Penetapan kandungan fenolik total dan uji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus (Piper cubeba L.).

(1)

ABSTRAK

Senyawa fenolik yang terkandung dalam tanaman, khususnya asam fenolat dan flavonoid, telah diketahui memiliki aktivitas antioksidan yang dapat menghambat radikal bebas dan peroksidasi lipid. Kemukus (Piper cubeba L.) merupakan salah satu tanaman dari famili Piperaceae yang telah diketahui memiliki berbagai kandungan fitokimia yang memiliki potensi sebagai antioksidan.

Menurut hasil penelitian Nahak dan Sahu (2011), daun kemukus memiliki kandungan fitokimia berupa alkaloid, glikosida, steroid, flavonoid, tanin, dan antrakuinon. Flavonoid merupakan salah satu senyawa fenolik utama yang bersifat kurang polar. Etil asetat dapat menarik senyawa yang bersifat kurang polar sehingga dapat digunakan sebagai penyari untuk mengambil kandungan flavonoid yang ada dalam daun kemukus secara optimal.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui kandungan fenolik total dan aktivitas antioksidan daun kemukus yang diekstrak dengan metanol dan difraksinasi dengan etil asetat. Kandungan fenolik total diukur dengan metode Folin-Ciocalteu, sedangkan aktivitas antioksidan diukur dengan metode FTC (Ferric Thiocyanate) dan TBA (Thiobarbituric Acid) untuk mengetahui kemampuan penghambatan peroksida pada tahap pertama dan kedua peroksidasi lipid.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa kandungan fenolik total yang terdapat dalam fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus sebesar 155,157 ± 5,642 mg ekivalen asam galat per gram sampel. Aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus yang ditunjukkan dalam persen penghambatan peroksidasi lipid diukur dengan metode FTC dan TBA secara berturut-turut sebesar (9,378 ± 0,263)% dan (90,942 ± 0,750)%.

(2)

ABSTRACT

Phenolic compound contained in plants, especially phenolic acid and flavonoid, has been known to have antioxidant activity which can inhibit free radical and lipid peroxidation. Cubeb (Piper cubeba L.) is a plant in Piperaceae family which has been known to have some phytochemical content that can exhibit potential antioxidant activity.

According to the research by Nahak and Sahu (2011), Cubeb leaves have some phytochemical compounds such as alkaloid, glycoside, steroid, flavonoid, tannin, and anthraquinon. Flavonoid is one of major phenolic compound which is less polar. Ethyl acetate can extract less polar compound, therefore ethyl acetate can be used as an extractor to extract flavonoid contained in cubeb leaves optimally.

The aim of this research were to measure total phenolic content and antioxidant activity from cubeb leaves extracted by methanol and fractionated by ethyl acetate. Total phenolic content were measured by Folin-Ciocalteu method, meanwhile antioxidant activity were measured by FTC (Ferric Thiocyanate) method and TBA (Thiobarbituric Acid) method to evaluate the percent inhibition of peroxide in the first and second stage of lipid peroxidation.

The results showed that total phenolic content in ethyl acetate fraction of methanol extract of cubeb leaves was 155.157 ± 5.642 mg Gallic Acid Equivalents (GAE). Antioxidant activity of ethyl acetate fraction of methanol extract of Cubeb leaves showed as percent inhibition value was (9.378 ± 0.263)% and (90.942 ± 0.750)% for FTC and TBA method respectively.

(3)

PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOL DAUN

KEMUKUS (Piper cubeba L.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Maria Indah Rosari

NIM: 128114037

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

(4)

i

PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOL DAUN

KEMUKUS (Piper cubeba L.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Maria Indah Rosari

NIM: 128114037

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

(5)

(6)

(7)

(8)

(9)

vi

HALAMAN PERSEMBAHAN

“Sakèhing prakara bisa daksangga ana ing Panjenenganè kang

paring kakuwatan marang aku.”

-Filipi 4:13-

“Success is falling nine times and getting up ten.”

-Jon Bon Jovi-

Kupersembahkan skripsi ini untuk:

Tuhan Yesus Kristus, Penyelamatku, yang kasihnya tak pernah

berkesudahan, yang selalu menguatkan dan menolongku dalam

segala perkara apapun,

Papa dan Mama yang kusayangi, yang telah membesarkan,

merawat, mendidik, dan menyayangiku hingga sekarang,

keluarga besar, sahabat, teman,

(10)

vii PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Kuasa atas berkat

dan bimbingan-Nya penulis dapat menyelesaikan Skripsi yang berjudul “Penetapan Kandungan Fenolik Total dan Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanol Daun Kemukus (Piper cubeba L.)” ini dengan bbaik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana

Strata Satu Program Studi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma.

Penulis mengalami berbagai macam kesulitan dan masalah dalam proses

pengerjaan Skripsi ini. Kesulitan dan masalah ini dapat diatasi penulis dengan

bantuan dari segala pihak. Oleh karena itu penulis hendak mengucapkan terima

kasih kepada:

1. Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma

2. Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt., selaku Dosen Pembimbing dan Dosen

Penguji Skripsi atas segala kesabaran dan masukan sehingga skripsi ini dapat

diselesaikan dengan baik

3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku Dosen Penguji Skripsi atas masukan,

kritik, dan saran kepada penulis dalam penyusunan skripsi ini

4. Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt., selaku Dosen Penguji Skripsi atas

masukan, kritik, dan saran kepada penulis dalam penyusunan skripsi ini

5. Agustina Setiawati, M.Sc., Apt., selaku Kepala Laboratorium Fakultas

Farmasi yang telah memberikan izin dalam penggunaan laboratorium

6. Pak Wagiran selaku Laboran Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Pak

Suparlan selaku Laboran Laboratorium Kimia Organik, Mas Kunto selaku

Laboran Laboratorium Kimia Analisis, Mas Bimo selaku Laboran

Laboratorium Kimia Instrumen, Pak Heru selaku Laboran Laboratorium

Biofarmasetika, Pak Kayat selaku Laboran Laboratorium Biokimia, Mas

Agung selaku Laboran Laboratorium Kimia-Fisika, Pak Mus selaku Laboran

Laboratorium FTS-Solid, Mas Sigit selaku Laboran Kebun Tanaman Obat

(11)

viii

7. Keluarga (Papa dan Mama) atas kasih sayang, pengorbanan, dukungan, doa,

dan bantuan yang telah diberikan kepada Penulis, baik secara moral maupun

materiil

8. Rekan-rekan seperjuangan skripsi sekaligus sahabat-sahabatku, Agatha Herny

S. N., Yuliana Ratih Kamara Dewi, Violeta Jesmile, dan Clementia Nova,

yang telah berjuang bersama dengan Penulis menyelesaikan skripsi ini.

Terima kasih atas segala bantuan, kerjasama, dan semangat dalam penelitian

ini dari awal hingga akhir

9. Sahabat-sahabatku (Monik, Dewi Anugerah, dan Melani) atas dukungan,

semangat, canda tawa, dan persabatan selama empat tahun ini

10. Teman-teman Kos Putri Palantai (Elisa, Ridha, dan Irest) atas semangat,

dukungan, masukan, dan canda tawanya

11. Seluruh dosen, teman-teman FSM A, teman-teman FKK A 2012, serta

seluruh angkatan 2012 Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

12. Semua pihak yang tidak dapat Penulis sebutkan satu per satu sehingga Penulis

dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih memiliki kekurangan dalam

berbagai macam hal. Untuk itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang

membangun dari segala pihak. Semoga skripsi ini dapat berguna bagi seluruh

pembaca.

