ISBN: 978-602-97051-7-1 E-ISSN :
DOI :
699 ISOLASI PROTEIN DAN ANALISIS ASAM AMINO KONSENTRAT
PROTEIN DAUN KALIANDRA SEBAGAI UPAYA PENYEDIAAN SUPLEMEN PAKAN TERNAK: 1. Kualitas Asam Amino Konsentrat Protein Hasil
Ekstraksi Daun Kaliandra
Yatno1*, Nelson1, Rasmi Murni1, Suparjo1, Hanna Laily Syarifa2 1) Staf Pengajar Prodi Peternakan, Fak. Peternakan, Universitas Jambi
2 Alumni Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Jambi
Alamat kontak : Jl. Jambi-Ma.Bulian KM 15 Mendalo Darat Jambi 36361 Email: yatnoyatno97@yahoo.co.id . * Corresponding Author
The Research aims to determine the effect of extraction using various combination of pH acetat buffer solution pH 4,0; 4,6 and 5,2 to amino acid content of Caliandra Leaf Protein Concentrate (CLPC). Completely Randomized Design (CRD) with 3 treatments and 5 replications. The Caliandra Leaf Meal (CLM) (50 gram) was blended in acetat buffer solution (200 ml) pH 4,0; 4,6 and 5,2 for 15 menit and centrifuged to separate the supernatant from extracted CLMandprecipitated with buffer mix phospat (citric acid and Na2HPO4) until isoelectric point. The treatments were tested consisted of extracted with acetat buffer solution pH 4,0; 4,6 and 5,2. The parameters measured; isoelectric point at precipited, total non essential amino acid (TNEAA), total essential amino acid (TEAA) and Essential Amino Acid Index (EAAI).Amino acids content analysis by high performance liquid chromatography (HPLC). The results of analysis by HPLC showed that the content of total amino acids and essential amino acids index of Caliandra Leaf Protein Concentrate (CLPC) decreased with increasing pH buffer solution, except for the total content of the essential amino acid buffer solution pH 4.0 is lower than pH 4.6. CLPC contains all of amino acids except asparagine, glutamine, and tryptophan.
---Keyword: Extraction, Protein, Concentrate, Calliandra calothyrsus, Amino Acid PENDAHULUAN
Tumbuhan kaliandra kini mulai dibudidayakan karena banyaknya manfaat penggunaannya seperti sebagai pakan ternak, tanaman penghijauan, penahan longsor, dan batangnya sering digunakan untuk kayu bakar. Kaliandra digunakan secara luas untuk pakan ternak karena daun, bunga, dan tangkai mempunyai kandungan protein 20-25%, cepat tumbuh, dan kemampuan bertunas tinggi setelah pemangkasan (Patterson et al., 1997; Roshetko, 2000).
Produksi bahan pakan protein dari daun tampak memiliki keunggulan tersendiri karena tidak menyangkut biaya berulang (recurring cost) untuk budidaya seperti halnya hasil pertanian (Pirie, 1966; Tangka, 2003). Konsentrat protein daun adalah bentuk protein terkonsentrasi yang ditemukan dalam daun tanaman. Daun tanaman merupakan salah satu sumber protein, sehingga bisa dijadikan sumber suplement pakan (Kumar et
ISBN: 978-602-97051-7-1 E-ISSN :
DOI :
700 al., 2013). Nilai biologis konsentrat protein daun terletak di antara kedelai dan susu (Belitz et al., 2009). Beberapa peneliti melaporkan bahwa pembuatan konsentrat protein dari daun paku air (Azolla africana Desv) mampu meningkatkan protein 3 kali lebih tinggi dari bahan awal yaitu dari 28,10% menjadi 71,30% dan daun kiambang (Spirodela polyrrhiza L. Schleiden) dari 25.00% menjadi 64.60% (Fasakin, 1999).
Kualitas protein bukan hanya ditentukan dari jumlahnya, tetapi juga sangat ditentukan oleh susunan asam amino yang terkandung di dalamnya. Menurut Winarno (2008)dan Cairunisah (2011) apabila protein mengandung semua asam amino penting dalam jumlah yang diperlukan tubuh, maka protein ini mempunyai mutu yang tinggi. Kacang-kacangan, polong-polongan, dan legum lain mempunyai protein paling lengkap tapi tidak mengandung metionin. Hal ini bisa dicukupi dengan mengkonsumsi protein nabati yang berbeda dan saling melengkapi kekurangan beberapa jenis asam amino (Wade, 2003).
