mM) dan FeSO4 (0,2 ml, 0,01%) ke dalam campuran reaksi. Campuran reaksi diinkubasi pada 37°C selama 6 jam, kemudian ditambahkan 0,2 ml TCA 4%, 2 ml TBA 0,8%, dan 0,2 ml BHT 0,4%, dan dipanaskan pada suhu 100oC selama 20 menit. Jumlah peroksidasi lipid ditentukan dengan mengukur absorban dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 532 nm. Level penghambatan proksidasi lipid dinyatakan dalam persen dan dihitung dengan rumus:
% Penghambatan =[1 - A532 sampel/A532 kontrol] x 100% A532 = absorban pada panjang gelombang 532 nm
3. Aktivitas penangkapan radikal hidroksil
Aktivitas penangkapan radikal hidroksi ditentukan dengan metode yang dijelaskan oleh Avellar et al. (2004) yang dimodifikasi. Campuran reaksi dasar mengandung 1 ml 1,10-phenanthroline 0,75 mM, 2 ml phosphate buffer (pH 7,4) dan 1 ml FeSO4 0,75 mM dicampur dengan sempurna. Kemudian ditambahkan 1 ml H2O2 0,12% dan 1 ml sampel.
14
Campran reaksi diinkubasi pada suhu 37oC selama 90 menit dan absorbansi diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 536 nm. Kemampuan menangkap radikal hidroksil dihitung dengan rumus:
Aktivitas penangkapan radikal hidroksil (%) = [(As-Ac)/(Ab-Ac)] x 100 As = Absorbansi sampel
Ac = Absorbansi control yang mengandung 1,10-phenanthroline, FeSO4 danH2O2 Ab = Absorbansi blanko yang mengandung 1,10-phenanthroline dan FeSO4
4. Aktivitas pengikatan ion logam Fe
Aktifitas pengikatan Fe2+ diukur dengan metode Yen dan Wu (1999). Fe2 + diuji dengan mengukur pembentukan kompleks ferrous besi-ferrozine. Campuran reaksi terdiri dari 4,6 ml air deionisasi, besi klorida (0,1 ml, 2 mM, Sigma) dan ferrozine (0,2 ml, 5 mM, Sigma), dan ditambahkan 0,1 ml sampel. Setelah didiamkan 10 menit pada suhu kamar, campuran diukur absorbansinya pada panjang gelombang 562 nm. Persentase aktivitas pengikatan Fe adalah sebagai berikut:
Aktifitas pengikatan (%) = [1 - (absorbansi sampel) / (absorbansi kontrol)] x 100
d. Analisis data
Data aktivitas antioksidan dari beberapa strain probiotik disajikan dalam bentuk dan tabel dan dianalisis secara deskriptif.
15
BAB V. HASIL YANG TELAH DICAPAI
Penelitian untuk menyeleksi satu strain probiotik yang mempunyai aktivitas antioksidan tertinggi dari beberapa strain yang diisolasi dari feses bayi didahului dengan uji konfirmasi dari koleksi starin yang digunakan. Uji konfirmasi meliputi uji Gas, katalase, Gram, morfologi serta populasi BAL pada OD (optical density) tertentu. Hal ini dilakukan untuk mengkonfirmasi BAL yang digunakan sebelun dilakukan uji aktivitas antioksidannya. Data uji konfirmasi dapat dilihat pada Tabel 1. Dan total BAL pada nilai OD tertentu dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 1. Data Uji Gas, katalase, Gram dan morfologi beberapa isolat dari feses bayi Isolat Gas Katalase Gram Morfologi Lactobacillus sp. FBB 4 (-) (-) (+) Batang berantai Lactobacillus sp. FBB 5 (-) (-) (+) Batang berantai Lactobacillus sp. FBB 9 (-) (-) (+) Batang berantai Lactobacillus sp. FBB 10 (-) (-) (+) Batang berantai Lactobacillus sp. FBB 13 (-) (-) (+) Batang berantai Lactobacillus sp. FBB 18 (-) (-) (+) Batang berantai Lactobacillus sp. FBB 21 (-) (-) (+) Batang berantai Lactobacillus sp. FBB 22 (-) (-) (+) Batang berantai Lactobacillus sp. FBB 26 (-) (-) (+) Batang berantai Lactobacillus sp. FBB 38 (-) (-) (+) Batang berantai Lactobacillus sp. FBB 40 (-) (-) (+) Batang berantai Lactobacillus sp. FBB 52 (-) (-) (+) Batang berantai Lactobacillus sp. FBB 59 (-) (-) (+) Batang berantai Lactobacillus sp. FBB 60 (-) (-) (+) Batang berantai Lactobacillus sp. FBB 72 (-) (-) (+) Batang berantai Lactobacillus sp. FBB 74 (-) (-) (+) Batang berantai Lactobacillus sp. FBB 75 (-) (-) (+) Batang berantai
Dari uji konfirmasi menunjukkan bahwa semua isolat yang dipergunakan merupakan bakteri Gram positif, katalase negatif mempunyai bentuk batang berantai dan tidak membentuk gas yang berarti BAL yang digunakan termasuk homofermentatif yang menghasilkan asam laktat dari fermentasi karbohidrat.