Yogyakarta, 23 Juni 2016

(12)

ix DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... ii

HALAMAN PENGESAHAN ... iii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... iv

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ... v

HALAMAN PERSEMBAHAN ... vi

PRAKATA ... vii

DAFTAR ISI ... ix

DAFTAR TABEL ... xi

DAFTAR GAMBAR ... xii

DAFTAR LAMPIRAN ... xiii

ABSTRAK ... xiv

ABSTRACT ... xv

PENDAHULUAN ... 1

METODE PENELITIAN ... 3

HASIL DAN PEMBAHASAN ... 6

KESIMPULAN DAN SARAN ... 14

DAFTAR PUSTAKA ... 15

LAMPIRAN ... 17

(13)

x

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Hasil penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat

ekstrak metanol daun Kemukus ... 9

Tabel II. Nilai persen inhibisi sampel dengan metode FTC ... 12

(14)

xi

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Kurva baku asam galat untuk penetapan kandungan

fenolik total ... 8

Gambar 2. Pembentukan kompleks Fe3+-tiosianat dari kompleks

Fe2+-tiosianat oleh hidroperoksida ... 10

Gambar 3. Profil kenaikan rata-rata absorbansi sampel dengan

metode FTC selama tujuh hari ... 11

(15)

xii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Surat determinasi tanaman ... 18

Lampiran 2. Gambar daun Kemukus ... 19

Lampiran 3. Perhitungan pengujian kadar air serbuk simpllisia

daun Kemukus ... 20

Lampiran 4. Uji pendahuluan penetapan kandungan fenolik total

dengan metode Folin-Ciocalteu ... 20

Lampiran 5. Perhitungan rendemen ekstrak dan fraksi ... 20

Lampiran 6. Data penimbangan untuk penetapan kandungan

fenolik total ... 21

Lampiran 7. Data perhitungan konsentrasi asam galat dan fraksi

etil asetat untuk penetapan kandungan fenolik total... 22

Lampiran 8. Hasil optimasi operating time untuk penetapan

kandungan fenolik total ... 23

Lampiran 9. Optimasi panjang gelombang maksimum untuk penetapan

Lampiran 10. Hasil pengukuran kurva baku untuk penetapan

Lampiran 11. Perhitungan kandungan fenolik total fraksi etil asetat... 27

Lampiran 12. Data penimbangan untuk optimasi operating time uji

aktivitas antioksidan dengan metode FTC ... 28

Lampiran 13. Hasil optimasi operating time untuk uji aktivitas

antioksidan dengan metode FTC (triplo) ... 28

Lampiran 14. Data penimbangan untuk optimasi panjang

gelombang maksimum untuk uji antioksidan dengan

(16)

xiii

Lampiran 15. Hasil optimasi panjang gelombang untuk uji aktivitas

antioksidan dengan metode FTC ... 29

Lampiran 16. Data penimbangan untuk uji antioksidan dengan

metode FTC-TBA ... 32

Lampiran 17. Hasil pengukuran uji aktivitas antioksidan dengan

metode FTC ... 32

Lampiran 18. Hasil pengukuran uji aktivitas antioksidan dengan

metode TBA ... 33

Lampiran 19. Gambar larutan sampel fraksi etil asetat ekstrak

metanol daun kemukus pada metode FTC setelah

penambahan FeCl3 selama 7 hari (tiga kali replikasi) ... 35

(17)

xiv ABSTRAK

Senyawa fenolik yang terkandung dalam tanaman, khususnya asam fenolat dan flavonoid, telah diketahui memiliki aktivitas antioksidan yang dapat menghambat radikal bebas dan peroksidasi lipid. Kemukus (Piper cubeba L.) merupakan salah satu tanaman dari famili Piperaceae yang telah diketahui memiliki berbagai kandungan fitokimia yang memiliki potensi sebagai antioksidan.

Menurut hasil penelitian Nahak dan Sahu (2011), daun kemukus memiliki kandungan fitokimia berupa alkaloid, glikosida, steroid, flavonoid, tanin, dan antrakuinon. Flavonoid merupakan salah satu senyawa fenolik utama yang bersifat kurang polar. Etil asetat dapat menarik senyawa yang bersifat kurang polar sehingga dapat digunakan sebagai penyari untuk mengambil kandungan flavonoid yang ada dalam daun kemukus secara optimal.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui kandungan fenolik total dan aktivitas antioksidan daun kemukus yang diekstrak dengan metanol dan difraksinasi dengan etil asetat. Kandungan fenolik total diukur dengan metode Folin-Ciocalteu, sedangkan aktivitas antioksidan diukur dengan metode FTC (Ferric Thiocyanate) dan TBA (Thiobarbituric Acid) untuk mengetahui kemampuan penghambatan peroksida pada tahap pertama dan kedua peroksidasi lipid.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa kandungan fenolik total yang terdapat dalam fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus sebesar 155,157 ± 5,642 mg ekivalen asam galat per gram sampel. Aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus yang ditunjukkan dalam persen penghambatan peroksidasi lipid diukur dengan metode FTC dan TBA secara berturut-turut sebesar (9,378 ± 0,263)% dan (90,942 ± 0,750)%.

(18)

xv ABSTRACT

Phenolic compound contained in plants, especially phenolic acid and flavonoid, has been known to have antioxidant activity which can inhibit free radical and lipid peroxidation. Cubeb (Piper cubeba L.) is a plant in Piperaceae family which has been known to have some phytochemical content that can exhibit potential antioxidant activity.

According to the research by Nahak and Sahu (2011), Cubeb leaves have some phytochemical compounds such as alkaloid, glycoside, steroid, flavonoid, tannin, and anthraquinon. Flavonoid is one of major phenolic compound which is less polar. Ethyl acetate can extract less polar compound, therefore ethyl acetate can be used as an extractor to extract flavonoid contained in cubeb leaves optimally.

The aim of this research were to measure total phenolic content and antioxidant activity from cubeb leaves extracted by methanol and fractionated by ethyl acetate. Total phenolic content were measured by Folin-Ciocalteu method, meanwhile antioxidant activity were measured by FTC (Ferric Thiocyanate) method and TBA (Thiobarbituric Acid) method to evaluate the percent inhibition of peroxide in the first and second stage of lipid peroxidation.

The results showed that total phenolic content in ethyl acetate fraction of methanol extract of cubeb leaves was 155.157 ± 5.642 mg Gallic Acid Equivalents (GAE). Antioxidant activity of ethyl acetate fraction of methanol extract of Cubeb leaves showed as percent inhibition value was (9.378 ± 0.263)% and (90.942 ± 0.750)% for FTC and TBA method respectively.

(19)

1 PENDAHULUAN

Radikal bebas merupakan jenis molekul yang tidak stabil dengan elektron

yang tidak berpasangan dan terdapat pada berbagai sistem biologi dan makanan.