Untuk mempertahankan struktur dan fungsi protein, ekstraksi dilakukan pada suhu rendah (0 - 4ºC) dalam buffer dan pH tertentu (tergantung dari jenis protein yang akan dianalisa) (Satwika, 2010). Digunakan larutan buffer asetat karena sistem buffer natrium asetat-asam asetat termasuk buffer yang umum digunakan. Larutan buffer asetat dipilih pada pH 4,0; 4,6; dan 5,2 untuk dilihat apakah berpengaruh terhadap kandungan total asam amino dan indeks asam amino esensial. Penelitian ini dirancang untuk meng identifikasi asam amino pada konsentrat protein daun kaliandra dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi.
METODOLOGI PENELITIAN Alat dan Bahan Penelitian
Daun kaliandra, asam asetat, natrium asetat, natrium hidroksida, asam klorida, picolotiosianat, trietilamin, metanol, dan aquades.Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah blender, gelas–gelas kimia, neraca analitik, batang pengaduk, Sentrifuge Sigma 3-18KS, kulkas, pH meter Martini Instrument Mi 150, oven, corong kaca, gelas kimia, labu destruksi, dan HPLC.
ISBN: 978-602-97051-7-1 E-ISSN :
DOI :
701 Tahap Ekstraksi Protein
Ekstraksi menggunakan buffer asetat pH 4,0; 4,6; dan 5,2. Daun kaliandra sebanyak 50 gram dan 200 mL buffer asetat diblender selama 6 x 15 detik. Masing-masing pH buffer asetat diulangi sebanyak 5 kali. Setelah diblender kemudian sampel disentrifugasi dengan kecepatan 4500 rpm dan selama 15 menit untuk memisahkan residu dan filtrat.
Filtrat dari masing-masing konsentrasi diambil dan dimasukkan ke dalam 5 buah labu erlenmeyer sebanyak 15 mL sehingga diperoleh 45 labu.Larutan filtrat diukur pH awalnya kemudian diatur pH-nya mulai dari 3 sampai dengan pH 7 dengan cara menambahkan HCl 0,1 N ataupun NaOH 0,1 N sedikit demi sedikit hingga pH mencapai 3, 4, 5, 6, dan 7.Selanjutnya diinkubasi selama beberapa hari pada suhu dingin. Sampel disentrifugasi pada kecepatan 4700 rpm selama 30 menit.Endapan yang diperoleh dipisahkan dari filtrat dan dikeringkan pada suhu ruangan kemudian ditimbang. Jumlah endapan yang paling tinggi merupakan indikator titik isoelektrik dan dipakai sebagai dasar dalam produksi Konsentrat Protein Daun Kaliandra (KPDK).
Produksi konsentrat protein dilakukan dengan mengendapkan ekstrak protein dengan HCl/NaOH 0,1 N pada titik isoelektrik dan disentrifus pada kecepatan 4700 rpm selama 30 menit kemudian disaring. Endapan diambil dan dikeringkan dengan oven
dengan suhu 40oC selama 30-90 menit untuk selanjutnya dianalisis kandungan asam
aminonya. Produk endapan yang dihasilkan selanjutnya disebut Konsentrat Protein
Daun Kaliandra (KPDK).
Analisis Asam Amino dan IAAE
Sampel dihidrolisis asam menggunakan HCl 6 N sebanyak 5-10 mL yang
kemudian dipanaskan dalam oven pada suhu 100oC selama 24 jam. Sampel yang telah
dihidrolisis dibilas dengan 30 mL larutan pengering (metanol, picolotiocianat, dan trietilamin) dan cairan bilasan dimasukkan ke dalam labu evaporator. Sampel kemudian dikeringkan menggunakan rotary evaporator selama 15-30 menit.
Larutan derivatisasi sebanyak 30 μl ditambahkan pada hasil pengeringan (metanol, Na-asetat, dan trimetilamin). Selanjutnya dilakukan pengenceran dengan cara menambahkan 10 ml asetonitril 60 % dan natrium asetat 1 M lalu dibiarkan selama 20 menit. Injeksikan ke dalam HPLC sebanyak 5 μL.