16
Tabel 2. Nilai OD dan total BAL beberapa isolat dari feses bayi
Isolat Nilai OD Total BAL
Lactobacillus sp. FBB 4 2,486 2,28 x 108 Lactobacillus sp. FBB 5 2,889 3,14 x 108 Lactobacillus sp. FBB 9 2,603 4,00 x 106 Lactobacillus sp. FBB 10 2,787 5,53 x 109 Lactobacillus sp. FBB 13 2,231 2,03 x 109 Lactobacillus sp. FBB 18 2,575 1,35 x108 Lactobacillus sp. FBB 21 2,691 5,49 x 109 Lactobacillus sp. FBB 22 2,459 7,60 x 108 Lactobacillus sp. FBB 26 2,681 3,15 x 109 Lactobacillus sp. FBB 38 2,719 2,60 x 109 Lactobacillus sp. FBB 40 2,510 2,00 x 106 Lactobacillus sp. FBB 52 2,656 4,01 x 108 Lactobacillus sp. FBB 59 1,184 3,40 x 108 Lactobacillus sp. FBB 60 2,597 2,00 x 107 Lactobacillus sp. FBB 72 2,612 1,80 x 107 Lactobacillus sp. FBB 74 2,770 1,03 x 1010 Lactobacillus sp. FBB 75 2,624 8,00 x 108
Semua isolat menunjukkan pertumbuhan yang baik dengan nilai OD pada panjang gelombang 660 nm berkisar antara 1,184 sampai 2,889 dengan total BAL berkisar antara 106 sampai 1010. Selanjutnya dilakukan pengujian aktivitas antioksidan dari masing-masing strain untuk mendapatkan satu strain yang mempunyai aktivitas antioksidan tertinggi secara in vitro.
17
BAB VI. RENCANA TAHAPAN BERIKUTNYA
Rencana tahap berikutnya adalah menguji aktivitas antioksidan dari semua isolate yang telah dilakukan uji kofirmasi meliputi uji aktivitas penghambatan peroksidasi lipid, aktivitas penangkapan radikal hidroksil, dan aktivitas pengikatan ion Fe oleh strain probiotik secara in vitro
BAB VII. KESIMPULAN DAN SARAN
Sampai saat ini, dari rencana penelitian, telah terlaksana 35%, pengujian uji aktivitas penghambatan peroksidasi lipid, aktivitas penangkapan radikal hidroksil, dan aktivitas pengikatan ion Fe secara in vitro belum dilakukan. Pengujian aktivitas antioksidan secara in vitro tersebut akan segera dilakukan.
Dari hasil yang sudah didapatkan, sementara dapat disimpulkan sbb:
1. Semua isolate yang dipergunakan termasuk BAL dengan karakterisasi Gram positif, katalase negatif, tidak membentuk Gas dengan bentuk batang berantai. 2. Semua isolat menunjukkan pertumbuhan yang baik dengan nilai OD berkisar
18 DAFTAR PUSTAKA
Amanatidou, A., Bennik, M.H., Gorris, L.G., Smid, E.J. 2001. Superoxide dismutase plays an important role in the survival of Lactobacillus sake upon exposure to elevated oxygen. Arch. Microbiol.: 176: 79-88.