Senyawa oksigen reaktif seperti hidrogen peroksida, hidroksil radikal, oksida

nitrat, peroksinitrit, oksigen tunggal, peroksil radikal, dan anion superoksida

termasuk ke dalam contoh radikal bebas (Halliwell, 2001). Produksi berlebihan

dari senyawa reaktif tersebut dapat menghasilkan stres oksidatif yang disebabkan

oleh ketidakseimbangan sistem pertahanan antioksidan dengan pembentukan

radikal bebas dalam tubuh (Mayne, 2003).

Stres oksidatif terlibat dalam patogenesis berbagai gangguan dan

penyakit termasuk penyakit kronis yang berhubungan dengan usia, seperti

atherosklerosis, rheumatoid arthritis, opthalmologi, dan penyakit neurodegeneratif.

Stres oksidatif juga dapat memicu kanker. Di antara semua molekul biologi, lipid

paling rentan terhadap serangan reactive oxygen species (ROS) dan reactive

nitrogen species (RNS) (Niki, et al., 2005). Lipid yang mengandung asam lemak

tak jenuh teroksidasi oleh molekul oksigen dan oksidasi tersebut dilakukan

dengan mekanisme rantai radikal bebas (Aruoma, 1998). Peroksidasi lipid dapat

mengakibatkan penuaan, penyakit jantung koroner, diabetes mellitus, penyakit

rematik, gangguan hati, multiple sclerosis, penyakit Parkinson, penyakit autoimun,

Alzheimer, dan karsinogenesis (Lin, et al., 2003; Loliger, 1991).

Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menghambat kerusakan

yang disebabkan oleh radikal bebas. Antioksidan memiliki kemampuan dalam

menstabilkan atau menon-aktifkan radikal bebas sebelum menyerang komponen

seluler. Antioksidan bekerja dengan cara memberikan sebagian elektronnya dan

mengurangi energi radikal bebas reaktif, sehingga membentuk radikal bebas yang

lebih stabil (El-Missiry, 2012).

Beberapa tanaman telah diketahui dapat menjadi sumber antioksidan

alami dan memiliki peran penting dalam pencegahan penyakit kanker dan

penuaan. Salah satu famili tanaman yang telah diketahui menunjukkan potensi

yang besar sebagai antioksidan adalah Piperaceae (Dodson et al., 2000). Piper

(20)

2

Menurut hasil penelitian Nahak dan Sahu (2011), daun kemukus memiliki

kandungan fitokimia berupa alkaloid, glikosida, steroid, flavonoid, tannin, dan

antrakuinon. Flavonoid merupakan salah satu senyawa fenolik utama yang dapat

berfungsi sebagai antioksidan karena kemampuannya dalam meniadakan radikal

bebas dan radikal peroksida sehingga efektif dalam menghambat oksidasi lipid

(Kinsella, et al., 1993).

Pemilihan fraksi etil asetat didasarkan pada kemampuannya dalam

menarik senyawa-senyawa yang bersifat kurang polar. Flavonoid yang terkandung

dalam daun kemukus merupakan senyawa fenolik yang bersifat kurang polar

sehingga dengan penyari etil asetat diharapkan senyawa flavonoid yang

terkandung dapat terambil secara optimal (Andersen dan Markham, 2006).

Sedangkan pemilihan ekstrak metanol didasarkan pada jurnal Cowan (1999), yang

menyatakan bahwa metanol dapat menarik lebih banyak senyawa metabolit

dibandingkan air, etanol, kloroform, diklorometanol, eter, dan aseton.

Metode yang banyak digunakan untuk penetapan kandungan fenolik total

adalah metode Folin-Ciocalteu. Metode ini dapat mengukur kandungan fenolik

total dan substrat oksidasi lainnya. Selain itu metode ini dikenal sebagai metode

yang sederhana dan mampu memberikan hasil yang sama atau reprodusibel

(Ainsworth, 2007).

Pengukuran aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan metode Ferric

Thiocyanate (FTC) dan Thiobarbituric Acid (TBA) yang mampu mengukur

jumlah peroksida yang terbentuk akibat proses peroksidasi lipid. Metode FTC

digunakan untuk mengukur jumlah peroksida pada tahap awal peroksidasi lipid,

sedangkan metode TBA digunakan untuk mengukur jumlah peroksida pada tahap

kedua peroksidasi lipid dan mengukur radikal bebas yang terbentuk setelah

oksidasi peroksida (Aqil, et al., 2006; Rezaeizadeh, et al., 2011).

Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui kandungan fenolik total dan

aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus (Piper

cubeba L.). Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai

(21)

3 METODE PENELITIAN

Bahan penelitian yang digunakan adalah daun kemukus segar yang

diperoleh dari kebun obat Merapi Farma, akuades, methanol teknis, metanol p.a.

99,6%, etanol p.a. 99,6%, etanol 75%, etil asetat p.a., buffer fosfat 0,05M (pH 7),

asam galat p.a. (Sigma), reagen Folin-Ciocalteu, larutan natrium karbonat

(Na2CO3) 1M, amonium tiosianat 30%, besi klorida (FeCl3) 0,02M, asam linoleat

2,5%, larutan asam trikloroasetat (TCA) 10%, larutan tiobarbiturat 0,67%, dan

BHT (Butylated hydroxytoluene) p.a. (Sigma).

Alat penelitian yang digunakan adalah pisau stainless steel, blender, oven,

neraca analitik, orbital shaker, corong Buchner, pompa vakum, kertas saring,

vacuum rotary evaporator, waterbath, vortex, spektrofotometer UV-Vis

(Shimadzu UV-1240), mikropipet, desikator, tabung sentrifuge, dan alat-alat gelas

(Pyrex).

Tata Cara Penelitian:

1. Determinasi tanaman

Determinasi tanaman kemukus dilakukan di Fakultas Biologi Universitas

Gadjah Mada Yogyakarta.

2. Preparasi daun kemukus

Daun kemukus dilakukan sortasi basah untuk membersihkan

kotoran-kotoran atau bahan asing lainnya yang terbawa pada waktu panen, kemudian

dicuci dengan cara dialiri air sambil dibersihkan kotoran yang melekat pada

daun. Pencucian dilakukan hingga daun bersih. Daun kemukus dirajang

kemudian dikeringkan di dalam oven pada suhu 60oC. Posisi daun kemukus

tidak boleh saling menumpuk dan harus sering dibalik agar pengeringan merata.

Pengeringan dianggap selesai apabila daun sudah dapat pecah atau patah

apabila diremas. Setelah itu, daun kemukus kering dipisahkan dari

bahan-bahan pengganggu yang ikut serta selama proses pengeringan. Daun kemukus

dibuat menjadi serbuk dengan blender, kemudian dilakukan pengayakan

(22)

4 3. Pembuatan ekstrak daun kemukus

Serbuk simplisia daun kemukus dimaserasi dengan metanol teknis hingga

simplisia terendam sempurna. Maserasi dilakukan selama 24 jam pada suhu

ruangan sambil dilakukan penggojogan secara otomatis dengan menggunakan

orbital shaker. Setelah 3 hari dimaserasi, filtrat disaring dengan corong

Buchner dibantu oleh pompa vakum dan ampasnya diremaserasi dengan

metanol teknis selama 2 hari lalu disaring. Remaserasi dilakukan satu kali

karena filtrat sudah terlihat jernih. Penyari pada filtrat dihilangkan dengan cara

diuapkan dengan menggunakan vacuum rotary evaporator pada suhu 60oC.