ISBN: 978-602-97051-7-1 E-ISSN :
DOI :
702 HASIL DAN PEMBAHASAN
Titik Isoelektrik Protein Daun Kaliandra
Sampel daun kaliandra dalam penelitian ini diperoleh dari daerah Dusun Tuo Kabupaten Merangin Jambi. Pengendapan isoelektrik memanfaatkan sifat protein yang muatannya ditentukan dari pH lingkungan. Muatan total protein merupakan jumlah muatan positif dan negatif yang ditentukan oleh rantai samping terionisasi dari asam amino penyusun dan gugus prostetik protein. Jika jumlah gugus asam protein melebihi jumlah gugus basa, pH isoelektrik protein akan bernilai pH rendah dan protein yang diklasifikasikan sebagai asam. Protein menunjukkan variasi dalam pI yaitu antara pH 4-7 (Davey dan Lord, 2003).
Keadaan tercapainya pH isoelektrik protein diketahui dari jumlah endapan terbanyak pada pengaturan pH presipitasi dengan menggunakan HCl/NaOH 0,1 N yaitu pada pH 3, 4, 5, 6, dan 7. Setelah ditimbang diketahui bahwa protein paling banyak mengendap pada pH 7 untuk semua pH larutan pengekstrak seperti pada Gambar 4.
Gambar 1. Titik Isoelektrik protein (penambahan HCl/NaOH 0,1 N)
Berdasarkan Gambar 1 terlihat bahwa endapan protein yang paling banyak dicapai pada pH 7 sebesar 0,0526; 0,0555; dan 0,0542 gram dalam 15 mL ekstrak daun kaliandra. Ini berarti bahwa pada pH 7 paling mendekati titik isoelektrik protein. Pada dasarnya setiap bahan memiliki pH isoelektrik yang berbeda-beda tergantung pada asam amino yang terkandung di dalamnya. Protein memiliki titik isoelektrik yang berbeda karena urutan asam amino yang berbeda, sehingga dapat dipisahkan dengan mengatur pH dari larutan. Ketika pH disesuaikan dengan titik isoelektrik protein tertentu ia mengendap meninggalkan protein lain dalam larutan (McClements, 2013). Lebih spesifik, pH isoelektrik protein besarnya tergantung pada radikal karboksil bebas, yang cenderung
0,028 0,053 0,006 0,023 0,055 0,012 0,054 jumla h e n d ap an (gr am) pH pH 4.0 pH 4.6 pH 5.2
ISBN: 978-602-97051-7-1 E-ISSN :
DOI :
703 membentuk radikal bermuatan negatif sehingga nilai titik isolistriknya rendah. Sebaliknya, protein yang kaya akan radikal amino bebas mempunyai nilai titik isoelektrik tinggi (Sumardjo, 2009).
Kandungan Total Asam Amino KPDK
Asam amino nonesensial yang terdapat pada konsentrat protein daun kaliandra adalah asam aspartat, asam glutamat, prolin, alanin, serin, sistin, glisin, dan tirosin. Kandungan total asam amino nonesensial dapat dilihat pada Gambar 2. Asam amino nonesensial tertinggi didapat dari hasil ekstraksi dengan perlakuan P1 yaitu berjumlah 5,3 % sedangkan dari perlakuan P2 menghasilkan asam amino dengan total 5,19 %. Asam amino terendah didapat dari perlakuan P3 yaitu berjumlah 4,96 %. Asam amino nonsesensial tertinggi adalah asam glutamat (hasil perlakuan P1) yaitu sebesar 2,05 %, sedangkan asam amino nonesensial terendah adalah glisin (hasil perlakuan P1) yaitu sebesar 0,15 %.