Basileios, G., Spyropoulos, Evangelos, P., Misiakos, Constantine F., Christos, N., Stoidis. 2011. Review: Antioxidant Properties of Probiotics and Their Protective Effects in the Pathogenesis of Radiation-Induced Enteritis and Colitis. Dig. Dis. Sci.: 56: 285–294
Betsi, G. I., Papadavid, E., and Falagas, M.E. 2008. Probiotics for the Treatment or Prevention of Atopic Dermatitis: A Review of the Evidence From Randomized Controlled Trials. Am. J. Clin. Dermatol.: 9 (2) : 93 - 103.
Carroll, I.M., Andrus, J.M., Bruno-Ba´rcena, J.M., Klaenhammer, T.R., Hassan, H.M., and Threadgill, D.S. 2007. Anti-inflammatory properties of Lactobacillus gasseri expressing manganese superoxide dismutase using the interleukin 10-deficient mouse model of colitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.:293: G729– G738.
Chang, S.K. and Hassan, H.M. 1997. Characterization of superoxide dismutase in Streptococcus thermophilus. Appl Environ Microbiol.: 63: 3732–3735.
Collado, M. C., Isolauri, E., Salmien ,S., and Sanz , Y. 2009. The impact of probiotic on gut health. Curr Drug Metab.: 10 (1): 68-78.
Chu-Chyn, O., Tsong-Ming, L., Jaw- Ji, T., Jyh-Herng, Y., Haw -Wen, C., dan Meei-Yn, L. 2009. Antioxidative Effect of Lactic Acid Bacteria: Intact Cells vs. Intracellular Extracts. Journal of Food and Drug Analysis: 17 (3) : 209-216 FAO/WHO. 2002. Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for
the Evaluation of Probiotics in Food. London.
Farr, S. B. and Kogoma, T. 1991. Oxidative stress response in Escherichia coli and Salmonellas typhimurium. Microbiol. Rev.: 55: 561-585.
Fuller, R. 1989. A Review, Probiotic in Man and Animals. Journal of Applied Bacteriology : 66: 365-378.
Fridovich, I. 1995. Superoxide radical and superoxide dismutases. Annu. Rev.Biochem. : 64: 97-112
19
Gao,D., Zhu, G., Gao, Z., Liu, Z., Wang, L., and Guo, W., 2011. Antioxidative and hypolipidemic effect of lactic acid bacteria from pickled Chinese cabbage. Journal of Medicinal Plant Research : 5(8) : 1439-1446.
Hardiningsih, R. dan Nurhidayat, N. 2006. Pengaruh Pemberian Pakan Hiperkolesterolemia Terhadap Bobot Badan Tikus Putih Wistar yang Diberi Bakteri Asam Laktat. Biodiversitas: 7(2) : 127-130
Heinonen, O.P, and Albanes, D., 1994, The effect of vitamin E and β-carotene on the incidence of lung cancer and other cancer in male smokers. J.Med. :330: 1029-1035.
Halliwell, B. and Gutteridge, J. M. C. 1999. Free radicals in Biology and Medicine. Clarendon Press.
Isolauri, E, Sutas, Y., Kankaanpaa, Arvilommi, P. H., and Salminen, S. 2001. Probiotics: effects on immunity. Am. J. Clin. Nutr. : 73 (2) : 444 – 450.
Isolauri, E. and Salminen .S. 2008. Probiotics: Use in Allergic Disorders: a Nutrition, Allergy, Mucosal Immunology, and Intestinal Microbiota (NAMI) Research Group Report. J. Clin. Gastroenterol. : 42 (2) : 91 – 96.
Kodali, V.P., Sen, R. 2008. Antioxidant and free radical scavenging activities of an exopolysaccharide from a probiotic bacterium. J. Biotechnol :3 : 245–251.