Kemudian diuapkan kembali dengan menggunakan waterbath untuk diperoleh

ekstrak kental. Setelah itu dilakukan penimbangan bobot tetap untuk

memastikan ekstrak bebas dari penyari.

4. Fraksinasi

Ekstrak kental yang diperoleh difraksinasi menggunakan metode

ekstraksi cair-cair. Ekstrak kental dilarutkan dalam akuades hangat, kemudian

difraksinasi menggunakan etil asetat dengan perbandingan akuades : etil asetat

1:1 v/v di dalam corong pisah. Terbentuk dua lapisan, yaitu lapisan air dan

lapisan etil asetat. Lapisan etil asetat (bagian atas) diambil dan ditampung

dalam wadah sedangkan lapisan air (bagian bawah) difraksinasi kembali

menggunakan etil asetat dengan perbandingan yang sama. Tahapan ini diulang

hingga fraksi jernih. Fraksi etil asetat kemudian dipekatkan menggunakan

vacuum rotary evaporator pada suhu 77oC. Fraksi etil asetat pekat kemudian

diuapkan menggunakan waterbath untuk menghilangkan sisa penyari,

dilanjutkan dengan penimbangan bobot tetap. Fraksi etil asetat yang sudah

bebas dari penyari tersebut kemudian disimpan dalam desikator.

5. Penetapan kandungan fenolik total

Larutan sampel dibuat dengan menimbang fraksi etil asetat ekstrak

metanol daun kemukus sebanyak 10 mg kemudian dilarutkan dalam 10 mL

metanol:air (1:1) sehingga didapatkan konsentrasi larutan stok 1 mg/mL.

(23)

5

0,5 mL larutan intermediet dicampur dengan 2 mL reagen Folin-Ciocalteu dan

diinkubasi selama 5 menit. Selanjutnya ditambahkan 4 mL larutan Na2CO3 1M

kemudian didiamkan selama operating time yang telah ditentukan sebelumnya,

yaitu 30 menit dan dibaca pada panjang gelombang 735 nm, yang merupakan

hasil dari penentuan panjang gelombang maksimum. Replikasi dilakukan

sebanyak tiga kali. Kurva baku asam galat dibuat dengan konsentrasi 40; 50;

60; 70; dan 80 µg/mL. Hasil dinyatakan sebagai mg ekivalen asam galat per

gram ekstrak.

6. Uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC (Ferri-Tiosianat)

a. Pembuatan larutan A kontrol positif dan kontrol negatif

Kontrol positif yang digunakan adalah BHT. Sebanyak 4 mg BHT

ditimbang kemudian dilarutkan dalam 4 mL etanol absolut dalam tabung

reaksi bertutup. Kemudian ditambahkan 4,1 mL asam linoleat 2,5%, 8 mL

buffer fosfat pH 7 0,05M, dan 3,9 mL akuades. Larutan tersebut diinkubasi

dalam oven dengan suhu 40oC selama 24 jam. Pembuatan kontrol negatif

sama seperti pembuatan kontrol positif tanpa penambahan BHT.

b. Pembuatan larutan A sampel

Larutan sampel dibuat dengan menimbang fraksi etil asetat daun kemukus

sebanyak 4 mg kemudian dilarutkan dalam 4 mL etanol absolut dalam

tabung reaksi bertutup. Kemudian ditambahkan 4,1 mL asam linoleat 2,5%,

8 mL buffer fosfat pH 7 0,05M, dan 3,9 mL akuades. Larutan tersebut diberi

label larutan A dan dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. Larutan tersebut

diinkubasi dalam oven dengan suhu 40oC selama 24 jam.

c. Pengujian antioksidan

Dibuat larutan B untuk masing-masing larutan A kontrol positif, kontrol

negatif, dan sampel untuk pengujian antioksidan dengan mencampur 9,7 mL

etanol 75% dan 0,1 mL ammonium tiosianat 30% dalam tabung sentrifuge.

Masing-masing larutan A kontrol positif, kontrol negatif, dan sampel yang

telah diinkubasi selama 24 jam diambil sebanyak 100µL dan ditambahkan

ke dalam larutan B. Larutan tersebut divortex kemudian ditambahkan

(24)

6

homogen. Larutan tersebut didiamkan selama operating time yang telah

ditentukan sebelumnya, yaitu 5 menit, kemudian diukur dengan

spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 488,5 nm, yang

merupakan hasil dari penentuan panjang gelombang maksimum.

Pengukuran dilakukan setiap 24 jam selama beberapa hari hingga larutan

kontrol negatif jenuh yang ditunjukkan dengan menurunnya nilai absorbansi

(dalam penelitian ini, inkubasi dilakukan selama 8 hari).

7. Penegasan aktivitas antioksidan dengan metode TBA (asam tiobarbiturat)

Larutan sampel dan larutan standar yang digunakan pada metode FTC

pada hari terakhir diambil sebanyak 2 mL dan ditambahkan 1 mL larutan asam

trikloroasetat 20% dan 2 mL larutan asam tiobarbiturat 0,67%. Setelah

didihkan selama 10 menit, sampel didinginkan. Larutan tersebut kemudian

disentrifugasi pada kecepatan 3.000 rpm selama 30 menit. Absorbansi

supernatan dibaca pada panjang gelombang 532 nm dengan spektrofotometer

visibel.

6. Analisis statistik

Hasil dari tiga kali replikasi sampel ditampilkan sebagai rata-rata ± SD.

Data dihitung dengan metode One Sample T-Test menggunakan program PSPP

untuk menentukan signifikansi perbedaan pada level p<0,05.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Senyawa fenolik merupakan penangkal radikal oksigen yang baik

dikarenakan potensi reduksi elektron dari radikal fenolik lebih rendah daripada

potensi reduksi elektron dari radikal oksigen (Grace, 2005; Bors, et al., 1990).

Selain itu radikal fenolik bersifat kurang reaktif dibandingkan radikal oksigen

(Bors, et al., 1990) sehingga senyawa fenolik dapat menghambat radikal oksigen.

Berbagai metode penetapan kandungan fenolik total pada produk

makanan atau sampel biologis didasarkan pada reaksi senyawa fenolik dengan

reagen kolorimetri, salah satunya adalah reagen Ciocalteu. Metode

Folin-Ciocalteu merupakan salah satu metode yang sering digunakan dalam pengukuran

(25)

Folin-7

Ciocalteu diketahui sebagai metode yang cepat dan sederhana untuk mengukur

kandungan fenolik total dan senyawa oksidasi dalam ekstrak tanaman.

