O OH HO OH OH OH
BIOESAI MELIBATKAN ENZIM
S2-Kimia Institut Pertanian Bogor
Company
LOGO
Agenda
Pendahuluan
Yang perlu diperhatian untuk esai dengan
enzim
Pengembangan metode esai cepat enzim
untuk penapisan bahan alam: Contoh
LOGO
Pendahuluan
Enzim tertentu adalah molekul target
untuk penemuan obat dan banyak obat
ditemukan dengan melibatkan enzim
target dalam penapisannya.
Biasanya esai ini memanfaatkan enzim
yang dimurnikan sebagian atau murni dari
manusia dan melibatkan pengukuran
pembentukan produk menggunakan
beberapa metode seperti radiometri,
kolorimetri dan fluorometri
Company
LOGO
Yang perlu diperhatikan dalam
pengembangan esai dengan enzim
Sumber enzim
Konsentrasi enzim yang digunakan
Menentukan substrat dan konsentrasi esai akhir
Perlunya kofaktor dan konsentrasi esai akhir
Penentuan batas akhir analisis
pH analisis
Suhu analisis
Profil inhibitor
Kompatibiliti DMSO
Kompatibiliti ekstrak
Company
LOGO
Yang perlu diperhatikan dalam
pengembangan esai dengan enzim
Sebelum mengembangkan metode esai
enzim, perlu dipelajari mekanisme reaksi
enzim yang mungkin.
Apakah reaksi enzim melibatkan satu jenis
substrat atau multisubstrat, mekanisme
katalisis, apa kofaktor yang diperlukan
faktor yang meregulasi aktivitas enzim
Company
LOGO
Memilih sumber enzim Memilih konsentrasi enzim
Memilih substrat dan konsentrasi substrat Memilih konsentrasi kofaktor
Memilih pH analisis Memilih suhu analisis Kompatibilitas DMSO Kompatibilitas ekstrak Profil inhibitor Inhibisi kompetitif Inhibisi unkompetitif Inhibisi nonkompetitif
Yang perlu diperhatikan dalam
pengembangan esai dengan enzim
LOGO
Memilih sumber enzim
Sebaiknya yang berasal dari manusia untuk tujuanpengobatan
Sebagian besar enzim yang diisolasi dari spesies yang berbeda mungkin sangat homolog tapi mungkin tidak sama sifatnya dengan enzim manusia
Umumnya sulit mengisolasi enzim langsung dari manusia Sel manusia atau cell lines secara praktis merupakan
sumber enzim
Setelah sumber enzim ditentukan murnikan enzim hingga jumlah yang cukup untuk penapisan
Pemurnian enzim memberikan bobot yang kecil karena kehilangan selama pemurnian atau rusak saat dimurnikan
Company
LOGO
Memilih sumber enzim
Metode yang paling mudah untuk
memproduksi enzim untuk esai penapisan
ialah melakukan clone dan ekspresi enzim
manusia pada sistem yang sesuai
Beberapa suplayer telah menyediakan
enzim dengan beberapa tingkat kemurnian
Makin murni biasanya makin tinggi
Company
LOGO
Memilih konsentrasi enzim
Jumlah enzim yang digunakan dalam esai
sebaiknya diminimalkan tetapi tetap harus
memenuhi syarat S/N yang baik
Dicoba esai menggunakan enzim dengan
beberapa konsentrasi lalu diputuskan
berapa konsentrasi enzim terrendah yang
baik digunakan untuk esai tsb
Stabilitas enzim sering berkurang karena
penyimpanan perlu dicek sebelum
melakukan esai
Company
LOGO
Memilih substrat dan konsentrasi
substrat
A. esai enzim reversible dengan 1 substrat
Substrat tipe ini biasanya tinggi afinitasnya untuk
berinteraksi dengan enzim cukup dengan jumlah substrat yang sedikit dapat memberikan esai yang sensitif untuk identifikasi inhibitor yang berkompetisi dengan substrat pada sisi aktif
Secara fisiologis substrat yang digunakan biasanya memiliki nilai Km yang kecil, tetapi beberapa esai menggunakan peptida sintesis atau turunan peptida. Km enzim untuk substrat tertentu ditentukan secara percobaan dengan menentukan hubungan konsentrasi substrat pada laju reaksi awal
LOGO
substrat
A. esai enzim reversible dengan 1 substrat
Pada konsentrasi rendah, laju reaksi awal setara dengan konsentrasi substrat dan reaksi mengikuti laju reaksi orde pertama terhadap substrat.
Jika konsentrasi enzim meningkat laju reaksi tidak bergantung pada konsentrasi substrat atau laju mengikuti reaksi orde ke-nol.
Berdasarkan persamaan Michaelis-Menten untuk substrat tunggal:
Company
LOGO
Memilih substrat dan konsentrasi
substrat
A. esai enzim reversible dengan 1 substrat
Secara umum, direkomendasikan bahwa nilai Km dari substrat
dimasukkan dalam esai enzim dengan satu substrat.