Klaenhammer, T.R. and Kullen, M.J. 1999. Selection and design of probiotics. Int. J. Food Microbiol. : 50: 45-57.
Kim, H. S. , Chae, H. S., Jeong, S. G., Ham,J. S., Im, S. K., Ahn, C. N. and Lee, J. M. 2005. Antioxidant Activity of Some Yogurt Starter Cultures. Asian-Aust. J. Anim. Sci. : 18 ( 2) : 255-258
Kim, H.S., Jeong, S.G., Ham, J.S., Chae, H.S., Lee, J.M., and Ahn, C.N., 2006a. Antioxidative and probiotic properties of Lactobacillus gasseri NLRI-312 isolated from Korean infant feces. Asian-Aust. J. Anim. Sci. :19: 1335-1341. Kim, H.S., Chae, H.S., Jeong, S.G., Ham, J.S., Im, S.K., Ahn, C.N., and Lee, J.M.
2006b. In vitro antioxidative properties of lactobacilli. Asian-Aust. J. Anim. Sci. :19. (2) : 262-265.
Kumar, M., Nagpal, R., Kumar, Hemalatha, R., Verma,V., Kumar, A., Chakraborty, C., Singh, B., Marotta, F., Jain, S., and Yadav, H., 2012. Experimental Diabetes Research. Article ID 902917, 14 pages doi:10.1155/2012/902917
20
Kullisaar, T., Zilmer, M,, Mikelsaar ,M., Vihalemm, T., Annuk, H., Kairane, C., Kilk, A. 2002. Two antioxidative Lactobacilli strains as promising probiotics. Int. J. Food Microbiol.:72: 215-224.
Lee, D.K., Jang, S., Baek, E.H., Kim, M.J., Lee, K.S., Shin, H.S., Chung, M.J., Kim, J.E., Lee, K.O., and Ha, N.J. 2009. Lactic acid bacteria affect serum cholesterol levels, harmful fecal enzyme activity, and fecal water content. Lipids in Health and Disease. :8: 21
Lee, J., Hwang, K., Chung, M.Y., Chao, D.H., and Park, C.S. (2005). Resistance of Lactobacillus casei KCTC 3260 to reactive oxygen species (ROS): Role for a metal ion chelating effect. J. Food Science: 70: 388-391.
Lin, M.Y., and Yen, C.L. 1999. Antioxidative ability of lactic acid bacteria. J. Agric. Food Chem. : 47 : 1460–1466.
Lutgendorff, F., Trulsson, L.M., van Minnen, L.P. 2008. Probiotics enhance pancreatic glutathione biosynthesis and reduce oxidative stress in experimental acute pancreatitis. Am. J. Physiol. Gastrointest Liver Physiol.: 295: G1111–G1121. Musenga, A., Mandrioli, R., Bonifazi, P., Kenndler, E., Pompei, A., and Raggi, M.A.
2007. Sensitive and selective determination of glutathione in probiotic bacteria by capillary electrophoresis-laser induced fluorescence. Anal Bioanal Chem. : 387 : 917–924.
Marteau, P.R., de Vrese, M., Cellier, C.J., and Schrezeenmeier, J. 2001. Protection from gastrointestinal deseases with the use of probiotics. Am. J. Clin. Nutr.: 73: 430S-436S.
Neha, A., Kamaljit, S., Ajay, B., dan Tarun, G., 2012. Probiotic: as effective treatment of diseases. www.irjponline : 3 (1): 96 - 101
Ooi, L.G. dan Liong, M. T. 2010. Cholesterol-Lowering Effects of Probiotics and Prebiotics: A Review of in Vivo and in Vitro. Int. J. Mol. Sci.: 11(6): 2499–2522. Pato, U. 2003. Potensi bakteri asam laktat yang diisolasi dari dadih untuk menurunkan
resiko penyakit kanker. Jurnal Natur Indonesia : 5(2): 162-166.
Pompella, A., Visvikis, A., Paolicchi, A., De Tata V., and Casini , A.F. 2003. The changing faces of glutathione, a cellular protagonist. Biochem Pharmacol. : 66 : 1499–1503.