Prinsip metode Folin-Ciocalteu didasarkan pada transfer elektron dalam

medium alkali, akibat penambahan Na2CO3, dari senyawa fenolik ke dalam

kompleks asam fosfomolibdat dan asam fosfotungstat untuk membentuk

kompleks biru yang dapat dideteksi secara spektroskopis pada panjang gelombang

sekitar 760 nm (Singleton, et al., 1999). Reaksi yang terjadi adalah sebagai

Penetapan kandungan fenolik total dimulai dengan penetapan operating

time dan panjang gelombang maksimum. Penentuan operating time bertujuan

untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil, di mana pada waktu tersebut

tercapai reaksi yang optimal dan diperoleh absorbansi yang stabil. Pada saat awal

terjadi reaksi, absorbansi senyawa yang berwarna ini meningkat sampai waktu

tertentu hingga diperoleh absorbansi yang stabil. Semakin lama waktu pengukuran

maka ada kemungkinan senyawa yang berwarna tersebut menjadi rusak atau

terurai sehingga intensitas warnanya turun akibatnya absorbansinya juga turun.

Maka pengukuran senyawa berwarna (hasil suatu reaksi kimia) harus dilakukan

pada saat operating time (Gandjar dan Rohman, 2007).

Penentuan operating time dilakukan dengan menggunakan asam galat

sebagai senyawa pembanding selama 60 menit dengan selang waktu pengukuran 5

menit. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer UV-visibel

pada panjang gelombang teoritis 760 nm. Operating time yang diperoleh untuk

penetapan kandungan fenolik total adalah 30 menit. Pada waktu tersebut diperoleh

absorbansi yang stabil, terlihat dari selisih yang kecil antar absorbansinya.

Setelah diperoleh operating time, selanjutnya dilakukan penentuan

panjang gelombang maksimum untuk penetapan kandungan fenolik total. Tujuan

(26)

8

gelombang yang mempunyai nilai absorbansi maksimal. Pengukuran panjang

gelombang maksimum dilakukan pada rentang panjang gelombang 600-800 nm.

Pada penentuan panjang gelombang untuk penetapan fenolik total didapatkan

panjang gelombang maksimum 735 nm. Pada panjang gelombang tersebut nilai

absorbansi yang diperoleh menunjukkan nilai yang maksimal.

Pembuatan kurva baku dilakukan dengan asam galat sebagai standar

karena asam galat merupakan salah satu jenis asam fenolat yang masuk ke dalam

golongan senyawa fenolik utama. Larutan standar asam galat dibuat dalam lima

tingkat konsentrasi, yaitu 40, 50, 60, 70, dan 80 µg/mL dengan tiga kali replikasi.

Kurva baku asam galat dibuat dengan memplotkan nilai absorbansi versus

konsentrasi.

Gambar 1. Kurva baku asam galat untuk penetapan kandungan fenolik total

Persamaan yang digunakan dalam menentukan kandungan fenolik total

adalah persamaan regresi linier replikasi ketiga, yaitu y = 0,00624x + 0,0974

dengan linearitas r = 0,9924. Absorbansi sampel yang didapat kemudian

dimasukkan ke dalam persamaan tersebut untuk memperoleh nilai kandungan

fenolik total sampel ditunjukkan dengan satuan mg ekivalen asam galat per gram

sampel. Hasil perhitungan menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak metanol

daun kemukus memiliki nilai kandungan fenolik total sebesar 155,157 ± 5,642 mg

(27)

9

3,75 mg ekivalen asam galat per gram sampel. Hasil kandungan senyawa fenolik

pada penelitian ini lebih tinggi dibandingkan dengan penelitian yang dilakukan

oleh Aqil et al. (2006). Hal ini dikarenakan senyawa fenolik, khususnya flavonoid,

umumnya banyak terkandung di dalam daun.

Tabel I. Hasil penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus

Konsentrasi Absorbansi Kandungan fenolik total

Pada penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanol

daun kemukus, larutan menunjukkan warna biru setelah ditambahkan reagen

Folin-Ciocalteu dan larutan Na2CO3. Hal tersebut menunjukkan bahwa terdapat

senyawa fenolik yang terkandung di dalam fraksi etil asetat ekstrak metanol daun

kemukus.

Polifenol merupakan senyawa utama pada tanaman yang menghasikan

aktivitas antioksidan. Senyawa fenolik utama yang memiliki aktivitas antioksidan

adalah asam fenolat dan flavonoid (Demiray, et al., 2009). Menurut hasil

penelitian Nahak dan Sahu (2011), tanaman kemukus memiliki kandungan

fitokimia berupa alkaloid, glikosida, steroid, flavonoid, tanin, dan antrakuinon.

Flavonoid merupakan salah satu jenis senyawa fenolik utama di dalam tanaman.

Kandungan senyawa fenolik berupa flavonoid yang dimiliki tanaman kemukus

menghasilkan aktivitas antioksidan yang dapat menghambat radikal bebas.

Pengujian aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun

kemukus dilakukan dengan metode FTC dan TBA dengan mekanisme asam

lionoleat. Asam linoleat merupakan salah satu asam lemak tak jenuh yang rentan

mengalami auto-oksidasi. Faktor-faktor yang mempengaruhi proses oksidasi asam

linoleat adalah panas, cahaya, oksigen, dan ion logam.

Peroksidasi lipid diawali oleh ROS (Reactive Oxygen Species) atau

(28)

10

(O2+), oksigen tunggal (O2), oksigen triplet (3O2), ozon (O3), radikal hidroksil

(+OH), radikal alkoksil (RO+), dan radikal peroksil (ROO+). ROS mengambil

atom hidrogen dari gugus metil asam lemak tak jenuh dan membentuk radikal

bebas seperti radikal peroksil. Saat radikal bebas ini terbentuk, peroksidasi lipid

berkembang sehingga lipid memproduksi bebagai produk oksidasi sekunder.

Beberapa produk oksidasi sekunder yang dibentuk dari lipid digunakan sebagai

biomarker untuk mengetahui peran produk oksidasi sekunder dalam penyakit

kanker dan neurodegeneratif (Matsuo, 1985).

Keberadaan antioksidan (A˙) dapat memecah reaksi berantai dengan

bereaksi dengan lipid peroksida (LOO˙) yang membentuk radikal yang stabil yang

bersifat relatif tidak reaktif atau produk non-radikal.

LOO˙ + AH LOOH + A˙

A˙ + LOO˙ Produk non-radikal A˙ + A˙ Produk non-radikal

(Halliwel dan Chirico, 1993)

Metode FTC digunakan untuk menentukan tingkat hidroperoksida lipid

dalam suatu sistem biologis. Pada metode ini, asam linoleat digunakan sebagai

sumber peroksida. Peroksida yang terbentuk bereaksi dengan FeCl2 untuk

membentuk ion Fe3+ yang kemudian bereaksi dengan ammonium tiosianat (SCN-)

membentuk kompleks ferri-tiosianat (Fe(SCN)3) berwarna merah yang dibaca

absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang teoritis 500 nm.

Gambar 2. Pembentukan kompleks Fe3 +

-tiosianat dari kompleks Fe2 +

-tiosianat oleh hidroperoksida (Moon dan Shibamoto, 2009)

Kontrol positif yang digunakan adalah BHT (Butyl hydroxytoluene) yang

merupakan salah satu antioksidan sintetis. Kontrol positif digunakan sebagai

pembanding aktivitas antioksidan dengan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun

(29)

11

berperan sebagai acuan untuk melihat kenaikan jumlah peroksida yang terbentuk

setiap harinya selama waktu pengukuran.

