BAB III METODE PENELITIAN. Penelitian ini dilakukan di Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret

commit to user BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian bioinformatika yang menganalisis ikatan reseptor estrogen α terhadap fitokimia tumbuhan famili Asteraceae dibandingkan tamoksifen.

B. Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta pada September-Oktober 2014.

C. Subjek Penelitian

Subjek yang digunakan adalah struktur 3D ERα, tamoksifen, dan fitokimia tumbuhan famili Asteraceae yang didapatkan dari database HerbalDB.

1. Struktur ERα

Struktur ERα yang digunakan penulis merupakan struktur 3D yang diunduh dalam bentuk teks *.pdb dari database Protein Data Bank (http://rcsb.org) dengan kode 3ERT. Penulis menggunakan software Chimera 1.10 untuk melakukan preparasi protein dari 3ERT sehingga mendapatkan ERα yang siap dipakai dalam proses molecular docking.

2. Struktur Tamoksifen

Struktur tamoksifen yang digunakan penulis merupakan struktur 3D

yang diunduh dari database Pubchem Compound

(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) dengan Pubchem ID 2733526.

3. Struktur Fitokimia Tumbuhan Famili Asteraceae

Struktur fitokimia tumbuhan famili Asteraceae yang digunakan penulis merupakan struktur 3D yang diunduh dari database Pubchem Compound dengan daftar senyawa fitokimia berasal dari database HerbalDB (http://herbaldb.farmasi.ui.ac.id/v3).

D. Teknik Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel dilakukan dengan cara total sampling yang didapatkan dari database HerbalDB, Pubchem Compound, dan Protein Data

Bank.

E. Rancangan Penelitian

Gambar 3.1. Skema Rancangan Penelitian. Keterangan:

X : Screening tumbuhan. D1 : Database HerbalDB.

D2 : DatabasePubchem Compound.

Z : Struktur 3D fitokimia dari tumbuhan famili Asteraceae. A1 : Struktur 3D fitokimia dari tumbuhan famili Asteraceae ke-1.

A2 : Struktur 3D fitokimia dari tumbuhan famili Asteraceae ke-2.

An : Struktur 3D fitokimia dari tumbuhan famili Asteraceae ke-n.

T : Struktur 3D tamoksifen.

MD : Analisis molecular docking menggunakan AutoDock Vina di dalam PyRx 0.8.

B : Struktur 3D ERα.

SA1 : Skor afinitas ikatan hasil molecular docking antara struktur 3D

fitokimia dari tumbuhan famili Asteraceae ke-1 dan ERα. SA2 : Skor afinitas ikatan hasil molecular docking antara struktur 3D

fitokimia dari tumbuhan famili Asteraceae ke-2 dan ERα. SAn : Skor afinitas ikatan hasil molecular docking antara struktur 3D

fitokimia dari tumbuhan famili Asteraceae ke-n dan ERα. SB : Skor afinitas ikatan hasil molecular docking antara struktur 3D

tamoksifen dan ERα.

V : Visualisasi menggunakan software Pymol 1.7.2.

CSA1 : Lokasi ikatan struktur 3D fitokimia dari tumbuhan famili Asteraceae

ke-1 dengan ERα.

CSA2 : Lokasi ikatan struktur 3D fitokimia dari tumbuhan famili Asteraceae

CSA1n : Lokasi ikatan struktur 3D fitokimia dari tumbuhan famili Asteraceae

ke-

N dengan ERα.

CSB : Lokasi ikatan struktur 3D tamoksifen dengan ERα. F. Identifikasi Variabel

1. Variabel bebas : struktur 3D tamoksifen dan fitokimia dari tumbuhan famili

Asteraceae.

2. Variabel terikat : afinitas ikatan dan lokasi ikatan antara variabel bebas dengan ERα.

G. Definisi Operasional Variabel

1. Variabel bebas : struktur 3D tamoksifen dan fitokimia dari tumbuhan famili

Asteraceae.

Struktur 3D tamoksifen merupakan struktur yang diunduh dari

database Pubchem Compound. Sedangkan struktur 3D fitokimia merupakan

struktur yang diunduh dari Pubchem Compound berdasarkan daftar fitokimia tumbuhan famili Asteraceae pada database HerbalDB. Struktur 3D tamoksifen dan fitokimia yang digunakan untuk docking dalam bentuk *pdbqt.