21
Peran, L., Camuesco, D., and Comalada, M. 2006. Lactobacillus fermentum, a probiotic capable to release glutathione, prevents colonic inflammation in the TNBS model of rat colitis. Int. J. Colorectal Dis. : 21 : 737–746.
Pant. N., Marcotte, H., Brussow, H., Svensson, L., and Hammarstrom, L. 2007. Effective Prophylaxis Against Rotavirus Diarrhea Using a Combination of Lactobacillus rhamnosus GG and Antibodies. BMC Microbiol. :7 (86): 2180 – 2187.
Sujaya, I N., Utami, D, N.M., Suariani, N.L.P., Widarini, N.P., Nocianitri, K.A., Nursini, N.W.. 2008a. Potensi Lactobacillus Spp. Isolat Susu Kuda Sumbawa Sebagai Probiotik. J. Vet. : 9 : 33-40.
Steel, R.G.D. dan Torrie, J.H. 1993. Prinsip dan prosedur statistic. Penerjemah Bambang Sumantri, PT. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta
Sulistyowati. 2008. Pemanfaatan Yoghurt Sebagai Bahan Penurun Trigliserida Darah Manusia. WAHANA :51 (2) : 18-26.
Sanders, M. E. 2000. Symposium: Probiotic Bacteria: Implications
Sujaya, I N., Minamida, K., Sone, T., Yokota, A., Asano, A. and Tomita, F. 2003. Effects of Long Term Ingestion of DFAIII on Human Intestinal Microbiota. Ann. Meeting of Japan Society for Lactic Acid Bacteria, Tokyo.
Salminen, S., Wright, A.V., and Ouwehand, A., 2004. Lactic acid bacteria, microbiological and functional aspects. Marcel Dekker Inc. USA.
Salazar-Lindo, E., Figueroa-Quintanilla, D., Caciano, M. I., Reto-Valiente, V., Chauviere, G. and Colin, P. 2007. Effectiveness and Safety of Lactobacillus LB in the Treatment of Mild Acute Diarrhea in Children. J. Ped. Gastroenterol. Nutr. : 44 : 571-576.
Torii, S., Torii, A., Itoh, K., Urisu, A., Terada, A., Fujisawa, T., Yamada, K., Suzuki, H., Ishida, Y., Nakamura, F., Kanzato, H., Sawada, D., Nonaka, A., Hatanaka, M., and Fujiwara, S. 2010. Effects of Oral Administration of Lactobacillus acidophilus L-92 on the Symptoms and Serum Markers of Atopic Dermatitis in Children. Int. Arch. Allergy Immunol. :154(3): 236-245
Tabbers, M.M. and Benninga, M.A.. 2007. Administration of Probiotic Lactobacilli to Children With Gastrointestinal Problems : There is Still Little Evidence. Ned. Tijdschr. Geneeskd. : 151 (40) : 2198 – 2202
22
Uni, I. A. S. M. 2012. Isolasi Bakteri Asam Laktat Penghidrolisis Garam Empedu dari Feses Bayi dan Uji Ketahanannya Terhadap pH Rendah untuk Pengembangan Probiotik. Skripsi. Jurusan Biologi, Fakultas MIPA. Unud. Denpasar.
Valko, M, et aI, 2006, Free radical, metal and antioxidant in oxidative stress inducced cancer, J.Chem-BioI, Rusia :160 : 1-40.
Vaughan, E.E., de Vries, M.C., Zoetendal, E.G., Ben-Amor, K., Akkermans, A.D.L., and de Vos, W. M. 2002. The Intestinal LABs. Antonie Van Leeuwenhoek. : 82(1-4):341-352.
WHO (World Health Organization). 2004. Death From Conorary Heart Disease, Risk Factor : Lipid, Available : www. WHO.int/06lipids040527 (Accessed : 2011, April 12)
Zhang, Y., Du, R., Wang, L., Zhang, H. 2010. The antioxidative effects of probiotic Lactobacillus casei Zhang on the hyperlipidemic rats. Eur. Food Res. Technol. : 231:151–158