Sebelum dilakukan pengujian aktivitas antioksidan dengan metode FTC,

dilakukan optimasi metode berupa penentuan operating time dan panjang

gelombang maksimum. Operating time yang diperoleh adalah 5 menit, sementara

panjang gelombang yang mampu menunjukkan absorbansi maksimum adalah

488,5 nm.

Uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC dilakukan selama beberapa

hari hingga kontrol negatif menunjukkan absorbansi maksimum dan warna merah

larutan akibat pembentukan kompleks ferri-tiosianat terlihat semakin pekat. Hal

tersebut menandakan bahwa proses peroksidasi lipid asam linoleat sudah berjalan

secara maksimal. Pengukuran absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan

sampel dilakukan selama tujuh hari dengan rentang waktu pembacaan sampel

setiap 24 jam. Absorbansi maksimal kontrol negatif dicapai pada hari keenam,

menandakan proses peroksidasi telah berjalan maksimal dan semakin banyak

peroksida atau radikal bebas yang terbentuk.

Gambar 3. Profil kenaikan rata-rata absorbansi sampel dengan metode FTC selama tujuh hari

Hasil yang diperoleh menunjukkan kesesuaian dengan mekanisme reaksi

di mana nilai absorbansi kontrol negatif lebih tinggi dibandingkan nilai absorbansi

(30)

12

pada kontrol negatif yang dapat menghambat proses peroksidasi lipid, sehingga

ion Fe3+ yang terbentuk semakin banyak dan warna merah akibat pembentukan

kompleks ferri-tiosianat lebih pekat dibandingkan kontrol positif yang berisi BHT

dan sampel yang berisi fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus.

Pada pengukuran hari keenam, saat proses peroksidasi lipid sudah

berjalan secara maksimal, kontrol positif yang berisi BHT menunjukkan nilai

persen inhibisi yang lebih besar dibandingkan fraksi etil asetat ekstrak metanol

daun kemukus, yaitu sebesar (10,306 ± 0,734)%, sementara fraksi etil asetat

ekstrak metanol memiliki nilai persen inhibisi sebesar (9,378 ± 0,263)%. Secara

statistik nilai persen inhibisi kedua sampel tersebut berbeda bermakna (p<0,05).

Hal tersebut menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus

kurang mampu menghambat peroksidasi yang terbentuk dibandingkan BHT yang

merupakan antioksidan sintetis. Namun fraksi etil asetat ekstrak metanol daun

kemukus tetap memiliki aktivitas antioksidan yang mampu menghambat proses

peroksidasi lipid, ditunjukkan dengan nilai absorbansi yang lebih kecil

dibandingkan kontrol negatif.

Tabel II. Nilai persen inhibisi sampel dengan metode FTC

% Inhibisi kontrol (+)

Keterangan: R1 = Replikasi 1; R2 = Replikasi 2; Replikasi 3

Potensi fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus dapat dikaitkan

dengan kandungan senyawa fenolik yang dimilikinya. Gugus hidroksil yang

terdapat dalam senyawa fenolik berkontribusi secara langsung pada aktivitas

antioksidan dan kemampuan penghambatan radikal bebas dan peroksidasi lipid.

Senyawa fenolik dapat berperan sebagai antioksidan dengan menon-aktifkan

radikal bebas lipid atau mencegah dekomposisi hidroperoksida ke dalam radikal

(31)

13

Setelah dilakukan pengujian aktivitas antioksidan dengan metode FTC,

dilakukan pengujian aktivitas antioksidan dengan metode TBA. Metode TBA

digunakan untuk mengukur jumlah peroksida pada tahap kedua peroksidasi lipid

dan mengukur radikal bebas yang ada setelah oksidasi peroksida. Pada tahap

kedua peroksidasi lipid, asam linoleat yang sudah banyak terbentuk menjadi

radikal terdekomposisi menjadi senyawa yang lebih sederhana dan relatif stabil,

yaitu MDA (malonaldehida). MDA digunakan sebagai biomarker untuk

mengetahui tahap akhir peroksidasi lipid. Prinsip metode ini adalah pengukuran

serapan dengan spektrofotometer dari reaksi MDA dengan asam tiobarbiturat

yang berwarna merah muda pada panjang gelombang 532 nm.

Gambar 4. Pembentukan kompleks MDA-TBA (Moon dan Shibamoto, 2009)

Pada hari kedelapan setelah pengujian dengan metode FTC, dilakukan

pengujian aktivitas antioksidan dengan metode TBA untuk mengukur nilai

penghambatan MDA, produk oksidasi sekunder yang terbentuk setelah tahap

pertama peroksidasi lipid. Pada hari ketujuh, jumlah peroksida yang terbentuk

sudah mulai menurun, ditunjukkan dengan menurunnya nilai aborbansi kontrol

negatif. Hal tersebut disebabkan mulai terbentuknya senyawa MDA dari asam

linoleat sehingga pengukuran dengan metode TBA dilakukan pada hari kedelapan.

Tabel III. Aktivitas antioksidan sampel dengan metode TBA

Absorbansi % Inhibisi (%) Kontrol negatif 1,001 ± 0,004 0

BHT 0,168 ± 0,009 83,916 ± 0,888

Fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus

(32)

14

Tabel III menunjukkan bahwa nilai absorbansi dan persen inhibisi fraksi

etil asetat ekstrak metanol daun kemukus terhadap MDA lebih besar dibandingkan

BHT dengan nilai persen inhibisi fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus

sebesar (90,942 ± 0,750)%, sementara nilai persen inhibisi BHT sebesar (83,916 ±

0,888)%. Secara statistik, nilai persen inhibisi kedua sampel tersebut berbeda

bermakna (p<0,05). Hal tersebut menunjukkan bahwa pada tahap kedua

peroksidasi lipid, aktivitas penghambatan MDA oleh fraksi etil asetat ekstrak

metanol daun kemukus lebih besar dibandingkan penghambatan peroksida pada

tahap pertama peroksidasi lipid.

Metode FTC dan TBA memiliki kelemahan yaitu hanya mampu

menunjukkan aktivitas antioksidan dengan hasil persen penghambatan peroksida.

Kedua metode ini tidak dapat menunjukkan pada konsentrasi berapa sampel yang

diuji mampu menghambat radikal bebas secara efektif. Selain itu metode FTC

memiliki kelemahan pada pembentukan kompleks warna, di mana semakin lama

operating time kompleks warna akan semakin memudar sehingga dapat

mempengaruhi akurasi.

KESIMPULAN DAN SARAN

Kandungan fenolik total yang dinyatakan dalam mg ekivalen asam galat

per gram sampel pada fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus sebesar

155,157 ± 5,642 mg ekivalen asam galat per gram sampel. Aktivitas antioksidan

fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus yang dinyatakan dalam persen

inhibisi dengan metode FTC dan TBA berturut-turut adalah (9,378 ± 0,263)% dan

(90,942 ± 0,750)%. Hasil tersebut menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus memiliki potensi sebagai antioksidan.

Saran untuk penelitian selanjutnya perlu dilakukan pembuatan sampel

dalam berbagai tingkat konsentrasi untuk mengetahui konsentrasi sampel yang

mampu menghambat lipid peroksidasi secara efektif. Perlu dilakukan juga

penambahan jumlah replikasi sampel untuk mengatasi masalah ketidakakuratan

pembacaan absorbansi dengan metode FTC akibat kelemahan dalam pembentukan

(33)

15

senyawa dalam daun kemukus yang berperan dalam penghambatan lipid

peroksida.