2. Variabel terikat : afinitas ikatan dan lokasi ikatan antara variabel bebas dan ERα.

Afinitas ikatan yang dimaksud adalah kekuatan senyawa ligan seperti tamoksifen dan fitokimia untuk berikatan dengan ERα. Afinitas ikatan bisa diketahui menggunakan AutoDock Vina dengan satuan energi ikatannya

adalah kkal/mol. Lokasi ikatan merupakan tempat terjadinya ikatan antara ligan dan ERα yang letaknya berada pada urutan asam amino tertentu. Lokasi ikatan bisa diketahui menggunakan visualisasi Pymol 1.7.2.

H. Instrumen Penelitian 1. Hardware:

PC Laptop Asus X200CA yang diproduksi oleh perusahaan ASUSTek

Computer Incorporation pada tahun 2013 di Cina dengan spesifikasi

minimal:

a. Processor Intel® Celeron® CPU 1007U @1.50GHz (2 CPUs). b. RAM 4096 MB.

c. VGA Intel® HD Graphics 1517 MB. d. Screen 11,6” 1366 x 768 pixel. 2. Software:

a. Sistem Operasi Windows 8.0 Pro 32 bit

Windows 8.0 Pro 32 bit merupakan software sistem operasi

komputer versi 8.0 yang diproduksi pada tahun 2012 oleh perusahaan

Microsoft Windows. Software ini bisa diunduh melalui website

http://windows.microsoft.com. b. PyRx 0.8

PyRx versi 0.8 merupakan software untuk penemuan obat secara komputasi yang diproduksi pada tahun 2010 di California. Software ini dikembangkan oleh Sargis Dallakyan dan dapat diunduh secara gratis melalui website http://pyrx.sourceforge.net.

c. Hex 8.0.0

Hex versi 8.0.0 merupakan software docking yang diproduksi pada tahun 2013 di Prancis. Software ini dikembangkan oleh Dave Ritchie dan dapat diunduh secara gratis melalui website http://hex.loria.fr.

d. MGLTools 1.5.6

MGLTools versi 1.5.6 merupakan software yang berfungsi dalam menentukan grid box selama proses docking. Software ini diproduksi pada tahun 2012 di California yang dikembangkan oleh The Scripps Research

Institute dan dapat diunduh secara gratis melalui website

http://mgltools.scripps.edu. e. Chimera 1.10

Chimera versi 1.10 merupakan software yang berfungsi dalam melakukan preparasi protein target. Software ini diproduksi pada tahun 2014 oleh The Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics Universitas California dan dapat diunduh secara gratis melalui website http://cgl.ucsf.edu/chimera.

f. Pymol 1.7.2

Pymol versi 1.7.2 merupakan software yang berfungsi dalam melakukan visualisasi hasil docking. Software ini dikproduksi pada tahun 2014 oleh Schrodinger dan dapat diunduh secara gratis melalui website http://pymol.org.

I. Cara Kerja Penelitian

1. Preparasi Protein ERα Menggunakan Chimera

a. Mempersiapkan protein ERα sebagai reseptor yang diinginkan dengan mengunduh kompleks 3ERT.pdb dari http://rcsb.org.

b. Membuka software Chimera 1.10. Kemudian memilih menu “File”  “Open”  memilih file 3ERT.pdb yang sudah diunduh pada folder penyimpanan  “Open”.

c. Memilih dan menghapus ligan 4-hydroxytamoxifen (OHT) dan HOH dari kompleks. Memilih menu “Select”  “Residue”  “all nonstandard”. Selanjutnya memilih menu “Actions”  “Atoms/Bonds”  “delete”. d. Menggunakan menu “Dock Prep” untuk menyelesaikan preparasi reseptor.