Di bawah nilai Km, S/N akan terlalu rendah
Penggunaan enzim di atas nilai Km akan meningkatkan nilai S/N tetapi makin tidak sensitif dalam mendeteksi inhibitor kompetitif karena sangat banyak substratnya
Company
LOGO
Memilih substrat dan konsentrasi
substrat
B. esai enzim reversible dengan 2 substrat
Penentuan Km untuk 2 substrat mirip dengan metode 1 substrat
Konsentrasi B tetap pada tingkat jenuh dan konsentrasi A bervariasi untuk ditentukan efeknya pada laju reaksi dan nilai Km untuk A yang ditulis sebagai KmA
Secara umum 3 konsentrasi B yang tetap digunakan Kebalikannya KmB ditentukan pada konsentrasi A jenuh yang tetap dan konsentrasi B bervariasi
Reaksi enzim - 2 substrat umumnya berada pada 2 kelas umum yaitu single- dan double- displacement enzyme reaction
Company
LOGO
Memilih substrat dan konsentrasi
substrat
B. esai enzim reversible dengan 2 substrat
Reaksi enzim single-displacement: kedua substrat A dan B akan berikatan dengan enzim untuk membentuk kompleks ternary. Substrat A dan B akan berasosiasi dengan enzim dalam keadaan acak atau beraturan
Reaksi enzim double-displacement, satu substrat harus berikatan pada enzim dan satu produk dilepaskan sebelum substrat kedua berikatan dan berdisosiasi dari enzim
LOGO
substrat
B. esai enzim reversible dengan 2 substrat
Dalam reaksi 2 substrat dapat ditentukan esai digunakan untuk inhibitor substrat A atau B yang berinteraksi dengan enzim Contoh: reaksi protein kinase
Substrat: ATP dan peptida yang akan
difosforilasi
Biasanya digunakan inhibitor uantuk
peptida fosfat dan bukan inhibitor untuk ATP
Esai melibatkan jumlah ATP yang jenis
dan nilai Km untuk peptida
Akan dihasilkan esai yang sensitif untuk
mendapatkan inhibitor kompetitif
Company
LOGO
Memilih konsentrasi kofaktor
Banyak enzim memerlukan kofaktor untuk aktivitasmaksimal
Setelah kofaktor ditentukan, perlu ditentukan konsentrasi kofaktor yang diperlukan untuk aktivitas enzim yang optimal
Secara umum, konsentrasi jenuh harus digunakan dalam esai penapisan
Contoh esai enzim NO sintase harus mengandung jumlah kofaktor NADPH, tetrahidrobiofterin, kalsium dan kalmodulin dalam konsentrasi jenuh
Company
LOGO
Memilih titik akhir esai
3 tipe esai yang umum digunakan:
Radiometrik sangat sensitif dan bisa untuk
automatis, perlu substrat dan produk yang terlabel, tidak baik untuk volume yang besar karena biaya yang mahal dan limbahnya
Kolorimetrik kurang sensitif tetapi banyak untuk
high troughput screening. Perhatikan warna sampel yang mungkin muncul yang mengganggu nilai titik akhir
Fluorometrik sangat sensitif dan digunakan HTS.
Natural produk dapat mengganggu nilai titik akhir. Yang paling banyak digunakan karena S/Nnya memungkinkan dia untuk diminiaturisasi
Company
LOGO
Memilih pH esai
Kebanyakan enzim memiliki nilai pH optimum
untuk aktivitas maksimal
Hubungan aktivitas enzim dan pH untuk enzim
merupakan fungsi lonceng
Perlu menentukan pH optimum dengan
pengukuran sederhana pada nilai pH yang
berbeda untuk konsentrasi substrat jenuhnya
Nilai Km juga bergantung pH yang digunakan
LOGO
Memilih suhu esai
Suhu esai juga penting untuk ditentukan
Umumnya reaksi enzim meningkat dengan
meningkatnya suhu (laju meningkat 2 kali tiap
kenaikan 10
oC)
Tetapi peningkatan suhu dapat mendenaturasi
enzim atau terjadi proteolisis pembatas suhu
inkubasi
Untuk tujuan praktis esai biasanya dilakukan
pada suhu ruang sehingga tidak memerlukan
inkubator
Company
LOGO
Kompatibitas DMSO
Ekstrak kering natural produk biasanya
dilarutkan dalam DMSO sebelum
digunakan untuk uji
Semakin tinggi konsentrasi DMSO dalam
esai, semakin tinggi kemungkinan
metabolit sekunder ada di dalam larutan
Perlu diperhatikan apakah esai enzim
tolerance terhadap konsentrasi DMSO
berbeda yang digunakan
Company
LOGO
Kompatibitas Ekstrak
Senyawa kimmia berbeda dalam ekstrak
dari berbagai organisme memberikan tipe
metabolit sekunder yang berbeda
Perlu dievaluasi dan ditentukan
konsentrasi optimalnya termasuk dalam
skrining
Secara umum yang digunakan antara
0.1% - 1%
Company
LOGO
Profil Inhibitor
Perlu mengetahui tipe inhibitor
Nilai Ki dan mekanisme inhibisi dapat ditentukan