DAFTAR PUSTAKA

Agbor, G.A., Vinston, J.A., Donnelly, P.E., 2014, Folin-Ciocalteau Reagent for Polyphenolic Assay, International Journal of Food Science, Nutrition and Dietetics, Vol. 3, Issue 8, pp. 147-156.

Ainsworth, E.A., Gillespie, K.M., 2007, Estimation of Total Phenolic Content and Other Oxidation Substrate in Plant Tissues Using Folin-Ciocalteu Reagent, Nature Publishing Group, Vol. 2, No. 4, pp. 875-877.

Andersen, O.M., Markham, K.R., 2006, Flavonoids: Chemistry, Biochemistry, and Applications, Taylor & Francis Group, London, p. 2.

Aqil, F., Ahmad, I., Mehmood, Z., 2006, Antioxidant and Free Radical Scavenging Properties of Twelve Traditionally Used Indian Medicinal Plants, Turk. J. Biol., Vol. 30, pp. 177-183.

Aruoma, O.I., 1998, Free Radicals, Oxidative Stress, and Antioxidants in Human Health and Disease, J. Am. Oil Chem. Soc., Vol. 75, pp. 199-212.

Bors, W., Heller, W., Michel, C. & Saran, M., 1990, Flavonoids as Antioxidants: Determination of Radical-Scavenging Efficiencies, Methods Enzymol, Vol. 186, pp. 343–355.

Cowan, M.M., 1999, Plant Products as Antimicrobial Agents, Clinical Microbiology Review, Vol. 12, No. 4, pp. 564-582.

Demiray, S., Pintado, M.E., Castro, P.M.L., 2009, Evaluation of Phenolic Profiles and Antioxidant Activities of Turkish Medicinal Plants: Tilia argentea, Crataegi folium leaves and Polygonum bistorta roots, World Acad, Sci. Eng. Technol., Vol. 54, pp. 312-317.

Dodson, C.D., Dyer, L.A., Searcy, J., Wright, Z., Letourneau, D.K., 2000, Cenocladamide: A Dihydropyridone Alkaloid from Piper cenocladum, Phytochemistry, Vol. 53, pp. 51-54.

El-Missiry, M.A., 2012, Antioxidant Enzyme, InTech, Croatia, pp. 3-15.

Gandjar, I. G., Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, hal. 220-265.

Grace, S.C., 2005, Phenolics as Antioxidants in Antioxidants and Reactive Oxygen Species in Plants (ed. Smirnoff, N.), Blackwell Publishing, Oxford, UK, pp. 141–168.

Halliwel, B., 2001, Vitamin C and Genomic Stability, Mutat. Res., Vol. 45 (1-2), pp. 29-35.

Halliwel, B., Chirico, S., 1993, Lipid Peroxidation: Its Mechanism, Measurements, and Significance, Am. J. Clin. Nutr., Vol. 57, pp. 715S-725S.

Kinsella, J.E., Frankel, E., German, B., Kanner, J., 1993, Possible Mechanism for The Protective Antioxidants in Wine and Plants Food, J. Food Technology, Vol. 4, Issue 5, p. 89.

(34)

16

Loliger, J., 1991, Free Radicals and Food Additives, Taylor and Francis, London, p. 121.

Matsuo, M., 1985, Synthesis and Degradation of Lipid Peroxides in Bodies, Center for Academic Publications Japan, pp.13-44.

Mayne, S.T., 2003, Antioxidant Nutrition and Chronic Disease: Use of Biomarkers of Exposure and Oxidative Stress Status in Epidemiological Research, J. Nutr., Vol. 133, p. 933.

Moon, J.K., Shibamoto, T., 2009, Antioxidant Assays for Plant and Food Components, J. Agric. Food. Chem., Vol. 57, pp. 1655-1666

Nahak, G., Sahu, R.K., 2011, Phytochemical Evaluation and Antioxidant Activity of Piper cubeba and Piper nigrum, Journal of Applied Pharmaceutical Science, Vol. 01 (08), pp. 153-157.

Niki, E., Yoshida, Y., Saito, Y., Noguchi, N., 2005, Lipid Peroxidation: Mechanisms, Inhibition, and Biological Effects, Biochem Biophys. Res. Commun., Vol. 388, pp. 668-676.

Pitchaon, M., Suttajit, M., Pongsawatmani, R., 2007, Assesment of Phenolic Content and Free Radical Scavenging Capacity of Some Thai Indigenous Plants, Food Chem, Vol. 100, pp. 1409-1418.

Rezaeizadeh, A., Zuki, A.B.S., Abdollahi, M., Goh, Y.M., Noordin, M.M., Hamid, M., Azmi, T. I., 2011, Determination of Antioxidant Activity in Methanolic Extract and Chloroformic Extract of Momordica charantia, African Journal of Biotechnology, Vol. 10, Issue 24, pp. 4392-4940. Singleton, V.L., Orthofer, R., Lamuela-Ravento´s, R.M, 1999, Analysis of total

(35)

17

(36)

(37)

19 Lampiran 2. Gambar daun kemukus

Lampiran 3. Perhitungan pengujian kadar air serbuk simplisia daun kemukus

% Kadar air = � −� ℎ�

� × 100%

a. Replikasi 1

Bobot awal = 5,013 gram

Bobot akhir = 4,596 gram

% Kadar air = 8,318%

b. Replikasi 2

% Kadar air = 8,872%

c. Replikasi 3

(38)

20

Lampiran 4. Uji pendahuluan penetapan kandungan fenolik total dengan metode Folin-Ciocalteau

A

B C

Keterangan:

A = Kontrol positif (asam galat + reagen Folin-Ciocalteau + Na2CO3)

B = Kontrol negatif (metanol : air (1:1) + reagen Folin-Ciocalteau + Na2CO3)

C = Sampel (fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus + reagen

Folin-Ciocalteau + Na2CO3)

Lampiran 5. Perhitungan rendemen ekstrak dan fraksi a. Ekstrak metanol daun kemukus

Bobot (gram) Bobot simplisia yang

digunakan

41,840

(39)

21 Bobot cawan + ekstrak 75, 3560

Bobot ekstrak 2,0285

% rendemen ekstrak = �

� � �

×

100%

% rendemen ekstrak = 2,0285

41,84

×

100% = 4,8482%

b. Fraksi etil asetat daun kemukus

Bobot (gram) Bobot simplisia yang

digunakan

41,8400

Bobot cawan kosong 70,6085 Bobot cawan + fraksi

etil asetat

72,6300

Bobot fraksi etil asetat 2,0215

% rendemen fraksi = �

� � �

×

100%

% rendemen fraksi = 2,0215

41,84

×

100% = 4,8315%

Lampiran 6. Data penimbangan untuk penetapan kandungan fenolik total a. Penimbangan asam galat (larutan stok)

Replikasi 1 (gram) Replikasi 2 (gram) Replikasi 3 (gram) Bobot gelas beker 63,7284 61,4635 62,1535 Bobot gelas beker