Memilih menu “Tools”  “Structure Editing”  “Dock Prep”. Setelah muncul jendela “Dock Prep”, memilih “OK”. Kemudian muncul jendela “Add Hydrogens for Dock Prep”, memilih “OK”. Kemudian muncul jendela “Assign Charges for Dock Prep”, pada pilihan “other residue” tandai Gasteiger dan memilih “OK”.

e. Menyimpan hasil ERα dalam bentuk *.mol2 pada folder tertentu. Mengetik nama reseptor yang diinginkan dan memilih “save”.

f. Memilih menu “Select”  “Chemistry”  “element”  “H”. Setelah itu, memilih menu “Actions”  “Atom/Bonds”  “delete”.

g. Menyimpan hasil ERα dalam bentuk *.pdb. Memilih menu “File”  “Save PDB”. Kemudian muncul jendela penyimpanan yang baru. Mengetik nama reseptor yang diinginkan dan pilih “save”.

h. Persiapan ERα untuk proses molecular docking telah selesai. 2. Preparasi Protein ERα Menggunakan PyRx

a. Langkah ini merupakan kelanjutan dari cara kerja nomer 1.

b. Membuka software PyRx 0.8, kemudian memilih menu “File”  “Load Molecule”  memilih reseptor ERα dalam bentuk *.pdb yang sudah dilakukan preparasi menggunakan Chimera.

c. Kemudian melakukan klik kanan pada tulisan ERα  pilih “AutoDock”  “Make Macromolecule”.

d. Setelah itu, akan muncul jendela bertuliskan “Select Conformation”  memilih “OK”.

e. Reseptor ERα telah berhasil diubah bentuknya menjadi *.pdbqt sehingga persiapan reseptor selesai.

3. Preparasi Ligan

a. Membuka software PyRx 0.8, kemudian memilih menu “Open Babel” pada jendela bawah yang bertuliskan “Controls”.

b. Menambahkan semua struktur 3D tamoksifen dan fitokimia tumbuhan famili Asteraceae yang diunduh dari Pubchem Compound dalam bentuk *.sdf. Caranya dengan memilih gambar icon kelima (“insert new item”) dari kiri pada jendela “Open Babel”  “Open”.

c. Setelah memilih semua struktur 3D dan memasukkan ke dalam “Open Babel”, menggunakan mouse untuk klik kanan pada struktur yang dimasukkan  memilih “Convert All to AutoDock Ligan (pdbqt)”.

d. Ligan telah berhasil diubah bentuknya menjadi *.pdbqt sehingga persiapan ligan selesai.

4. Penentuan Grid Box Menggunakan MGLTools

a. Membuka software MGLTools 1.5.6, kemudian memilih menu “File”  “Read Molecule”  memilih kompleks 3ERT.pdb pada penyimpanan  “Open”.

b. Memilih tanda seperti panah di depan 3ERT.pdb pada jendela sebelah kanan terlihat jendela “DashBoard”. Memilih tanda panah lagi di depan “A”, kemudian mencari senyawa OHT 600 dan memilihnya. Pada jendela kanan akan terlihat adanya gambran struktur dengan warna yang berbeda yaitu OHT 600.

c. Memilih menu “Grid”  “Grid Box”  muncul jendela baru “Grid Options”.

d. Menentukan “Center Grid Box” dengan mengubah nilai x, y, dan z sehingga terlihat kotak menutupi gambaran sturktur OHT 600. Hal ini bisa dipastikan dengan cara memutar gambar secara 3 dimensi menggunakan

cursor.

e. Penentuan “Center Grid Box” yang merupakan nilai x, y, dan z telah selesai.

5. Validasi Metode Docking Menggunakan Pymol a. Membuka software Pymol 1.7.2.

b. Memilih menu “File”  “Open”  memilih ligan hasil docking dalam bentuk *.pdbqt yang dalam penelitian ini menggunakan Pubchem ID 449459 (4-hydorxytamoksifen)  “Open”.

c. Memilih menu “File”  “Open”  memilih ligan (4-hydroxytamoxifen) dari struktur kristal 3ERT yang telah dipisahkan dari proteinnya dan disimpan dalam bentuk *.pdb  “Open”.

d. Memilih menu “Wizard”  “Pair Fitting”  memilih atom dari poin b sebagai mobile atom  memilih atom dari poin c sebagai fixed atom  memilih menu “Fit (jumlah atom yang dipilih) Pairs”.

e. Pada tampilan kiri atas dari visualisasi molekul akan terlihat nilai dari Root

Mean Square Deviation.