dibandingkan dengan informasi dari literatur
Aktivator enzim juga merupakan info yang
menarik untuk diketahui
3 tipe inhibitor enzim cek dari Vmax dan nilai
Km ditentukan Ki-nya
Kompetitif Unkompetitif nonkompetitif
LOGO
Profil Inhibitor
Inhibisi Kompetitif
Inhibitor yang
berkompetisi dengan
substrat pada sisi aktif
enzim
Inhibisi kompetitif dapat
berkurang dengan
meningkatkan
konsentrasi substrat
Km meningkat, tidak
mengubah Vmax
CompanyLOGO
Profil Inhibitor
Inhibisi Unkompetitif
Inhibitor yang tidak
berinteraksi dengan
enzim bebas tetapi
berinteraksi dengan
kompleks
enzim-substrat sehingga
menghambat
pembentukan produk
Km dan Vmax turun
Company
LOGO
Profil Inhibitor
Inhibisi Nonkompetitif Inhibitor yang berinteraksi dengan
enzim bebas atau dengan kompleks enzim-substrat
Biasanya berikatan dengan enzim
bukan pada sisi aktif dan mengubah konformasi enzim sehingga enzim tidak berfungsi sehingga tidak terbentuk kompleks substrat-enzim atau dekomposisi menghasilkan satu produk dengan laju tipikal
Jarang ditemukan, kadang disebut
mixed inhibition
Km tetap dan Vmax turun saat ada
inhibitor
Company
LOGO
Profil Inhibitor
Dari poin pencarian obat, inhibitor nonkompetitif
tidak terlalu diutamakan dibandingkan inhibitor
kompetitif dan diperkirakan lebih nonselektif dan
dapat menghambat berbagai enzim
Untuk enzim 2 substrat, pengaruh peningkatan
konsentrasi inhibitor dievaluasi pengaruhnya
dihubungkan dengan substrat A dan substrat B
pada nilai Km dan Vmax ditentukan dari
LOGO
untuk penapisan bahan alam: Contoh
Farnesiltransferase:
enzim yang mengatalisis penambahan C15 farnesil
isoprenoid ke substrat protein pada asam amino C terminal
Ras: substrat fisiologis
Beberapa kanker manusia resisten untuk obat
antikanker konvensional seperti kanker kolon dan pankreas, kadar Ras protein yang termutasi ditemukan tinggi
Inhibitor Ras farnesilasi merupakan agen antikanker Enzim yang mengandung Zn protein sitosolik
heterodimer mengandung subunit dan yang memerlukan ion Zn dan Mg untuk aktivitas
Company
LOGO
Pengembangan metode esai cepat enzim
untuk penapisan bahan alam: Contoh
Farnesiltransferase:
subunit berikatan dengan farnesilpirofosfat dan dibagi ke
enzim isoprenilasi yang berhubungan seperti
geranilgeraniltransferase. Sub unit berikatan dengan substrat.
Perlu dicek tipe inhibitor apa yang ditentukan
Inhibitor kompetitif ikatan farnesilpirofosfat tidak diharapkan
karena akan juga menjadi inhibitor untuk geranilgeranil
transferase selektivitasnya berkurang dan menyebabkan efek kebalikan.
Yang dicari inhibitor pada subunit karena lebih selektif Perlu mencari sumber enzim farnesiltransferase yang cocok,
otak tikus tidak cocok (50 otak tikus hanya untuk 100 assay plates)
Company
LOGO
Pengembangan metode esai cepat enzim
untuk penapisan bahan alam: Contoh
Farnesiltransferase:
Metode radiometrik Company LOGOTirosinase
COOH NH2 HO COOH NH2 HO COOH NH2 O HO O tirosin dopakuinon dopa TYR TYR N H HO HO COOH leukodopakrom N H+ -O O COOH dopakrom N H HO HO COOH N H O O COOH N H HO HO -CO2 N H O O DHI IQ DHICA ICAQ TYR TRP-2 TRP-1 eumelanin COOH NH2 HO HO COOH NH2 HO S H2N COOH N S sisteinildopa HBTA f eomelanin glutation atau sistein Eumelanogenesis FeomelanogenesisLOGO
Metode
•Tirosinase mushroom •Sampel atau pelarut
5 min L-tirosin L-DOPA (substrat) 30 min Absorbans pada 490 nm Kontrol positif: •Asam kojat IC 50 Company LOGO
Jerawat
Acne is the most common skin
disease characterized by pimples on the face, chest, and back.
It occurs when the pores of the
skin clogged with oil, dead skin cells, and bacteria
(Propionibacterium acnes).
bacteria antibacterial bacteria
grow
acne is formed
lipase
triglycerides free fatty
acids Inflammation
ROS
antioxidant
Company
LOGO
Lipase inhibitory assay
•DTNB •PMSF •Crude lipase •Sample or solvent 30oC 5 min BALB (substrate) 30oC 30 min Stopping reagent Absorbance at 414 nm Positive controls: •Tetracycline •Chloramphenicol •IPMP IC50: concentration that
can inhibit 50% lipase reaction
DTNB: 5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) PMSF: phenylmethylsulphonyl fluoride BALB: dimercaptopropanol tributyrate