Gambar 2. Kandungan Total Asam Amino Nonesensial KPDK (%)
Sedangkan asam amino esensial yang terdapat pada konsentrat protein daun kaliandra adalah isoleusin, leusin, lisin, metionin, fenilalanin, histidin, treonin, valin, dan arginin. Kandungan total asam asam amino esensial berturut-turut dapat dilihat pada Gambar 2. Berdasarkan gambar tersebut asam amino esensial tertinggi didapat dari perlakuan P1 yaitu berjumlah 3,39% dan dari perlakuan P2 menghasilkan asam amino dengan total 3,46%. Asam amino terendah didapat dari perlakuan P3 yaitu berjumlah 3,26%. Asam amino esensial tertinggi adalah leusin (dari perlakuan P1) yaitu sebesar 0,53% dan asam amino esensial terendah adalah isoleusin (dari perlakuan P3) yaitu sebesar 0,20%. 5,3 5,19 4,96 Asa m Ami n o Non esens ia l (%)
ISBN: 978-602-97051-7-1 E-ISSN :
DOI :
704 Gambar 3. Kandungan Total Asam Amino Esensial (%)
Berdasarkan data hasil penelitian diketahui bahwa kadar protein kasar meningkat dari perlakuan P1, P2, dan P3 tetapi kandungan total asam aminonya menurun. Hal ini menunjukkan bahwa dari 10,15 %; 19,95 %; dan 30,45 % protein kasar, hanya mengandung berturut-turut 8,69 %; 8,65 %; dan 8,22 % total asam amino. Berarti selain mengandung asam amino, konsentrat protein daun kaliandra juga mengandung asam amino bebas, nukleotida, dan nitrogen nonprotein yang terdeteksi sebagai protein kasar. Menurut Lehninger (1982) semakin jauh perbedaan pH dari titik isoelektrik maka kelarutan protein akan semakin meningkat. Oleh karena itu kandungan total asam amino semakin menurun dari perlakuan P1, P2, dan P3 karena semakin mendekati pH isoelektrik yaitu pH 7, kecuali kandungan total asam amino esensial pada P1 yang lebih rendah daripada perlakuan P2. Karena asam amino threonin yang terdeteksi dari perlakuan P1 jauh lebih kecil dari perlakuan lain yaitu sebesar 0,37% sehingga kandungan total asam amino esensial menjadi rendah.
Indeks Asam Amino Esensial KPDK
Penilaian kualitas protein suatu bahan ditentukan oleh kadar terendah dari asam amino esensialnya, bila dibandingkan dengan protein telur sebagai standarnya. Karena proporsi asam amino yang relatif paling stabil dan menyebabkan keseimbangan nitrogen menjadi normal, adalah pola susunan asam amino esensial yang terdapat dalam telur. Semakin dekat jenis dan jumlah asam amino dalam bahan baku pakan dengan jenis dan jumlah asam amino dalam telur berarti semakin baik kualitas bahan baku tersebut berarti semakin baik kualitas bahan baku tersebut (Afrianto dan Liviawaty, 2005). Nilai indeks asam amino esensial konsentrat protein daun kaliandra dapat dilihat pada Gambar 4.
3,39 3,46 3,26 Asa m Ami n o Ese n sia l (%)
ISBN: 978-602-97051-7-1 E-ISSN :
DOI :
705 Gambar 4. Indeks Asam Amino Esensial KPDK (%)
Dari Gambar 4 dapat dilihat bahwa indeks asam amino esensial tertinggi pada perlakuan P2 yaitu sebesar 6,82 %, selanjutnya pada perlakuan P1 yaitu sebesar 6,71 %, dan pada perlakuan P3 sebesar 6,35 %. Yang artinya bahwa kandungan rata-rata asam amino esensial dalam konsentrat protein daun kaliandra hanya sekitar 6,82 %; 6,71 %; dan 6,35 % dari jumlah protein dalam telur. Tentunya nilai ini sangat kecil bila dibandingkan dengan protein yang terkandung di dalam telur. Nilai IAAE sangat ditentukan oleh kandungan total asam amino esensial yang dihasilkan. Semakin tinggi kandungan asam amino esensialnya maka semakin tinggi nilai IAAE nya.
Seperti protein nabati lainnya, dipastikan akan ada ketidakseimbangan dalam kandungan asam amino konsentrat protein daun kaliandra. Asam amino pembatas yang ditemukan pada konsentrat protein adalah isoleusin dan valin. Kriteria yang diklasifikasikan sumber protein berkualitas baik jika memiliki indeks asam amino esensial lebih besar dari atau sama dengan 90 %; sumber protein yang bermanfaat memiliki nilai 80 %; dan tidak memadai ketika nilai di bawah 70 % (Penaflorida, 1989). Jadi, konsentrat protein dalam penelitian ini dapat dianggap sebagai sumber protein yang belum memadai tetapi ketika dilengkapi dengan AA pembatas atau dikombinasikan dengan sumber protein pelengkap dan diperoleh metode ekstraksi yang lebih efektif diharapkan dapat diklasifikasikan sebagai protein yang bermanfaat.
Berdasarkan standar mutu pakan konsentrat protein SNI (2009) diketahui bahwa konsentrat protein daun kaliandra belum mencapai kualitas yang disyaratkan karena rendahnya kandungan protein kasar dan asam aminonya. Kadar protein kasar konsentrat protein daun kaliandra masih di bawah 36,0% dan kandungan asam amino esensialnya
6,71 6,82 6,35 IAA E (% )
ISBN: 978-602-97051-7-1 E-ISSN :
DOI :
706 masih di bawah standar. Namun demikian konsentrat protein daun kaliandra masih dapat dimanfaatkan karena memiliki kandungan asam amino esensial yang lengkap. Hanya saja perlu dilakukan studi lebih lanjut untuk mendapatkan metode ekstraksi yang lebih baik demi meningkatkan nilai nutrisi konsentrat protein daun kaliandra.