6. Proses Docking Menggunakan PyRx

a. Membuka software PyRx 0.8, kemudian memilih “Vina Wizard” pada jendela bawah yang bertuliskan “Controls”.

b. Pada jendela “Start Here” pilih “Start”.

c. Kemudian muncul jendela “Select Molecules”, pilih “Add Macromolecule”. Selanjutnya memilih makromolekul ERα.

d. Memilih “Add Ligan”, kemudian memilih ligan yang sudah diproses menggunakan Open Babel sebelumnya.

e. Memilih “Forward”.

f. Menyesuaikan nilai grid box pada jendela “Vina Search Space” sesuai hasil yang dipreoleh pada langkah nomer 4. Kemudian memilih “Run Vina”.

g. Ketika hasil AutoDock Vina sudah muncul, terlihat kuat ikat dan tempat berikatan ligan terhadap reseptor. Setelah itu, menyimpan hasil data AutoDock dengan memilih icon nomor kedua dari kiri (“Save as Comma-Separated Values”) pada jendela “Analize Results”. Mengetik nama file yang diinginkan, kemudian pilih “OK”.

h. Proses docking menggunakan PyRx 0.8 telah selesai. 7. Analisis Hasil Docking Menggunakan PyRx

a. Membuka hasil proses docking yang telah disimpan sebelumnya dalam bentuk *.csv.

b. Hasil proses docking akan terlihat dalam tabel dengan judul masing-masing kolomnya: “Ligand”, “Binding Affinity”, “rmsd/ub”, dan “rmsd/lb”.

c. Melakukan pengurutan data berdasarkan nilai “rmsd/ub” dan “rmsd/lb” dengan nilai 0 sehingga didapatkan afinitas ikatan yang terkecil dari masing-masing ligan.

d. Kemudian mencari ligan yang mempunyai nilai afinitas ikatan lebih kecil dari tamoksifen. Ligan tersebut akan dipakai dalam proses docking menggunakan Hex.

8. Proses Docking Menggunakan Hex

a. Berdasarkan hasil docking menggunakan PyRx didapatkan ligan yang mempunyai nilai afinitas ikatan lebih kecil dari tamoksifen. Ligan ini akan dipakai dalam proses docking menggunakan Hex.

c. Memilih menu “File”  “Open”  “Reseptor”  memilih protein ERα dalam bentuk *.pdb pada tempat penyimpanan  “OK”.

d. Memilih menu “File”  “Open”  “Ligand”  memilih ligan dalam bentuk *.sdf pada tempat penyimpanan  “OK”.

e. Memilih menu “Controls”  “Docking”.

f. Mengubah pilihan pada “Correlation Type” menjadi “Shape + Electro + DARS” kemudian memilih “Activate”. Kemudian akan muncul jendela baru yang menunjukkan kemajuan proses docking Hex.

g. Ketika proses docking telah selesai, akan terlihat nilai energi yang digunakan.

h. Memilih menu “File”  “Save”  “Both”  memilih lokasi tempat penyimpanan dan mengetikkan nama dalam bentuk *.pdb  “OK”. i. Hasil didapatkan kompleks ligan-protein yang menjadi satu dan proses

docking menggunakan Hex telah selesai.

9. Visualisasi Hasil Docking Menggunakan Pymol a. Membuka software Pymol 1.7.2.

b. Memilih menu “File”  “Open”  memilih hasil docking menggunakan Hex pada tempat penyimpanan  “Open”.

c. Gambaran struktur 3D hasil docking akan terlihat pada jendela kiri, sedangkan jendela kanan akan terlihat nama hasil docking yang sedang terbuka.

d. Memilih icon “Action” di sebelah kanan nama hasil docking  “Preset”  “Publication”

e. Terlihat ligan dan reseptor dalam tampilan yang bagus untuk publikasi. f. Memilih icon “Action” di sebelah kanan nama hasil docking  “Preset”

 “Ligands”.

g. Terlihat gambaran struktur yang menjadi fokus terhadap ligan yang berikatan dengan reseptor ERα pada jendela kiri.

h. Mencari letak ikatan hidrogen dengan indikator garis putus-putus warna kuning.

i. Melakukan pencarian asam amino yang letaknya berdekatan dengan ligan. Kemudian memilih semua asam amino yang diduga menjadi tempat ikatan.

j. Memilih menu “Label” pada icon sebelah kiri “<sele>”  “Residue”  akan terlihat nama asam amino yang telah dipilih tadi. Kemudian mencatat hasil yang ditemukan.