+ isi

63,7385 61,4735 62,1636

Bobot zat 0,0101 0,0100 0,0101

b. Penimbangan fraksi etil asetat

+ isi

61,0940 61,5300 61,6120

(40)

22

Lampiran 7. Data perhitungan konsentrasi asam galat dan fraksi etil asetat untuk penetapan kandungan fenolik total

a. Contoh perhitungan konsentrasi asam galat replikasi 1

Bobot asam galat replikasi 1 = 0,0101 g = 10,1 mg

Konsentrasi larutan stok asam galat = 10,1 �

10 �

=

1010 µg/mL

Perhitungan seri konsentrasi replikasi 1

Seri 1 :

V1 . C1 = V2 . C2

0,4 mL . 1010 µg/mL = 10 mL . C2

C2 = 40,4 µg/mL

Seri 2 :

V1 . C1 = V2 . C2

0,5 mL . 1010 µg/mL = 10 mL . C2

C2 = 50,5 µg/mL

Seri 3 :

V1 . C1 = V2 . C2

0,6 mL . 1010 µg/mL = 10mL . C2

C2 = 60,6 µg/mL

Seri 4 :

V1 . C1 = V2 . C2

0,7 mL . 1010 µg/mL = 10mL . C2

C2 = 70,7 µg/mL

Seri 5 :

V1 . C1 = V2 . C2

0,8 mL . 1010 µg/mL = 10 mL . C2

(41)

23

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Seri 1 40,4 µg/mL 40 µg/mL 40,4 µg/mL Seri 2 50,5 µg/mL 50 µg/mL 50,5 µg/mL Seri 3 60,6 µg/mL 60 µg/mL 60,6 µg/mL Seri 4 70,7 µg/mL 70 µg/mL 70,7 µg/mL Seri 5 80,8 µg/mL 80 µg/mL 80,8 µg/mL

b. Contoh perhitungan konsentrasi fraksi etil asetat

Bobot fraksi etil asetat replikasi 1 = 0,0100 gram = 1000 µg/mL

Pengenceran fraksi etil asetat replikasi 1

V1 . C1 = V2 . C2

2 mL . 1000 µg/mL = 10mL . C2

C2 = 200 µg/mL

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Konsentrasi fraksi 200 µg/mL 200 µg/mL 200 µg/mL

Lampiran 8. Hasil optimasi operating time untuk penetapan kandungan fenolik total

a. Replikasi 1

Menit ke- Absorbansi pada panjang gelombang 750 nm 40 µg/mL 60 µg/mL 80 µg/mL

(42)

24 b. Replikasi 2

Menit ke-

Absorbansi pada panjang gelombang 750 nm 40 µg/mL 60 µg/mL 80 µg/mL

Pada replikasi 2, operating time yang didapat adalah 30 menit

c. Replikasi 3

Menit ke-

Absorbansi pada panjang gelombang 750 nm 40 µg/mL 60 µg/mL 80 µg/mL

(43)

25

Lampiran 9. Optimasi panjang gelombang maksimum untuk penetapan kandungan fenolik total

a. Konsentrasi 40 µg/mL

(44)

(45)

27

Lampiran 10. Hasil pengukuran kurva baku untuk penetapan kandungan fenolik total

a. Replikasi 1

Seri Konsentrasi Absorbansi Persamaan kurva baku 1 40,4 µg/mL 0,349 A = 0,0700

Lampiran 11. Perhitungan kandungan fenolik total fraksi etil asetat Konsentrasi Absorbansi Kandungan

fenolik total

Contoh perhitungan kandungan fenolik total replikasi 1 :

y = 0,0062x + 0,0974

0,298 = 0,0062x + 0,0974

x = 29,985 µg/mL = 0,029985 mg/mL

(46)

28

Kandungan fenolik total = X = 0,029985 . 50

0,0100 = 149,925

Maka kandungan fenolik total dalam sampel replikasi 1 sebesar 149,925 mg

ekivalen asam galat per gram sampel.

Lampiran 12. Data penimbangan untuk optimasi operating time uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC

a. Penimbangan BHT (kontrol positif)

Bobot gelas beker = 63,0377 gram

Bobot gelas beker + isi = 63,0418 gram

Bobot zat = 0,0041 gram

Lampiran 13. Hasil optimasi operating time untuk uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC (triplo)

Menit ke

Absorbansi pada panjang gelombang 500 nm

Pengukuran 1 Pengukuran 2 Pengukuran 3

1 0,985 0,959 0,948

3 0,918 0,907 0,899

5 0,875 0,875 0,874

7 0,864 0,862 0,860

10 0,855 0,853 0,853

Operating time yang didapat adalah 5 menit

Lampiran 14. Data penimbangan untuk optimasi panjang gelombang maksimum uji antioksidan dengan metode FTC

+ isi

61,5122 61,7657 63,6609

(47)

29

Lampiran 15. Hasil optimasi panjang gelombang untuk uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC

(48)

(49)

31 c. Replikasi 3

Lampiran 16. Data penimbangan untuk uji antioksidan metode dengan FTC-TBA

(50)

32

b. Penimbangan sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus

Replikasi 1 (gram) Replikasi 2 (gram) Replikasi 3 (gram) Bobot cawan 27,9630 20,6332 27,1955 Bobot cawan + isi 27,9670 20,6372 27,1995 Bobot zat 0,0040 0,0040 0,0040

Lampiran 17. Hasil pengukuran uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC

a. Nilai absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan sampel

Ha

b. Rata-rata nilai absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan sampel

Hari

b. Perhitungan nilai % inhibisi dengan metode FTC (hari keenam)

(51)

33

Contoh perhitungan nilai % inhibisi sampel replikasi 1 hari ke- 1:

Persen inhibisi = 2,193−1,984

2,193 × 100%

= 9,530%

c. Grafik absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan sampel selama tujuh hari

Lampiran 18. Hasil pengukuran uji aktivitas antioksidan dengan metode TBA

a. Nilai absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan sampel

Kontrol (-) Kontrol (+) Sampel

b. Perhitungan nilai % inhibisi dengan metode TBA

Persen inhibisi = (A0– A1/A0) x 100%

Profil Kenaikan Rata-rata Absorbansi Kontrol Negatif, Kontrol Positif, dan Sampel

(52)

34

Kontrol (+) (%)

Rata-rata ± SD

% CV

Sampel (%)

Rata-rata ± SD

% CV

R1 R2 R3 R1 R2 R3

82,218 83,516 83,916 83,916 ± 0,888

1,058 91,708 90,210 90,909 90,942 ± 0,750

0,825

Contoh perhitungan nilai % inhibisi sampel replikasi 1:

Persen inhibisi = 1,000−0,083

1,000 × 100%

(53)

35

Lampiran 18. Gambar larutan sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemmukus pada metode FTC setelah penambahan FeCl3 selama 7 hari (tiga

kali replikasi)

1 2 3 4

5 6 7 Keterangan gambar:

Gambar 1: Sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus hari ke-1

(54)

36

Lampiran 20. Gambar larutan uji pada metode TBA a. Larutan kontrol positif dan kontrol negatif

Keterangan gambar:

A: Sampel berisi kontrol negatif (ethanol 96%)

B: Sampel berisi kontrol positif (BHT)

b. Larutan uji berisi fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus (tiga kali

(55)