KESIMPULAN
1. Titik isoelektrik protein daun kaliandra dicapai pada pH 7 dengan jumlah endapan 0,053; 0,055; dan 0,054 gram/15mL.
2. Semakin tinggi pH larutan buffer maka semakin kecil total asam amino esensial (AAE), asam amino nonesensial, dan indeks asam amino esensial (IAAE) nya kecuali nilai AAE dan IAAE hasil ekstraksi dengan larutan buffer pH 4,0 yang lebih rendah daripada pH 4,6.
3. Asam amino yang teridentifikasi adalah asam aspartat, asam glutamat, serin, glisin, alanine, prolin, tirosin, sistin, histidin, arginine, threonine, valin, metionin, isoleusin, leusin, fenilalanin, dan lisin.
4. Ekstraksi daun kaliandra dengan larutan buffer pH 4,6 merupakan perlakuan terbaik dalam menghasilkan KPDK.
SARAN
Saran untuk penelitian selanjutnya agar dalam pembuatan konsentrat protein daun kaliandra dapat menggunakan pH larutan buffer rentang pH 6 sampai 8, dan daun dilayukan lebih dari satu malam karena pelayuan selama satu malam masih menyisakan kandungan tannin pada daun kaliandra. Serta perlu dilakukan pembilasan sebelum pengeringan dengan menggunakan pelarut polar untuk meningkatkan jumlah rendemen dan protein kasar dalam konsentrat protein.
ISBN: 978-602-97051-7-1 E-ISSN :
DOI :
707 DAFTAR PUSTAKA
Afrianto, E. dan E. Liviawaty. 2005. Pakan Ikan. Kanisius: Yogyakarta.
Belitz, H.D., W. Grosch and P. Schieberle. 2009. Food Chemistry, 4th ed. Springer Book, Heidelberg, Germany.
Badan Standarisasi Nasional. 2009. Standar Nasional Indonesia (SNI). Pakan Konsentrat Bagian 5. SNI-3148.5. Jakarta.
Davey, J. dan M. Lord. 2003. Essential Cell Biology Volume 2: Cell Function. Oxford University Press: Oxford.
Fasakin, E.A. 1999. Nutrient Quality of Leaf Protein Concentrates Produced From Water Fern (Azolla Africana Desv) and Duckweed (Spirodela Polyrrhiza L. Schleiden).
Bioresource Technology. 69(2):185-187.
Kumar, K.S., K. Gansesan., K. Selvaraj., P.VS. Rao. 2014. Studies on the Functional Properties of Protein Concentrate of Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty an Edible Seaweed. Food Chemistry. 153 p. 353-360.
Lehninger, A.L. 1982. Principle of Biochemistry. Worth Publ. Inc., NewYork.
McClements DJ. Analysis of Protein. Available on the internet:
http://people.umass.edu/~mcclemen/581Proteins. htm Accessed 31/02/2016.
Peñaflorida V. D., 1989 An evaluation of indigenous protein sources as potentialcomponent in the diet formulation for tiger prawn, Penaeus monodon, usingessential amino acid index (EAAI). Aquaculture. 83:319-330.
Roshetko, JM. 2000. Calliandra calothyrsus in Indonesia: Seed production in a Small Scale. In: Workshop on Seed Production and Utilization of Kaliandra. Bogor, Indonesia. p 27-30.
Satwika, R.A. 2010. Kombinasi Metode Sonikasi, Pemanasan, dan Fraksinasi Amonium
Sulfat untuk Ekstraksi Enzim Fosfolipase-A2 dari Acantaster Planci. Jakarta: FT
UI.
Sumardjo, D. 2009. Pengantar Kimia: Buku Panduan Kuliah Mahasiswa Kedokteran. EGC: Jakarta.
Surzycki, S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlay: Berlin.. Tangka, J.K., 2003. Analysis of The Thermal Energy Requirements for The Extraction
of Leaf Protein Concentrate From Some Green Plants. Biosystems Eng., 86: 473-479.
Wade, L.G. 2003. Organic Chemistry. Prantice Hall: USA.
